Manual de Microbiologia I Medicina 2014 PDF

}
2,014
Manual de prcticas de
Microbiologa I
Elaboracin
Elaboracin
Licda. Eyda Menda de Campollo (QB)
Licda. Ana Ester Barrientos (QB)
Revisin
Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramrez (QB, MA)
Licda. Isabel Cristina Gaitn Fernndez (QB, MA)
1
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano
REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA I
1. El alumno deber ingresar al laboratorio con equipo de seguridad:

Bata blanca hasta la rodilla y de manga larga (con su respectivo nombre y el logo
de la universidad bordado).
Gafas de seguridad.
2. Para tener derecho a ingresar al laboratorio, el alumno debe entregar al inicio de cada
prctica:
Cuaderno completo de laboratorio con los aspectos solicitados para la prctica.
Reporte de la prctica anterior.
El laboratorio inicia puntualmente, no se permitir el ingreso tarde bajo ninguna

excusa. NO SE REPONDR LABORATORIO POR NINGN MOTIVO
3. El alumno no podr ingresar al laboratorio si:
Si tiene el cuaderno incompleto o hay evidencia de copia entre dos o ms

compaeros de laboratorio, de lo contrario tendr inasistencia aunque haya
firmado la lista de asistencia.
4. En el laboratorio est prohibido el ingreso de:

Celulares, localizadores, reproductores de msica o cualquier otro artefacto
(iPod, iPad, Laptops, tablets etc.) que pueda interferir con la atencin del
estudiante.
Comida y bebidas.
Gorras, suteres o chumpas que no sean del uniforme.
Mochilas, bolsos, u otro accesorio que no sea requerido por el docente. Todas las
pertenencias deber dejarlas en el los casilleros de la entrada del rea de
laboratorio.
5. En las prcticas no se puede ingresar al laboratorio con uas acrlicas, joyera.
6. Las personas con cabello largo deben recogerlo con una cola o gancho (no fleco).
7. El alumno es responsable del material que recibe, mantenindolo limpio y en perfecto

estado a lo largo de cada prctica. Deber realizar una requisicin del material antes
de iniciar la prctica y al finalizar ser revisado por las licenciadas a cargo.
2
8. En caso de que el estudiante dae parcial o totalmente un material, deber firmar un

vale con su nombre, nmero de puesto, descripcin del material daado, fecha y
firma, comprometindose a reponer el material durante las dos prcticas siguientes,
de no hacerlo perder el derecho a ingresar al laboratorio. NOTA: El estudiante
deber estar solvente al momento de realizar los exmenes parciales y el final de
laboratorio.
9. Los alumnos sern responsables de dejar los reactivos cerrados y sin contaminar por
otros, las mesas limpias y en orden, lo mismo que el equipo que sea utilizado durante
la prctica.
10. Es necesario que cualquier persona que se encuentre dentro de las instalaciones del
laboratorio se comporte de forma adecuada, cumpliendo con el reglamento y las
normas de seguridad requeridas (Prctica No. 1).
3
ASPECTOS A EVALUAR
1. PLANIFICACION
Generalidades para presentar el cuaderno
El cuaderno debe ser:
De pasta dura, tamao media carta de 80 hojas con lneas (no espiral).
Forrado con plstico sin color en particular.
Identificado en la primera hoja
El cuaderno de laboratorio contiene las siguientes secciones:
Seccin Contenido Valor (pts)

Indicar claramente el nmero, ttulo y la fecha en que se
Encabezado ---
llevar a cabo la prctica de laboratorio.
Deber de escribir los objetivos de cada prctica, para
Objetivos familiarizarse con el contenido que se espera aprender en 5
cada una de ellas.
Realizar una representacin grfica del procedimiento que
Diagrama de flujo se llevar a cabo en el laboratorio en forma clara y 10
resumida.
Para todos los reactivos utilizados en la prctica deber
indicar en una tabla:
Toxicidad por contacto en piel
Toxicidad por contacto en ojos:
Toxicidad por inhalacin:
Toxicidades
Toxicidad por ingestin: 5
Es de vital importancia incluir los efectos de exposicin,
forma de aplicar primeros auxilios y la forma adecuada
de desecho. Si existen reactivos que se repitan en
diferentes prcticas, deber escribir esta informacin cada
vez que ste se repita.
Se realizarn las tablas que contengan la informacin
Tablas de generada durante la prctica, as como los dibujos que se
resultados y consideren necesarios. Estos resultados servirn para
dibujo de realizar el informe de laboratorio. Para poderse retirar el
observaciones alumno deber presentarlos, y sern sellados por el
instructor
Se calificar el orden, legibilidad de la escritura, limpieza y
Presentacin ---
que el cuaderno est al da.
Nota total del cuaderno de laboratorio 20 pts
NOTA: No puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultneos.
4
Debe escribir con lapicero azul o negro y con letra legible, los dibujos deben de pintarse y
describirse segn se indique en cada prctica.
El cuaderno se calificar al iniciar cada prctica de laboratorio.
2. DESARROLLO DE LA PRCTICA DE LABORATORIO

Antes de poder realizar cualquier trabajo dentro del laboratorio, el estudiante
deber demostrar fehacientemente que tiene el conocimiento necesario para poder llevar
a cabo la prctica. Para ello se realizar un examen corto al inicio de cada prctica.
Durante el desarrollo de la prctica el docente evaluar los siguientes aspectos:
atencin, orden, limpieza y capacidad y disposicin para seguir instrucciones. Las faltas
graves, especialmente las que puedan poner en riesgo la salud y seguridad de los dems,
puede ameritar el retiro temporal o definitivo de un estudiante, teniendo cero en la prctica
completa.
Toda expulsin del laboratorio es contada como inasistencia, aunque el estudiante
ya haya firmado la lista de asistencia.
El examen corto ser sobre el contenido de la prctica y tendr un valor de 30
puntos.
3. REPORTE DE LABORATORIO
La principal forma de evaluacin del trabajo hecho durante el laboratorio, as como
la comprensin obtenida despus de realizada la prctica, es el reporte de laboratorio. En
l se evidencia el nivel de comprensin y la calidad de trabajo realizado por el estudiante.
Es necesario que muestre tanto una buena redaccin como una buena ortografa.
Como futuros profesionales de las ciencias mdicas, es importante que los estudiantes
ejerciten y mejoren su habilidad de redaccin de informes, ya que es parte de la formacin
de todo profesional.
Generalidades para presentar el Reporte:
Hojas tamao carta impresas en dplex
Letra tipo Arial, tamao 11 a espacio cerrado (1,0)
El reporte de laboratorio incluye las siguientes secciones:
5
Valor
Seccin Contenido
(pts)
Debe mostrar toda la informacin de identificacin del
estudiante y de la prctica.
Encabezado
REPORTE No. X Fecha de entrega ---
NOMBRE DE LA PRCTICA
Nombre y Apellido, carn, seccin y nmero de puesto.
Debe expresar en forma clara y breve los objetivos, as como
los resultados y conclusiones ms importantes de la prctica,
Resumen 5
deber redactarse en tiempo pasado e impersonal. Mximo 10
lneas.
Se deber buscar informacin relacionada al tema de la
prctica, el cual servir tambin para reforzar el conocimiento
Marco Terico 5
adquirido durante la misma.
Deber de tener por lo menos dos pginas y no exceder de 3
Se solicita que esta seccin se presente en cuadros tabulados
de fcil lectura, a manera que la interpretacin sea de fcil
entendimiento para cualquier otra persona que no haya estado
en el desarrollo de la prctica. Cada cuadro debe tener nmero,
ttulo que lo describa y fuente de donde se obtuvo la
Resultados informacin. 10
NO se aceptan datos, clculos y resultados escritos a mano.
De presentarlos as, se calificar con un cero esa seccin.
En el caso de realizar dibujos estos deben de estar descritos,
pintados y sealados en caso de que en cada uno hayan
distintas estructuras
Es un anlisis e interpretacin de los resultados obtenidos,
contrastando con lo descrito en la teora. El estudiante puede
poner en prctica el aprendizaje que haya obtenido. Debe
Discusin de explicar su experimento en base al principio qumico estudiado,
10
Resultados utilizando un lenguaje tcnico-cientfico y redaccin adecuada.
Adems, debe discutir sobre las posibles fuentes de error
involucradas en la prctica y posibles formas de mejorar la
ejecucin y rendimiento de la misma.
Responden a los objetivos y se derivan de los resultados
obtenidos, no deben ser muy extensas.
Conclusiones Como regla, no se puede concluir teora ni aspectos que no 10
hayan sido incluidos en la discusin.
Debern colocar por lo menos 3 conclusiones
Responder las interrogantes planteadas al final de cada prctica
Cuestionario 5
en el manual de laboratorio.
Referencias Presentar segn los lineamientos del curso de Metodologa de
5
la Investigacin.
Nota total del reporte de laboratorio 50
6
NOTA: Algunas secciones no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega

puntos, sin embargo su ausencia s resta puntos de la nota del reporte de laboratorio.
Los estudiantes que no lleguen al da de la lectura de los cultivos, NO podrn entregar
reporte, aunque hayan elaborado otras partes de la prctica.
OBSERVACIONES IMPORTANTES
El reporte de laboratorio debe ser entregado en el periodo de laboratorio de la
siguiente prctica.
No se calificarn reportes sin nombre.
No se recibirn reportes parcial o totalmente escritos A MANO.
No se recibirn reportes tardos ni en formatos electrnicos (correo electrnico o
traslado por USB).
El reporte debe entregarse engrapado (no clips).
Toda aquella persona que se haya ausentado o haya sido retirada por cualquier
motivo de una prctica, NO TIENE DERECHO a entregar el informe respectivo,
sin importar si la falta haya sido justificada. Sin embargo, esto no quiere decir
que el alumno se libere de la evaluacin del tema de la prctica durante las
pruebas parciales y final del laboratorio.
Los reportes se corregirn y devolvern en la semana siguiente a la entrega del mismo.
Si algn alumno tiene cualquier duda o reclamo sobre la forma en que se ha calificado su
reporte, debe hablar con su instructor DENTRO DE LA PRIMERA SEMANA despus de
haberlo recibido corregido NO AL FINAL DEL SEMESTRE. No se aceptarn reclamos
posteriores.
IMPORTANTE:
Se tomar como falta grave (nota 0) cualquier indicio de plagio:
Reproduccin no autorizada de una publicacin, palabra por palabra, incluyendo
internet),
Copia total o parcial del contenido del reporte por parte de dos o ms alumnos (la
sancin aplica a todos los estudiantes involucrados). Todo caso quedar
documentado, y una reincidencia puede significar el retiro definitivo del
laboratorio.
7
DISTRIBUCIN DE LA ZONA DE LABORATORIO
Rubro a evaluar Punteo

Prcticas de laboratorio y hojas de trabajo 20
Examen final de laboratorio (incluye todo el contenido
5
estudiado en el laboratorio)
Total nota de Laboratorio 25
-
Rubro a evaluar por prctica Punteo neto Porcentaje
-
Examen Corto 0.30 30 %
-
Cuaderno 0.20 20 %
-
Reporte 0.50 50 %
Total Prctica Individual 1.00 100 %
8
CALENDARIZACIN DE PRCTICAS
No. Nombre Fecha

0. Instrucciones generales del laboratorio 14 y 15 de enero
1. Bioseguridad y buenas prcticas de laboratorio 21 y 22 de enero
2. Uso adecuado del microscopio 28 y 29 de enero
3. Presencia de microorganismos y coloracin simple 4 y 5 de febrero
4. Tcnicas de aislamiento y recuento bacteriano 11 y 12 de febrero
5. Tinciones especiales 18 y 19 de febrero
Gram, Ziehl-Neelsen, cpsula y esporas
6. Cultivo y aislamiento de bacterias anaerbicas. 25 y 26 de febrero
cultivo de garganta
7. Correlacin de resultados en el laboratorio de (terica) 4 y 5 de marzo
Primeros exmenes parciales 11-15 de marzo
8. Prueba de identificacin de cocos gram positivo 18 y 19 de marzo
9. Examen en fresco de orina y urocultivo 25 y 26 de marzo
10. Examen de heces y coprocultivo 1 y 2 de abril
11. Pruebas bioqumicas para la identificacin bacteriana 8 y 9 de abril
Asueto de Semana Santa 14-19 de abril
12. Antibiograma: Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos 22 y 23 de abril
Segundos exmenes parciales 28-30 de abril
Asueto: Da del trabajo 1 de mayo
Segundos exmenes parciales 2 y 3 de mayo
13. Lectura e interpretacin de resultados obtenidos con los 6 y 7 de mayo
medios de cultivo
14. Poder bactericida 13 y 14 de mayo
Preparacin para feria Cientifca 20 y 21 de mayo
Repaso 28 y 29 de mayo
Examen final de laboratorio 3 y 4 de junio
9
INDICE
Pgina
11
Prctica 1. Introduccin, normas de bioseguridad y
buenas prcticas de laboratorio
16
Prctica 2. Uso adecuado del microscopio
21
Prctica 3. Presencia de Microorganismos y Coloracin Simple
Prctica 4. Tcnicas de aislamiento bacteriano y recuento bacteriano 28
Prctica 5. Tinciones especiales: 34

Tincin de Gram, Ziehl Neelsen y cpsula
41
Prctica 6. Cultivo y aislamiento de bacterias anaerbicas:
Cultivo de garganta
47
Prctica 7. Correlacin de resultados de laboratorio de Microbiologa
53
Prctica 8. Pruebas de identificacin de cococs gram positivo
60
Prctica 9. Examen de orina en fresco y urocultivo
Prctica 10. . Examen de heces en fresco y coprocultivo 67
Prctica 11. Pruebas bioqumicas para la identificacin bacteriana 73
Prctica 12. Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos 78
Prctica 13. Lectura e interpretacin de resultados obtenidos con los 82

medios de cultivo
Prctica 14. Poder bactericida 87
Repaso 92
10
INTRODUCCIN, NORMAS DE BIOSEGURIDAD Y

BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO
Practica 1
1. Introduccin
Se conoce como bioseguridad al conjunto de medidas preventivas destinadas a
reducir o eliminar los riesgos por agentes biolgicos, fsicos o qumicos a que se expone
el personal, as como a proteger a la comunidad y al medio ambiente. Las buenas
prcticas de laboratorio (o GLP, good laboratory practices) son una buena herramienta de
apoyo para la ejecucin del trabajo rutinario en el laboratorio. Es imprescindible, adems,
familiarizarse con los insumos necesarios para el desarrollo y cumplimiento de las Normas
de Bioseguridad y para la implementacin de las buenas prcticas de trabajo.
2. Objetivos
Que el estudiante
Conozca las normas de bioseguridad y sus implicaciones en el desempeo del
trabajo del laboratorio.
Se familiarice con el desarrollo y cumplimiento de las normas de bioseguridad, y
as garantizar su seguridad y la de sus compaeros.
Aprenda a trabajar en forma disciplinada, ordenada y con mucha limpieza dentro
del laboratorio.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante aprender los conceptos fundamentales del
Sistema de Bioseguridad y la importancia que tienen dentro del trabajo del
laboratorio, adems de su aplicacin en el qu hacer del trabajo profesional.
El estudiante se familiarizar con la ejecucin y cumplimento de buenas prcticas
de laboratorio y sus aplicaciones en cada uno de los procedimientos que hacen
efectivo el trabajo del laboratorio y aprenda con propiedad la ejecucin de buenas
prcticas, especialmente en el rea de Microbiologa.
4. Antecedentes
Los laboratorios de Microbiologa constituyen un medio ambiente de trabajo especial,
generalmente nico, que puede presentar riesgos de enfermedades infecciosas
identificables para las personas que se encuentran en o cerca de ellos. Durante todo el
transcurso de la historia de la Microbiologa, las infecciones se han contrado en el
laboratorio. Los informes publicados hacia fines del siglo pasado, describieron casos de
tifoidea, clera, brucelosis y ttano, adquiridos en el laboratorio. Y se ha considerado que
la exposicin a aerosoles infecciosos ha sido la fuente de infeccin ms comn.
11
Las GLP surgieron con el objetivo de disminuir los accidentes e incidentes en el

laboratorio y de mejorar el manejo de los datos generados en el rea de trabajo.
Principios similares a los de GLP, pero con mayor nfasis en el enfoque cientfico fueron
desarrollados en 1978 por la OECD (Organizacin para la Cooperacin Econmica y el
Desarrollo, por sus siglas en ingls). La norma ISO 17025 est orientada prioritariamente
al concepto cientfico detrs del trabajo del laboratorio. La certificacin obtenida con esta
norma se extiende especficamente por mtodo de anlisis. Claro est que para que el
mtodo sea certificado, el entorno de los laboratorios debe cumplir con los requisitos de
calidad necesarios.
5. Materiales y Equipo
Asas de platino Marcadores permanentes
Bolsas plsticas rojas (para (provisto por los estudiantes)
descarte de material Masking tape
contaminado) Mecheros Bunsen
Cajas de petri Pizetas con alcohol al 70%
Frascos plsticos de boca ancha Pizetas con cloro al 0.5%
Gradilla para tubos Torundas de algodn
Lminas cubreobjeto Tubos con agua destilada
Lminas portaobjeto Tubos pyrex con desinfectante y
Lpiz (provisto por los arena
estudiantes) Tubos pyrex de vidrio, tapa
rosca
6. Procedimiento
PARTE I. Normas de bioseguridad
Escuche con atencin la presentacin de Normas de Bioseguridad dentro del
laboratorio de Biologa.
Anote la informacin que crea necesaria para la elaboracin del informe de
laboratorio
RECUERDE QUE LOS ERRORES HUMANOS, LAS TCNICAS INCORRECTAS

Y EL MAL USO DE LOS EQUIPOS PROVOCAN LA MAYOR PARTE DE
ACCIDENTES E INFECCIONES EN LOS LABORATORIOS.
Manipulacin de muestras
Tanto los procedimientos en la extraccin, toma, conservacin y transporte
(interno o externo) de la muestra, son considerados como factores de riesgo para
todo el personal involucrado en dicha tarea.
En todos estos procedimientos deben llevarse puestos los guantes
La toma de muestra de sangre debe estar a cargo de una persona
experimentada.
12
Recipientes para muestras

stos pueden ser de vidrio o de plstico.
De fcil rotulacin
Deben ser resistentes y evitar fugas o derrames.
El exterior debe estar perfectamente limpio.
Apertura de paquetes
Deben abrirse sobre una bandeja
Notificar inmediatamente si el recipiente est roto o con fugas
Todo el personal debe estar enterado de los riesgos que se corren en esta rea
de trabajo.
Manejo de tubos
Todos los tubos que contengan muestra deben taparse inmediatamente
Si son enviados a otro laboratorio, deben transportarse dentro de un recipiente
secundario
Debe utilizarse guantes en la apertura de tubos
Debe utilizarse el dedo meique al momento de destaparlos
NUNCA se debe tocar la boca ni las superficies externas ni internas del tubo con
los implementos de trabajo cuando se extrae muestras del tubo
La apertura se realiza frente a un mechero
Se anota la fecha de trabajo
Manejo de cajas de petri

NUNCA debe olerse el contenido de las cajas
NO deje las cajas abiertas y expuestas al aire
Rotule la parte de debajo de la caja, incluyendo: Nombre del paciente, nmero
de muestra, fecha de la siembra
Si va a referir la caja con muestra, selle toda la orilla de la misma con masking
tape (o papel Parafilm)
La caja ya inoculada se coloca boca abajo dentro de la incubadora
Si la caja va a guardarse en el refrigerador, debe introducirse en una bolsa
Ziploc, siempre boca abajo y debidamente rotulada
13
Antes de inocular las cajas de petri, revise la superficie del medio y verifique la
ausencia total de crecimiento bacteriano no deseado (contaminacin)
Verifique la fecha de vencimiento del medio de cultivo
Manejo de lminas portaobjetos

Tome las lminas por las orillas
Cuando realice un frotis, utilice nicamente el centro de la misma,
aproximadamente un tercio de la superficie.
No deje al descubierto la preparacin
Fije la muestra a la lmina, despus que sta se ha secado
No utilice lminas rayadas para efectuar las preparaciones
Utilice, de preferencia, lminas nuevas, limpias y desengrasadas
Rotule la lmina con nmero correlativo o bien con los datos del paciente, antes
de realizar la preparacin
Despus de coloreadas las lminas, gurdelas en una caja, y guarde la caja en
un lugar seco y libre de insectos y roedores
Hay material que an despus de haber sido fijado y/o coloreado en la lmina
sigue siendo infecciosos
PARTE II. Buenas prcticas de laboratorio

Practique la ejecucin de buenas prcticas de laboratorio con los materiales
proporcionados para el efecto
Anote en su cuaderno detalladamente cada una de las buenas prcticas.
Acceso limitado al laboratorio
Lavado de manos luego de manipular materiales viables, al quitarse los guantes
y antes de retirarse del laboratorio
No comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar
alimentos para uso humano, dentro del laboratorio
Manejo seguro de objetos punzocortantes
Procedimientos realizados con precaucin, para minimizar la creacin de
salpicaduras o aerosoles.
Las superficies de trabajo se descontamina como mnimo dos veces, al inicio y al
final de la jornada de trabajo.
Todos los cultivos, muestras y otros materiales ya utilizados, que se consideren
como desecho, debe ser descontaminados antes de ser desechados fuera del
laboratorio.
14
Notificar de inmediato cualquier tipo de accidente e incidente suscitado en el

laboratorio.
7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad

Lavarse las manos despus de realizar cualquier tarea dentro del laboratorio de
microbiologa.
La limpieza, el orden y la disciplina deben ser fundamentales en el desarrollo de
la prctica
NINGN EQUIPO DE PROTECCIN SUSTITUYE EL CUIDADO,

ORDEN Y PRECAUCIN QUE DEBE TENER CADA ESTUDIANTE
AL REALIZAR SU TRABAJO.
8. Cuestionario
a. Investigue sobre la Norma de Bioseguridad, dependiendo del tipo de bacteria a
trabajar dentro del laboratorio.
b. Investigue los niveles de bioseguridad existentes y los requerimientos para cada
uno de ellos.
c. Investigue tipos de accidentes ocurridos en el laboratorio pro el NO
cumplimiento de las normas de bioseguridad y la NO ejecucin de buenas
prcticas dentro del laboratorio.
9. Formato de presentacin de resultados

microbiologa.
La limpieza, el orden y la disciplina deben ser fundamentales en el desarrollo de
la prctica
10. Bibliografa de referencia

Richmond, J. Seguridad en el laboratorio de Microbiologa y Biomdica. Primera
Edicin en espaol. CDC. Atlanta, Georgia. Pg. 1-4 y 13-14.
Lobos, H y Garca, J. 1983. Procedimientos y tcnicas de laboratorio. Vol. 1.
San Francisco, Editorial Universitaria. Pg. 82-87.
15
USO ADECUADO DEL MICROSCOPIO

Practica 2
1. Introduccin
El Microscopio es un instrumento hecho a base de lentes que ha permitido a los
hombres poder llevar a cabo estudios en aquellos individuos y clulas que no pueden
verse a simple vista. La microscopa data del siglo XVII, aunque antes de esa fecha se
sospechaba de la existencia de criaturas que no podan ser observadas a simple vista.
Uno de los aspectos relevantes en el uso de Microscopio, se debe al uso del objetivo
de inmersin, el cual utiliza un medio lquido que rellena el espacio entre el objeto y el
objetivo se le denomina lquido de inmersin. El ndice de refraccin de ste es prximo al
del vidrio (se utiliza agua, glicerina, aceites cedral y de enebro, monobromonaftalina, etc.)
En la figura se muestra el papel del lquido:
En el sistema "seco" el flujo luminoso se limita por el ngulo slido U y en el lado

sumergido por el ngulo Um, donde Um>U. De esta forma con la misma intensidad de
iluminacin e igual abertura del condensador, la imagen se ver mucho mejor con el
objetivo de inmersin que en "seco".
Adems esto asegura al microscopio un mayor poder separador.
PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

Sistema ptico
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del
objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin y ampla la imagen.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecnico
SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
16
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.

CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular,
binocular.
REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite al girar, cambiar
los objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y
micromtrico que consigue el enfoque correcto
Con el desarrollo y uso apropiado del Microscopio, en los ltimos tres siglos, se ha
permitido ampliar el campo de las investigaciones, convirtindose en el instrumento
bsico para abrir nuevas fronteras a la ciencia.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Conozca e identifique las partes de un Microscopio compuesto y sus funciones.
Adquiera habilidad en la utilizacin eficiente del Microscopio.
Comprenda la utilidad que tiene el Microscopio, en el campo de investigacin.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante aprender el uso adecuado del Microscopio y su
importancia dentro del campo de la investigacin.
Aprender a manejarlo adecuadamente y se familiarizar con cada una de las
partes y sus bondades.
17
4. Antecedentes
Hooke y Malpighi, emplearon lentes simples en el estudio de caractersticas
estructurales de ciertos micro objetos. En 1664 Hooke describi las estructuras de los
mohos.
Pero la persona que vio con cierto detalle los microorganismos fue un holands
aficionado de nombre Antn Van Leeuwenthoek, quien utiliz los microscopios simples,
realizados por el mismo. Entre 1673 y 1716 Leeuwenthoek, fabric lentes compuestos y a
partir del siglo XIX el Microscopio fue perfeccionando, hacindolo cada vez ms
sofisticado, hasta llegar a la actualidad, con el Microscopio electrnico.
En 1931 Knoll y Ruska fabricaron el primer microscopio electrnico, cuyo
perfeccionamiento en 1950 permiti la observacin de tejidos; esto facilit la comprensin
de las relaciones estructurales y funcionales de los compuestos supra-macromoleculares
y los diferentes niveles de organizacin biolgica.
En la segunda mitad del siglo XX, se increment en forma significativa el nmero de
conocimientos relacionados con la estructura celular y molecular asociadas a su funcin,
desde 1858 en que Virchow emiti el enunciado: Las clulas son la unidades
estructurales y funcionales de la vida y por lo tanto las unidades estructurales de la
enfermedad. Lo cual, aunado a los grandes avances tecnolgicos permiti vincular en
forma sustentada la Biologa, Bioqumica, Histologa, Gentica e Inmunologa y desarrollar
disciplinas tales como la Biologa Celular y Molecular a partir de las cuales se ha
profundizado el concepto de salud y enfermedad.
Bolsas para descarte de basura. Microscopio compuesto.
Cloro al 5 % Papel limpia lentes.
Cubre objetos. Papel mayordomo.
Desinfectante Alcohol 70 % Papel peridico
Frascos con aceite de Pinzas (con o sin dientes)
inmersin. Porta objetos.
Goteros con agua destilada. Tijeras.
Granos de polen. Trozo de tela.
Lminas ya preparadas (Frotis Un cabello
sanguneos y de colonias
bacterianas)
6. Procedimiento
PARTE A
Para transportar el Microscopio de un lugar a otro, utilice ambas manos,
sujetndolo por el soporte con una mano y sostenindole la base con la palma de
la otra mano, llevndolo siempre en posicin vertical.
Verifique que el microscopio est en el lugar correcto
Asegrese que el objetivo de menor aumento, est en posicin para observar
sobre la platina.
18
Si no est haga girar el revolver, haga descender la platina hasta el mximo y

mueva el tornillo macromtrico, para bajar el tubo del microscopio hacia la platina
lentamente.
Conecte la fuente de luz, observe a travs del ocular, hasta observar el crculo de
luz sin sombra (abra y cierre el diafragma si es necesario).
Anote las partes del microscopio y su funcin (en el cuaderno de trabajo,
ayudado con un dibujo).
PARTE B.
Haga las observaciones de las siguientes preparaciones:
Preparacin # 1: En un portaobjeto, coloque un pedazo de papel (1 cm.
cuadrado) que tenga impresa una letra asimtrica, agregue una gota de agua
destilada y coloque el cubre objeto.
Ponga la preparacin sobre la platina y sbala con el tornillo macromtrico, hasta
observar el objeto a travs del lente ocular.
Afine la imagen utilizando el tornillo micromtrico ajuste la intensidad de luz,
abriendo y cerrando el diafragma, hasta lograr una visin clara.
Esquematice y anote sus observaciones correspondientes.
Preparacin # 2: Repita los procedimientos a partir del inciso a al d pero con un
trozo de tela, como muestra a observar.
Preparacin # 3: Con granos de polen: sacudiendo las anteras de un flor sobre el
portaobjeto limpio, agregando agua destilada y coloque el cubre objeto, elimine el
exceso de agua con el papel absorbente.
Cambie a objetivo seco fuerte, observe y esquematice.
Preparacin # 4: Repita los procedimientos como indica el inciso f y g,
nicamente utilizando como muestra un cabello.
A una lmina ya preparada, agregue una gota de aceite de inmersin y coloque
sobre la platina, enfoque con el seco dbil y luego cambi al lente de inmersin.
Al terminar retire la preparacin.
Apague la fuente de luz.
Limpie el ocular y los objetivos con papel limpia lentes.
Gire el revlver y deje el microscopio en seco dbil.
Descienda la platina,
Desconecte el microscopio.
Ponga la funda correspondiente.
Djelo en la mesa de trabajo
19

Procure dejar el Microscopio en el mismo sitio.
Economice la vida de la lmpara, asegurndose de ejecutar la iluminacin
correcta.
No permita que cidos, lquidos o aceites ensucien el microscopio.
Nunca utilice lentes de mayor aumento, sin cubrir la preparacin con un cubre
objeto.
Nunca deje el objetivo de inmersin lleno de aceite, use papel limpia lentes, con
movimientos suaves y circulares para su limpieza, especialmente al final de su
uso.

Esquematice las observaciones realizadas de cada una de las lminas.
Responda el cuestionario.
9. Cuestionario
Resuelva las siguientes preguntas:
a. Cuando utiliz el microscopio, las imgenes se observaron derechas o
invertidas?
b. Cuando movi el tornillo hacia la derecha, izquierda, abajo y arriba, hacia
dnde se desplaz la imagen?
c. Por qu razn las muestras que se observan en el microscopio compuesto
deben ser delgadas y utilizar un medio de montaje?
d. Explique las razones porque NO deben tocarse los lentes de un microscopio
con los dedos.
e. Investigue sobre las buenas prcticas en el uso de microscopio.
f. Investigue sobre los diferentes tipos de microscopios y su utilizacin.
10. Bibliografa
Cortes Jos A. El microscopio ptico compuesto. 2001 ltima modificacin:
2005. Disponible en: http://www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm
20
PRESENCIA DE MICROORGANISMOS
Y COLORACIN SIMPLE
Practica 3
1. Introduccin
Una caracterstica importante de las bacterias es la
ubicuidad. Esto significa que estn presentes en todo lugar
dentro de la Biosfera. Existen bacterias adaptadas a ambientes
en los cuales ninguna otra forma de vida sobrevive. Se afirma
que las bacterias son la forma de vida ms antigua, simple y
numerosa. Son organismos unicelulares y en muchos casos se
agrupan en colonias. A pesar de que habitan por millones a
nuestro alrededor, slo es posible verlas con ayuda de un
microscopio y de tcnicas especficas de tincin y aislamiento.
2. Objetivos
Que el estudiante
Compruebe la presencia de microorganismos en diferentes superficies.
Adquiera habilidad en el manejo de medios de cultivo para determinar la
presencia de ciertos microorganismos.
Explique la importancia de trabajar con asepsia en un laboratorio de
microbiologa.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante lograr comprobar la presencia de microorganismos, en
todas las superficies y medios. Podr evidenciar cuenta de la convivencia de ellos con l,
por ejemplo sobre su piel o cuero cabelludo. Con lo cual podr deducir la importancia y
desarrollar habilidades para trabajar aspticamente en el laboratorio de Microbiologa
con lo cual lograr garanta de calidad en el trabajo de Laboratorio.
4. Antecedentes
Regularmente relacionamos microorganismos con enfermedad o suciedad, lo cual es
cierto porque en ambos casos es muy probable o seguro encontrar microorganismos
patgenos. Sin embargo la mayora de microorganismos son inocuos y no slo eso sino
que desempean roles indispensables dentro de los ecosistemas. Tienen una
impresionante diversidad de formas y pueden existir en un amplio rango de hbitats y
condiciones ambientales. Pueden vivir dentro de numerosos organismos as como sobre
sustratos no vivos.
Se estima que el organismo humano alberga unos 100 billones de bacterias de unas
cuatrocientas especies distintas y un nmero ms pequeo de virus, hongos y protozoos.
La mayora de ellos son comensales, ya que viven con nosotros sin causar dao. Su
nmero, as como la variedad de especies, cambian continuamente. En cada momento,
21
cada uno de nosotros posee un espectro particular e individualizado de microorganismos.

Muchas especies bacterianas que proliferan en la luz del colon no son cultivables en el
laboratorio, aunque pueden reconocerse con el microscopio. Los mtodos de biologa
molecular sugieren que cada individuo alberga una proporcin importante de variedades
bacterianas no identificadas que constituiran hasta un 20 o 30% de su microbiota. Se
denomina Microbiota Mixta Normal (MMN) al conjunto de todos estos microorganismos
comensales que no producen enfermedades y habitan en la piel, las cavidades que tienen
contacto con la superficie de nuestro cuerpo o el tracto gastrointestinal.
Es importante tambin considerar que algunos microorganismos que constituyen la
MMN pueden daar la salud si se alteran las condiciones fisiolgicas, si los
microorganismos aumentan su virulencia o si se introducen en reas estriles (libres de
microorganismos) del cuerpo.
Asas en aro. Marcador permanente para
Bao mara a 50 C. vidrio.
Bolsas para descarte de basura. Mechero de Bunsen.
Cajas de petri, estriles. Microscopio compuesto
Colorantes: azul de metileno y Papel limpia lentes.
safranina. Papel mayordomo.
Erlenmeyer de 100 ml con agar Paquetes de gasa estril
nutritivo Porta objeto.
Frascos con aceite de Tubos con agua destilada estril
inmersin. Tubos con arena y
Gradilla de alambre. desinfectante.
Hisopos estriles. Varillas de vidrio para coloracin
Incubadora a 37 C
Lentes de proteccin.
6. Procedimiento
Determinacin de la presencia de microorganismos.
Preparacin de las cajas de petri.
Trabajar el procedimiento frente a la llama del
Mechero Bunsen y sin hablar.
Quitar con mucho cuidado el empaque exterior de cada
una de las cajas de petri, sin destapar directamente la
caja.
Cada estudiante deber apilar las cajas a la izquierda
del mechero, dejando hacia arriba la tapadera de
mayor tamao.
Colocar los erlenmeyer conteniendo el agar nutritivo frente a la llama del
mechero.
(Asegrese de que el medio de cultivo est totalmente lquido, para verterlo)
22
Retirar el camo y el papel de cada uno de los erlenmeyer.

Retirar el tapn de gasa, y flamear con cuidado la boca del erlenmeyer.
Tomar una caja con la mano izquierda, colocarla frente al mechero y destaparla
parcialmente.
Verter aproximadamente 20 ml del medio en la primera caja de petri con la mano
derecha.
Tapar inmediatamente la caja de petri.
Trasladar la caja debidamente tapada, a la derecha del mechero con la mano
izquierda, evitando agitar el contenido de la caja.( No la aleje ms de 50 cm. de
distancia de la llama del mechero)
Flamear de nuevo la boca del erlenmeyer.
Repetir el mismo procedimiento desde el inciso g hasta el k con las restantes
cajas de petri.
Con la mano izquierda, destapar parcialmente la caja de petri, sin soltar la
tapadera superior.
Con la mano derecha, tomar el mechero y pasar muy suavemente la llama sobre
la superficie del medio, hasta eliminar toda burbuja que hubiera quedado en la
superficie del medio.
Tapar inmediatamente la caja de petri con mucho cuidado.
Dejar solidificar el medio por trmino de 30 minutos.
Toma de muestras.
Muestra representativa del ambiente.
Rotular la caja con un trozo de masking-tape indicando el tipo de muestra y la
fecha.
Quitar la tapa superior de la caja y djela expuesta al aire del laboratorio durante
15 minutos
Cubrirla de nuevo e incubar a 37o C por 48 horas.
Muestra de superficies.
Rotular la caja indicando el tipo de muestra y la fecha.
Con el marcador trazar una lnea divisoria a la mitad del fondo exterior de la caja.
Remover el forro de un hisopo estril y frotar la superficie de su mesa de trabajo.
Con la mano izquierda, tomar la parte inferior de la caja que contiene el medio de
cultivo.
Con la mano derecha, tomar el hisopo e inocular la muestra en uno de los lados
de la muestra.
23
Identificar con el marcador la parte posterior del lado de la caja donde se inocul.
Remover el forro de un hisopo estril y frotar una superficie de la mesa de trabajo
que no haya sido desinfectada.
Con la mano izquierda, tomar la parte inferior de la caja que contiene el medio de
cultivo.
Con la mano derecha, tomar el hisopo e inocular la muestra en el otro lado de la
caja.
Identificar con el marcador la parte posterior del lado de la caja donde se inocul.
Tapar la caja y colocarla en la incubadora a 37 o C durante 48 horas.
Muestra de mano
Con el marcador trazar una lnea divisoria a la mitad del fondo exterior de la caja.
Levantar la tapa de la caja y tocar el lado derecho de la superficie del agar con la
yema de los dedos, tapar inmediatamente la caja.
Lavarse las manos con abundante agua y jabn y frotar fuertemente los dedos.
Secar la yema de los dedos de una mano, con gasa estril y repetir el mismo
procedimiento, en el otro lado de la caja.
Tapar e incubar a 37 C por 48 horas.
Coloracin Simple
Preparacin del frotis.
Colocar una gota de agua destilada estril, en el centro de una lmina limpia,
desgrasada y debidamente identificada.
Remover el tapn del tubo de cultivo Streptococcus sp. conservndolo en el dedo
meique. Flamear la boca del tubo.
Introducir el asa estril (flameada y fra).en el tubo con cultivo y rozarla
suavemente el rea con crecimiento bacteriano.
Flamear la boca del tubo y taparlo de nuevo.
24
Colocar el tubo en la gradilla.

Con el asa cargada, realice un pequeo crculo dentro de la gota de agua. Dejar
secar al ambiente.
Limpiar el asa dentro del erlenmeyer con arena., introduciendo el asa varias
veces.
Flamear el asa.
Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
Fijar la muestra pasando el frotis varias veces por la llama del mechero.
Coloracin de la muestra
Colocar las lminas sobre el soporte para colorear (de alambre o vidrio).
Cubrir la lmina de Streptococcus sp con azul de metileno y la de Staphylococcus
sp con safranina.
Dejar reposar 5 minutos.
Escurrir el colorante y lavar la lmina con agua del chorro.
Dejar escurrir y secar cuidadosamente a temperatura ambiente.
Observacin al Microscopio
Observar utilizando el objetivo de inmersin.
Anotar los resultados obtenidos y dibujar lo observado en el microscopio.
Lectura de Cultivos
Leer los resultados de medios de cultivo 48 horas despus de realizadas la siembras.
Para cada una de las muestras anotar el nmero y tipo de colonias presentes. Comparar
resultados entre muestras.

a. Lvese las manos despus de realizar cualquier tarea dentro del laboratorio de
microbiologa.
b. Todo material empleado en las prcticas microbiolgicas, se descarta en las
bolsas rojas.
c. No dejar por ningn motivo, cajas, tubos o cualquier otro material contaminado, en
lugares que no correspondan al rea de trabajo.
25
8. Cuestionario
a. A qu se refiere el trmino Tcnica asptica ?
b. Por qu no se debe hablar durante los procedimientos de determinacin de
presencia de microorganismos?
c. Por qu se debe dejar los cultivos 48 horas en la incubadora?
d. Por qu en la mayora de muestras se obtuvo un recuento bacteriano tan bajo?
e. Cules son las bacterias consideradas MMN para la piel humana?
f. Qu son los medios de enriquecimiento?
g. Investigue sobre las buenas prcticas en un laboratorio de microbiologa.
h. Investigue sobre los microorganismos utilizados en la prctica.


Murray. Patrick y colaboradores.2004. Microbiologa Mdica 4ta Edicin. Madrid
Espaa. .El SEVIER Sciencie.Mosby.
Lobos y Garca M. 1983, Procedimientos y tcnicas de laboratorio. 2da.Edicin.
Volumen I. Santiago de Chile. Editorial Universitaria.
26
27
TCNICAS DE AISLAMIENTO BACTERIANO Y RECUENTO

BACTERIANO
Prctica 4
1. Introduccin
Para demostrar la presencia de una bacteria
patgena y lograr su completa identificacin es necesario
en primer lugar obtener una muestra del paciente, del
rea o medio contaminado. Sin embargo en pocos casos
se obtendr cultivos bacterianos puros, ya que
regularmente las bacterias existen en poblaciones mixtas.
Es necesario, entonces, obtener un cultivo puro. Se
trata de separar una especie bacteriana de todas las
dems que comparten su hbitat para poder estudiar sus
caractersticas culturales, morfolgicas y fisiolgicas con
lo cual lograr una adecuada identificacin.
Uno de los mtodos ms importantes para la
identificacin de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El Medio
de Cultivo es el material alimenticio en el que crecen los microorganismos. Al
crecimiento de los microorganismos se le denomina Cultivo. En distintos laboratorios de
Microbiologa se ha preparado ms de 2,000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunirse varias condiciones propicias, entre ellas: temperatura, humedad, presin de
oxgeno y pH. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de microorganismos contaminantes en todas sus formas.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Explique el principio en el que se basa el aislamiento, identificacin y crecimiento
de las bacterias, en diferentes caldos y medios de cultivo.
Desarrolle habilidad en el manejo de los diferentes caldos y medios de cultivo.
Enumere las ventajas que aporta el uso de cada uno de ellos y su utilidad
diagnstica.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante lograr una idea completa de las ventajas que aportan
el manejo de los diferentes tipos de medios de cultivo, dentro del trabajo rutinario para el
aislamiento, purificacin e identificacin de las bacterias.
28
4. Antecedentes
El agar es un elemento muy empleado para la
preparacin de medios de cultivo. Se obtiene de un alga
roja denominada Gracilaria. Qumicamente, es una
mezcla compleja de sales de polisacridos, la mayora de
ellos galactsidos. Las grandes molculas que lo
constituyen determinan sus caractersticas coloidales y
espesantes, que lo han hecho casi insustituible. Adems
de polisacridos, el Agar contiene numerosos cationes
asociados, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio y
algunos otros. La Gelatina es otro agente solidificante
pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
producen enzimas capaces de licuarlo.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en
composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es agar con una infusin de extractos de carne y Peptona a los que se
aade otros ingredientes.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: incrementar el valor
nutritivo del medio y detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que
ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes y/o ms exigentes. Tambin se
aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin
de cido o como inhibidores del crecimiento de algunas bacterias (el Rojo Fenol se usa
como indicador ya que es rojo a pH bsico y amarillo a pH alcalino).
Utilizando diversas tcnicas y medios de cultivo especiales es posible contar el
nmero de microorganismos presentes en un determinado lugar o en un medio como el
agua o el aire. Este recuento es de suma importancia, ya que en muchos casos,
bacterias patgenas pueden estar presentes y llegar hasta el organismo humano y
provocarle enfermedad.
Una fuente muy importante de bacterias patgenas puede ser el agua. Aunque en
las ciudades utilizamos agua potable 1, en algunos casos el agua puede llegar
contaminada a las casas. Normalmente no se busca bacterias como Salmonella o
Shigella, pues aparecen en escasa cantidad y su supervivencia en este medio es
favorable. Se utiliza mtodos ms seguros para establecer la calidad higinica de las
aguas, basndose en la investigacin de bacterias coliformes como indicadores de
contaminacin fecal. El agua que contenga bacterias de ese grupo se considera
potencialmente peligrosa, pues en cualquier momento puede llegar a transportar bacterias
patgenas, provenientes de portadores sanos, individuos enfermos o animales.
El agua contiene bacterias cuyas necesidades nutritivas y de temperatura ptima de
desarrollo son variables. En un anlisis ordinario de agua se inicia sembrando en medio
slido un volumen conocido de la muestra de agua para determinar el nmero de
1Potable Significa que es apta para la alimentacin y uso domstico: no deber contener sustancias o cuerpos extraos
de origen biolgico, orgnico, inorgnico o radiactivo en cantidades tales que la hagan peligrosa para la salud.
29
bacterias mesfilas viables, ya que las coliformes estn incluidas en este grupo. Se
incuba durante un tiempo y a determinadas temperaturas y se cuenta el nmero de
colonias que se obtienen. El medio utilizado es agar nutritivo. El lmite aceptable es el
siguiente:
Bacterias mesfilas viables en agar, durante 24 hrs. a 37C:
No ms de 500 UFC/ml.
Si en una muestra de agua se obtiene un valor superior a 500 UFC/ml es necesario

continuar el anlisis para confirmar la presencia de coliformes y tomar medidas dirigidas a
la correcta potabilizacin del agua. La muestra para anlisis bacteriolgico debe
efectuarse con el mayor cuidado. Se deben utilizar frascos esterilizados y con envoltura
externa. La capacidad debe ser de 200 a 250 ml. Debe transcurrir el menor tiempo entre
la extraccin y la llegada al laboratorio, y que durante ese tiempo se mantenga entre 4 y
10 C. De lo contrario se producen modificaciones cualitativas y cuantitativas de la
microbiota.
Toma de muestra de un grifo en una caera de agua corriente:

1. Se elige un grifo que este conectado directamente con una caera de
distribucin, es decir, que el ramal del grifo no este comunicado con tanques
domiciliarios, filtros, ablandadores u otros artefactos similares. Tampoco
conviene extraer muestras de grifos colocados en puntos muertos de la
caera. Estas precauciones no se tienen en cuenta cuando se desea conocer
la calidad del agua que suministra un determinado grifo, en lugar de la que
conduce la caera principal.
2. Se quitan del grifo los dispositivos destinados a evitar salpicado. Luego se
limpia la boca del grifo con un algodn embebido en alcohol hasta que salga
limpio y cuidando de eliminar la suciedad que a veces se acumula en la parte
interna del orificio.
3. Se esteriliza el grifo calentndolo durante un par de minutos con un hisopo
embebido en alcohol.
4. Despus se deja salir agua en forma abundante durante 2 o 3 minutos.
5. Se reduce el flujo de agua en forma tal que el chorro no produzca salpicaduras
y se llene el envase.
6. Se identifica el envase con la fecha, hora y lugar de muestreo.
Mechero de Bunsen. Tubos con caldo enriquecedor
Cajas de petri, con crecimiento Tripticasa soya.
bacteriano. Tubos con 9 ml de agua estril
Cajas de petri con medios de para realizar diluciones.
cultivo estril. (TCBS, SS, Mac Tubos con muestras
Conkey) desconocidas.
Cajas de petri estriles Envases estriles (para tomar
muestras de agua)
30
Papel mayordomo. Guantes de ltex.

Asas en aro. Hisopos estriles.
Tubos con agua destilada Beackers con cloro.
estril. Bolsas para descarte de basura.
Tubos con arena y Incubadora a 37 C
desinfectante. Enlenmeyer con agar nutritivo a
Marcador permanente para 70 C
vidrio.
6. Procedimiento
PARTE I. Inoculacin del Caldo de Enriquecedor

Trabajar todo el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen
Tomar el tubo de muestra desconocida, destaparlo con cuidado y flamear la boca
del mismo.
Introducir un hisopo estril, dentro del tubo de muestra desconocida y cargarlo
(permitir que se sature).con la muestra., escurrir levemente al retirarlo.
Destapar con cuidado el tubo con caldo enriquecedor y flamear la boca del
mismo.
Introducir este mismo hisopo dentro del tubo con caldo enriquecedor.
Agitar el hisopo suave y lentamente dentro del tubo y presionarlo contra las
paredes internas del tubo.
Sacar con cuidado el hisopo y descartar.
Flamee inmediatamente la boca del tubo con caldo enriquecedor y colocar la tapa
de rosca, sin atornillar o sellar.
Incubar a 37o C por trmino de 48 horas.
PARTE II. Inoculacin de las cajas con medio slido o agar.

Trazar una lnea divisoria en el centro de las cajas de medio slido e identificar
cada lado.
De un lado sembrar (utilizando el asa en anillo y no un hisopo) una cepa
conocida y del otro lado sembrar el material del tubo con la muestra desconocida.
Dispersar la muestra estriando sobre la mitad correspondiente de la caja.
Incubar a 37 C por trmino de 48 horas.
31
PARTE III. Recuento de bacterias en muestra de agua de chorro.

Identificar los tubos con 9 ml de agua destilada como 1:10, 1:100 y 1:1000.
Agitar el frasco 10 a 15 segundos, para asegurar la distribucin uniforme de las
bacterias del lquido.
Destapar el frasco y flamearlo.
Utilizando una pipeta esterilizada, tomar 1 ml de muestra.
Verter la alcuota en la caja de petri utilizando la tcnica asptica.
Agregar aspticamente el agar nutritivo fundido y enfriado a menos de 50 C
(que no queme el dorso de la mano) y rotar la caja para que la muestra quede
distribuida homogneamente.
Repetir los pasos anteriores y agregar la alcuota en el tubo 1:10. Se agita est
aspirando y expeliendo el lquido de la pipeta repetidas veces.
Utilizando la pipeta, tomar 1 ml del lquido diluido y verter en otra caja de petri.
Tomar 1 ml de lquido del tubo 1:10 y verter en el tubo 1:100. Con la tcnica
correcta verter 1 ml de contenido del tubo 1:100 en caja de petri y agregarle agar.
Tomar 1 ml del contenido del tubo 1:100 y verter en el 1:1000. Con la tcnica
correcta verter 1 ml de contenido del tubo 1:1000 en caja de petri y agregarle
agar.
Dejar reposar las cajas hasta que el agar se endurezca, invertir las cajas e
incubar de 32-35 C durante 24 horas.
PARTE IV. Lectura de los medios y caldo.

Al cumplir el tiempo de incubacin, realizar las lecturas.
Completar la siguiente tabla
Color de las
Medio de cultivo Aspecto del medio No. De colonias
colonias
Caldo Tripticasa Soya
TCBS
SS
Mac Conkey
Para el agar nutritivo, contar el nmero de colonias presentes en cada caja y

multiplicar por el factor de dilucin (recproco de la dilucin utilizada). Informar
segn el caso, el resultado como nmero de microorganismos aerobios mesfilos
por ml. El resultado se informa como Unidades Formadoras de Colonias por
32
mililitro (UFC/ml) ya que cada clula bacteriana viable, dar lugar al desarrollo de
una colonia.
Ejemplo:
a. Placa 1(muestra sin diluir): 300 colonias

b. Placa 2(dilucin 1:10) 38 colonias x 10 = 380 colonias
c. Placa 3 (dilucin 1:100) 4 colonias x 100 = 400 colonia

microbiologa.
Todo material empleado en las prcticas microbiolgicas, se descarta en las
bolsas rojas.
No dejar por ningn motivo, cajas, tubos o cualquier otro material contaminado,
en lugares que no correspondan al rea de trabajo.
NINGN EQUIPO DE PROTECCIN SUSTITUYE EL CUIDADO, ORDEN Y

PRECAUCIN QUE DEBE TENER CADA ESTUDIANTE AL REALIZAR SU TRABAJO.
8. Cuestionario
a. Qu buenas prcticas deben observarse para la preparacin de medios de
cultivo?
b. Cules son las diferencias entre un medio enriquecedor, uno de aislamiento y
otro de identificacin, en funcin de sus componentes
c. Cules son algunos de los errores que conducen a resultados equivocados al
realizar las lecturas de los medios o caldos?
d. Por qu es necesario esterilizar el chorro o grifo de donde se tomar la
muestra?
e. Investigue sobre los Diferentes tipos de medios existentes en el mercado.
f. Cules son los rangos de temperatura para incubacin, utilizados par el
aislamiento e identificacin de bacterias.
g. Qu diferencia existe entre CALDO y AGAR?
h. Qu sustancias o factores permiten diferentes colores de colonias en los
medios utilizados?
i. Investigue como se llama y describa brevemente la tcnica ms utilizada para
anlisis bacteriolgico del agua.
33
Gini, G. et al 2006. Manual de Prcticas de Microbiologa General.
Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia,
Universidad de San Carlos de Guatemala.
34
TINCIONES ESPECIALES:TINCIN DE GRAM, ZIEHL NEELSEN

Y CPSULA
Prctica 5
1. Introduccin
Uno de los principales procedimientos para el estudio de los microorganismos,
consiste en la preparacin adecuada de exmenes y de tinciones de los grmenes que
all se encuentran. Por ser estos microorganismos transparentes, la aplicacin de
colorantes hace ms fcil su observacin y el estudio de caractersticas tales como la
forma, agrupacin y si es posible poner de manifiesto la presencia de ciertas estructuras
celulares.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Conozca y comprenda el principio sobre el cual funcionan cada una de las
diferentes tcnicas de coloracin.
Adquiera habilidad en el manejo de diferentes coloraciones.
Comprenda la utilidad que implica trabajar con las coloraciones especiales y su
aporte inmediato al rea de diagnstico.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante lograr una idea completa de las ventajas que aportan
las diferentes tcnicas de coloraciones, tanto en las reas de trabajo de diagnstico, como
de investigacin por ser estas de un manipuleo sencillo y de fcil comprensin e
interpretacin.
4. Antecedentes
Para efectuar una observacin del microorganismo, los mtodos de coloracin son
diversos y adems, constituyen un tem ms que posibilita realizar una clasificacin, es
decir, que hay tcnicas que permiten hacer un diagnstico informando cmo reacciona
una clula microbiana a ciertas manipulaciones fsicas y qumicas con los colorantes (Ej.:
mtodos de Gram, cido-alcohol resistencia, etc.).
El descubrimiento del microscopio de contraste de fase y el uso del microscopio
electrnico para exmenes de microorganismos, han dejado de lado muchas de las
tcnicas de coloracin. A pesar de ello, los colorantes y las coloraciones se siguen
usando en trabajo de diagnstico y de investigacin por las mltiples ventajas que
proporcionan la perfecta realizacin de stas tcnicas nos permiten realizar diagnsticos
presuntivos y muchas veces, establecer la implantacin de la terapia adecuada.
Por lo tanto, estas tcnicas de coloracin, son y sern una herramienta valiosa que
en muchos casos pueden, incluso, salvar la vida a un paciente.
35
Coloraciones para Microscopio ptico.

Salvo excepciones, todas las tcnicas de coloracin, requieren un tratamiento previo
de preparacin, el cual se denomina FROTIS. El mismo consta de 4 pasos
fundamentales. Ellos son:
1) Preparacin del extendido - 2) Secado - 3) Fijado y 4) Coloracin
Extendido: la finalidad de esta operacin es obtener una monocapa de clulas lo ms

separada posible, para poder observar a los microorganismos y las agrupaciones en
forma clara.
Secado: su finalidad es evaporar el lquido de extendido. Si es que se presenta el caso de
estructuras lbiles, el secado se hace al aire (temperatura ambiente). Se lo hace por
proximidad a una fuente de calor (mechero, estufa) si es que se desea observar y colorear
estructuras no lbiles al calor.
Fijado: la finalidad del fijado es coagular las protenas protoplasmticas en el portaobjetos
y as los microorganismos quedan adheridos al vidrio y resisten sin desprenderse los
tratamientos de la tincin. El mismo puede realizarse con: a) calor, cortando la llama de
un mechero rpidamente 2 o 3 veces; b) con sustancias qumicas como formaldehdo,
cidos y alcoholes y c) con alcohol - ter, en volumen 1/1.
La fijacin produce el encogimiento de las clulas, lo que se subsana con la
Coloracin que las hace distender e incluso, parecer mayor en tamao de lo que son. En
la coloracin, se emplea cualquiera de la las tcnicas elegidas.
Coloracin de Gram
Fundamento
La coloracin de Gram. Es una tcnica de tincin de frotis que permite agrupar las
bacterias en dos grandes grupos: los Gram. Positivos (Azul o Violeta) y los Gram.
Negativos (Rojo). Siendo este el primer paso a efectuar cuando se busca la identificacin
de las especies bacterianas.
La teora actual sobre el Gram. es que las diferencias tintoriales se deben
principalmente a los diferentes grados de permeabilidad en las paredes celulares de las
distintas bacterias.
Hoy en da la coloracin de Gram. es de uso mundial. Sabemos sin temor a
equivocarnos, que este mtodo es, sin duda, uno de los pilares del diagnstico temprano
de las infecciones bacterianas.
Ziehl Neelsen
Fundamento
36
La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la decoloracin con cidos

fuertes despus de ser teidos con solucin de fucsina caliente, permite reunirlas bajo la
denominacin general de bacterias cido alcohol resistente.
El gnero Mycobacterium, incluido en esta clasificacin, comprende especies
patgenas para el hombre, animales y especies saprofitas. El grado de cido-alcohol
resistencia es variable entre los distintos resistentes aparecen rojos, mientras que otros
grmenes y clulas toman distintos tonos de azul.
Tincin de cpsula
Fundamento
La cpsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas
bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulacin de material
mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. Las cpsulas se
pueden clasificar en funcin del grado de asociacin con la superficie celular, o por su
consistencia. La cpsula est constituida por sustancias mucilaginosas que son
secretadas por las bacterias y que se mantienen adheridas al exterior de la pared celular,
rodeando la clula.
Esta no es realmente una coloracin pues la cpsula no es coloreada, sino que el
medio que los contiene (portaobjetos) es el que se cubre con el precipitado de la tinta
china. Por lo tanto, se observa el campo negro y a las bacterias y sobre todo, la cpsula
alrededor de la misma, como un cuerpo refringente y brillante.
Marcador indeleble para vidrio.
Aplicador de madera.
Mascarilla.
Asas en aro.
Mechero de Bunsen.
Bolsas para descarte de basura.
Mechero de vidrio ( con alcohol)
Cajas de petri, con crecimiento
bacteriano. Microscopio compuesto.
Colorantes para Cpsula: Tinta china Muestra de Esputo
Parker, Azul de Metileno o Safranina) Papel limpia lentes.
Colorantes para Gram: Cristal Violeta, Papel mayordomo.
Solucin de Lugol, Alcohol Acetona, Perilla de goma
Solucin de Safranina Pipetas pasteur estriles.
Colorantes para Ziehl Neelsen: Porta objeto limpio y
Fucsina fenicada, Alcohol cido, Azul desgrasado.
de metileno Tubos con agua destilada
Frascos con aceite de inmersin. estril.
Guantes de ltex. Tubos con arena y
Incubadora a 37 C desinfectante.
Lminas fijadas con BAAR. Varillas de vidrio para
Lentes de proteccin. coloracin.
37
6. Procedimiento
PARTE I. Tincin de Gram.
Cajas con: S. aureus y E.coli
Trabaje todo el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen
Trabaje con sus cajas de petri que contiene las cepas antes indicadas.
Destape con cuidado una a una las cajas de petri.
Prepare con mucha precaucin tres frotis con diferente tipo de colonia (segn
metodologa establecida con anterioridad)
Cubra los frotis con solucin cristal violeta y djelo por un minuto.
Lave con agua de chorro y escurra.
Cbrala con solucin de Lugol durante un minuto.
Lvela con agua de chorro y escurra.
Gotee alcohol acetona sobre la preparacin, hasta que esta deje de soltar color
violeta. (unas 4 a 6 gotas) LAVE INMEDIATAMENTE.
Cubra la lmina con Solucin de Safranina, durante un minuto.
Escurra el colorante y lave la lmina con agua de chorro, escurra y deje secar a
temperatura ambiente.
PARTE II. Tincin de Ziehl Neelsen.

Con las lminas ya preparadas, realice la coloracin para BAAR (bacilos alcohol
acido resistente).
Cubra el frotis con Fascina Fenicada y caliente suavemente por debajo de la
lmina, con la llama de un mechero (de alcohol) hasta que se produzca emisin
de vapores blanquecinos visibles.
Espere 5 minutos y luego llave con agua de chorro, para eliminar el exceso de
colorante
Cubra el extendido con Alcohol Acido al 3 %, esperar 30 segundos o hasta que la
coloracin del extendido alcance un rosado plido.
a. Lave con agua de chorro, para eliminar el Alcohol Acido.
Cubra el extendido con el colorante Azul de metileno y espere 30 segundos.
Lave con agua corriente, escurra y deje secar el extendido al aire, NO frotar.
PARTE III Tincin para Cpsula

Trabaje todo el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen
Trabaje con la caja de petri, que contiene las cepas de Klebsiella sp.
38
Coloque una gota de agua destilada estril, en el extremo de una lmina.

Destape con cuidado la caja de petri, escogiendo nicamente una de las colonias
presentes, tmela con el asa debidamente flameada y fra y extienda la pequea
cantidad del cultivo sobre la gota de agua.
Usando el asa, extienda la suspensin en un tercio de la lmina y deje secar al
aire.
Fije la preparacin pasando la lmina dos o tres veces por la llama de un
mechero (dejando el lado donde se hizo el frotis por arriba.).
Cubra la preparacin con Azul de Metileno, deje 5 minutos, lave con agua de
choro y escurra.
Deje secar al aire.
Agregue una gota de tinta china Parker, y con el extremo de otra lmina porta
objetos realice un frotis sobre la preparacin, en un ngulo de 45.
Deje secar y agregue aceite de inmersin, para su visualizacin.
PARTE IV. Observacin al Microscopio.

Agregue una gota de aceite de inmersin, a cada uno de los frotis o extendidos.
Utilice el objetivo de inmersin.
Anote a continuacin los resultados obtenidos, acompaado de ilustraciones
esquemticas.

Lvese las manos despus de realizar cualquier tarea dentro del laboratorio de
microbiologa.
bolsas rojas.
En el caso de las lminas utilizadas para la coloracin de Ziehl Neelsen, nunca
deben reutilizarse, especialmente las que resulten positivas.

PRECAUCIN QUE DEBE TENER CADA ESTUDIANTE AL REALIZAR SU
TRABAJO.
39
8. Cuestionario
a. Por qu se le dio el nombre de Coloracin de Gram?
b. Cules son las ventajas que aporta una buena coloracin?
c. Cules son algunos de los errores que conducen a un resultado equivocado o
falso positivo (para cada una de las tcnicas de coloracin)?
d. Investigue porqu las bacterias retienen los diferentes tipos de colorantes
e. Investigue sobre Nombre de bacterias oportunistas y patgenas, Gram.
Positivas, Gram. Negativas, BAAR y bacterias con cpsula


Campollo, Eyda de. Tromme Martina .2001. Manual de tcnicas y
procedimientos de bacteriologa de la tuberculosis. 2da Edicin. Papelera
Fuentes. Guatemala, Guatemala
Javascrpt. 2003 Genios de la Microbiologa [Venezuela] Cielo V.23 (No.2)
revistasvm@hotmail.com
40
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAERBICAS.

CULTIVO DE GARGANTA
Prctica 6
1. Introduccin
Desde un punto de vista simplista, pero muy til, se puede definir a las bacterias
anaerobias como aquellas que para crecer en la superficie de un medio de cultivo
necesitan una atmsfera sin oxgeno, ya que este elemento es txico para ellas. Con
estos dos conceptos se puede inferir que existe una amplia gama de microorganismos,
desde los muy tolerantes y resistentes hasta los extremadamente lbiles a este gas.
La mayora de las infecciones bacterianas de la faringe son producidas por bacterias
anaerobias estrictas o anaerobias facultativas como por ejemplo: Streptococcus del grupo
A. Otras bacterias que pueden producir faringitis son Corynebacterium diphtheriae,
B.pertusis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydophila pneunoniae y Micoplasma pneunoniae.
Estas bacterias son relativamente infrecuentes y deben utilizarse tcnicas especiales para
su aislamiento. Otras bacterias menos importantes en infecciones de faringe son:
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, S.auresus, K.pneumoniae
Debe tomarse muestra de la zona de las amgdalas, la faringe posterior y de
cualquier exudado o zona ulcerada. Otras infecciones del tracto respiratorio superior
pueden afectar la epiglotis y los senos. Los intentos de tomar cultivo de epiglotis pueden
precipitar la obstruccin completa del flujo areo, por tanto estos cultivos nunca se deben
realizar.
2. Objetivos
Que el estudiante
Aprenda a realizar una toma de muestra correcta para cultivo de garganta.
41
Aprenda a identificar los microorganismos que se aslan de una toma de muestra

de garganta.
Comprenda la importancia de una correcta toma y conservacin de muestra
Adquiera habilidad en el manejo y lectura del medio de cultivo utilizado para el
aislamiento e identificacin.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa sobre el aislamiento de las
bacterias anaerbicas, tomando como ejemplo un cultivo de garganta.
4. Antecedentes
Aunque las bacterias anaerobias fueron descubiertas a finales del siglo XIX, en la
poca dorada de la microbiologa, no fue hasta los aos 70 cuando se sentaron las bases
del conocimiento actual. El grupo del Instituto Politcnico de Virginia en los Estados
Unidos estableci los principios de la moderna taxonoma y clasificacin y desarroll un
sistema que permita el aislamiento de las especies ms sensibles al oxgeno.
El hbitat de las bacterias anaerobias est limitado a zonas corporales del hombre y
de los animales donde la tensin de oxgeno es baja. Forman parte de la microbiota
normal como comensales y mutualistas, jugando un importante papel en la resistencia
inespecfica a la infeccin. Son particularmente frecuentes en la boca (especialmente en
la placa dental sobre todo en su porcin subgingival) y en las vas respiratorias altas,
vagina e intestino (en especial en colon, recto y en las heces, donde superan a los
aerobios y a los microorganismos facultativos). A partir de aqu pueden contaminar de
forma pasajera la piel, sobre todo la del perin. La piel es pobre en anaerobios
permanentes, el ms significativo es Propionibacterium acnes que vive en las glndulas
sebceas. Desde estas localizaciones, particularmente del tubo digestivo, son eliminados
muriendo en el ambiente, con la excepcin de los clostridios que sobreviven gracias a la
formacin de esporas y que por ellas forman parte de la flora telrica y ambiental. La
colonizacin inicial se realiza por transmisin directa.
Colorantes: Para Gram. (Cristal
Alcohol al 70% (5.0 ml/A) Violeta, Solucin de Lugol,
Asa en aro (1/A) Alcohol Acetona, Solucin de
Baja lenguas (1/A) Safranina),
Bickers con cloro (1 por mesa, con 20 Frascos con aceite de
ml de cloro) inmersin. (2 gotas/A)
Bolsas para descarte de basura.(dos / Guantes de ltex.
prctica) Hisopos estriles (2/A)
Cajas de petri, con medios de cultivo: Incubadora a 37C
Agar Sangre Jarra Gaspar (para anaerobios)
Candela o veladora. Lentes de proteccin.
42
Magazn de taxo A (Bacittracina,1 Tubos tapa rosca con arena y

disco/ A) desinfectante. (5.0ml/A de
Marcador indeleble para vidrio. desinfectante)
Mascarilla desechable. Tubos tapa rosca con agua
Mechero de Bunsen. destilada estril (10 ml/A)
Microscopio compuesto. Varillas de vidrio para
Papel limpia lentes. coloracin.
Papel mayordomo.
Porta objeto limpio y desgrasado (2/A)
Torundas de algodn (1/A)
6. Procedimiento
PARTE I. Toma de muestra.
Hisopado de amgdalas.
Antes de tomar la muestra, pngase los
anteojos protectores, la mascarilla y los
guantes.
Coloque al paciente sentado frente a usted y
pdale que trague fuertemente dos veces.
Pida al paciente que vea hacia arriba, con la
boca abierta, que saque la lengua y diga AH
AH.
Con un baja lenguas, presione fuertemente la
lengua hacia abajo y simultneamente, si es
posible, iluminar bien el fondo de la garganta (detrs de la vula o campanilla),
con una lmpara porttil de bateras.
Localizar en el fondo de la garganta y en las amgdalas, que se encuentran a los
lados, las siguientes lesiones:
Inflamacin (enrojecimiento).
Pus (secrecin blanquecina o amarillenta).
Ulceras blanquecinas.
Con el hisopo estril frotar firmemente las lesiones, con sumo cuidado de no
tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos (cachetes) o los
labios, al momento de retirar el hisopo.
Trabaje todo el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen.
PARTE II. Inoculacin del medio de cultivo

Descargue inmediatamente la muestra tomada con el hisopo en la caja de agar
Sangre (con sangre de carnero al 5 %).
Esterilice y enfre el asa en aro para trabajar.
43
Con el asa en aro estril, estre en tres secciones la caja.

En la parte ms densa coloque con cuidado y con ayuda del magazn, un taxo A.
Para este paso, utilice una pinza estril, flameada y enfriada, para dispensar los
discos.
Incube en jarro con candela a 36 C.
PARTE III. Preparacin del frotis

Rotule dos lminas portaobjetos limpios y desgrasados con su nombre
Utilice el mismo hisopo con el que inocul la caja de medio de cultivo y haga un
frotis.
Deje secar a temperatura ambiente.
Fije a la llama.
Coloree con tincin de Gram (Parte IV).
Observe al microscopio con el lente de inmersin (100 X) (Parte V).
PARTE IV. Tincin de Gram

Use la lmina que prepar en la Parte III del procedimiento para la coloracin con
tincin de Gram.
Cubra la lmina con solucin Cristal Violeta y djelo actuar por un minuto.
Cubra el frotis con alcohol acetona por un minuto.
Cubra la lmina con solucin de Safranina durante un minuto.
Escurra el colorante y lave la lmina con agua de chorro. Escurra y deje secar a
PARTE IV. Tincin de Gram

Use la lmina coloreada que prepar en la Parte IV del procedimiento.
Agregue una gota de aceite de inmersin al frotis coloreado.
Utilice el objetivo de inmersin.
Anote a continuacin los resultados obtenidos, acompaado de ilustraciones
esquemticas.
44

microbiologa.
bolsas rojas.
Descarte las muestras en los contenedores para el efecto.

TRABAJO.
8. Cuestionario
a. Cmo se realiza la lectura en el caso de agar Sangre en cultivo de garganta?
b. Cmo se interpretan los resultados con el Taxo A?
c. Qu resultados aporta la lectura del agar sangre para cultivo de garganta?

Investigue sobre la sintomatologa clnica de las afecciones de garganta o
faringe.

Alcal L, Betriu C y colaboradores. Procedimientos en Microbiologa Clnica.
2004 10 oct. 2005.
Universidad de Maryland. Medical Center. Cultivo por cepillado de garganta. 2004
10 oct del 2005. Disponible en:
http://www.umm.edu/esp_ency/article/003746.htm
Medline Plus. Biblioteca Nacional de medicina EE:UU. y los Institutos Nacionales
en Salud Irritacin de Garganta. 10 de oct 2005. fecha actualizacin 08 de sep.
2005.
Soria F. 1,978 Manual de bacteriologa. Disco. Novena Edicin. Grficas
MIRASA. S. L. Valdemoro , Madrid.
45
Rohde Pal (editor). 1,974 Manual de procedimientos de laboratorio. BBL 5ta.

Edicin. Editores Asociados. S.A. Mxico D.F.
Torres, Miguel. 1999 Manual prctica de bacteriologa Mdica. 1ra Edicin.
Serviprensa C.A. Guatemala, Guatemala.
46
Correlacin de Resultados de Laboratorio de Microbiologa

Prctica 7
1. Introduccin
Los aportes que brindan los diferentes tipos de resultados de laboratorio, son muy
valiosos para el mdico y se en especial de pruebas en el rea de microbiologa como
una valiosa herramienta que le permite confirmar la presencia de determinado agente
etiolgico cuando la clnica le ha hecho considerar su presencia. Es por ello
indispensable que considerarlas desde un principio, compaginando con la historia
clnica y la epidemiologa.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Correlacione la historia clnica y los resultados de laboratorio para lograr un
adecuado diagnstico.
Explique la relacin entre Infeccin del Tracto Urinario y elementos formes
presentes en muestras de orina.
Explique la relacin entre Infeccin Intestinal, pudiendo hacer un diagnstico
diferencial, de otras patologas que ocasionan diarrea.
Haga uso adecuado de la informacin disponible en Internet para la elaboracin
de informes de laboratorio.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante utilizar todos los criterios diagnsticos, para llegar a
una definicin de caso, identificando el agente causal de la patologa tanto del tracto
urinario como del digestivo.
4. Antecedentes
Actualmente se dispone de muchas pruebas y metodologas diagnsticas, las
cuales estn documentadas en Internet y son de gran cantidad, pero hay que tener
cuidado de no consultar pginas sin criterio cientfico. Es por ello muy importante que
sepamos discernir la informacin de buena calidad. Recomendaciones para bsquedas
de documentos electrnicos de fuentes cientficas o educativas:
Ir a bsqueda avanzada de un motor de bsqueda y seleccionar bsqueda de
resultados de dominio .edu
47
Utilizar buscadores especializados, por ejemplo Google scholar.
Alcohol al 70%.
Cloro al 5 %. Papel tornasol.
Computadoras Prcticas de laboratorio # 7 y 8.
Guantes de ltex. Sistema de Internet.
libros de texto. Torundas de algodn.
6. Procedimiento
Desarrolle los casos clnicos que a continuacin se le presentan.
PARTE I. Lectura del caso clnico.

Lea detenidamente el caso.
Consulte los protocolos de las prcticas # 8 y 9.
PARTE II Apoyo con Internet.

Consulte en Internet.
Tome los dibujos que sean necesarios para ilustrar sus casos clnicos.
Ponga la bibliografa como corresponde segn las instrucciones del Manual de
Laboratorio.
PARTE III Resolucin del Cuestionario.

1. Resuelva todas las preguntas de cada uno de los casos clnicos.
CASO CLINICO 1
Nia de dos aos con peso y estatura normal para su edad, consulta al Centro de
Salud por diarrea aguda. Su madre informa al mdico que la nia ha estado con fiebre,
vmitos, nauseas, dolor abdominal.
La familia de Carmen Lucia Monroy, viven en una casa humilde y subsisten de la
siembra de hortalizas, adems de la crianza de gallinas y otros animales, domsticos los
cuales tambin consumen. Adems informa que inicio con sntomas desde hace dos das.
Al examinarla el mdico encuentra deshidratacin, por lo que se decide trasladarlo
al Hospital departamental para su hospitalizacin. El mdico de urgencia solicita
exmenes bacteriolgicos, parasicolgicos y hematolgicos. Indica
Adems la rehidratacin inmediata.
48
Aspecto de deposicin: Ligeramente sanguinolenta y ligeramente acuosa.

Examen de heces en fresco: No se observan parsitos.
Coprocultivo:
Agar Mc Conkey: Colonias incoloras,
pequeas, lisas. Agar XLD: Colonias
rosadas con el centro negro
Examen de orina: Normal
Hemograma: Leucocitos o polimorfonucleares 68 %
Preguntas
1. Cmo pudo haberse infectado?
2. Qu significado tiene las colonias incoloras en el agar MacConkey y las colonias
negras en el XLD
3. El agente etiolgico de la enfermedad
4. Dibuje e interprete los resultados de la batera bioqumica para el agente causal
5. Explique el porqu de los resultados de laboratorio que se encuentran
anormales, indicando sus valores de referencia
CASO CLINICO 2
Paciente adulto, sexo masculino, Macario Lemus, de 38 aos, albail. Llega a la
emergencia por nausea, vmitos, sin dolor abdominal de 2 das de evolucin, se presenta
totalmente deshidratado, Refiere que el fin de semana fue a una fiesta, en casa de sus
familiares y comido comida casera.
A las dos horas despus, ingresa otra familiar del Sr. Macario Lemus, con los mismos
sntomas. El mdico solicita anlisis de laboratorio:
Aspecto de deposicin: Acuosa, como agua de arroz.
Examen de heces: No se observan parsitos
Frote en fresco, se aprecian bacilos mviles.
Leucocitos y eritrocitos fecales: 5 por campo
Examen de sangre: Recuento de Glbulos blancos: 11,000/mm3
Coprocultivo: Despus de 24 horas de incubacin se observa lo siguiente:
Agar McConkey: Colonias rosadas. , pequeas, lisas.
Agar S.S. No hubo crecimiento.
Agar TCBS: Colonias amarillas grandes
49
Preguntas
1. Qu agente etiolgico le sugiere los resultados iniciales de coprocultivo?
2. Qu pruebas bacteriolgicas se necesitan para confirmar el agente etiolgico?
3. Cree que es necesario obtener ms datos en relacin a los antecedentes,
sntomas o signos para aclarar el diagnstico?
4. Qu tratamiento recomendara de forma inmediata?
5. Si decide indicar antibiticos, Cul o cules seleccionara y en base a que
elementos hara esta seleccin?
CASO CLINICO 3
Paciente de 83 aos, sana. Antecedentes de episodios de dolor abdominal alto y
vmitos que el familiar atribua a ingestas excesivas. Fue trada al Hospital debido a que
present fro intenso, con ascenso de temperatura a 40 C, dolor abdominal alto a
predominio en hipocondrio izquierdo y posteriormente diarrea. No se quej de sntomas
urinarios ni respiratorios. Estos datos los proporcion una sobrina, pues la enferma no
responda.
Examen fsico: obesa, muy deprimida, deshidratada, 38C de temperatura axilar,
dolor a la palpacin de hipocondrio y fosa lumbar izquierdos. El resto fue normal.
Resultados de Laboratorio:
Recuento de Glbulos Blancos 20.000 elementos/mm3.
Orina: Anlis is qumico: Proteinuria y hematuria.
Se observ lo siguiente en el sedimento urinario (ver fotografa):
Fotografa 1. Sedimento urinario

Urocultivo:
Resultados iniciales Crecimiento de Colonias fucia en agar McConkey.
50
Crecimiento de colonias crema en agar sangre.

Recuento promedio 98 colonias.
Preguntas
1. Indique que son los hallazgos microscpicos encontrados en el sedimento urinario
2. Cmo interpretara el resultado del recuento bacteriano de
acuerdo al criterio de Kaas?
3. Qu agente etiolgico le sugiere los resultados iniciales de urocultivo?
4. Cmo se reportaran los datos de la batera para esta bacteria, dibuje?
5. Cree que es necesarios obtener ms datos en relacin a los antecedentes,
sntomas o signos para aclarar el diagnstico?
6. Cree que es urgente iniciar un plan de antibiticos o esperara el resultado
de los estudios bacteriolgicos solicitados?
7. Si decide indicar antibiticos, cul o cules seleccionara y en base a que
elementos hara esta seleccin?

a. Lvese las manos despus de realizar cualquier tarea dentro del laboratorio
de microbiologa.
Descarte los materiales descartables en los conteneros para el efecto.
NINGUN EQUIPO DE PROTECCION SUSTITUYE EL CUIDADO, ORDEN Y

PRECAUCION QUE DEBE TENER CADA ESTUDIANTE AL
REALIZAR SU TRABAJO.

Resolucin de casos clnicos. Incluir lo siguiente:
9. Informe final
Anote las preguntas de cada caso con sus respuestas respectivas, de forma clara y
concisa.
Escriba una conclusin de cada caso sobre el diagnstico de cada paciente
10 Bibliografa de referencia
Biblioteca Nacional de Medicina. Enciclopedia Mdica. Estados Unidos. Cultivo de
Orina. 10/06/2005. 17 de marzo del 2006.
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/print/ency/article/003751.htm
51
Lobos R. y Garca M...1983. Procedimientos y tcnicas de Laboratorio. Edicin

nica. Editorial Universitaria. San Francisco Santiago de Chille.
Hohenberger E. y Colaboradores. Compendio, Urianlisis con tiras reactivas-2da.
Edicin. Editorial Roche Diagnostico. Alemania.
Soria F. 1,978 Manual de bacteriologa. Disco. Novena Edicin. Grficas MIRASA.
S,L. Valdemoro , Madrid.
52
PRUEBAS DE IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS

Prctica 8
1. Introduccin
Los cocos Gram positivo incluyen a los estafilococos y
estreptococos. Estos ltimos son los microorganismos que
con ms frecuencia producen infecciones en la comunidad,
as como infecciones intrahospitalarias. A pesar de que se
han desarrollado nuevos antibiticos, las infecciones por
estos microorganismos persisten especialmente debido a
la resistencia que desarrollan.
Estos se pueden clasificar, inicialmente, en cuanto a
sus requerimientos atmosfricos. As tenemos los cocos
Gram positivos anaerobios estrictos, constituidos por los
gneros Peptococcus y Peptoestreptococcus. Por otro lado tenemos los cocos Gram
positivos aerobios y anaerobios facultativos, que estn constituidos por la familia
Micrococacceae (gneros Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomacoccus) y
los gneros Streptococcus y Enterococcus.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Ejecute una correcta tcnica de aislamiento y sub-cultivo de bacterias.
Identifique diferentes especies de cocos gram positivo de acuerdo con su
morfologa microscpica, macroscpica, requerimientos atmosfricos y
caractersticas bioqumicas.
Adquiera habilidad en el manejo y lectura del medio de cultivo, utilizado para el
aislamiento e identificacin de cocos gram positivo.
Adquiera habilidad en la realizacin de pruebas bioqumicas para la
diferenciacin de Staphylococcus y Streptococcus.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa sobre la tcnica del
aislamiento de cocos Gram positivo y del uso de las pruebas iniciales para identificacin
de Staphylococcus y Streptococcus.
4. Antecedentes
Para observar la morfologa microscpica se debe realizar un frotis y luego la tincin
de Gram, lo que nos permitir apreciar la forma, agrupacin y comportamiento de la cepa
en estudio frente al Gram.
53
El gnero Staphylococcus se caracteriza por ser cocos Gram positivos que se

agrupan en forma de racimo. Macroscpicamente observamos, en primer lugar, que
existan colonias perfectamente aisladas. El aislamiento nos permitir observar las
caractersticas de las colonias en agar sangre, las cuales sern redondas, grandes,
cremosas y frecuentemente con pigmentacin amarilla. El gnero Staphylococcus es
aerobio-anaerobio facultativo, por lo tanto crecer solo en la incubadora o en jarra con
candela. No es exigente en cuanto a sus requerimientos nutricionales, por lo tanto crece
en medios de cultivo pobres. Las pruebas o ensayos bioqumicos son aquellas que ponen
en evidencia la existencia de una enzima o pasos metablicos determinados.
Realizaremos las principales pruebas bioqumicas necesarias para la identificacin de los
estafilococos.
Catalasa: La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno
(H2O2) en oxgeno y agua. Qumicamente la catalasa es una hemoprotena de estructura
similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula estn
en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la
mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa.
La mayora de las bacterias anaerobias descomponen el H 2O2 con peroxidasas
semejantes a la catalasa, pero cada molcula contiene un solo in frrico. El perxido de
hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo aerbico de los
carbohidratos. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas
bacterianas. La catalasa acta de acuerdo con la siguiente reaccin:
H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy

comnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos
(positivos). Si la prueba es positiva aparecern burbujas (efervescencia) inmediatamente.
Coagulasa: La coagulasa es una enzima proteica de composicin qumica
desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un coagulo visible. Se considera que la
coagulasa funciona in vivo produciendo una barrera en el sitio de la infeccin
estafiloccica. Esto puede servir para localizar los organismos en abscesos. En el
laboratorio, la prueba de la coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al S.
aureus (coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla
en 2 formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que
requieren el uso de tcnicas separadas:
54
1. Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija, conocida como factor

de aglutinacin, est unida a la pared celular bacteriana y no est presente en los
filtrados de cultivos. Los hilos de fibrina formados entre las clulas bacterianas
suspendidas en plasma (fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la
presencia de agregados visibles en el portaobjetos. La actividad de la coagulasa
fija no es inhibida por los anticuerpos formados contra la coagulasa libre.
2. Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia semejante
a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos. Cuando se realiza
una suspensin de bacterias productoras de coagulasa en una pequea cantidad
de plasma en un tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como consecuencia
de la utilizacin de los factores de la coagulacin del plasma de manera similar a
cuando se aade trombina.
El gnero Streptococcus es exigente en cuanto a sus requerimientos nutricionales y

por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le aporten los nutrientes necesarios,
por ejemplo, agar sangre de carnero. Despus de determinar que se trata de un coco
Gram positivo, se realiza la primera prueba bioqumica, que es la de catalasa. Luego de
determinar que se trata de un coco Gram positivo catalasa negativo, debemos proceder a
observar el efecto que tiene la cepa sobre el agar sangre (hemlisis). As podemos
clasificar este grupo de en:
1. hemolticos: son aquellos que producen hemlisis parcial, la cual se observa
como un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias.
2. hemolticos: son aquellos que producen una hemlisis total de los glbulos
rojos, observndose como un halo transparente alrededor de las colonias.
3. hemolticos: son aquellos que no producen hemlisis sobre el agar sangre.
55
Si se demuestra la presencia de un estreptococo hemolticos se realiza la prueba de

CAMP para separar S. agalactiae de los dems estreptococos hemolticos. Esta prueba
se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor llamado CAMP (factor
de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de hemlisis producida por un
estafilococo productor de -lisina. Se realiza estriando un cultivo de estreptococo
hemoltico en forma perpendicular a una estra de un estafilococo productor de -lisina en
agar sangre. Se incuba 18-24 horas a 37 C. La prueba positiva se evidencia por la
presencia de una zona de potenciacin de la hemlisis en forma de puntas de flecha en el
lugar donde se acercan las dos estras.
Si se demuestra la presencia de un estreptococo hemoltico es necesario identificar
si se trata de S. pneumoniae. Esta prueba se basa en la sensibilidad de S. pneumoniae a
una concentracin menor o igual a 5g/ml de optoquina. Para ello se estra un cuadrante
de una placa de agar sangre en varias direcciones y se coloca un disco de optoquina en
el centro del rea estriada. Se incuba de 18-24 horas a 37C. Si se presenta halo de
inhibicin mayor de 15mm se trata de S. pneumoniae.
Agua oxigenada Magazn de taxo P(1 disco/A)

Alcohol al 70% (5.0 ml / A) Marcador indeleble para vidrio.
Asa en aro (1/A) Mascarilla desechable
Bajalenguas (1/A) Mechero de Bunsen.
Beakers con cloro (1 por mesa, con Microscopio compuesto.
20 ml de cloro) Palillos estriles (2/A)
Bolsas para descarte de basura (dos / Papel limpia lentes.
seccin) Papel mayordomo.
Cajas de petri, con medios de cultivo: Porta objeto limpio y
Agar Sangre (1/A) desgrasado.(2/A)
Candela o veladora. Torundas de algodn (1/A)
Colorantes: Para Gram. (Cristal Tubos con plasma
Violeta, Solucin de Lugol, Alcohol Tubos tapa rosca con agua
Acetona, Solucin de Safranina), destilada estril (10 ml/A)
Frascos con aceite de inmersin. (2 Tubos tapa rosca con arena y
gotas/A) desinfectante. (5.0 ml/A de
Guantes de ltex. desinfectante)
Incubadora a 37C Varillas de vidrio para
Jarra Gaspak (para anaerobios ) coloracin.
6. Procedimiento
Antes de colocarse guantes:
Rotular tres lminas portaobjetos limpios y desgrasados con nombre, fecha y
cada una con el respectivo nmero de muestra.
56
Trazar una lnea en la parte posterior de una caja de agar sangre, identificarla
con nombre, fecha y el correspondiente nmero de muestra a cada lado.
PARTE I. Morfologa macroscpica y tincin de Gram

Trabajar frente al mechero Bunsen.
Observar la morfologa macroscpica de las colonias en diferentes cajas de Petri
y especialmente el tipo de hemlisis de cada una.
Anotar las observaciones
Preparar cuidadosamente un frotis a partir de cada una de las cajas de Petri con
cultivos bacterianos.
Teir los frotis con la tincin de Gram.
Observar al microscopio la morfologa de las bacterias y la forma de agrupacin.
Considerando la morfologa macroscpica y microscpica de cada una de las
muestras tratar de establecer cuales muestras corresponden a Staphylococcus y
cuales a Streptococcus.
PARTE II. Prueba de la catalasa

Verter 1 gota de perxido de hidrgeno en una lmina portaobjetos limpia y
desgrasada.
Utilizando un palillo estril, recoger una colonia bacteriana y colocarla dentro de
la gota de agua oxigenada.
Observar los resultados y anotar
Descartar cuidadosamente el palillo y la lmina en un beaker con cloro.
Repetir el procedimiento para las colonias de las otras cajas de Petri con
bacterias.
PARTE III. Prueba de coagulasa (en tubo)

Utilizando la tcnica asptica, tomar con el asa una colonia de una caja de Petri.
Inocular la colonia en el tubo de ensayo conteniendo plasma.
Agitar con el asa vigorosamente, tratando de mezclar bien la colonia con el
plasma.
Colocar en la incubadora.
Revisar el tubo una, dos y tres horas despus de inocular la colonia en el plasma
para comprobar la formacin del coagulo.
Repetir el procedimiento para las colonias de las otras cajas de Petri con
bacterias.
57
PARTE IV. Test de CAMP

En la caja con agar sangre dividida a la mitad y utilizando la tcnica asptica, con
el asa en argolla, hacer una estra con Staphylococcus aureus, (debe quedar
cerca y paralela a la lnea de divisin de la caja).
Con sumo cuidado hacer una estra con el Streptococcus beta hemoltico a
identificar, de tal manera que quede perpendicular a la estra de S. aureus, pero
que no la toque.
PARTE V. Taxo P
Seleccionar la caja que tenga Streptococcus hemoltico.
Con el asa en argolla tomar una colonia y cuidadosamente, realizar un estriado
en la mitad sin inocular de la caja. Estriar por lo menos en tres direcciones.
Utilizando una pinza esterilizada en el mechero, colocar en el centro del estriado
un disco taxo P.
Incubar en jarra con candela y humedad 24 horas a 37 C.
Leer y anotar los resultados.
La presencia de de Streptococcus agalactiae se confirma por la formacin una
flecha de hemlisis intensa, que apunta hacia la estra de S. aureus. La
presencia de Streptococcus pneumoniae se confirma por el halo de inhibicin
alrededor del disco de taxo P.

microbiologa.
bolsas rojas.
58

TRABAJO.
8. Cuestionario
a. Por qu en la prueba de la catalasa es recomendable manipular la muestra
con un aplicador de madera y no con un asa metlica?
b. Por qu en la prueba de la coagulasa no se recomienda utilizar plasma
citratado?
c. Indica 2 pruebas ms que permiten la identificacin plena de S. aureus, S.
pneumoniae y S. agalactiae?

Construya una tabla incluyendo todas las pruebas realizadas y cada una de las
bacterias analizadas.
Responda el cuestionario

Campollo, E. Prcticas de Microbiologa 1. Universidad Mariano Glvez.
Facultad de Ciencias Mdicas. 2005.
Torres,M. 1999 Manual Prctico de bacteriologa Mdica. 2da. Edicin. Editorial
Serviprensa C.A. Guatemala Guatemala.
Bernard, John. 1991 Todd-Sandford-Davidsohn Diagnstico y Tratamiento
Clnicos por el Laboratorio. 8 Edicin. Editorial Salvat. Barcelona, Espaa.
Koneman y Col. 1992 Diagnstico Microbiolgico. 3 Edicin. Editorial Mdica
Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
59
EXAMEN EN FRESCO DE ORINA

Y UROCULTIVO
Prctica 9
1. Introduccin
La medicina moderna dispone de diversos mtodos de ensayo o tcnicas rpidas e
higinicas que permiten el anlisis seguro y fiable de las muestras de orina. Una de estas
tcnicas es la utilizacin de las tiras de orina, que contienen un men de parmetros que
han ido aumentando con las dcadas y pueden utilizarse para reconocer los sntomas
iniciales de las tres principales categoras de patologas:
Enfermedades renales y del tracto urogenital.
Enfermedades metablicas (Diabetes millitus).
Enfermedades hepticas y trastornos hemolticos.
Otro de los mtodos empleados es el Urocultivo, el cual identifica a las infecciones
agudas o crnicas del tracto urinario que pueden afectar los riones, los urteres, la
vejiga y la uretra. Se puede apreciar el valor de estos mtodos bacteriolgicos
parcialmente cuantitativos para determinar la importancia clnica de las bacterias en orina.
2. Objetivos
Que el estudiante
Comprenda las ventajas que aporta un adecuado manejo de muestra para la
realizacin de un urocultivo y con ello un diagnstico certero.
Adquiera habilidad en el manejo de diferentes medios de cultivo.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa de las ventajas que
aportan el uso de diferentes medios de cultivos, para un adecuado aislamiento de las
bacterias, y comprenda la importancia de un adecuado y oportuno diagnstico, para el
inicio del tratamiento correspondiente.
4. Antecedentes
La orina vesical es normalmente estril, las punciones suprapbica en sujetos sin
signos, ni sntomas de infeccin urinaria, han permitido demostrar esta afirmacin.
Sin embargo los primeros mililitros emitidos por personas normales a travs de la
uretra, presentan siempre bacterias, debido a la flora normal de la uretra, las cuales son
arrastrada por la orina, conteniendo flora normal del prepucio y contaminacin fecal en
caso de lactantes.
60
De lo anterior se derivan las siguientes consecuencias:

a. El sondeo vesical, es una tcnica riesgosa ya que lleva a una contaminacin
ascendente.
b. Quedan dos alternativas para la toma de muestra:
1. La tcnica del segundo chorro con prctica de conteo de colonias y
2. Puncin suprapbica.
Es importante hacer notar que para tener un dato completo del examen de orina, este
debe contar con la siguiente informacin:
Aspectos macroscpicos.
Pruebas bioqumicas.
Coloracin de Gram.
Recuento de colonias.
Identificacin del germen.
5. Materiales y Equipo:
Micro centrfuga
Alcohol al 70%.
Microscopio compuesto.
Asas en aro.
Papel limpia lentes.
Bickers con cloro.
Papel mayordomo.
Bolsas para descarte de basura.
Papel tornasol.
Caja de petri estril.
Pipeta pasteur estril.
Caja de pretri estril.
Pipetas serolgicas.
Cajas de petri, con medios de
cultivo: Agar Sangre, Mac Conkey. Pipeteador.
Cloro al 0.5 %. Porta objeto limpio y desgrasado
Colorantes: Para Gram. (Cristal Tiras reactivas para orina.
Violeta, Solucin de Lugol, Alcohol Torundas de algodn.
Acetona, Solucin de Safranina) Tubos microcentrfuga estriles
Cubre objetos limpios. capacidad 2 ml.
Enlenmeyer con 20 ml de Agar Tubos tapa rosa estriles, para
Nutritivo. Agua Destilada estril.
Frascos con aceite de inmersin. Tubos tapa rosca con arena y
Frascos con muestra desinfectante.
desconocida. Tubos tapa rosca con agua
Guantes de ltex. destilada estril.
Incubadora a 37C Varillas de vidrio para
coloracin.
Vortex.
Mechero de Bunsen.
61
6. Procedimiento
Obtencin de muestra
Orina de segundo chorro, obtenida 2 horas antes como mximo, sin preservantes.
PARTE I. Aspectos macroscpicos: observacin directa de la muestra

Tome nota directamente de las siguientes observaciones de la muestra de orina.
Color: Clara, amarilla, caf, roja, etc.
Aspecto: Lmpida, turbia, semi turbia.
Presencia de sangre.
Presencia de contaminacin con heces fecales.
PARTE II Preparacin del frotis

Trabaje frente al Mechero Bunsen.
Tome el frasco que contiene la muestra y verifique que se encuentre bien puesta
la tapa y bien enroscada.
Agite cuidadosamente el frasco, aproximadamente con unos 20 movimientos, con
una trayectoria de aprox. 30 cm.
Tome aproximadamente 2 ml de muestra, con ayuda de una pipeta Pasteur
estril.
Con cuidado introduzca la muestra dentro del tubo de microcentrfuga y tape
cuidadosamente.
Nivele el tubo de la muestra con otro tubo del mismo tamao que puede contener
nicamente agua.
Introduzca los dos tubos (el que contiene la muestra y el que contiene agua) en la
centrifuga, en posiciones opuestas.
Tape la centrifuga y centrifugue por 2 minutos a 3,000 rpm.
Destape cuidadosamente la centrifuga, cuando sta se halla detenido
completamente.
Retire los tubos de la centrfuga y trabaje con el tubo de la muestra.
Destape cuidadosamente y descarte el sobrenadante en un beaker con cloro al
0.5 %.
Rotule dos lminas portaobjetos limpios y desgrasados (a y b) con su nombre
Agite (con ayuda del vortex) el sedimento con un poco de sobrenadante que
qued en el tubo
62
En el portaobjetos (a), con ayuda de la pipeta Pasteur estril, coloque una gota
del sedimento en la porcin central del mismo y sin dejar secar, colquele un
cubre objeto limpio. NOTA: de lo contrario djela en cmara hmeda
OBSERVE AL MICROSCOPIO CON EL LENTE 40 X (Seco fuerte).
Con la segunda lmina (b) proceda de la misma forma que con la anterior (lmina
a), nicamente agregando el procedimiento de frotacin, hasta lograr un
extendido fino, el cual debe dejar secar a temperatura ambiente, para luego fijar
a la llama y colorear con la tincin de Gram.
OBSERVE AL MICRSOSCOPIO CON EL LENTE DE INMERSION (100 X)
PARTE III Identificacin del germen

Inoculacin en variaos medios de cultivo (agar Sangre y MacConkey).
Trabaje frente al Mechero Bunsen.
Rotule ambas cajas con su nombre y el nmero de la muestra.
Agite (con ayuda del vortex), el mismo tubo de microcentrfuga del procedimiento
anterior (parte II)
Extraiga una gota de la mezcla con la pipeta Pasteur estril
Destape primero una caja y coloque una gota en el medio de cultivo.
Proceda igual con la segunda caja.
Destape de nuevo cuidadosamente la caja de agar Sangre y, con ayuda del asa
estril, esparza la muestra sobre toda la superficie del agar.
a. Repita la operacin con la caja que contiene el medio de Mac Conkey.
Incube a 37 C por trmino de 24 a 48 horas.
PARTE IV Tincin de Gram

Coloree la segunda lmina (b) que se prepar en la Parte II del procedimiento con
la tincin de Gram, as:
Cubra la lmina con solucin cristal violeta y djela actuar por un minuto.
Cubra el frotis con alcohol acetona por un minuto
Cubra la lmina con solucin de safranina durante un minuto.
63
PARTE V Recuento de colonias

Trabaje frente al mechero Bunsen. Trabaje con el recipiente inicial que contiene
la muestra. Las tcnicas ms empleadas son la de asa calibrada o la de las
diluciones progresivas de orina.
Tcnica de diluciones progresivas.

Utilice tres tubos tapa rosca, conteniendo 9 ml de agua destilada estril.
Rotule el primer tubo rotlelo como dilucin 1:10.
Rotule el segundo como dilucin 1:100
Rotule el tercero como dilucin 1:1000
Tome 1 ml de muestra con ayuda de una pipeta serolgica estril y agrguelo al
primer frasco (dilucin 1:10).
Con la pipeta serolgica, mezcle suavemente la muestra y el agua.
Transfiera 1 ml de la mezcla del primer tubo al segundo tubo (dilucin 1:100).
Repita el procedimiento del punto h con el segundo tubo.
Transfiera 1 ml de la mezcla del segundo tubo al tercer tubo (dilucin 1:1000)
Vuelva a mezclar suavemente.
Extraiga 1 ml del tercer tubo, depostelo en el fondo de una caja de petri estril y
agregue 20 ml de agar nutritivo fundido y a 45 C.
Tape la caja de petri y agite suavemente en forma de crculos.
Espere a que solidifique el medio.
Lleve a la incubadora a 37 C y lea transcurridas 18 horas.
Contabilice las colonias.
PARTE VI. Observacin al Microscopio

Lmina en fresco:
Reporte la presencia de las siguientes estructuras:
1. Clulas epiteliales.
2. Moco
3. Cristales
4. Cilindros
64
5. Leucocitos.
6. Eritrocitos.
7. Levaduras.
8. Bacterias.
Lmina coloreada.
1. Agregue una gota de aceite de inmersin, al frotis coloreado.
2. Utilice el objetivo de inmersin.
3. Anote a continuacin los resultados obtenidos, acompaado de
ilustraciones esquemticas.
PARTE VII Determinacin de pruebas bioqumicas

Destape cuidadosamente el frasco que contiene la muestra.
Sumerja la tira reactiva durante 5 segundos dentro del frasco que contiene la
muestra, revisando que el lquido cubra la totalidad de los cuadritos de reaccin.
Retire la tira sin derramar muestra y sin tocar la pared del recipiente.
Limpie con cuidado la parte trasera de la tira, con un trozo de papel absorbente
A continuacin coloque la tira reactiva, sobre una base horizontal no absorbente
o sobre el recipiente de orina. Espere un minuto.
Trascurrido el tiempo, compare la reaccin de color con los colores que aparecen
en la etiqueta del frasco que contiene las tiras reactivas. El color predominante
en la zona es decisivo. Durante la interpretacin, no debe tomarse en cuenta
cualquier mancha pequea de diferente color.
Reporte:
Densidad, Glucosa,
pH, Cetonas,
Leucocitos, Urobilingeno,
Nitritos, Bilirrubina y
Protena, Sangre o eritrocitos.

microbiologa.
bolsas rojas.
65

TRABAJO.
8. Cuestionario
a. Cul es el procedimiento para tomar una muestra de orina del segundo
chorro?
b. Cmo se realiza el conteo de colonias?
c. Cul es la funcin de la dilucin?

Investigue sobre los agentes causales de infecciones urinarias.

Biblioteca Nacional de Medicina. Enciclopedia Mdica. Estados Unidos. Cultivo
de Orina. 10/06/2005. 17 de marzo del 2006.
Hohenberger E. y Colaboradores. Compendio, Urianlisis con tiras reactivas
2da. Edicin. Editorial Roche Diagnostico. Alemania.
MIRASA. S.L. Valdemoro, Madrid.
66
EXAMEN DE HECES EN FRESCO

Y COPROCULTIVO
Prctica 10
1. Introduccin
Una gran variedad de bacterias pueden producir infecciones gastrointestinales.
Estas bacterias, generalmente son las pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,
quienes normalmente habitan en el intestino humano, que se conocen comnmente como
enterobacterias, formando el 1 % aproximadamente de la microbiota fecal y el resto los
constituyen las bacterias anaerobias.
El material slido de las heces est compuesto esencialmente por restos alimenticios
no digeribles y productos que han sido secretados o se acumulan en la luz del intestino,
entre ellos: secreciones mucosas, celulosa, restos de jugos intestinales, procedentes del
hgado, pncreas y otras glndulas digestivas, enzimas, leucocitos, clulas epiteliales,
glbulos de grasa, productos nitrogenados. El olor desagradable de las heces humanas
se debe, sobre todo, a la presencia de indol, escatol, mercapatanos y sulfuro de
hidrgeno, que son producto del metabolismo bacteriano.
Demostrar por medio de un cultivo de heces (coprocultivo) la presencia de
enterobacterias es de suma importancia, ya que el resultado de este cultivo puede
confirmar el diagnstico clnico e iniciar el tratamiento indicado para el paciente. Tambin
la presencia de estos organismos coliformes se utiliza con frecuencia como ndice de
posible contaminacin fecal del agua, de la sangre y de otros materiales de importancia
sanitaria.
2. Objetivos
Que el estudiante
Comprenda las ventajas que aporta un adecuado manejo de muestra, para la
realizacin de un coprocultivo y con ello un diagnstico certero.
Adquiera habilidad en el manejo de diferentes medios de cultivo.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa de las ventajas que
aportan el uso de diferentes medios de cultivos, para un adecuado aislamiento de
Enterobacterias, y comprenda la importancia de un adecuado y pronto resultado, para el
inicio del tratamiento correspondiente.
4. Antecedentes
La microscopia y el cultivo son medios de los que nos servimos para determinar la
causa de una infeccin. El procedimiento que se utiliza suele iniciarse con la toma de
67
muestras de los tejidos, heces, orina, exudados, lquidos corporales, etc. del paciente. A
continuacin, estas muestras se estudian en el laboratorio de microbiologa y se observan
los microorganismos presentes, tales como bacterias, a travs del microscopio. El cultivo
tienen como funcin lograr la proliferacin de esos microorganismos y de ese modo poder
estudiarlos mejor.
Bacterias
Son organismos unicelulares (formados por una sola clula) de tamao muy pequeo
(como mximo de algunas milsimas de milmetro de longitud). En general son capaces
de desarrollarse de modo independiente en el medio en que viven. Son procariotas,
puesto que su ncleo no est diferenciado y generalmente estn cubiertas de una gruesa
pared celular.
Procesamiento de las muestras
Una vez que llegan las muestras al laboratorio, se realiza una tincin de una
extensin sobre un portaobjetos, as poder observar la morfologa de los microorganismos
presentes en la muestra y sus caractersticas tintoriales. Luego se procede a inocular
distintos medios de cultivo.
Estos medios de cultivo se examinan para detectar el crecimiento de los posibles
microorganismos existentes en las muestras. Una vez que se detecta el crecimiento de
algn microorganismo se procede a su identificacin mediante distintas pruebas
bioqumicas y se realiza un antibiograma (para estudiar la sensibilidad del microorganismo
aislado frente a distintos antibiticos).
Alcohol al 70% (5.0 ml/A) Frascos aceite de inmersin (2

Aplicadores de madera. (2/A) gotas/A)
Asas en aro. Frascos con muestra
Beakers con cloro (1 por mesa, con desconocida (10 g)
20 ml de cloro) Guantes de ltex.
Bolsas para descarte de basura. Incubadora a 37 C.
(dos/prctica) Lentes de proteccin.
Cajas de petri limpias (cmara Marcador indeleble para vidrio.
hmeda; 1 caja /A) Mechero de Bunsen.
Cajas de petri limpias. (1/A) Microscopio compuesto.
Cajas de petri, con medios de Papel limpia lentes.
cultivo: XLD, SS, Mac Conkey. (1 de Papel mayordomo.
c/u por A) Papel tornasol (3 cm/muestra
Centrfuga. desconocida)
Cloro al 0.5 % (25 ml/muestra Perillas de goma.(1 por muestra)
desconocida) Pipeta pasteur
Colorantes: Para Gram. (Cristal estril.(1/muestra)
Violeta, Solucin de Lugol, Alcohol Porta objeto limpio y
Acetona, Solucin de Safranina), desgrasado.(2/A)
Cubre objetos limpios (2/A) Torundas de algodn (1/A)
Tubos Split.
68
Tubos tapa rosca con arena y Tubos tapa rosca con agua
desinfectante. (5.0 ml/A de destilada estril (5.0 ml/A)
desinfectante) Varillas de metal para
Tubos tapa rosca con Solucin coloracin.
Salina estril. ( 2.0 ml / A ) Vortex.
6. Procedimiento
PARTE I. Observacin directa de la muestra
Tome nota directamente de las siguientes observaciones de la muestra de heces.
Consistencia (formada, semiformada, pastosa, lquida)
Color: (caf, marrn, amarilla, negra, etc.)
Presencia de restos alimenticios
Presencia de moco.
Presencia de sangre.
PARTE II Determinacin de pH
Tome un portaobjetos limpio y deposite un trozo de papel pH o tornasol.
Deposite una pequea porcin de muestra con ayuda del aplicador de madera
sobre el papel tornasol.
Lea y anote el pH, dependiendo de la escala de colores.
Reporte
pH cido rango de 1 a 6.9
pH neutro 7.0 exacto
pH alcalino rango de 7.1 a 14
PARTE III Preparacin de la emulsin

Trabaje frente al mechero.
Destape frente a un mechero el tubo split.
Deje el extremo plano hacia abajo, y el extremo cnico hacia arriba.
Al destapar el tubo, verifique que la paletita quede unida al extremo cnico.
Agregue 2 ml de solucin salina al tubo de fondo plano con ayuda de una pipeta
Pasteur.
Tome aproximadamente 0.5 g de muestra con ayuda de la paletita e introdzcala
en el tubo plano.
Enrosque con cuidado, asegurndose que cierre hermticamente.
69
Envuelva la rosca del tubo con un algodn humedecido con cloro al 0.5 %.
Agite vigorosamente con ayuda del vortex, o manualmente, manteniendo siempre
el extremo plano hacia abajo, hasta la completa disolucin de la muestra.
Coloque el tubo en la centrfuga de forma que el extremo cnico quede hacia
abajo y centrifugue por 5 minutos. El material debe pasar a travs del colador.
Coloque el tubo en la gradilla, espere de 3 a 4 minutos para que decanten lo
aerosoles.
Destape cuidadosamente y descarte el sobrenadante en el beaker con cloro al
0.5 %
PARTE IV Siembra en diferentes medios de Cultivo.

Trabaje frente al mechero Bunsen. Con la emulsin obtenida en la parte III del
procedimiento trabaje las siembras en los diferentes medios de cultivo. (XLD, SS, y
MacConkey).
Rotule cada una de las cajas de medios de cultivo.
Agite el tubo muy suavemente.
Extraiga una gota de la emulsin con ayuda de una pipeta Pasteur estril.
Destape con cuidado una de las cajas que contiene el medio de cultivo (XLD) y
deposite una gota de la emulsin en un extremo de la misma, sobre el agar.
Destape de nuevo la caja y estri el contenido del material en toda la superficie
del medio, con ayuda de un asa en aro, debidamente esterilizada, siguiendo las
instrucciones del catedrtico.
Repita el mismo procedimiento para la siembra de los medios SS y del Mac
Conkey.
Incube las tres cajas de medio ya inoculadas, en la incubadora a 37 C por
trmino de 24 a 48 horas.
Apague el mechero.
PARTE V Preparacin del frotis.

Rotule dos lminas portaobjetos limpios y desgrasados con su nombre o nmero
de la muestra.
Resuspenda el sedimento, con agitacin leve.
Coloque una gota de la emulsin, en cada uno de los portaobjetos.
En el primer portaobjeto, coloque un cubre objeto limpio y OBSERVE AL
MICROSCOPIO CON EL LENTE 40 X (seco fuerte). Si va a demorar para la
observacin microscpica, coloque esta lmina en cmara hmeda, hasta
su observacin.
70
Con la segunda lmina proceda de la misma forma que con la anterior,

nicamente que la frotacin es hasta lograr un extendido fino, el cual debe dejar
secar a temperatura ambiente, para luego fijar a la llama y colorear con la
Tincin de Gram.
OBSERVE AL MICRSOSCOPIO CON EL LENTE DE INMERSION (100 X)
PARTE V Tincin de Gram.

Coloree la segunda lmina que se prepar en la Parte VI del procedimiento con la
tincin de Gram.
Cubra la lmina con solucin cristal violeta y djelo actuar por un minuto.
Escurra el colorante, lave con agua de chorro y escurra.
a. Escurra el colorante, lvela con agua de chorro y escurra.
Cubra el frotis con alcohol acetona por un minuto.
Escurra el alcohol acetona, lave con agua de chorro y escurra.
Cubra la lmina con solucin de Safranina, durante un minuto.
PARTE VI. Observacin al Microscopio.

a. Lmina en fresco:
Anote los resultados de la observacin inmediata segn el Parte V del
procedimiento.
b. Lmina coloreada.
Agregue una gota de aceite de inmersin al frotis coloreado.
1. Utilice el objetivo 40X y luego el objetivo de inmersin.
2. Anote a continuacin los resultados obtenidos, acompaado de
ilustraciones esquemticas.

microbiologa.
bolsas rojas.
71

TRABAJO
8. Cuestionario
a. Por qu se utilizan estos tres tipos de medios?
b. Cules son las ventajas de un adecuado manejo de muestra?
c. Cules son algunos de los errores que conducen a falsos resultados?
d. Qu aportes proporcionan estos exmenes al mdico tratante?

Responda el cuestionario y realice la investigacin.
Investigue cules de todas las Enterobacterias son oportunistas y cules son
patgenas
Investigue sobre la sintomatologa causada por las Enterobacterias en general.
Complete la informacin solicitada en el cuadro despus de realizar la lectura.
Medio de Color del medio Color del Nmero y Nmero y Nmero y

cultivo antes de la medio color de color de color de
siembra despus colonias colonias colonias
de la lactosa lactosa con cido
incubacin positivas negativas sulfrico
Mac Conkey
SS
XLD

Torres, M. 1999 Manual Prctico de bacteriologa Mdica. 2da. Edicin. Editorial
MIRASA. S.L. Valdemoro, Madrid.
72
PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN

BACTERIANA
(ENTEROBACTERIAS)
Prctica 11
1. Introduccin
Los mtodos de diagnstico en el laboratorio permiten poner de manifiesto tanto las
caractersticas primarias (morfologa de colonias, pigmentos, tincin, movilidad, indol,
oxidasa, catalasa, acidifacin de lactosa, nitratos, entre otros) como las secundarias.
Existe una variedad de medios o caldos de cultivo para poner de manifiesto estas
caractersticas, tales como:
Agar con triple azcar y hierro (TSI)
Medio SIM (SIM)
Agar de citrato de Simmons (C)
Agar lisina y hierro (LIA)
Agar Urea
2. Objetivos
Que el estudiante
Aprenda a realizar una tcnica de identificacin bioqumica para las
enterobacterias.
Comprenda la importancia de toda la informacin que brindan las pruebas
bioqumicas, especialmente para identificar la especie causante de una afeccin
bacteriana.
Adquiera habilidad para la lectura e interpretacin de las diferentes pruebas
bioqumicas.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa sobre las caractersticas
bioqumicas que poseen las enterobacterias y su importancia para una adecuada
identificacin entre un mismo gnero bacteriano.
4. Antecedentes
Adems de las caractersticas morfolgicas, tintoriales, cultivo y otras, las
caractersticas bioqumicas son importantes y, a veces, esenciales en la identificacin y
descripcin de una bacteria. Entre estas pruebas tenemos las ms importantes:
73
Fermentacin en agar triple azcar y hierro (TSI). Este medio se recomienda para
la identificacin de patgenos entricos Gram negativos. En l se indica la capacidad del
microorganismo para fermentar la lactosa, sacarosa y dextrosa, mediante la formacin de
cido y gas, adems de su capacidad de producir sulfuro de hidrgeno. Se usa como
medio inclinado y permite la valoracin de tres parmetros o pruebas bioqumicas:
Superficie inclinada: Valora la fermentacin de la lactosa o sacarosa, originando que
el medio tome un color amarillo debido a la formacin de cidos (A). Contienen rojo de
fenol como indicador de acidez.
Profundidad: Los bacilos fermentadores de la glucosa forman suficiente cido para
que el medio tome un color amarillo en la profundidad o medio entubado, relativamente
anaerobio, pero no en la superficie inclinada. La formacin de gases es caracterstica en
estas condiciones, lo cual hace que aparezcan burbujas e inclusive desplazamiento del
medio hacia la salida del tubo (G).
Sulfuro de hidrgeno (H2S). El medio contiene sales de hierro, para detectar la
produccin de sulfuro de hidrgeno. Los bacilos productores de este gas hacen que el
medio tome un color ennegrecido.
Movilidad en medio SIM. Los medios semislidos se han empleado extensamente

en la determinacin de movilidad de bacterias, adems de la produccin de cido
sulfhdrico y la fermentacin de hidratos de carbono por miembros del grupo Salmonella y
Shigella. Estos medios tambin pueden demostrar la produccin de indol. El medio SIM
se emplea en la identificacin rutinaria en cultivos de miembros de los grupos Salmonella
y Shigella, las cuales manifiestan produccin de cido sulfrico, produccin de indol y
movilidad en el mismo tubo. La motilidad (M) a travs del medio semislido se traduce
por diseminacin de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de
inoculacin (reaccin positiva). Si la motilidad es negativa, el crecimiento se encuentra
restringido en la profundidad. De esta manera, el medio permite distinguir a los
organismos mviles de los inmviles. Algunas bacterias poseen movilidad por medio de
sus flagelos, principalmente los bacilos, aunque existen algunas formas de cocos mviles.
Utilizacin del carbono a travs del agar citrato de Simmons (C). Este medio es
capaz de diferencial entre un coliforme fecal y los miembros del grupo de aergenos,
basndose en la utilizacin del citrato. Tambin se utiliza para la diferenciacin de ciertos
miembros del grupo de Salmonella. Para esta prueba se utiliza el agar de Simmons, el
cual contiene citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador. La nica fuente de
carbono en este medio es el citrato. Si la reaccin es positiva, el indicador se vuelve azul.
Los dems microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde, indicando una
reaccin negativa.
Esta prueba determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente
de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su
metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias, estas
caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
74
Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella,

Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
Fermentacin de agar lisina y hierro (LIA). Este medio se utiliza para la deteccin
de organismos que pueden fermentar rpidamente la lisina. Los cultivos que
descarboxilan la lisina rpidamente provocan una reaccin alcalina (color prpura en todo
el medio) o una reaccin neutra en el fondo del tubo. Los organismos que no
descarboxilan la lisina producen una pendiente alcalina (color prpura) y un fondo cido
(color amarillo). Los cultivos que producen H2S provocan un ennegrecimiento intenso en
el medio. Los microorganismos que desaminan la lisina producen una pendiente roja
profunda sobre un fondo cido (color amarillo). Entre los grupos reconocidos de
enterobacterias que regularmente descarboxilan la lisina de forma rpida y producen H 2S
se encuentran Salmonella y Arizona.
Prueba de urea. Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el

metabolismo bacteriano, la cual, al hidrolizar la urea, forma amonaco que alcaliniza el
medio, evidencindose mediante el cambio de color de medio desde un amarillo plido
hasta un rojo fucsia. El indicador de pH que se usa es el rojo de fenol.
Estereoscopio alumno)
Mechero de Bunsen. Marcador indeleble para vidrio.
Incubadora a 37C Lentes de proteccin.
Cajas de petri, con medios de cultivo: Alcohol al 70% (5.0 ml/A)
Agar Meller-Hinton con cepa Guantes de ltex.
problema. (1/mesa) Papel mayordomo.
Tubos tapa rosca con arena y Torundas de algodn (1/A)
desinfectante. (5.0 ml/A de Beakers con cloro al 0.5% (1 por
desinfectante) mesa, con 20 ml de cloro)
Tubos tapa rosca con agua destilada Bolsas para descarte de
estril (10 ml/A) basura.(dos / prctica)
Tubos con medio: TSI, LIA, SIM (o Asa en hilo (1/A)
MIO), citrato, urea (1 de c/u por
6. Procedimiento
PARTE I. Siembra de batera de medios de cultivo
Trabaje frente al mechero de Bunsen.
Rotule cada uno de los tubos (5) con los medios de cultivo (TSI, LIA, SIM o MIO,
Citrato, Urea) con su nombre y la fecha.
Coloque la caja con el crecimiento bacteriano bajo la lente de estereoscopio y
enfoque.
75
Vea con detenimiento y elija una sola colonia, muy bien aislada (esta servir para
todo el procedimiento)
Destape cuidadosamente la caja de Petri.
Con la punta del asa en hilo muy recta y estril, toque la colonia elegida.
Retire el asa con mucho cuidado, a manera de no tocar otras colonias de la caja
Petri.
Proceda a inocular la batera de tubos para pruebas bioqumicas.
Destape el tubo de TSI y flamee la boca del tubo.
Pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el
fondo del tubo. Retire el asa sin salir del tubo y luego haga un estriado rpido y
parejo en la superficie inclinada.
Sin flamear y con la misma asa inocule el medio LIA, pinchando tres veces y
luego estriando la superficie.
Sin flamear y con la misma asa inocule el medio SIM (o MIO) con una nica
pinchadura al fondo y muy vertical.
Por ltimo, siempre sin flamear y con la misma asa estre la superficie del
medio citrato y urea.
No olvide que cada vez que destapa y tapa cada tubo debe flamear la boca
del mismo.
Coloque las tapas suavemente, no las trasrrosque.
Coloque en la gradilla e incube a 37C por trmino de 18 a 24 horas.
Realice las lecturas y compare los resultados con las tablas correspondientes.

microbiologa.
bolsas rojas.

TRABAJO.
76
8. Cuestionario
a. Por qu se utiliza una sola colonia para realizar la batera de pruebas
bioqumicas?
b. Investigue sobre otros tipos de pruebas bioqumicas que completen la
informacin para la identificacin de enterobacterias.
c. Investigue sobre los resultados esperados para Shigella, Salmonella, E. coli,
Proteus, Klebsiella, Providencia, Serratia y Arizona.

Agregue en una tabla los resultados obtenidos despus de la lectura de los tubos
con medios de identificacin bioqumica.

Corts, J. A. 2001. Prueba del citrato. Recursos didcticos de Biologa. ltima
modificacin: 29 de octubre 2002. Accedido el 8 de noviembre del 2005.
Disponible en: http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/citrato.htm
Universidad de Salamanca. 2004. Aislamiento e identificacin de Shigella sp.
Laboratorio de tecnologa educativa. Departamento de Microbiologa y Gentica.
Accedido el 8 de noviembre, 2005.
2005.
S. L. Valdemoro , Madrid.
77
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

(ANTIBIOGRAMA)
Prctica 12
1. Introduccin
Las pruebas de susceptibilidad a antibiticos se
utilizan para apoyar la quimioterapia antimicrobiana
en procesos infecciosos producidos por bacterias en
las que la susceptibilidad es incierta. Principalmente
cuando la bacteria pertenece a una especie capaz de
mostrar resistencia a los antibiticos comnmente
usados. Entre ellas cabe citar especialmente las
diferentes especies de la familia Enterobacteriaceae.
Los mecanismos de resistencia incluyen la
produccin de enzimas inactivantes de la droga, que
alteran el objetivo, o alteran la accin. Las pruebas
de susceptibilidad rara vez son necesarias cuando la
infeccin es producida por un organismo con una
reconocida susceptibilidad a una droga (susceptibilidad del Streptococcus pyogenes a la
penicilina). Las pruebas de susceptibilidad son tambin importantes en estudios
epidemiolgicos de resistencia y en estudios de nuevos agentes antimicrobianos.
2. Objetivos
Que el estudiante
Ejecute una tcnica de sensibilidad microbiana en placa.
Explique la importancia sobre la informacin valiosa que aporta la tcnica de
sensibilidad microbiana, con respecto al tratamiento para una afeccin bacteriana.
Adquiera habilidad en la lectura e interpretacin de la tcnica de sensibilidad a los
antimicrobianos.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa sobre la metodologa
empleada en la realizacin de tcnicas que determinan la sensibilidad o resistencia de
determinados antibiticos.
4. Antecedentes
Constantemente aumenta la resistencia a los antibiticos por parte de las diferentes
especies bacterianas patgenas. A la vez, aumenta el nmero de antibiticos para uso
teraputico disponibles para el mdico. Los dos aspectos anteriores crean una necesidad
constante de realizar pruebas in vitro para determinar la susceptibilidad a antibiticos de
78
la o las bacterias que causan una infeccin. Sin embargo, el mdico nunca debe perder
de vista que ocasionalmente la susceptibilidad in vivo puede variar.
Existen diversas tcnicas para dicha prueba, pero una de las ms utilizadas y
aprobadas es la Bauer-Kirby, la cual tambin ha sido aceptada como la tcnica estndar
para la realizacin de las pruebas de sensibilidad por difusin con discos y en la mayora
de los casos brinda informacin til. Esta tcnica presenta unas pocas limitaciones. La
prueba slo debe aplicarse a especies bacterianas que han sido cuidadosamente
evaluadas. Las bacterias que crecen con lentitud, las que necesitan nutrientes
especiales, o las que requieren CO 2 o condiciones anaerobias para su desarrollo, no
deben probarse, a menos que la validez del procedimiento haya sido comprobada.
Especialmente debe tenerse en cuenta que slo se pueden obtener resultados confiables
usando la metodologa estandarizada, la cual se ha logrado estableciendo medidas de
dimetro de zona correlacionados con la determinacin de concentracin inhibitoria
mnima (o CIM) con cepas conocidas, susceptibles y resistentes a varios antibiticos
Las colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda desempear un rol
patgeno deben ser seleccionadas en un agar primario y probar su susceptibilidad. Los
procedimientos de identificacin a menudo son realizados al mismo tiempo. No debe
probarse mezclas de diferentes microorganismos en una misma caja de ensayo de
susceptibilidad. La prctica de realizar la prueba de susceptibilidad directamente con
material clnico
alumno)
Estereoscopio
Mechero de Bunsen.
Incubadora a 37C
Alcohol al 70% (5.0 ml/A)
Cajas de petri, con medios de cultivo:
Guantes de ltex.
Agar Meller-Hinton con cepa
problema. (1/mesa) Papel mayordomo.
Tubos tapa rosca con arena y Torundas de algodn (1/A)
desinfectante. (5.0 ml/A de Beakers con cloro al 0.5% (1 por
desinfectante) mesa, con 20 ml de cloro)
Tubos tapa rosca con agua destilada Bolsas para descarte de
estril (10 ml/A) basura.(dos / prctica)
Tubos con medio: TSI, LIA, SIM (o Asa en hilo (1/A)
MIO), citrato, urea (1 de c/u por
6. Procedimiento
PARTE I. Siembra de batera de medios de cultivo
Rotule cada uno de los tubos (5) con los medios de cultivo (TSI, LIA, SIM o MIO,
Citrato, Urea) con su nombre y la fecha.
Coloque la caja con el crecimiento bacteriano bajo la lente de estereoscopio y
79
enfoque.
Vea con detenimiento y elija una sola colonia, muy bien aislada (esta servir para
todo el procedimiento)
Destape cuidadosamente la caja de Petri.
Con la punta del asa en hilo muy recta y estril, toque la colonia elegida.
Retire el asa con mucho cuidado, a manera de no tocar otras colonias de la caja
Petri.
Proceda a inocular la batera de tubos para pruebas bioqumicas.
Destape el tubo de TSI y flamee la boca del tubo.
Pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el
fondo del tubo. Retire el asa sin salir del tubo y luego haga un estriado rpido y
parejo en la superficie inclinada.
Sin flamear y con la misma asa inocule el medio LIA, pinchando tres veces y
luego estriando la superficie.
Sin flamear y con la misma asa inocule el medio SIM (o MIO) con una nica
pinchadura al fondo y muy vertical.
Por ltimo, siempre sin flamear y con la misma asa estre la superficie del
medio citrato y urea.
No olvide que cada vez que destapa y tapa cada tubo debe flamear la boca
del mismo.
Coloque las tapas suavemente, no las trasrrosque.
Coloque en la gradilla e incube a 37C por trmino de 18 a 24 horas.
Realice las lecturas y compare los resultados con las tablas correspondientes.

microbiologa.
bolsas rojas.

TRABAJO
80
8. Cuestionario
a. Por qu se utiliza una sola colonia para realizar la batera de pruebas
bioqumicas?
b. Investigue sobre otros tipos de pruebas bioqumicas que completen la
informacin para la identificacin de enterobacterias.
c. Investigue sobre los resultados esperados para Shigella, Salmonella, E. coli,
Proteus, Klebsiella, Providencia, Serratia y Arizona.
Agregue en una tabla los resultados obtenidos despus de la lectura de los tubos
con medios de identificacin bioqumica.

Corts, J. A. 2001. Prueba del citrato. Recursos didcticos de Biologa. ltima
modificacin: 29 de octubre 2002. Accedido el 8 de noviembre del 2005.
Disponible en: http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/citrato.htm
Universidad de Salamanca. 2004. Aislamiento e identificacin de Shigella sp.
Laboratorio de tecnologa educativa. Departamento de Microbiologa y Gentica.
Accedido el 8 de noviembre, 2005.
2005.
81
LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

OBTENIDOS CON LOS MEDIOS DE CULTIVO
Prctica 13
1. Introduccin
La microbiologa es el estudio de los microorganismos, grupo grande y diverso de

formas de vida libre que existen como clulas aisladas o integradoras de grupos. As
pues, las clulas microbianas son diferentes de las clulas de los animales y las plantas
que son incapaces de vivir aisladas en la naturaleza, en vista de que nicamente pueden
sobrevivir como parte de organismos multicelulares.Para la identificacin del
microorganismo se debe realizar una coloracin o tincin de Gram. La tincin de Gram es
una tincin diferencial porque no todas las clulas se tien de la misma manera y permite
discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias: las eubacterias Gram. positivas y
Gram. negativas.Y puede aislarse un microorganismo conociendo previamente los
requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales ptimas para su crecimiento.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Adquiera experiencia en el manejo de los materiales y tcnicas bsicas que se

utilizarn a lo largo del curso en lo trabajos prcticos.
Refuerce los conocimientos previos sobre el trabajo de laboratorio.
Coordine la parte operativa de trabajo en el laboratorio con las normas de
bioseguridad.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante reforzar los conocimientos previos, sobre el trabajo

del laboratorio y la valiosa informacin que aportan el uso de diferentes medios de
cultivos, para el aislamiento de bacterias y su importancia con la clnica, adems de
comprender el porqu de las medidas de bioseguridad en el trabajo de laboratorio.
4. Antecedentes
Como primer paso en la identificacin de los microorganismos, nos basamos en la

coloracin de Gram, en la cual los microorganismos Gram positivos, como el
Staphylococcusaureus, adquieren un color violeta, dado que contienen una pared celular
estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram negativos, como la
Escherichiacoli, que adquieren un color rosado. La diferencia en la coloracin no se debe
a reacciones qumicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura fsica de
la pared.
82
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado

por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio.
Disponibilidad de nutrientes adecuados. Un medio de cultivo adecuado para la

investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre,
fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias
adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones
qumicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de
carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas
sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los
factores nutritivos lbiles.Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas
sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente
fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos,
que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a
muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden
ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de
naturaleza vitamnica.Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes,
bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
Consistencia adecuada del medio. Partiendo de un medio lquido podemos

modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo
que obtendramos medios en estado semislido o slido.Los medios solidificados con
gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan
adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que
otros tienen la capacidad de licuarla.Actualmente los medios slidos son de uso universal,
por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo
uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases. Gran cantidad de bacterias

pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener
el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios
estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental.
En un punto intermedio, los microorganismosmicroaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las
citadas condiciones.
83
Condiciones adecuadas de humedad. Un nivel mnimo de humedad, tanto en el

medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas
vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35C a 37C proporcionando una fuente
adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los
cultivos y evitar as que se deseque el medio.
Luz ambiental. La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la

oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso
de los microorganismos fotosintticos.
pH. La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de

los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar
que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento
bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos
normales.
Temperatura. Los microorganismosmesfilos crecen de forma ptima a

temperaturas entre 15 C y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a
80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los
patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de
37C, y los saprftos tienen rangos ms amplios.
Esterilidad del medio. Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente
estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o
incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en
dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)
Cuaderno de trabajo de
laboratorio.
Informes anteriores de lecturas de
cajas, con cultivo bacteriolgico.
Hoja de trabajo.
Literatura adicional
84
6. Procedimiento
PARTE I. Clasificacin de la informacin anterior.
Revise su cuaderno de trabajo del laboratorio.
Ordene y clasifique la informacin.
Llene el cuadro siguiente.
Tipo de Aplicaciones Inhibidor Indicador Color y

Nombre del caldo o
medio apariencia
medio de cultivo
de
colonias.
Caldo tripticasa soya.
Agar Nutritivo
S.S.
TCBS.
XLD
Mac Conkey
PARTE II Anlisis de la Informacin.
a. Con ayuda de la tabla, analice la informacin de todos sus resultados

anteriores.
PARTE III Resuelva las siguientes preguntas:
a. Por qu, para una identificacin preliminar deben utilizarse ms de dos

diferentes tipos de medios de cultivo.
b. Cules son las ventajas que tiene el aislamiento de las colonias.
c. Cules son algunos de los riegos que se corren en el laboratorio al no
cumplir con las medidas de bioseguridad.
microbiologa.

TRABAJO.
85
8. Cuestionario
a. Cmo se realiza la lectura en el caso de agar Sangre en cultivo de garganta?

b. Cmo se interpretan los resultados con el Taxo A?
c. Qu resultados aporta la lectura del agar sangre para cultivo de garganta?
Complete la informacin del cuadro.

Indique la bibliografa consultada
Agregue 3 conclusiones de la revisin de material
Lobos, R y Garca M. 1983. Procedimientos y tcnicas de Laboratorio. Edicin

nica. Editorial Universitaria. San Francisco. Santiago de Chile.
86
87
PODER BACTERICIDA
Prctica 14
1. Introduccin
Numerosos compuestos qumicos, tanto orgnicos

como inorgnicos
, son txicos para las bacterias. A los agentes
qumicos que destruyen grmenes patgenos se les
denomina desinfectantes y a los que se aplican tpicamente
se les denomina antispticos. El efecto biolgico de stos
agentes puede ser bactericida o nicamente bacteriosttico.
Algunos de estos compuestos son ampliamente utilizados
en hospitales y son fundamentales para prevenir, erradicar y controlar las
infecciones. El uso y conocimiento adecuado del modo de accin de desinfectantes y
antispticos es muy importante, ya que ellos tienen incidencia directa sobre la salud,
higiene hospitalaria y sobre los ndices de infecciones nosocomiales. Se ha utilizado
muchos mtodos para comprobar el valor bactericida y bacteriosttico de los
desinfectantes. La estandarizacin de dichas sustancias se basa en la comparacin de
las propiedades de las mismas con el fenol. El resultado se expresa con el nombre de
coeficiente fenlico, el cual es la proporcin entre la capacidad germicida de un
desinfectante y la del fenol en condiciones idnticas.
2. Objetivos
Que el estudiante:
Ejecute una tcnica de valoracin de poder bactericida de sustancias qumicas.
Explique la importancia del uso de desinfectantes y antispticos en la prctica
mdica.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa sobre la importancia del
uso de agentes qumicos como parte fundamental de la asepsia y antiasepsia en la
prctica mdica.
4. Antecedentes
La determinacin del efecto antisptico o desinfectante de los diferentes productos es
complicada, porque este efecto depende de gran nmero de factores externos como
temperatura, humedad, pH, tipo de microorganismo a eliminar y muchos ms. Existen
protocolos que regulan la forma como se debe evaluar la eficacia de un compuesto
germicida y entre ellas la ms utilizada es la prueba del coeficiente del fenol (CF), en la
que se utiliza como desinfectante de referencia el fenol y como microorganismo de
referencia el Staphylococcus aureus y la Salmonella typhi.
88
En funcin de su coeficiente fenlico (CF), los germicidas se clasifican en:

Grado alto: Destruyen todos los microorganismos, con excepcin de esporas
bacterianas.
Grado intermedio: Destruyen las bacterias y micobacterias, as como casi todos los
virus y hongos.
Grado bajo: Destruyen la mayor parte de las bacterias, algunos hongos y algunos
virus.
Las clasificaciones anteriores suponen que las superficies de accin deben estar
libres de material orgnico muerto, por lo que un buen lavado mecnico previo es
imprescindible.
El fenol ha sido tradicionalmente el antisptico de referencia con el que se ha
comparado la actividad de otros antispticos. Su actividad se sustenta en una alteracin
de la permeabilidad de la membrana citoplasmtica, lo que produce lisis celular en
elevadas concentraciones. En funcin de su concentracin puede actuar como
bactericida o bacteriosttico. Es activo frente a virus y hongos, y no es activo frente a
esporas. Actualmente se ha restringido su uso por su toxicidad y poder irritante. Tiene un
gran nmero de derivados, siendo los ms conocidos los bifenoles (triclosn y
hexaclorofeno) y halofenoles (cloroxilenol).
El alcohol, especficamente etlico, se usa al 70% como antisptico y desinfectante
de grado intermedio. Como antiviral, es activo solamente ante los virus con cubierta
lipdica. Este antisptico ha resistido la prueba del tiempo y tiene por ventaja que se
contamina slo espordicamente, por lo que se utiliza ampliamente en los hospitales para
la asepsia de la piel, y como desinfectante de estetoscopios, termmetros, ampolletas de
medicamentos de uso mltiple y algunas superficies externas. Tiene por desventaja el
disolver las montaduras de los lentes de instrumentos pticos y endurecer los materiales
plsticos. Su rpida evaporacin limita su uso como desinfectante de superficies
ambientales. El etanol absoluto no tiene efecto germicida.
El cloruro de benzalconio es un antisptico y desinfectante de bajo nivel, que tiene
accin casi exclusivamente sobre cocos Gram positivos. Ya no debe usarse debido a
que la mayora de las infecciones nosocomiales estn causadas por bacilos Gram
negativos, y stos contaminan fcilemnte el cloruro de benzalconio.
La clorhexidina es un antisptico con accin limitada contra micobacterias, hongos y
virus, pero tiene una excelente accin contra las bacterias que causan las principales
infecciones nosocomiales (cocos Gram positivos y bacilos Gram negativos). Se ha
utilizado con xito en el lavado de manos en reas crticas de los hospitales, as como en
la antisepsia preoperatoria. Tiene un efecto residual sobre la piel, lo que parece limitar el
crecimiento bacteriano.
El mertiolato o timerosal es una solucin etanlica cuyo soluto principal es el cloruro
etilmercrico. Tiene una actividad bacteriosttica y fugisttica dbil, siendo inactivo frente
a virus, micobacterias y esporas. Si se aplica en superficies extensas de la piel y se
absorbe puede provocar problemas renales. La aplicacin prolongada en mucosas
orofarngea y rectal provoca envenenamiento mercurial. Se han descrito reacciones de
hipersensibilidad. Se inactiva en presencia de materia orgnica. A pesar de todo, se
sigue empleando a nivel popular como antisptico en pequeas heridas y muchos
mdicos an lo utilizan.
89
Pipetas Pasteur estriles, con
Alcohol al 70% (5.0 ml/A) bulbo
Asa en argolla Solucin de alcohol al 60%, al
Beakers con cloro al 0.5% (1 por 70% y al 80%
mesa, con 20 ml de cloro) Soluciones de antispticos:
Bolsas para descarte de cloro al 5%, al 2.5% y al 1.25%,
basura alcohol al
Cajas de petri, con medios de Suspensiones bacterianas
cultivo: Agar nutritivo (1/A) de Staphylococcus aureus,
desinfectante comercial puro, en Pseudomonas y E. coli en caldo
dilucin 1:2 y en dilucin 1:4 tripticasa soya
Guantes de ltex. Torundas de algodn (1/A)
Incubadora a 37C Tubos con estndar 0.5
Jabn comercial puro, en de McFarland
dilucin 1:2 y en dilucin 1:4, Tubos tapa rosca con
Lentes de proteccin. arena y desinfectante. (5.0
Marcador indeleble para vidrio. ml/A de desinfectante)
Mechero de Bunsen. Tubos con solucin salina
Papel mayordomo. estril (1/A)
Pipetas serolgicas de 1.0 Tubos tapa rosca con agua
mL, estriles (1/A) destilada estril (10 ml/A)
6. Procedimiento
Rotule cada caja con agar indicando nombre personal, fecha, desinfectante y
dilucin. Divida la caja en cuatro reas, identificndolas por la orilla de la
siguiente manera:
0 minutos, 5 minutos, 10 minutos y 15 minutos.
Cada persona trabajar con un microorganismo y tres diluciones de un
desinfectante, una por una.
Prepare una suspensin bacteriana de acuerdo con el estndar 0.5 de
McFarland.
Tomando el tiempo, aada 0.5 mL de la suspensin bacteriana de la dilucin
correspondiente del desinfectante.
Inmediatamente despus de agregar la suspensin bacteriana al desinfectante,
deposite una asada de la suspensin y estre en el cuadrante correspondiente a
los cero minutos en la caja de agar nutritivo.
Al cumplirse cinco minutos, tome una asada de la suspensin y estre el
cuadrante correspondiente.
Al cumplirse diez minutos, tome una asada de la suspensin y estre el
90
Al cumplirse quince minutos, tome una asada de la suspensin y estre el

Espere unos minutos hasta que los inculos se sequen e incube la caja a 37C
durante 24 horas.

microbiologa. b. Todo material empleado en las prcticas microbiolgicas, se
descarta en las bolsas rojas.
No dejar por ningn motivo, cajas, tubos o cualquier otro material contaminado, en
lugares que no correspondan al rea de trabajo.

TRABAJO.
8. Cuestionario
a. Cul es la tcnica asptica a aplicarse en caso de toma de una muestra de
sangre, ciruga mayor, ciruga menor y curacin de una herida?
b. Investigue sobre el mecanismo de accin de cada uno de los germicidas
utilizados en la prctica, explique en qu casos se utilizan como desinfectantes
y en qu casos se utilizan como antispticos.
c. Discuta, segn sus resultados y lo investigado, cul es la mejor forma de
utilizar las sustancias incluidas en esta prctica.

Complete la siguiente tabla anotando en la casilla correspondiente el nmero de
colonias halladas.
Crecimiento del microorganismo (+), ausencia de crecimiento (-)
0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15
Cloro
Alcohol
Jabn
Desinfectante
91

Lobos, R. y Garca, M. 1983. Procedimientos y tcnicas de laboratorio. Edicin
nica. Editorial Universitaria. San Francisco. Santiago de Chile.
Bernard, John. 1991. Tood-Standford-Davidson Diagnstico y tratamiento
clnico por el Laboratorio. 8 Edicin. Editorial Salvat. Barcelona, Espaa.
Koneman y colaboradores. 1992. Diagnstico microbiolgico. 3 Edicin.
Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
92
CONSOLIDADO DE PRCTICAS DE LABORATORIO

Repaso
1. Introduccin
Para la identificacin de gneros y especies bacterianas es necesario realizar gran

diversidad de pruebas en el laboratorio de microbiologa. Algunas de las pruebas ms
usadas en Guatemala para identificacin de los gneros y especies que con ms
frecuencia producen infecciones las desarrollamos en las prcticas anteriores de
laboratorio. Estas pruebas y muchas ms se integran para poder realizar una
adecuada identificacin a partir de muestras tomadas a pacientes.
2. Objetivos
Que el estudiante
Integre los conocimientos y destrezas adquiridas en las todas las prcticas de

laboratorio realizadas a travs del semestre para la identificacin de bacterias gram
positivos y gram negativo.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante obtendr una idea completa sobre la aplicacin correcta
de diversas pruebas para la identificacin de gneros y especies bacterianas.
4. Antecedentes
Despus de tomar una muestra de un paciente para realizar un diagnstico

microbiolgico, se realiza regularmente la inoculacin de medios de cultivo
adecuados considerando el tipo de muestra, su procedencia y el tipo de bacteria que
se espera aislar. En la mayora de casos, a las 24 o 48 horas de incubacin de los
medios de cultivo primarios (A. sangre, A. Chocolate, Mac Conkey, S.S. y otros) se
obtiene abundante crecimiento bacteriano que el microbilogo debe interpretar, para
decidir que tipo de pruebas de identificacin realizar. Las pruebas de identificacin
para enterobacterias ms utilizadas estn incluidas en la batera y para identificacin de
cocos gram positivo es fundamental la utilizacin de taxos y la observacin del
crecimiento en agar sangre de carnero.
93
Alcohol al 70% Bolsas para descarte de basura

Papel mayordomo. Computadoras
Torundas de algodn
6. Procedimiento
A continuacin encontrar casos clnicos en los que tendr que identificar el

gnero y la especie de las bacterias de acuerdo con la informacin que se le
proporcionar. Adems deber responder algunas preguntas o completar lo que se
indique. Para la resolucin de los casos podr utilizar todas las prcticas anteriores de
laboratorio e informacin de Internet. Al finalizar su trabajo deber entregarlo a su
profesor de Microbiologa en hojas en blanco, escribiendo pregunta y respuesta de cada
caso.
Caso clnico 1
Varn de 40 aos con antecedentes de alcoholismo crnico que ingreso por
cuadro de disnea, fiebre precedida de escalofros, dolor pleurtico derecho y tos con
expectoracin purulenta
Interpretacin de Gram
Morfologa:
Tipo de Gram
Agar Sangre (descripcin de las colonias,

incluyendo apariencia, color, etc.)
94
Agar MacConkey
(Descripcin de la colonia, apariencia, color,

utilizacin de la lactosa)
TSI:
LIA:
MIO
CITRAO
UREA
Resistente
Susceptible
Gnero y especie bacteriana: _______________
Diagnstico: ________________
Conclusin del caso _______________________________________________________

________________________________________________________________________
95
Caso clnico 2
Nio de 12 aos con fiebre de 38.5 C, cefalea, faringe y las amgdalas
eritematosas, cubiertas por exudado amarillento, a la palpacin los ganglios cervicales se
hallan hipertrficos y dolorosos
Interpretacin de Gram
Morfologa:
Tipo de Gram
Agar Sangre
Tipo de hemlisis (, o )
Descripcin de la hemlisis
Interpretacin de la prueba
Antibitico que contienen el taxo
96
Gnero y especie bacteriana:
Diagnstico:
Antibitico Recomendado:
Conclusin del caso ______________________________________________________

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Caso clnico 3
Paciente adulto, sexo masculino, 45 aos, comerciante. Llega a la emergencia por

nausea, vmitos, dolor abdominal y disentera de 2 das de evolucin
Gram de heces fecales (dibujo) Descripcin
MacConkey
97
S.S.
Bateria
TSI
LIA
MIO
CITRATO
UREA
Gnero y especie bacteriana:
Diagnstico:
Conclusin del caso _______________________________________________________

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
____________
Caso clnico 4
Paciente femenino de 55 aos de edad, ingresa a la emergencia del hospital por
presentar tos productiva con hemoptisis. Se pide al laboratorio realizar una muestra de
esputo. Indique
98
Descripcin de lo
observado
Significado clnico de la observacin (diagnstico presuntivo)

______________________________________________________________________
Tincin de la muestra ____________________________________________________
Gnero y especie del microorganismo _______________________________________
Conclusin del caso ______________________________________________________

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________
Lobos R. y Garca M. 1983. Procedimientos y tcnicas de Laboratorio. Edicin

Torres,M. 1999 Manual Prctico de Bacteriologa Mdica. 2da. Edicin. Editorial
Serviprensa C.A. Guatemala Guatemala.
Bernard, John. 1991 Todd-Sandford-Davidsohn Diagnstico y Tratamiento
Clnicos por el Laboratorio. 8 Edicin. Editorial Salvat. Barcelona, Espaa.
Koneman y Col. 1992 Diagnstico Microbiolgico. 3 Edicin. Editorial Mdica
Panamericana.
99

Manual de Microbiologia I Medicina 2014 PDF

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REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE

1. El alumno deber ingresar al laboratorio con equipo de seguridad:

El laboratorio inicia puntualmente, no se permitir el ingreso tarde bajo ninguna

3. El alumno no podr ingresar al laboratorio si:

Si tiene el cuaderno incompleto o hay evidencia de copia entre dos o ms

4. En el laboratorio est prohibido el ingreso de:

5. En las prcticas no se puede ingresar al laboratorio con uas acrlicas, joyera.

7. El alumno es responsable del material que recibe, mantenindolo limpio y en perfecto

8. En caso de que el estudiante dae parcial o totalmente un material, deber firmar un

El cuaderno de laboratorio contiene las siguientes secciones:

Seccin Contenido Valor (pts)

2. DESARROLLO DE LA PRCTICA DE LABORATORIO

El reporte de laboratorio incluye las siguientes secciones:

NOTA: Algunas secciones no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega

DISTRIBUCIN DE LA ZONA DE LABORATORIO

Rubro a evaluar Punteo

No. Nombre Fecha

Prctica 4. Tcnicas de aislamiento bacteriano y recuento bacteriano 28

Prctica 5. Tinciones especiales: 34

Prctica 10. . Examen de heces en fresco y coprocultivo 67

Prctica 11. Pruebas bioqumicas para la identificacin bacteriana 73

Prctica 12. Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos 78

Prctica 13. Lectura e interpretacin de resultados obtenidos con los 82

Prctica 14. Poder bactericida 87

INTRODUCCIN, NORMAS DE BIOSEGURIDAD Y

Las GLP surgieron con el objetivo de disminuir los accidentes e incidentes en el

RECUERDE QUE LOS ERRORES HUMANOS, LAS TCNICAS INCORRECTAS

Recipientes para muestras

Manejo de cajas de petri

Manejo de lminas portaobjetos

PARTE II. Buenas prcticas de laboratorio

Notificar de inmediato cualquier tipo de accidente e incidente suscitado en el

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad

NINGN EQUIPO DE PROTECCIN SUSTITUYE EL CUIDADO,

9. Formato de presentacin de resultados

10. Bibliografa de referencia

USO ADECUADO DEL MICROSCOPIO

En el sistema "seco" el flujo luminoso se limita por el ngulo slido U y en el lado

PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.

Si no est haga girar el revolver, haga descender la platina hasta el mximo y

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad

8. Formato de presentacin de resultados

cada uno de nosotros posee un espectro particular e individualizado de microorganismos.

Retirar el camo y el papel de cada uno de los erlenmeyer.

Colocar el tubo en la gradilla.

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad

9. Formato de presentacin de resultados

10. Bibliografa de referencia

TCNICAS DE AISLAMIENTO BACTERIANO Y RECUENTO

Bacterias mesfilas viables en agar, durante 24 hrs. a 37C:

Si en una muestra de agua se obtiene un valor superior a 500 UFC/ml es necesario

Toma de muestra de un grifo en una caera de agua corriente:

Papel mayordomo. Guantes de ltex.

PARTE I. Inoculacin del Caldo de Enriquecedor

PARTE II. Inoculacin de las cajas con medio slido o agar.

PARTE III. Recuento de bacterias en muestra de agua de chorro.

PARTE IV. Lectura de los medios y caldo.

Para el agar nutritivo, contar el nmero de colonias presentes en cada caja y

a. Placa 1(muestra sin diluir): 300 colonias

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad