Preparacin de un frotis bacteriano

Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o

cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos
habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que
la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin
bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo
menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que
pudiera haber.

REALIZACIN DEL FROTIS

1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra,
ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de
agua, que resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad
del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la
mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede
bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los
dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el
porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no
calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse.

FIJACIN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos.
Dejar enfriar el porta entre los pases.
5. Con metanol (para bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de
metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su
canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de
metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el
proceso de tincin.

TINCIN DEL FROTIS BACTERIANO

6. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que
indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos.
 En ocasiones el colorante tie slo en caliente, por lo que el tiempo que dure su
actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del
mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no
llegue a hervir ya que se producira la destruccin de las clulas.
7. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se
realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte
superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido
directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la
mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con
cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.
8. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningn caso se debe
frotar el porta.
9. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si se
quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersin.

MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIN

La tcnica siguiente es de aplicacin para cualquier preparacin microscpica que se

desee montar de forma definitiva. Se anotar en un extremo del portaobjetos el contenido
de la preparacin, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno.
10. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones
mantenindolos un mnimo de 5 minutos en cada bao. La serie de alcoholes
puede modificarse en funcin de la disponibilidad de los reactivos, pero el
objetivo es que la preparacin quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el
reactivo antes de introducirlo en el siguiente bao.
a. Alcohol de 70
b. Alcohol de 95
c. Acetona pura
d. Acetona-xilol (1:1)
e. Xilol
11. Montar la preparacin. Emplear blsamo de Canad, euparal o algn medio de
montaje sinttico. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.
 Observacin de bacterias
OBJETIVOS

1. Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras

naturales.
2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se
recomienda una u otra.
3. Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos
de agrupaciones que existen.
4. Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del
aceite de inmersin.
MATERIAL

Mechero Bunsen o de alcohol Colorantes para tincin:

a) Solucin de cristal violeta al 1%
Asa de siembra o aguja b) Solucin de safranina al 0,5%
enmangada c) Azul de metileno al 1%
Pinzas Microscopio y aceite de inmersin
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen
natural: yogur, vinagre, sarro
dental, suelo, etc.

BACTERIAS DEL YOGUR

El yogur es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la leche. A escala
industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4% de una
asociacin de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de
cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta
preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianas distintas (cocos y
bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Adems,
el tamao del lactobacilo (unos 30m de longitud) facilita la observacin aunque no se
tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio.
1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota
de agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
4. Observar al mximo aumento del microscopio.

BACTERIAS DEL VINAGRE

El vinagre es una solucin acuosa rica en cido actico resultante de la fermentacin
espontnea del vino o de bebidas alcohlicas de baja graduacin. La acetificacin del
vino es producida por bacterias aerbicas del cido actico, principalmente Acetobacter
aceti, aunque tambin Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares.
1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin de madre de vinagre
natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado.
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis.
3. Dejar secar y fijar con calor.
4. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.

BACTERIAS DEL SARRO DENTAL

El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los
dientes. Est constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias
junto con sus productos metablicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy
variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la
preparacin, pero suelen abundar bacterias saprfitas, pudindose observar gran variedad
de morfologas: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.
1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro dental y disolverla
en una gota de agua sobre el portaobjetos.
2. Dejar secar y fijar con calor.
3. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.

BACTERIAS DEL SUELO

La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prcticamente
infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso,
desconocidas para los microbilogos. Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con
dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de
un jardn. Despus de varios das, las bacterias se habrn adherido al vidrio y slo habr
que fijarlas por calor y teirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar
los bordes del portaobjetos, as como la parte que no se va a teir.
 Tincin Gram
Microscopio Frasco lavador
Portaobjetos Mechero de alcohol
Cubreobjetos Papel de filtro
Asa de siembra Cristal violeta
Cubeta de tincin Lugol
Cultivo bacteriano Alcohol-acetona
Pinzas Safranina

REALIZACIN
1. Preparar los frotis bacterianos.
2. Teir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la
preparacin deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teir con safranina 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparacin.
11. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.
Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la
batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias
respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los
tiempos.
En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen
hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los
tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan
mientras duren esos colorantes son fiables.
Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es
mucho ms caro.
 Tincin de esporas
Microscopio Pinzas
Portaobjetos Frasco lavador
Cubreobjetos Mechero de alcohol
Asa de siembra Papel de filtro
Cubeta de tincin Verde Malaquita
Cultivo bacteriano Safranina
REALIZACIN
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima
de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante
5 min. Aadir ms colorante si la muestra se seca.
3. Lavar con agua el resto de colorante.
4. Teir con safranina 1 min.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Secar la preparacin.
7. Observar la preparacin al microscopio.
 Gemacin de levaduras
MATERIAL

Microscopio Agua azucarada

Portaobjetos Aguja enmangada
Cubreobjetos Lactofenol-safranina
Levadura

TCNICA
1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta
que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada.
2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.
3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensin acuosa
de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se
consigue una doble finalidad:
o Ver mejor las clulas de las levaduras, teidas por la safranina.

o Retrasar un poco el desprendimiento de las clulas hijas gracias a la accin

desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.
RESULTADOS
Las siguientes fotos han sido obtenidas a partir de preparaciones teidas con azul de
metileno y no con lactofenol-safranina.
 Observacin microscpica de hongos
OBJETIVOS

1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de

mohos.
2. Observar la morfologa de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no
septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan
MATERIAL

Microscopio Trozo enmohecido de fruta o pan

Portaobjetos y cubreobjetos (22x22
mm) muy limpios y desengrasados
con alcohol
Aguja enmangada o lanceta
o un cultivo de hongos
Solucin de lactofenol al azul
algodn
Cinta adhesiva transparente

PREPARACIN EN FRESCO DE MOHOS

TCNICA
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado
grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado
gruesa. Realizar la misma operacin en otro portaobjetos que se usar para lavar
la muestra.
2. Tomar el material a observar en una mnima cantidad con agujas finas o lancetas
procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de
uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el
exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver
lo que realmente interesa, los conidiforos.
3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que ser
ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas
tapizadas en su interior por los conidiforos), se aplastarn stos ligeramente
sobre la gota o se seccionarn con un bistur.
4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede
amontonado.
5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se
formen burbujas entre los dos vidrios.

PREPARACIN EN CINTA ADHESIVA

TCNICA
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado
grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado
gruesa.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.
3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan
enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central
de una colonia puede haber una excesiva concentracin de esporas.
4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.
5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.