ENZIMAS

YUL JACKELINE CAICEDO OVIEDO

BRAYAN RICARDO GUERRERO OJEDA
INGRID JOHANA MESA FONSECA
DIANA KATHERINE SANCHEZ MOJICA
SONIA MAYERLY SIERRA GONZALEZ

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERIAS FISICO-QUIMICAS
INGENIERIA QUIMICA
BIOPROCESOS I
BUCARAMANGA
2016-I
 ENZIMAS

YUL JACKELINE CAICEDO OVIEDO

BRAYAN RICARDO GUERRERO OJEDA
INGRID JOHANA MESA FONSECA
DIANA KATHERINE SANCHEZ MOJICA
SONIA MAYERLY SIERRA GONZALEZ
B1

DOCENTE:
Mg. MABEL JULIANA QUINTERO

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERIAS FISICO-QUIMICAS
INGENIERIA QUIMICA
BIOPROCESOS I
BUCARAMANGA
2016-I
 CONTENIDO

1. INTRODUCCIN...4
2. OBJETIVOS5
2.1. OBJETIVO GENERAL...5
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.5
3. ANTECEDENTES .6
4. MARCO TEORICO8
4.1. Enzimas...8
4.1.1. Nomenclatura de enzimas.8
4.1.2. Clasificacin internacional de las enzimas9
4.2. Cofactores enzimticos.....9
4.3. Funcionamiento enzimtico11
4.4. Cintica enzimtica..13
4.5. Inhibicin enzimtica....16
4.5.1. Inhibicin competitiva ...16
4.5.2. Inhibicin no competitiva ..17
4.5.3. Inhibicin mixta ..18
4.6. Aplicaciones Industriales 19
5. DESACTIVACIN TERMICA DE UNA -AMILASA COMERCIAL DE BACILLUS
LICHENIFORMIS UTILIZADA EN DETERGENTES.22
5.1. Diseo Metodolgico...22
5.2. Mtodos.23
5.2.1 Mtodo yodomtrico....23
5.3. Resultados.24
6. CONCLUSIONES ...27
7. BIBLIOGRAFA....28
 INTRODUCCIN

A lo largo del desarrollo de diferentes procesos industriales se ha visto la necesidad

de mejorar el tiempo de progreso de las diversas transformaciones, sean qumicas
o biolgicas, por tal razn se ha dado origen al estudio de los factores favorables
para ellas, con el fin de disminuir el tiempo de la reaccin. Estos estudios
conllevaron al uso de los catalizadores que son grandes aliados en los procesos
que involucran reacciones qumicas ya que disminuyen la energa de activacin de
dicha reaccin ayudando no solo a que sea ms rpida si no ms ptima
energticamente hablando.
Actualmente dadas las situaciones ambientales que se presentan a nivel mundial,
los procesos tpicos industriales han vuelto la mirada hacia los bioprocesos y,
encaminado al mximo desempeo de las reacciones se ha implementado el uso
de las enzimas, estas son molculas de naturaleza proteica, es decir, se encuentran
de forma natural o son producidas bajo operaciones exclusivas con microrganismos,
adems de tener las ventajas de no causar contaminacin son muy especficas a
los sustratos, lo que las hace tan eficientes, es decir, existe un tipo de enzima para
cada tipo de reaccin.
Unos de los problemas que afectan a las reacciones enzimticas es que pueden
someterse a desactivacin trmica a las condiciones utilizadas para el lavado con
el detergente, por tal motivo se presentar un artculo donde se realiza un estudio
de las condiciones a las cuales se puede desnaturalizar la enzima - amilasa, que
se reconoce hoy en da como una de las ms importantes enzimas, la cual tiene
gran cantidad de aplicaciones en la ciencia y la industria tales como la preparacin
de detergentes.

4
 2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Comprender las caractersticas generales y el funcionamiento de las

enzimas en los diferentes procesos industriales, as como analizar el
comportamiento de la enzima -amilasa en usada en detergentes.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Analizar experimentalmente la hidrlisis enzimtica de almidn mediante una

-amilasa comercial empleada en formulaciones de detergentes.

Proponer un modelo cintico para la hidrolisis teniendo en cuenta la influencia

de la concentracin de la enzima, PH, temperatura y concentracin de
sustrato sobre la reaccin enzimtica.

Estudiar y proponer un modelo cintico para la desactivacin trmica de la

enzima -amilasa comercial de origen bacteriano (bacillus licheniformis).

5
 3. ANTECEDENTES

Los catalizadores biolgicos se reconocieron como tales y fueron descritos por

primera vez a finales del siglo XVIII. El hecho que dio inicio a una extensa
investigacin de los que hoy conocemos como enzimas, fue la inquietud de saber
que era lo que suceda con la digestin de la carne.

Como bien lo decamos la digestin de la carne se realiza por las secreciones del
estmago y la transformacin del almidn en azcar, efecto de la saliva y as,
podramos seguir dando ejemplos de muchas otras reacciones que se llevan a cabo
en nuestro cuerpo donde las protagonistas son las enzimas.

En 1833, La primera enzima descubierta fue por Anselme Payen y Jean Franois
Person, ellos trabajaron sobre la (alfa amilasa), la cual la aislaron de una solucin
de malta con el nombre de diastasa por el griego separacin su funcin era separar
el almidn en unidades de glucosa, mientras que su amigo Payen investigaba sobre
la composicin de la madera pudo extraer la sustancia presente en las paredes
vegetales y la llamo celulosa, desde ese entonces el sufijo osa ha sido utilizado para
nombrar las enzimas de manera fcil.
En 1835, la primera teora general sobre la catlisis qumica publicada por J.J.
Berzelius inclua un ejemplo de lo que hoy conocemos como un enzima: la diastasa
de la malta, sealando que la hidrlisis del almidn se catalizaba ms eficazmente
por sta que por el cido sulfrico.
En 1860, Louis Pasteur propuso que la fermentacin del azcar para transformarse
en alcohol era inducida por ciertos catalizadores biolgicos, razn por la cual los
enzimas fueron llamados inicialmente "fermentos" supuso que dichos catalizadores
se hallaban unidos de modo indisoluble a la estructura de las clulas de la levadura
por lo que no podan actuar fuera de estas. Pasteur basndose en sus
experimentaciones pudo postular lo siguiente "la fermentacin del alcohol es un acto
relacionado con la vida y la organizacin de las clulas de las levaduras, y no con
la muerte y la putrefaccin de las clulas".
Resultado de este enunciado tambin apareci el seor Justus con Liebig quien
afirmaba lo contrario y deca que la fermentacin era una neta reaccin de
putrefaccin.
En 1877, se utiliza por primera vez la denominacin "enzima" (etimolgicamente "en
la levadura"). nombre que le dio Wilhelm Kuhn y que proviene de griego levadura.
En 1897, E. Bchner consigui extraer de las clulas de la levadura los enzimas
que catalizan la fermentacin alcohlica, demostrando que stos pueden actuar

6
independientemente de la estructura celular. Llam a la enzima que causa la
fermentacin de la sacarosa, zimasa. Este hecho permiti estudiar "in vitro" la
actividad y propiedades de los enzimas, aislarlos en estado puro y analizar su
composicin. Otro aporte fue la forma de nombrar las enzimas es de acuerdo a la
reaccin que producen. Normalmente, el sufijo "-asa" es agregado al nombre del
sustrato.
Despus de que se demostr que las enzimas pueden se extradas y trabajar de
manera independiente el reto estaba en descubrir su origen biolgico es aqu
cuando surge la relacin de enzimas con las protenas pero aparece Richard
Willsttter argumentando que las protenas es el transporte de las enzimas y que
ellas por si solas no realizaban ninguna catlisis.
En 1926, J.B. Sumner aisl un enzima, la ureasa, en forma cristalina pura y
demostr que los cristales estaban formados por protenas. Aparte de esto tambin
lo pudo realizar con la enzima catalasa en el ao de 1937.
Entre 1930 y 1936 se aislaron en forma cristalina pura diversos enzimas quedando
establecida de modo definitivo la naturaleza proteica de estos catalizadores
biolgicos. Desde entonces se han identificado varios miles de enzimas diferentes,
habindose aislado muchos de ellos en forma cristalina.
En el mismo perodo J.B.S. Haldane expuso la idea de que los enzimas establecen
tres interacciones dbiles con el sustrato para distorsionarlo y catalizar as su
transformacin; esta idea result capital para el moderno conocimiento de la accin
enzimtica.
Realmente quien pudo afirmar que las enzimas eran de origen proteico fue John
Howard Northrop consigui obtener pepsina(enzima digestiva) en forma pura
y cristalizada. Consigui cristalizar la tripsina y la quimotripsina en colaboracin
con Moses Kunitz en el transcurso de sus investigaciones sobre substancias
generadoras (es decir, sobre los precursores inactivos de las enzimas), aisl
el pepsingeno y el tripsingeno.
En 1946, John Howard Northrop y Wendell Meredith Stanley por la representacin
fiel de las enzimas y viru-proteinas.
En 1981, se descubri que determinados tipos de RNA pueden catalizar su propia
sntesis, hecho este que oblig a revisar algunas de las ideas preexistentes acerca
de la naturaleza de los biocatalizadores. En la actualidad se considera que, con la
excepcin de un reducido grupo de molculas de RNA con propiedades catalticas,
los enzimas son protenas, y como tales, exhiben todas las propiedades inherentes
a este grupo de biomolculas. Los pesos moleculares de las protenas enzimticas
oscilan desde unos 12.000 daltons hasta ms de un milln.

7
 4. MARCO TEORICO

4.1. Enzimas
Existen dos clases de protenas, las catalticas conocidas como enzimas y las
estructurales. La mayora de las reacciones qumicas no tendran lugar a una
velocidad apreciable sin los catalizadores, los catalizadores de las reacciones
qumicas biolgicas son protenas llamadas enzimas, es decir, las enzimas
disminuyen la energa de activacin de las reacciones que llevan a cabo en sistemas
biolgicos.
Las enzimas son biocatalizadores con alta selectividad y especificidad, debido a su
poder cataltico estas pueden incrementar de 108 a 1020 veces la velocidad a la que
las reacciones qumicas ocurren, la especificidad de una enzima est determinada
por el centro activo de la enzima1. Si una enzima se desnaturaliza o se disocia en
sus subunidades, la actividad cataltica suele desaparecer, las enzimas son muy
especficas para las reacciones que catalizan, es decir cada enzima cataliza
solamente un nico tipo de reaccin qumica o, en el caso de algunas enzimas, una
clase de reacciones estrechamente relacionadas es por esto que las enzimas son
clasificadas de acuerdo a el tipo de reacciones que catalizan.

4.1.1. Nomenclatura de enzimas

La mayora de las enzimas han sido nombradas con el sufijo asa seguido del
nombre del sustrato en el cual esta realiza su funcin cataltica; como en el caso de
la ureasa que es la encargada de catalizar la hidrolisis de la urea con produccin de
amoniaco y CO2. As mismo, hay enzimas para las que esta nomenclatura no es la
conveniente, debido a que no ofrece mucha informacin qumica; algunas de ellas
son: la tripsina, la pepsina, y la catalasa. Sin embargo, como el nmero de enzimas
iba aumentando esta clasificacin ya no era tan eficiente, por lo que se ha
implementado una clasificacin sistemtica de las enzimas segn recomendaciones
de una comisin internacional de enzimas. Este sistema divide a las enzimas en
seis clases principales, cada una de ellas se divide a su vez en subclases y stas
en sub-subclases atendiendo al tipo de reaccin catalizada. Cada enzima es
determinada de tres modos:

1) Un nombre recomendado, generalmente corto y usual.

2) Un nombre sistemtico que identifica la reaccin que cataliza.

1
Franklin, B. (2006). Captulo 1: Las enzimas. In: A. Nelson, ed., Principios de Bioqumica, 1st ed. Barcelona: Omega

8
 3) Un nmero de clasificacin, que se emplea cuando se precisa una
identificacin inequvoca de la enzima.
Esquematizacin de un ejemplo para nombrar una enzima:
ATP + CREATINA ADP + FOSFOCREATINA
Nombre recomendado: CREATIN-KINASA
Nombre sistemtico: ATP: CREATIN FOSFOTRANSFERASA
Nmero de clasificacin: EC 2.7.3.2.

En el nmero de clasificacin EC es la abreviatura de Comisin de Enzimas; el

primer dgito (2) indica la clase a la que pertenece el enzima, en este caso la clase
transferasas; el segundo dgito (7) indica la subclase (fosfotransferasas); el tercer
dgito (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con grupo nitrogenado como aceptor);
el cuarto dgito (2) identifica inequvocamente al enzima en cuestin.2

4.1.2. CLASIFICACIN INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS

Oxido-reductasas (reacciones de xido-reduccin)

Transferasas (Transferencia de grupos funcionales)
Hidrolasas (Reacciones de hidrolisis)
Liasas (Adicin a los dobles enlaces)
Isomerasas (Reaccin de isomerizacin)
Ligasas (Formacin de enlaces)

4.2. COFACTORES ENZIMATICOS

La actividad cataltica de las enzimas est restringida por las propiedades de los
grupos funcionales de los aminocidos del centro activo, por lo tanto, los cofactores
son molculas necesarias para algunas enzimas, cuando los cambios qumicos no
pueden ser producidos por los residuos de los aminocidos, el cofactor puede ser
un ion metlico, o una molcula orgnica llamada coenzima; estos son los
encargados de que la reaccin se lleve a cabo; algunas enzimas requieren de los

2
componentes moleculares de las clulas. (2016). Enzimas: cintica e inhibicin. [en lnea] disponible en:
https://noxservices.files.wordpress.com/2015/03/capitulo-08.pdf [13 Jun. 2016]

9
dos. El complejo enzima-cofactor catalticamente activo recibe el nombre de
holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la protena restante, que por s misma
es inactiva catalticamente, se designa con el nombre de apoenzima. 3.

HOLOENZIMA= APOENZIMA + COFACTOR

Grupos funcionales de coenzimas

cido pantotnico
cido lipoico
Biocitina
NAD/NADH+
Tiamina pp
Cobalamina
FMN/FMNH

Caractersticas generales de las coenzimas

Bajo peso molecular

Termoestables
Baja concentracin en las clulas
Pueden ser compartidos por muchas enzimas diferentes
Puede modificarse y no recuperarse en la misma reaccin
Son heterociclos o ciclos con electrones muy mviles
Poseen una extraordinaria reactividad
La mayora son de origen vitamnico

CLASIFICACIN DE COENZIMAS
Criterio nutricional: si son de origen vitamnico o no vitamnico

Criterio funcional: se encuentra las coenzimas de transporte de grupo y coenzimas

de transporte de electrones
Criterio enzimolgico: segn el tipo de reaccin en que participan.

3
mural.uv. (2016). Bioqumica. [en lnea] disponible en: http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/bioquimica/Tema4.pdf [13
Jun. 2016].

10
CARACTERSTICAS DE LOS COFACTORES METLICOS

Presentan elevada concentracin de carga positivas

Poseen valencias dirigidas
Pueden existir en dos o ms estados de valencia
Los ms importantes cofactores son los metales de transicin (Mn, Fe, Zn,
Co, Mo, Cu). (i3)

4.3. FUNCIONAMIENTO ENZIMATICO

ENERGA DE ACTIVACIN
Para lleve a cabo una reaccin qumica, expresada tambin como la reordenacin
de los tomos de los reactivos en productos se requiere la rotura previa de los
enlaces qumicos de los reaccionantes; dicha rotura requiere energa y es
denominada la energa de activacin esta es la mnima cantidad de energa
requerida para iniciar una reaccin qumica.

CATALIZADOR
Es una sustancia que disminuye la energa de activacin de una reaccin, por
consiguiente, aumenta la velocidad de una reaccin. Los catalizadores facilitan las
reacciones, pero ellos mismos no se consumen ni se modifican durante la reaccin.
Es importante destacar que los catalizadores no producen cambios en el equilibrio
de una reaccin, sino que afectan solo la velocidad con la que estas ocurren.4.
Como se haba definido anteriormente las enzimas son catalizadores biolgicos que
disminuyen la energa de activacin de las reacciones que catalizan, pero no
modifican la constante de equilibrio, por tanto, aceleran en igual proporcin la
velocidad de la reaccin en las dos direcciones.

4
Madigan, M., Martinko, J. and Parker, J. (2016). Biologa de los microorganismos. 10th ed. Madrid: PEARSON, Capitulo 5:
Nutricin, cultivo y metabolismo microbiano.

11
 Fig.1 La presencia de una enzima provoca
una disminucin de la Energa de Activacin

Los catalizadores de las reacciones biolgicas son protenas llamadas enzimas.

Las enzimas son muy especficas para las reacciones que catalizan. Es decir, cada
enzima cataliza solamente un nico tipo de reaccin qumica o, en el caso de
algunas enzimas, una clase de reacciones estrechamente relacionadas. Esta
especificidad se debe a la estructura tridimensional de la molcula de la enzima. En
una reaccin catalizada enzimticamente, la enzima se combina temporalmente son
el reaccionante, que se denomina sustrato (S) de la enzima, para formar un
complejo enzima-sustrato. Luego, cuando ocurre la reaccin, el producto (P) se
libera y la enzima (E) vuelve a su estado original 4.

CATALISIS ENZIMTICA
Para catalizar una reaccin especfica, una enzima debe realizar dos cosas: (1)
unirse al sustrato adecuado y (2) colocar el sustrato de modo preciso para que
interaccione con los grupos catalticos del sitio activo de la enzima. La unin de la
enzima y el sustrato acarrea la formacin del complejo enzima-sustrato.

12
 Fig.2 Representacin del ciclo cataltico de una enzima

4.4. CINTICA ENZIMTICA

La cintica enzimtica hace referencia a la velocidad de reaccin en presencia de
una enzima. Estas reacciones se ven afectadas por algunos factores como5:

Concentracin del sustrato.

PH
Temperatura

CONCENTRACION DEL SUSTRATO

Es uno de los principales factores que afecta la velocidad de este tipo de reacciones.
No obstante medir directamente cual es el efecto de la concentracin es algo
complejo ya que el sustrato se va a consumir poco a poco para transformarse en
producto lo que ocasiona que su concentracin cambie constantemente. Para
facilitar estos experimentos se mide la velocidad inicial V 0. Esta medida se debe a
que en los primeros segundos de reaccin la variacin del sustrato es muy baja, as

5
Gonzlez Maas, J. (2016). Enzimas. Cintica enzimtica. [En lnea] Ehu.eus. Disponible en:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e [10 Jun. 2016].

13
que se puede asumir constante. Seguido a esto se puede encontrar el valor de V 0
en funcin de la concentracin del sustrato [S] previamente establecida.

FIGURA 3. Efecto de la variacin de la

concentracin de sustrato [S] sobre la V0 cuando
se mantiene constante la concentracin de
enzima

A concentraciones de sustrato relativamente bajas, V0 aumenta casi linealmente

con el incremento de (S). A mayores concentraciones de sustrato, V0 aumenta a
incrementos cada vez menores en respuesta a incrementos de (S). Finalmente, se
alcanza un punto ms all del cual se dan incrementos muy pequeos de V 0 a
medida que aumenta (S). Esta meseta es la velocidad mxima, Vmax

La curva que se aprecia en la figura, corresponde a la relacin entre (S) y V0 que

se cumple en la mayora de las enzimas, se puede expresar matemticamente
mediante la ecuacin de Michaelis-Menten. Ellos la dedujeron a partir de la hiptesis
de que el paso limitante de velocidad en las reacciones enzimticas es la
descomposicin del complejo ES para formar el producto y el enzima libre. La
expresin es:
[]
=
+ []

6
Nelson, D. and Cox, M. (2009). Principios de bioqumica de LEHNINGER. 5th ed. OMEGA, p.195.

14
Km: constante de Michaelis
Al linealizar esta expresin se obtiene:
1 1
= +
[]

1
Cuya pendiente es: y el intercepto es

FIGURA 4. Grfico de dobles recprocos o de Lineweaver-Burk

PH

En las enzimas hay una importancia en cuanto al PH en el que se encuentran. Esto

se debe a que algunas cadenas laterales de aminocidos pueden actuar como
cidos o bases dbiles que desarrollan funciones crticas en el sitio activo de la
enzima que deben tener un cierto estado de ionizacin.7

TEMPERATURA

La velocidad de reaccin de la enzima aumenta al aumentar la temperatura, pero

a temperaturas muy altas la formacin de producto disminuye con el tiempo; esto
se debe desnaturalizacin de la enzima.

7
Effect of pH, Temperature, and High Pressure on Enzymatic Activity. (2015). How Enzymes Work, pp.53-74.

15
TABLA 1. Enzimas vs Catalizadores Qumicos

ENZIMAS CATALIZADORES QUIMICOS

Son producidos por organismos vivos. Son producidos por el hombre, muchos de ellos se
encuentran en la tierra de forma natural.

Estn conformadas por protenas en gran mayora. Compuestos generalmente metales como el TiO2.

Tiene un sitio activo por enzima. El sitio activo depende del rea superficial

Disminuye la energa de activacin. Disminuye la energa de activacin

No altera el balance energtico de las reacciones (las No son consumidos en la reaccin sera un
enzimas no son consumidas en la reaccin) catalizador ideal.

Gran eficiencia gracias a su especificidad. Su eficiencia depende de muchos factores, rea de

contacto, tipo de reaccin, reaccionantes.
Catalizan muchas reacciones (todas las que pueden El catalizador cumple su funcin en determinada
ocurrir en nuestro cuerpo) reaccin.

Fciles condiciones de operacin. Las condiciones de operacin deben ser especficas

es decir temperatura, presin, concentracin entre
otras.

El uso de complejos multi-enzimaticos no debe haber El uso de mltiples catalizadores se utiliza en

interacciones entre ellas. reacciones consecutivas no al mismo tiempo.

Qumica verde. Algunos de estos son contaminantes

Bajo costo. Hay diversidad de precios algunos como los que se

encuentran en el convertidor cataltico de
automviles son muy costosos como el Rodio,
Platino y Paladio.

No se satura la enzima. Se saturan en algn momento se acaban o se

desgastan con el tiempo.

4.5 INHIBICIN ENZIMATICA

Los inhibidores son molculas o iones que interfieren en la velocidad de la reaccin
hacindola ms lenta ya que compiten con el sustrato por el sitio cataltico.
Hay dos tipos de inhibidores enzimticos reversible e irreversible.
Las irreversibles se unen covalentemente a la enzima sin posibilidad alguna de
deshacer la unin, por lo general son sustancias toxicas sus efectos dependen del
tiempo que acten el inhibidor.

16
Las reversibles como su nombre lo dice est sujeto a una posible separacin
despus de haberse unido sustrato enzima.

TIPOS DE INHIBICIN
Empezaremos describiendo la inhibicin reversible la cual a su vez tiene otras
subdivisiones competitiva, no competitiva y mixta.

4.4.1. INHIBICIN COMPETITIVA

Unin del inhibidor al centro activo del enzima, compite con el sustrato, el inhibidor
tiene mucha similitud en forma con el sustrato por esta razn hay competicin por
que la enzima reconoce tambin el inhibidor.

FIGURA 5. Inhibicin Competitiva

La inhibicin competitiva disminuye la posibilidad de que el sustrato se una con la
enzima por que el inhibidor est ocupando ese lugar para superar este obstculo la
mejor opcin es aumentar la concentracin de sustrato para que la probabilidad de
encontrar ms rpido el sitio activo sea mayor, haciendo menor la probabilidad del
inhibidor en encontrar el sitio activo.
De esta manera tambin aseguramos que el Km aumente.

17
 8

FIGURA 6. Inhibicin Competitiva

La velocidad mxima se mantiene constante con o sin inhibidor, sin embargo, el Km

aumenta, como observamos el intersecto 1/VMax siempre permanece contante para
cualquier concentracin de inhibidor todas las lneas intersectan el mismo punto y.

4.4.2. INHIBICIN NO COMPETITIVA

Cuando el inhibidor y el sustrato no tienen la misma forma y por tanto no compiten

por el sitio activo, en este caso si se ve afectada la velocidad.

FIGURA 7. Inhibicin acompetitiva

La dificultad que presenta este tipo de inhibicin es que no se supera aumentando
la concentracin de sustrato, para este caso lo que se podra hacer es aumentar la
cantidad de enzima, pero esto depende de que tan econmica me salga para mi
proceso, la otra opcin est en inhibir el inhibidor.

8
3 uah. (2016). Parmetros que influyen en la velocidad de reaccin enzimtica. [en lnea] disponible en:
http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/temas/tema-9_inhibicion-enzimatica.pdf [10 Jun. 2016].

18
Este tipo de inhibicin no competitiva no me modifica el Km si no me afecta es la
velocidad.

FIGURA 8. Inhibicin acompetitiva

4.4.3. INHIBICIN MIXTA

Intermedio entre la inhibicin competitiva y no competitiva. Es un tipo de inhibicin

donde reduce su actividad, pero no afecta la unin con el sustrato, Con este tipo de
inhibicin Km crece y Vmax decrece.

FIGURA 9. Inhibicin mixta

9
Cardell Rosales, L. (2007). Bioqumica humana. La Habana: Ciencias Mdicas, captulo 6: Biocatalizadores .

19
El inhibidor (que no tiene que parecerse al sustrato) no se une al sitio activo, pero
tiene un efecto competitivo. Son excluyentes la actividad final depende de cul de
los dos prevalezca.

FIGURA 10. Inhibicin mixta

Podemos observar el efecto tanto en la velocidad como en el Km.

4.5. APLICACIONES

Las enzimas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, entre las
que se destaca la alimenticia. En algunos casos, como la obtencin de yogur, o la
produccin de cerveza o de vino, el proceso de fermentacin se debe a las enzimas
presentes en los microorganismos que intervienen en el proceso de produccin.10
Uno de los objetivos de los tratamientos textiles modernos es obtener el efecto
deseado en las fibras utilizando procesos que conlleven el mnimo impacto
ambiental. Dentro de este contexto, se comenzaron a utilizar diversos procesos
biotecnolgicos, mediante el empleo de enzimas. Estas cumplen el requisito de ser
respetuosos con el medio ambiente (debido a que las enzimas son biodegradables),
actan sobre molculas especficas y actan bajo condiciones suaves.11

10
Enzimas. (2010). [Blog] evidenzima.blogspot.com. Disponible en: http://evidenzima.blogspot.com.co/p/aplicaciones-
industriales.html [1 Jul. 2016].
11
Marketizer.com, Q. (2008). El uso de enzimas en la industria textil | QuimiNet.com. [en lnea] Quiminet.com. Disponible
en: http://www.quiminet.com/articulos/el-uso-de-enzimas-en-la-industria-textil-30326.htm [7 Jul. 2016].

20
TABLA 2. Uso de enzimas en la industria de alimenticia.12

INDUSTRIA ENZIMAS USOS

Lctea Tripsina Fabricacin de leche deslactosada, evita
Lactasa la cristalizacin de leche concentrada.
Quesera Quimosina(renina) Coagulacin de las protenas de la leche
Lactasa (casena).
Lipasa Influencia en el sabor y aceleracin de la
maduracin
Helados Lactasa Evita la textura arenosa provocada por
Glucosa- la cristalizacin. Permite la utilizacin de
isomerasa jarabes de alta fructosa.
Crnica Papana Ablandamiento de carnes.
Fiscina Produccin de hidrolizados.
Bromelina
Panificacin Amilasa Mejora la calidad del pan.
Proteasa Disminuye la viscosidad de la pasta.
Lipoxidasa Produce una miga muy blanca.
Lactasa Mejora la coloracin de la superficie.
Cervecera Amilasas Usadas para licuar la pasta de malta.
Papana Evitan la turbidez durante la
Pepsina conservacin de ciertos productos.
Vinificacin Pectinasas Mejoran la clarificacin y extraccin de
Glucosa-oxidasa jugos.
Evitan el oscurecimiento y los
desagradables.
Bebidas no Pectinasas Mejoran la clarificacin de jugos.
alcohlicas Glucosa- Conservacin de la glucosa en fructosa
isomerasa (jarabes de alta fructosa).
Tannasa Aumenta la solubilidad y disminuye la
Glucosa-oxidasa turbidez del t.
Evita el oscurecimiento y los sabores
desagradables.

Los detergentes constituyen una de las principales reas de aplicacin industrial de

enzimas. As, tanto en la formulacin de los detergentes para la ropa como para
lavavajillas se incluyen enzimas para facilitar la eliminacin de determinados restos
de suciedad. Actualmente tambin se utilizan enzimas en algunos productos para
la limpieza de las lentes de contacto o para la limpieza de dentaduras.

12
Porquebiotecnologia.com.ar. (2016). Biotecnologa. [en lnea] Disponible en:
http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=54 [9 Jun. 2016].

21
Las amilasas (alfa, beta y glucoamilasas) son reconocidas hoy en da en la
biotecnologa como una de las ms importantes familias de enzimas, tienen una
gran cantidad de aplicaciones en la ciencia y la industria, as como la licuefaccin
del almidn para obtener azucares, el desencolado de tejidos y preparaciones para
detergentes.
En la industria de detergentes se han realizado estudios para mejorar los problemas
que presentan al utilizarse en los procesos industriales, por ejemplo, la
desactivacin trmica en las condiciones de lavado con el detergente, una de las
enzimas ms usadas en detergentes es la -amilasa

22
 5. DESACTIVACIN TERMICA DE UNA -AMILASA COMERCIAL DE
BACILLUS LICHENIFORMIS UTILIZADA EN DETERGENTES.13

[Thermal deactivation of a comercial -amylase from Bacillus

licheniformis used in detergents]

5.1 DISEO METODOLGICO

La enzima que se investig para la aplicacin de nuevas formulaciones de

detergentes fue una -amilasa comercial de origen bacteriano (bacillus
licheniformis) de la casa NOVOZYMES A/S Termamyl 300 L Type DX, esta viene
en forma lquida con una densidad de 1.2 g/cm3. Esta enzima se utiliza
especficamente en formulaciones de detergentes para lavanderas y lavavajillas.
Presenta una actividad de 300 KNU/g, donde 1 KNU (Kilo Novo Unit) es la cantidad
de enzima que hidroliza 4870 mg (en base seca) de almidn por hora en condiciones
estndar pH=7, T=37C y Ca2+ 0.0003M.

Para llevar a cabo el experimento fueron fijadas unas condiciones de temperatura

de 60,65,70,75 C y pH 7.5 (0.1M solucin reguladora de fosfato). La concentracin
inicial de almidn de patata fue de 1g/L. Para el seguimiento de la reaccin
enzimtica se utiliz un procedimiento basado en el mtodo yodomtrico el cual
describe la actividad de las amilasas descrita por Fuwa.

La reaccin se lleva a cabo en tubos de ensayo roscados cerrados sumergidos en

un bao termostatizado a partir de un volumen de mezcla reaccionante de 5 mL, la
disolucin de enzima se prepar por dilucin de la enzima hasta la concentracin
deseada con una disolucin reguladora de fosfato 0.1M (pH = 7.5) y la de almidn
0.5% (p/v), tambin con disolucin reguladora de fosfato 0.1M (Ph=7.5). Para
asegurarse de una completa solubilizacin del almidn se llev la disolucin a
ebullicin durante 3 minutos; posteriormente se enfri a temperatura ambiente con
agua. Para los experimentos sin tiempo previo se le aadi al tubo de ensayo 1mL
de disolucin de almidn y 3.95 mL de una disolucin reguladora de fosfato 0.1 M
(pH = 7.5), se atempera a la temperatura de reaccin durante 10 minutos y se aadi
0.05 mL de disolucin de enzima y se deja reaccionar el tiempo deseado. Para los
experimentos con tiempo previo se aade al tubo de ensayo 0.05 mL de disolucin
de enzima con 3.95 ml de la disolucin reguladora de fosfato 0.1M (pH = 7.5), luego
se sumergi el tubo en un bao termostatizado a la temperatura de reaccin y se
dej transcurrir el tiempo previo requerido para el experimento, a continuacin, se
aadi 1mL de disolucin de almidn y se dej reaccionar el tiempo deseado.

13
Rodrguez, V., Alameda, E., Gallegos, J., Requena, A. and Lpez, A. (2006). Thermal deactivation of a commercial -
amylase from Bacillus licheniformis used in detergents. Biochemical Engineering Journal, 27(3), pp.299-304.

23
La parada de la reaccin y medida de la concentracin del almidn se realiz de
acuerdo con el mtodo propuesto por Paolucci-Jeanjean. Transcurrido el tiempo de
reaccin deseado, se ajusta con HCl 0.5 N el pH de la mezcla reaccionante de 3.4
hasta 3.9 y se sumerge inmediatamente el tubo en un bao de agua fra a 5C; una
vez enfriada el tubo fue introducido en agua hirviendo durante 10 minutos y despus
se enfri nuevamente a 5C y finalmente el pH de la mezcla se ajust a 6-6.5 con
NaOH 0.1 N. Una vez desactivada la enzima el contenido del tubo de ensayo se
traspasa a un matraz aforado de 250 mL y se aade 200mL de agua destilada y
5mL de disolucin 0.2% I2 2% KI. Transcurrido 10 minutos se midi en
espectrofotmetro la absorbancia a 575 nm. Esta medida permite obtener la
concentracin de almidn sin hidrolizar. La medida de la muestra problema se
realiza frente a un blanco que nicamente contiene I 2-KI y tampn en las mismas
concentraciones que la mezcla problema.

Para cada condicin de operacin se prepararon al menos dos tubos de ensayo

independientes para comprobar la concentracin inicial de sustrato se prepararon
dos tubos de ensayo anlogos a los de la mezcla reaccionante, pero sin enzima y
se someten al mismo tratamiento experimental. La concentracin inicial del almidn
Si, ser la media de ambos tubos.

5.2. MTODOS

MTODO YODOMTRICO

Para el seguimiento de la reaccin y medida de la actividad enzimtica en

ausencia de tensoactivos se utiliz un procedimiento basado en el mtodo
yodomtrico de medida de actividad de amilasas descrito por Fuwa. El
mtodo yodomtrico est basado en la capacidad que tiene la amilosa para
ligar yodo dando lugar a un complejo de color azul cuya absorbancia puede
medirse espectrofotomtricamente. Este mtodo fue utilizado por su relativa
sencillez y economa.

EQUIPOS NECESARIOS

Espectrofotmetro UV
Bao termostatizado
Bao generador de agua fra

REACTIVOS

Disolucin 0.2% I2- 2% KI

Disolucin del almidn soluble 0.5% (p/v)
HCl 0.5 N

24
 NaOH 0.1 N
Disolucin reguladora de fosfato
Enzima

5.3. RESULTADOS

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA: DESACTIVACIN TRMICA

Inicialmente se realizaron dos series de experimentos, a 65 y 75C, a pH de 7.5,

con una concentracin inicial de almidn S i, de aproximadamente de 1 g/L a
diferentes concentraciones iniciales de enzima comercial, e0: 6.9*10-4, 4.6*10-4,
3.45*10-4, 2.3*10-4 y 1.15*10-4 g/L y a diferentes tiempos de reaccin de 0, 5, 10, 15,
20 y 30 min.
Si se representan los resultados obtenidos para cada temperatura en un grfico de
x frente a e0 *tr, puede resultar que los puntos experimentales se agrupen en una
lnea nica, lo que indicara o que no existe desactivacin (y= e 0 t r) o que la
reaccin de desactivacin es de segundo orden, o bien puede resultar lneas
distintas para cada valor de e0, lo que indicara desactivacin con un orden distinto
a 2. Dado que existen pequeas variaciones en Si (0.95-1.11 g/L) y en algn caso
las conversiones a tiempo 0, x0, fueron distintas de 0 aunque con desviaciones muy
pequeas (x0 0.035), en vez de representar la x en el eje de ordenadas se utilizo
Si*(x- x0) para corregir las pequeas diferencias que puedan existir entre los
experimentos.

FIGURA. 10 Influencia del producto de la concentracin inicial de enzima por

tiempo de reaccin sobre la conversin.

Se puede observar en la FIG. 1 que para las dos temperaturas ensayadas los puntos
se alinean en una nica tendencia y por tanto o no hay desactivacin o bien que el
orden de la reaccin de la desactivacin de segundo orden. Para comprobar si

25
existe desactivacin se pueden realizar experimentos con tiempo previo, t p, es decir,
mantener la enzima durante un tiempo previo a la reaccin a la temperatura de esta;
posteriormente se compararon los resultados para una misma concentracin inicial
de enzima y diferentes tiempos de previos. Para este fin se realiz un experimento
a un pH fijo de 7.5 a las temperaturas de 60, 65, 70 y 75C y diferentes tiempos de
reaccin tr: 0, 5, 10, 15, 20 min. Los resultados obtenidos para los distintos tiempos
previo tp, ensayados se pueden observar en la FIG. 2.

FIGURA 11. Influencia del producto de la concentracin inicial de enzima por

tiempo de reaccin sobre la conversin a 60, 65, 70 y 75C para distintos
previos.
.
Para todas las temperaturas ensayadas se puede observar que existen tendencias
diferentes dependiendo del tiempo previo, lo que indica que se produjo la
desactivacin de acuerdo con los resultados con los experimentos realizados sin
tiempo previo indica que el orden de dicha desactivacin debe ser muy prximo a
2.

26
FIGURA 12. Influencia de la intensidad de tratamiento sobre la conversin
considerando la desactivacin a 60, 65, 70 y 75C.
En la figura se observa que todos los datos experimentales se ajustan
satisfactoriamente a una lnea recta, concluyndose que los parmetros cinticos
de desactivacin trmica determinados para la enzima estudiada nos permiten
ajustar los datos experimentales satisfactoriamente a las diferentes temperaturas
ensayada. Finalmente se realiz un ajuste tipo Arrhenius de la constante de
desactivacin trmica en funcin de la temperatura, resultando una energa de
activacin E, de 172 kJ/mol y un factor pre exponencial, A, de 2.01*10 28 (g/L*min).

27
 6. CONCLUSIONES

Al implementar enzimas tipo amilasas en formulaciones de detergentes se evidencia

un aporte de numerosas ventajas, como el ahorro de energa, reduccin de otros
componentes que son ms perjudiciales para el medio ambiente, adems se
pueden obtener a partir de fuentes renovables y actan sin poner en riesgo la vida
acutica o tener un efecto negativo en el tratamiento de aguas residuales.
Se ha desarrollado una nueva metodologa de estudio de la desactivacin trmica
de enzimas, basada en la realizacin de experimentos integrales, tiempo de
reaccin tr, pero manteniendo las disoluciones de enzima a la temperatura de
reaccin durante diferentes tiempos previos tp, que permite obtener el orden de la
desactivacin n, y la constante de desactivacin trmica kd.
Con los valores de las energas de activacin y de los factores preexponenciales de
la ecuacin de Arrhenius para los tres parmetros cinticos, KM, k y kd se ha
comprobado que el modelo cintico propuesto ajusta satisfactoriamente los
resultados experimentales obtenidos a las temperaturas ensayadas de 37, 55, 65 y
75 C, alas que se alcanzan conversiones de hasta 0.95.

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 7. BIBLIOGRAFA
Franklin, B. (2006). Captulo 1: Las enzimas. In: A. Nelson, ed., Principios de Bioqumica, 1st ed. Barcelona:
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