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Prcticas
3. TCNICAS DE CROMATOGRAFA Y
ESPECTROFOTOMETRA........................... 37
4. TCNICAS HISTOLGICAS Y
MICROSCOPIA ............................................ 45
5. TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y
ELECTROFORESIS ............... 53
1. Objetivo
2. Introduccin
La fisiologa y otras ramas de la biologa son ciencias cuantitativas que requieren de un sistema
de medicin estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medicin precisa.
La balanza compara la masa desconocida de una sustancia con la masa de un patrn o patrones de
referencia (internos o externos), sometidas ambas a la misma aceleracin debida a la gravedad. Al
proceso de comparar masas se denomina pesada.
El rasgo que define a las balanzas de laboratorio es el de la precisin junto al de alta resolucin.
Una vez calibradas, tienen tambin un alto grado de exactitud.
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
Precisin: capacidad de dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas
condiciones. Grado de concordancia o repetitividad de un resultado.
Una balanza ser precisa cuando diferentes medidas de una misma magnitud sean muy
parecidas. Una medida comn de la variabilidad es la desviacin estndar de las mediciones.
Resolucin: incremento de peso ms pequeo que permite diferenciar una medida de otra
Algunas balanzas, del tipo 2-4, tienen capacidad y legibilidad dual: pueden aumentar su
capacidad disminuyendo su legibilidad o disminuir su capacidad y aumentar su legibilidad.
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
1. Localizacin de la balanza
a) En una sala con una entrada, el mnimo nmero de ventanas. Evitar la luz directa del sol y corrientes
de aire. Evitar choques y vibraciones.
Si las balanzas estn ubicadas en lugares con alto grado de vibracin, se recomienda
colocarlas sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, la amortiguacin por aire evita
todo tipo de oscilaciones y vibraciones de una forma efectiva).
b) Mantener la temperatura de la sala constante. Humedad entre 45 - 60%.
c) Realizar las medidas lejos de fuentes de calor y de aparatos que utilicen ventiladores.
2. Cuidados bsicos
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
2.2 Pipetas
En el laboratorio, la medicin precisa del volumen es tan importante como la medicin precisa de
la masa. La medicin fiable del volumen se realiza con una pipeta, una bureta o un matraz aforado.
Las pipetas permiten la transferencia de volmenes medidos exactamente de un recipiente a otro.
1. Aforadas: transfieren un slo volumen fijo, las hay desde 0.5 a 200 mL
2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 mL
El llenado de las pipetas nunca se debe de hacer aspirando con la boca. Existen accesorios
auxiliares para macropipeteado que facilitan la operacin de carga y descarga.
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
1. Aspiracin: Gire la rueda hacia arriba y aspire, sin producir burbujas, hasta situarse un poco
por encima de la marca de calibracin. Desplace lentamente la rueda en sentido contrario para el ajuste
de la pipeta. Preste atencin al menisco.
2. Vaciado: Presionar la palanca una vez que la pipeta est dentro del tubo o recipiente
recibidor.
- monocanal de volumen fijo: nico volumen de transferencia, existen distintas pipetas que
cubren el intervalo entre 1 L y 1000 L
- monocanal de volumen variable: eleccin del volumen de transferencia mediante
desplazamiento de un micrmetro de ajuste localizado en la parte delantera o superior del
dispositivo. Poseen un indicador del volumen seleccionado
Con un nmero reducido de aparatos se cubre el intervalo entre 0,1 L y 1000 L
- multicanal: igual que la anterior pero dispensando 4, 8 12 veces simultneamente el mismo
volumen. Intervalo entre 0,5-300 L
Micrmetro
Indicador de volumen
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
El uso adecuado de las pipetas automticas est asociado a la eleccin de la punta de pipeta
correspondiente.
N: 0,1 20 L
A: 0,5 20 L
B: 2 200 L
C: 5 300 L
D: 50 1000 L
E: 0,5 5 mL
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
Ejercicio 4. Comprobacin del pipeteo por medida gravimtrica (balanza Denver Maxx).
El uso de pipetas automticas exige una comprobacin regular de la exactitud y precisin de las
mismas
Exactitud: indicada por E = diferencia entre el valor medio y el valor nominal referida al valor nominal
en %
El control de la exactitud se realiza mediante control gravimtrico y aplicando un factor de
correccin Z
Z = 1,0032 L/mg si el control se realiza a una temperatura de 21,5 C a una presin
atmosfrica de 1013 mbar y con agua destilada
Precisin: indicada por el coeficiente de variacin y definido ste como la desviacin estandard en %,
referida al valor medio.
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
Tabla 1
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
PEACHMETRO O PHMETRO
1. Objetivo
2. Introduccin
El pHmetro se utiliza tambin para determinar el pH de aguas, suelos, bebidas y alimentos. Los
instrumentos porttiles facilitan la medida en campo.
Al pHmetro, que mide la diferencia de potencial existente entre dos electrodos, se conecta un
electrodo combinado de pH: un electrodo de vidrio (indicador) y un electrodo de referencia montados
ambos en un solo cuerpo. Se constituye as el sistema necesario para la medida de pH, que debe ser
siempre precedida de una calibracin del equipo con disoluciones tampn de pH conocido.
Electrodo combinado de pH
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
Tipos de elementos de
referencia
Conector
Cable
Cabezal
De penetracin
Para emulsiones
Orificio de relleno
De superficie
Electrolito de referencia: (KCl 3M) puente salino entre el electrodo y el exterior. Impide
que los componentes de la disolucin objeto de medida se mezclen con los del electrodo
de referencia.
Diafragma: punto de unin entre electrolito y muestra. De cermica porosa, que permite un
pequeo flujo de electrolito hacia el exterior estableciendose el circuito elctrico para medicin
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
3. Consideraciones prcticas
4. Calibracin
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
3. Calibrar siempre con disoluciones tampn frescas. Estas se alteran con el paso del tiempo,
con el calor, la luz y, especialmente, con la contaminacin
4. No devolver al frasco del tampn la disolucin utilizada. Utilizar frascos pequeos para la
calibracin
5. Entre medidas, lavar con agua destilada y utilizar un papel sin pelusa para retirar el exceso
de agua
6. Es recomendable para la calibracin, as como para las mediciones, utilizar agitacin. Un
imn y un agitador magntico proporcionan rapidez y repetibilidad en las lecturas.
Tipos de calibracin
DISOLUCIONES Y CONCENTRACIONES
1. Objetivo
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
2. Introduccin
El bioensayo es una tcnica muy utilizada en Fisiologa Animal. Los estudios requieren
habitualmente el uso de disoluciones cuya concentracin inica y osmolaridad mantengan la integridad
y funcionalidad celular, y en los in vitro, adems, que la disolucin est tamponada. Es decir, que
contenga un sistema tampn o buffer para amortiguar las variaciones de pH que pudieran producirse a
lo largo de un trabajo experimental, al igual que hace el plasma.
3. Disoluciones y concentraciones
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
Las disoluciones stock, adems de proporcionar rapidez, disminuyen los posibles errores que se
produciran durante continuas pesadas de los componentes de las disoluciones de trabajo.
Para preparar disoluciones diluidas a partir de las concentradas se utiliza la siguiente ecuacin,
la cual se basa en que el n de moles de soluto de la disolucin diluida es igual al de moles en el
reactivo concentrado.
V1.C1 = V2.C2
Ejercicio 2. Tomando como disolucin stock la de NaCl 1 M, calcular el volumen que habra
que tomar para preparar 10 mL de NaCl 150 mM
5. Disoluciones tampn
Sistemas tampn o buffers son aquellas disoluciones cuya H+ apenas vara al aadir cidos o
bases fuertes. Suelen ser mezclas binarias de un cido dbil y una sal del mismo cido con base fuerte, o
bien una base dbil y la sal de esa base con un cido fuerte.
La eficacia amortiguadora del sistema depende de la proporcin relativa de las formas disociada y
sin disociar, siendo mxima cuando el cociente sal /cido es prximo a la unidad. Esta proporcin est
relacionada con el pH por la ecuacin de Henderson-Hasselbach.
El Tris-HCl es un tampn para medios biolgicos de uso habitual en el laboratorio. Est compuesto
de la base Tris-aminometano (Tris), y su sal cloruro de Tris. Sin embargo, no se suele comprar la sal,
sino slo la base, que se disuelve y se lleva al pH requerido aadiendo HCl. La cantidad de HCl no se
suele medir con precisin, sino que es la necesaria para llevar la solucin al pH deseado.
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
6. Disolucin isotnica
Una disolucin en la que se pueden introducir las clulas sin que se vea alterado su volumen celular
se denomina isotnica. Son disoluciones isotnicas (moleculares, electrolticas o mixtas) las que tienen
la misma osmolaridad que el plasma.
Osmolaridad /L = M .
M = concentracin molar del soluto
= n de partculas en que se disocia el soluto cuando est en disolucin
Osmolaridad/L de una disolucin constituida por un conjunto de solutos = suma de osmolaridades parciales
Osmolaridad
El movimiento pasivo de agua a travs de una membrana semipermeable, y a favor de su gradiente de
concentracin, se denomina smosis. El grado de presin necesario para interrumpir completamente la smosis
recibe el nombre de presin osmtica.
La presin osmtica es proporcional al nmero de partculas disueltas / unidad de volumen lquido. La
concentracin de las disoluciones osmticas en base al n de partculas, se expresa en osmoles. Un osmol es la
cantidad de soluto no disociado cuya presin osmtica corresponde a un mol.
Cuando los no electrolitos se disuelven en un litro de agua, las molculas individuales entran en solucin
separadamente, y cada una constituye una partcula disuelta. Como un mol de soluto tiene el mismo nmero de
molculas (n de Avogadro), una disolucin de glucosa 0.1M tiene el mismo n de partculas que una disolucin
de urea 0.1M. Y ambas la misma presin osmtica = 0.1 osmoles.
Cuando los electrolitos se disuelven en un litro de agua, las molculas individuales se disocian en dos o ms
iones, cada uno de los cuales constituye una partcula disuelta. As 0.1 mol de ClNa, que se disocia en Cl- y Na+,
da lugar a dos partculas y, por lo tanto, ejerce una presin osmtica = 0.2 osmoles.
Una disolucin que contiene 1 osmol de soluto disuelto por litro de agua se dice que tiene una osmolaridad de
1 osmol/L.
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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,
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2. TCNICAS DE
ESTERILIZACIN Y
MEDIOS DE CULTIVO Y
CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Esterilizacin
La esterilizacin es la eliminacin de todos los organismos presentes en un material, incluidas las
esporas y otros agentes infecciosos. La metodologa utilizada depende de la naturaleza del material que
se va a esterilizar. Los principales mtodos para destruir o eliminar microorganismos son los siguientes:
La esterilizacin por vapor se realiza en un autoclave, aparato similar a una olla a presin en la que el
aire presente inicialmente en la cmara se expulsa quedando completamente llena de vapor de agua. La
presin de vapor interna asciende hasta que se alcanzan 121 C de temperatura y 1,1 Kg/cm2 de presin.
En estas condiciones todas las formas vegetativas y endosporas se destruyen en 10-12 minutos, aunque
el tiempo estndar de esterilizacin es de 15 minutos. Por lo general, el autoclave se emplea para
esterilizar medios de cultivo y soluciones acuosas no termolbiles, material de vidrio, plstico y metal.
2. Calor seco
Es menos efectivo que el calor hmedo, necesitndose temperaturas ms altas y tiempos ms largos que
con el calor hmedo para matar a los microorganismos. La muerte celular se produce debido a la
oxidacin de los componentes celulares y la desnaturalizacin de protenas. Este tipo de esterilizacin
se realiza en hornos especiales de esterilizacin y requiere un tiempo de exposicin largo del material
(por ejemplo, 2 horas a 160 C o 1 hora a 180 C). Se utiliza principalmente para la esterilizacin de
material de vidrio (placas de Petri no desechables, pipetas, etc.) y metal, y en algunos casos para
esterilizar productos en polvo, aceites y materiales similares.
Una alternativa de esterilizacin con calor seco es la incineracin, que se utiliza para la destruccin de
material hospitalario contaminado, animales de experimentacin, etc. En el laboratorio, la incineracin
se emplea para la esterilizacin de las asas de siembra metlicas antes y despus de ponerlas en contacto
con los cultivos.
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
3. Filtracin
Es el mtodo alternativo a la esterilizacin por calor cuando se esterilizan lquidos termosensibles o
gases. La filtracin no destruye los microorganismos, sino que los elimina mecnicamente, combinando
un proceso de retencin y absorcin. La tcnica consiste en hacer pasar el lquido o gas a travs de un
material poroso, el filtro, con tamao de poro demasiado pequeo para que pasen los microorganismos,
pero suficientemente grandes para permitir el paso del lquido. Estos filtros retienen las bacterias, pero
dejan pasar los virus.
Los filtros que se utilizan normalmente en la esterilizacin de lquidos son el filtro de membrana de
acetato de celulosa o nitrato de celulosa con un tamao de poro de 0,45 y 0,22 m. stos ltimos son
los que garantizan la eliminacin de las bacterias, ya que las bacterias ms pequeas conocidas miden
alrededor de 0,3 m. Para facilitar el paso de las soluciones a travs de los filtros de membrana se aplica
presin o se hace vaco, teniendo presente que los recipientes de recogida de la solucin filtrada deben
estar estriles. Hay un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retencin de partculas de
aire (HEPA, high-efficiency particulate air) que se utilizan en las cabinas de flujo laminar y de
seguridad biolgica porque permiten eliminar el 99,9 % de las partculas mayores de 0,3 m presentes
en el aire.
4. Radiaciones
4.1. Radiaciones no ionizantes. Luz UV. La radiacin ultravioleta no produce ionizacin al incidir
sobre una molcula, pero s excitacin de sus electrones, haciendo que reaccione de forma anmala. La
accin bactericida ms efectiva de la luz UV se produce a 260 nm, que es el mximo de absorcin del
DNA. La capacidad de penetracin de la luz UV es muy baja, no pudiendo atravesar el vidrio o
lquidos, por lo que slo se utiliza para la esterilizacin de superficies (las cmaras de flujo laminar) o la
esterilizacin de aire en quirfanos o salas aspticas. En algunos casos especficos tambin puede usarse
para la esterilizacin de agua.
4.2. Radiaciones ionizantes. Rayos gamma y rayos X. Debido a su elevada energa, causan la
ionizacin de las molculas y la aparicin de radicales libres altamente reactivos que destruyen
componentes celulares como el DNA y las protenas. Las radiaciones ionizantes, adems de tener un
mayor poder microbicida que la radiacin ultravioleta, presentan un mayor poder de penetracin,
pudiendo esterilizar el interior de material empaquetado. Aunque son altamente efectivas contra formas
vegetativas y endosporas, no siempre lo son contra virus. Debido a la peligrosidad del equipo de
radiacin, este tipo de esterilizacin se limita a las aplicaciones industriales a gran escala, emplendose
para esterilizar material plstico, material farmacutico (antibiticos, hormonas), etc.
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Tanto si se trata de medios definidos como complejos, hablamos de medios de cultivo lquidos o
caldos y medios slidos. Para pasar un medio lquido a medio slido tan solo es necesario aadir un
agente gelificante que permita al medio lquido solidificar: la adicin de agar al 1,5 % al medio lquido
es el procedimiento comnmente empleado.
Existen una serie de medios de cultivo cuya composicin ayuda a establecer o poner de manifiesto
determinadas propiedades de los microorganismos que pueden servir para su aislamiento y/o
clasificacin. En este caso hablamos de:
Medios generales: permiten el crecimiento de la mayora de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos (ej: Triptona Soja agar, Agar Nutritivo, etc).
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
En numerosos casos, un mismo medio puede ser a la vez selectivo y diferencial (ej. Agar Eosina-Azul
de Metileno Levine, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, etc.), o de enriquecimiento y diferencial (ej. Agar
Sangre).
Es importante tener en cuenta que distintos microorganismos pueden tener requerimientos nutricionales
muy diferentes. Por tanto, para el cultivo correcto de un microorganismo determinado es necesario
conocer sus exigencias nutritivas y suministrarlas en los medios de cultivo con los nutrientes esenciales
en la forma y proporcin adecuados.
Por otro lado, las soluciones salinas no son medios de cultivo, puesto que no permiten el crecimiento de
los microorganismos. Su funcin consiste en mantener los microorganismos en suspensin sin que se
vea afectada su viabilidad, debido a que son soluciones isotnicas.
Objetivo
Conocer las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo y soluciones empleadas en el
crecimiento, aislamiento e identificacin de diversos microorganismos.
Material y Procedimientos
Numerosas casas comerciales suministran a los laboratorios los medios de cultivo deshidratados, que se
reconstituyen con la adicin de agua destilada. Para su preparacin, se siguen las indicaciones
realizadas por las propias casas comerciales sobre el medio de cultivo.
Los medios lquidos se hidratan con agua destilada, se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos
de ensayo, matraces, botellas, etc) y se tapan con un tapn metlico, de PVC o de algodn hidrfugo.
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
La mayora de ellos se deben esterilizar y, una vez esterilizados, se mantienen a temperatura ambiente
para que enfren. Cuando la temperatura del medio de cultivo es igual a la temperatura ambiental, ya se
pueden utilizar.
Los medios slidos, una vez hidratados, se hierven para que el agar pueda formar un gel homogneo
con el medio cuando se enfre. La mayora de los medios se esterilizan en autoclave. Si se van a
preparar tubos con medio slido, el medio se distribuye en los tubos antes de esterilizarlo. Si la
finalidad es la preparacin de placas, el medio se deja enfriar en un bao o a temperatura ambiente una
vez estril. Cuando la temperatura del medio alcanza aproximadamente los 50 C se reparte
aspticamente en placas de Petri estriles a razn de 15-20 mL de medio por placa. El medio se debe
dejar solidificar antes de su empleo.
Para la preparacin de las soluciones salinas, se disuelven las sales en el agua destilada, se distribuyen
en los recipientes adecuados y se esteriliza en el autoclave.
A continuacin se indican los medios de cultivo y soluciones que se van a preparar as como el material
necesario y el procedimiento a seguir en su preparacin. Para esta prctica, los alumnos formarn 4
grupos.
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
GRUPO I
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 100 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 5-10 mL de capacidad.
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
GRUPO II
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 100 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 5-10 mL de capacidad.
2. Agar semislido
- Medio de cultivo para repartir en tubos.
- Cantidad a preparar: 50 mL.
- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).
- Componentes/L:
- Agar Nutritivo Cantidad fabricante (8 g/L)
- Agar 7,5 g
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver los componentes en agua destilada calentando hasta ebullicin. Repartir
en tubos y esterilizar a 121C/15 min. Dejar solidificar los tubos en vertical.
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
GRUPO III
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 100 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 5-10 mL de capacidad.
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MICROORGANISMOS
GRUPO IV
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 250 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 10 mL de capacidad.
2. Solucin Salina
- Solucin para repartir en tubos.
- Cantidad a preparar: 200 mL.
- Repartir en 20 tubos (9 mL/tubo).
- Componentes/L:
- NaCl 8,5 g
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver el NaCl en el agua destilada. Repartir en tubos y esterilizar a 121C/15
min.
Cuestiones
A.- Indica los medios de cultivo asignados a tu grupo de trabajo y los clculos realizados para la
preparacin de la cantidad especificada.
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MICROORGANISMOS
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MICROORGANISMOS
Objetivos
Conocer diferentes mtodos de siembra empleados para el aislamiento, identificacin y
mantenimiento de los microorganismos. Aprender a diferenciar entre cultivos puros y cultivos
mixtos.
Conocer y comprender las ventajas que supone la utilizacin de distintos tipos de medio de cultivo
para el aislamiento e identificacin de los microorganismos.
1. Siembra en placa
1.1. Siembra en placa en estras o por agotamiento
Es un mtodo cualitativo de aislamiento de microorganismos procedentes de una muestra o de un
cultivo de laboratorio. Consiste en arrastrar con el asa de siembra un nmero cada vez ms
pequeo de clulas sobre la superficie de un medio de cultivo slido en placa de Petri. Las clulas
aisladas se multiplicarn formando colonias independientes. Una colonia es una formacin o
agrupacin macroscpicamente visible de microorganismos en un medio slido. Es importante
indicar que cada colonia es un cultivo puro (poblacin de clulas que procede de una nica
clula).
Muestra
- Cultivos lquidos: N 1 y N 2
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Procedimiento:
Se emplearn 2 cultivos lquidos:
- Cultivo N 1: se debe sembrar para aislamiento en estra en una placa de TSA y en una placa de
Agar EMB Levine
- Cultivo N 2: se debe sembrar en una placa de TSA y en una placa de XLD.
Cuestiones
B.- Observa y anota si en las placas de TSA, Agar EMB Levine y XLD sembradas para
aislamiento en estra a partir de los cultivos lquidos suministrados se obtienen cultivos puros o
mixtos.
C.- Considerando que el medio TSA es un medio general y los medios Agar EMB Levine y XLD
son medios selectivos y diferenciales la obtencin de cultivos puros o mixtos en estos medios de
cultivo a partir de los cultivos lquidos sembrados es coherente con lo que cabra esperar y por
qu?
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Muestra
1 cultivo puro en medio slido
Procedimiento
El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en estra en los 2 tubos
con agar inclinado, tanto en el que contiene el medio TSA como el que contiene Agar Citrato.
Para ello, se seguirn los siguientes pasos:
1. Rotular los tubos para poder identificarlos.
2. Esterilizar el asa de siembra de bucle y dejarla enfriar.
3. Cargar el asa de siembra estril con la porcin del cultivo que se va a transferir.
4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estril.
5. Flamear la boca del tubo e introducir el asa de siembra cargada con el inculo bacteriano
dentro del tubo y realizar estras en zig-zag sobre la superficie inclinada del medio de cultivo,
desde la base a la parte alta del tubo.
6. Flamear la boca del tubo y taparlo.
7. Esterilizar el asa de siembra.
8. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.
Cuestiones
D.- Observa y anota si en los dos medios de cultivo slidos en tubo sembrados en estra hay
crecimiento continuo o se distinguen colonias aisladas. Se observa cambio de coloracin en
alguno de ellos?
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Muestra
1 cultivo puro en medio slido
Procedimiento
El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en picadura en el tubo
con agar semislido. Para ello, se seguirn los siguientes pasos:
1. Rotular los tubos para poder identificarlos.
2. Esterilizar el asa de picadura y dejarla enfriar.
3. Cargar la punta del asa con el cultivo puro que se va a transferir.
4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estril y flamear la boca del tubo.
5. Introducir todo el filamento del asa de picadura dentro del medio de cultivo, en direccin
perpendicular a la base del tubo pero sin llegar a tocar el fondo.
6. Flamear la boca del tubo y taparlo.
7. Esterilizar el asa de picadura.
8. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.
Cuestiones
E.- En el medio de cultivo semislido en tubo sembrado en picadura se observa desplazamiento
en el crecimiento con respecto a la lnea de siembra? Qu indica el resultado obtenido?
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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
nmero de clulas de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio de cultivo adecuado.
Por esta razn, el recuento de clulas viables tambin se llama recuento en placa o recuento de colonias.
En este procedimiento se supone que cada clula viable puede formar una colonia.
Hay dos mtodos para realizar un recuento en placa de microorganismos viables: el mtodo de siembra
por extensin, en el que un determinado volumen de la muestra diluida se extiende sobre la superficie
de una placa con medio slido y el mtodo de siembra por inclusin o en profundidad, en el que se
pipetea un volumen conocido (normalmente 1 mL) del cultivo en una placa Petri estril sobre la que se
aade el medio con agar fundido (Figura 2).
Figura 2. Metodos de siembra para realizar un recuento de clulas viables en placa: siembra por
extensin y siembra por inclusin o vertido en placa. Imagen tomada de Madigan et al., 2004.
Brock, Biologa de los Microorganismos.
Antes de proceder a la siembra de la muestra hay una serie de consideraciones importantes. Por un lado,
el recuento se puede realizar tanto en muestras lquidas como en slidas, pero en este ltimo caso ser
necesario preparar una suspensin o dilucin inicial con la muestra empleando una solucin isotnica
estril. Adicionalmente, el nmero de colonias presentes en las placas no debe ser demasiado grande,
pues algunas colonias se podran fusionar y las estimaciones obtenidas seran errneas. Tambin es
importante no obtener un nmero de colonias demasiado bajo, para que el clculo sea ms preciso y no
se arrastren errores asociados con la preparacin de excesivas diluciones. En general, se considera que
el nmero de colonias por placa apropiado para el recuento oscila entre 30 y 300. Para conseguirlo, casi
siempre se diluye la muestra (Figura 3). Teniendo en cuenta que raramente se sabe de antemano el
nmero de clulas viables, se suelen hacer varias diluciones decimales sucesivas de la muestra. Tanto la
preparacin de la suspensin inicial (muestras slidas), como de las diluciones decimales sucesivas,
forman parte de la preparacin de la muestra para el anlisis.
En esta prctica se emplear una muestra lquida que contiene una concentracin desconocida de
microorganismos. Por ello, antes de proceder a su siembra, se deben preparar una serie de diluciones
33
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Objetivo
Realizar el recuento de microorganismos viables presentes en una muestra problema.
34
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Muestras
- Las diluciones 1/100 y 1/1000 obtenidas a partir de la muestra de partida.
Procedimiento
1. Preparacin de diluciones decimales sucesivas
A partir de la muestra lquida suministrada, se prepararn tres diluciones de la muestra: diluciones
1/10, 1/100 y 1/1000. Para ello, se seguirn los siguientes pasos:
1. Rotular los tubos con las distintas diluciones que se van a realizar
2. Preparacin de dilucin 1/10: usando una punta de pipeta estril, se toma 1 mL de la
muestra y se transfiere a un tubo con 9 mL de solucin salina estril. A continuacin, se
agita el tubo por rotacin (nunca por inversin) para una homogenizacin completa del
inculo incorporado con el diluyente.
3. Para hacer diluciones sucesivas (diluciones 1/100 y 1/1000), se usa una nueva punta de
pipeta estril en cada paso de la dilucin, se toma 1 mL de la dilucin precedente y se lleva
a un tubo con 9 mL de solucin salina estril, recordando que se debe agitar siempre el tubo
una vez incorporado el inculo.
35
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS
Cuestiones
F.- Indica los clculos realizados para obtener el recuento de microorganismos viables presentes en la
muestra suministrada, especificando el recuento obtenido en placa y la dilucin empleada. Anota
tambin el resultado final.
36
3. TCNICAS DE
CROMATOGRAFA Y
ESPECTROFOTOMETRA
TCNICAS ESPECTROFOTOMTRICAS
Objetivos:
a) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo del pH.
b) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo de la
concentracin.
La mayora de los problemas analticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la
cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o ms componentes de la misma. Se pueden
plantear las siguientes cuestiones: una, de carcter cualitativo (de qu componente se trata?), y otra de
carcter cuantitativo (cunto hay de ese componente?). Para ello, se puede utilizar el mtodo
instrumental de anlisis, como es la espectrofotometra para medir la absorcin de radiacin
ultravioleta y visible que interacta con la materia (tomos y molculas), la misma es considerada una
tcnica cualitativa y cuantitativa basndose en la medicin del color o de la longitud de onda de una
radiacin e intensidad de la misma.
Fundamento de la espectrofotometra
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, incluso el vidrio que parece ser
transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible y el agua
que absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioletas,
visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas y es caracterstica para cada sustancia
qumica.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida y la energa radiante no
puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben
ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo las longitudes de onda no
absorbidas pueden ser visualizadas.
39
TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA
40
TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA
longitudes de onda, aportando informacin sobre la molcula, puesto que est relacionado con su
estructura molecular.
Los cambios en las condiciones ambientales de una molcula pueden provocar cambios en su
estructura molecular. As, un cambio en el pH puede provocar alteraciones en su espectro de absorcin.
El compuesto que se usar en la prctica ser el naranja de metilo, que es un colorante que se utiliza
como indicador de pH.
Naranja de metilo
Procedimiento
En primer lugar se preparan las siguientes soluciones de trabajo, a partir de las cuales
prepararemos las soluciones a analizar:
41
TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA
Una vez preparadas las tres soluciones madre, se proceder a mezclar las soluciones 2 y 3
siguiendo la tabla siguiente, para preparar las soluciones tampn:
En este punto tendremos 5 tubos de ensayo que formarn un gradiente de pH. A continuacin se
aaden con una micropipeta 0.1 mL de la solucin stock de naranja de metilo a cada una de las
soluciones tampn y se agitan las soluciones. Una vez comprobado que se genera un gradiente de color,
se realizan los espectros de absorcin entre 350 y 650 nm de las distintas muestras.
Cuestiones:
1. Comentar los resultados. Describir la grfica obtenida, observando las variaciones en los
espectros de absorcin y comentando como aumenta o disminuye la absorbancia en funcin de la
longitud de onda y el pH del medio.
2. Se observa un punto isosbstico cuando en una solucin coinciden dos especies absorbentes en
equilibrio. Observa la grfica. Puedes localizar algn punto isosbstico? Existe algn punto en
el que la absorbancia no dependa del pH del medio?
3. En cada uno de los tubos el pH es distinto. Por qu vara el espectro de absorcin del naranja
de metilo al variar el pH?
42
TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA
Practica 2. Efecto de la concentracin sobre el espectro de absorcin.
Introduccin:
43
TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA
Las condiciones en las que se encuentra una molcula pueden determinar cambios estructurales
que afecten a sus propiedades. En esta prctica observaremos como un aumento en la concentracin de
una sustancia puede desencadenar un cambio estructural que cambie notablemente sus propiedades de
absorcin de luz.
Procedimiento
Se realiza un espectro de absorcin entre 400 y 700 nm de las soluciones 1x10-4 y 1x10-6 M. A
continuacin se mide la absorbancia de las tres soluciones a 610 y a 663 nm.
Cuestiones:
2. Calcular la ratio entre la absorbancia a 610 y la absorbancia a 663 de las tres soluciones.
3. Comentar los resultados obtenidos tanto para los espectros de absorcin realizados en el
laboratorio como para las grficas del apartado 1. Se observa alguna desviacin de la Ley de
Beer-Bougher-Lambert? Cul podra ser la explicacin de estos resultados?
44
4. TCNICAS HISTOLGICAS
Y MICROSCOPIA
INTRODUCCIN
47
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
vamos a estudiar, el mtodo de seccionado que vamos a utilizar y la tcnica que vamos a aplicar sobre
las secciones obtenidas.
Si la muestra se procesa para su observacin al ME, se realiza una doble fijacin, de forma que
primero se fija con paraformaldehdo o glutaraldehdo (o con una mezcla de ambos), y a continuacin
con tetrxido de osmio.
2.- Inclusin. Permite darle consistencia a los tejidos y facilitar su seccionado con una cuchilla.
Consiste en rodear la pieza de un material, llamado medio de inclusin, que sea lo suficientemente
rgido que permita su seccionado Tras llevar a cabo la inclusin, obtendremos un bloque compacto de
la pieza de tejido rodeada por el medio de inclusin. En el procesado para la observacin en el MO se
utilizan medios de inclusin hidrfobos (por ejemplo, la parafina), que requieren la deshidratacin
previa del tejido, o medios de inclusin hidrfilos (por ejemplo, la gelatina), que son miscibles con el
agua. El uso de medios de inclusin hidrfilos permite un procesado ms rpido y menos daino para
el tejido. En ocasiones, la inclusin no es un paso imprescindible, ya que la consistencia se logra con
la fijacin o con la congelacin del tejido, sin necesidad de utilizar un medio de inclusin.
En la inclusin para la observacin al ME se utilizan plsticos especiales (resinas) que
proporcionan una mayor dureza que los medios de inclusin para microscopa ptica, lo que permite la
obtencin de secciones muy finas. En este caso la inclusin es imprescindible para lograr la
consistencia de la muestra.
3.- Seccionado. Para la mayora de los procedimientos y estudios histolgicos, se requieren
secciones de tejidos lo suficientemente delgados para que pase la luz y puedan observarse al MO, o
para que penetren los electrones y puedan observarse al ME. Los microtomos son instrumentos que
con la ayuda de una navaja o cuchilla permiten obtener cortes finos de los materiales a estudiar. Los
microtomos constan de un portabloques donde se coloca la muestra, una cuchilla y un sistema de
avance regulado del bloque (o de la cuchilla) que permite controlar el grosor de los cortes. En
microscopa ptica las cuchillas utilizadas son de acero y se obtienen secciones de varias micras (m)
de grosor, mientras que en microscopa electrnica las cuchillas son de vidrio o de diamante y se
obtienen secciones de varios nanmetros (nm) de grosor, es decir, mil veces ms finos que para el
MO, debido a que el poder de penetracin de los electrones es muy inferior al de los fotones. Hay
muchos tipos de microtomos y el uso de uno u otro tipo depende de si el material se ha incluido o no,
y, en su caso, del medio de inclusin que se haya utilizado. Los microtomos ms utilizados hoy en da
son los siguientes:
* Microtomo de rotacin o de tipo Minot. Se utiliza para seccionar piezas de tejido incluidas en
parafina y se obtienen secciones de entre 5 y 30m de grosor. En este microtomo la cuchilla
permanece fija y perpendicular al portabloques, en posicin vertical. El movimiento rotatorio de una
manivela hace que el bloque con la muestra se desplace hacia la cuchilla una distancia fija que
determina el grosor del corte.
48
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
49
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
(osmio, uranilo, plomo) que harn las estructuras celulares ms o menos densas a los electrones
permitiendo as la obtencin de una imagen. En el ME se obtienen imgenes en blanco y negro.
5.- Montaje. Consiste en colocar un cubreobjetos sobre las secciones para protegerlas durante la
observacin en el MO. Cuando no queremos conservar la preparacin podemos aadir, entre el
cubreobjetos y las secciones, una gota de agua, de tampn (agua con una mezcla de sales) o de
glicerina. En este caso, tras la observacin se desecha la preparacin. Cuando nos interesa conservar la
preparacin, es necesario utilizar un medio entre las secciones y el cubreobjetos, llamado medio de
montaje, que debe ser transparente, asegurar lo mximo posible la conservacin de las preparaciones y
asegurar la adherencia entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Hay medios de montaje hidrfilos y
medios de montaje hidrfobos. El montaje slo se lleva a cabo en el procesado para el MO, ya que, en
el caso del procesado para el ME las secciones se sitan sobre rejillas metlicas especiales y no
necesitan esa proteccin.
6.- Observacin al microscopio ptico o electrnico. Las muestras biolgicas o las clulas, en
general, son difciles de observar a simple vista debido a su reducido tamao y a su transparencia a la
luz visible, por lo que para su observacin, necesitamos los microscopios, que son instrumentos de
ptica que nos permiten ver objetos muy pequeos o detalles estructurales imposibles de distinguir a
simple vista.
A) El microscopio ptico utiliza la luz comn (luz blanca, emitida por una fuente de luz situada
en la base del microscopio) que atraviesa la muestra biolgica e ilumina el campo de observacin.
Cuenta con tres sistemas de lentes: a) el condensador, que concentra la luz emitida sobre la muestra;
b) los objetivos que aumentan la imagen X veces, normalmente en los microscopios utilizados en
prcticas hay cuatro objetivos de 4, 10, 40 y 100 aumentos; y c) los oculares que aumentan la imagen
10 veces (los hay de mayor aumento) y permiten la visualizacin directa de la muestra. Los aumentos
finales se obtienen multiplicando los aumentos del objetivo por los del ocular (por ejemplo, en un
microscopio de prcticas el mayor aumento que obtendramos sera: [objetivo 100X] x [ocular de 10X]
= 1000 aumentos). Sin embargo, en un microscopio ptico lo importante no son los aumentos sino su
poder de resolucin (PR), es decir, la capacidad de distinguir como separados dos puntos que se
encuentran muy cercanos. Y el PR depende del lmite de resolucin (LR, distancia mnima a la cual
dos objetos pueden ser diferenciados) y, de hecho, el PR es inversamente proporcional al lmite de
resolucin (PR =1/LR).
El lmite de resolucin de un microscopio se calcula mediante la frmula de Abbe:
Limite de resolucin (LR) = 061 x / n x sen
En esta frmula: 061 es una constante, es la longitud de onda de la luz utilizada (luz blanca,
550nm), y n x sen es la apertura numrica (AN) de la lente objetivo. La AN depende del ndice de
refraccin del medio situado entre la muestra y el objetivo (n) y del ngulo de apertura del objetivo
utilizado (). Normalmente el medio situado entre la muestra y el objetivo es aire (n=1), aceite de
50
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
inmersin (n=1,5) o agua (n=1,3). El uso del aceite de inmersin (impide la desviacin de los rayos
ms oblicuos) aumenta el PR porque aumenta la AN. El ngulo es la mitad del ngulo formado por
el cono de rayos recogidos por la lente objetivo sobre un punto de la muestra. Como la mxima
anchura es de 180, el valor de sen (90) es como mximo 1 (0.93 en los microscopios actuales).
Por tanto, el PR del microscopio depende de la de la luz utilizada y de la AN, de forma que,
cuanto menor sea y mayor sea la AN, ms pequeo es el LR y mayor el PR. Los objetivos de mayor
aumento tienen mayor AN debido a que el ngulo aumenta al disminuir la distancia de la muestra a
la lente, por tanto, al subir el aumento aumentamos el PR.
El lmite de resolucin de un MO, en las condiciones ms ptimas, es decir, utilizando el
objetivo de 100 aumentos con aceite de inmersin es LR = 0.61 x 550nm/1,5 x 0.93= 240nm = 0,24
m. Es decir, que en un MO podemos observar como separadas estructuras que tienen como mnimo
ese dimetro, o que estn separadas como mnimo por esa distancia (bacterias, mitocondrias, ncleo,
plastos,...). Con el MO distinguiramos la forma de estas estructuras pero no sus detalles internos.
Estructuras celulares de menor tamao (cidos nucleicos, ribosomas,) tendramos que observarlas al
ME, cuyo LR es mil veces menor que el del MO (LR=2-5A=0.2nm=0.0002m) debido a que la de
los electrones es muy pequea (= 0.004nm). Por tanto, el PR de un ME es mil veces mayor que el del
MO y nos permite observar la ultraestructura celular. Teniendo en cuenta que el LR del ojo humano es
de 100-200m (0.1-0.2 mm), el MO ha aumentado unas mil veces el LR de nuestro ojo, y el ME lo ha
aumentado un milln de veces.
El diafragma del condensador (o de apertura) es otro dispositivo importante que se encuentra
situado debajo del condensador y con l podemos graduar la cantidad de luz que llega a la muestra.
Cuando cerramos el diafragma la muestra recibe menos luz, de forma que aumentamos el contraste y
la profundidad de campo pero disminuimos la resolucin.
El MO que se usa habitualmente es el MO de campo claro o fotnico, utilizado para la
observacin de preparaciones teidas de clulas o de secciones de rganos o tejidos. Existen otros
tipos de MO, como el MO de campo oscuro, el MO de contraste de fases o el MO de contraste
diferencial de interferencia (DIC) o de Nomarski, que presentan dispositivos especiales
(condensadores, objetivos, prismas) que permiten la observacin de secciones de tejidos sin teir y de
clulas vivas y mviles (bacterias, espermatozoides, protozoos, cultivos celulares, clulas en mitosis o
en migracin,). El MO de fluorescencia y el MO de barrido confocal presentan dispositivos
especiales que permiten la observacin de muestras fluorescentes.
El MO invertido se utiliza para la observacin de muestras que se encuentran en frascos o placas
de fondo plano, como por ejemplo, los cultivos celulares o en la manipulacin de gametos y embriones
vivos in vitro en tcnicas de fecundacin asistida. Su nombre se debe a que la fuente de luz est en la
parte superior del microscopio y los objetivos en la parte inferior, bajo la platina. El hecho de que est
invertido permite acercar los objetivos a las clulas, ya que en un MO convencional la distancia entre
51
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
los objetivos y el fondo de la placa sera muy grande. Independientemente de que el microscopio sea
convencional o invertido puede presentar los distintos dispositivos de las distintas pticas.
B) El microscopio electrnico no utiliza la luz visible (fotones), sino electrones acelerados.
Hay dos tipos de ME:
B1.- El microscopio electrnico de transmisin (MET) consta de una columna hueca donde se
hace el vaco para que los electrones, emitidos por un can de electrones situado en lo alto de la
columna, no se dispersen. Consta, adems, de distintas lentes electromagnticas (condensadora,
objetivo y proyectora) y distintos diafragmas. La muestra se sita entre la lente condensadora y la
lente objetivo. Es importante destacar que en el MET las secciones ultrafinas no se colocan sobre
portaobjetos, ya que los electrones no son capaces de atravesar el vidrio, sino sobre rejillas de cobre o
nquel que no impiden el paso de los electrones.
Los electrones pasan por la lente condensadora, que concentra el haz de electrones procedente
del can sobre la muestra, llegan a la lente objetivo que origina y enfoca la imagen, y por ltimo la
lente proyectora magnifica la imagen obtenida. La imagen se observa directamente en una pantalla
fluorescente, o indirectamente mediante la obtencin de una imagen fotogrfica o digitalizada. Para
visualizar la imagen debe tener lugar la dispersin de los electrones al atravesar la muestra y deben
producirse interacciones de esos electrones con los tomos de esa muestra. En la imagen final veremos
zonas claras (estructuras claras o transparentes a los electrones), por las que los electrones han
atravesado la muestra, y zonas oscuras (estructuras densas a los electrones o electrondensas) que
corresponden a las regiones donde los electrones han sido desviados.
B2.- El microscopio electrnico de barrido (MEB) se utiliza para observar la superficie de una
muestra que no ha sido seccionada (rganos o partes de rganos, pequeos organismos, granos de
polen, clulas enteras, orgnulos,). En este caso el haz de electrones no est fijo, sino que se mueve
y va rastreando la superficie de la muestra, que est recubierta de una capa de un material metlico con
gran capacidad de transmisin de energa elctrica (generalmente se utiliza oro). La presencia de ese
material hace que la superficie de la muestra, al ser barrida por el haz de electrones, emita a su vez
otros electrones que son recogidos por un detector y originan una imagen en relieve de la superficie de
la muestra que se observa en un monitor de televisin. Al igual que en el MET, en este microscopio
las imgenes se obtienen en blanco y negro.
OBJETIVO
Que el alumno se familiarice con la metodologa que se lleva a cabo en el procesado de tejidos
para su observacin en el microscopio ptico. Para ello, en estas prcticas haremos secciones de
tejidos animales, previamente fijados, utilizando dos tipos de microtomos: un vibroslice (o vibratomo)
para seccionar piezas de tejido sin incluir; y un microtomo de rotacin para seccionar piezas de tejido
incluido en parafina. A continuacin, teiremos las secciones obtenidas, las montaremos, y las
observaremos al microscopio ptico de campo claro. Adems, observaremos preparaciones sin teir en
52
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
otros tipos de microscopios pticos (campo oscuro y contraste diferencial de interferencia (DIC) o de
Nomarski).
MATERIAL
Microtomo de rotacin, bloques de tejidos incluidos en parafina, vibroslice, placas Petri,
pinceles, placas con pocillos, cristalizadores con puente, cubetas de vidrio verticales, portaobjetos y
cubreobjetos, colorantes, agua destilada, etanol (70, 96, 100), lquido intermediario (histo-clear),
medio de montaje (Eukitt), microscopio ptico.
MTODOS:
Prctica 1: Seccionado, tincin y montaje.
A.- Seccionado (microtoma). Manejo de un vibroslice y obtencin de cortes de tejido animal
previamente fijado y sin incluir. Manejo de un microtomo de rotacin y obtencin de cortes de tejido
animal previamente fijado e incluido en parafina.
B.- Tincin. B1.- Tras la obtencin de secciones de un tejido animal en el vibroslice se procede
a realizar la tincin. Estas secciones flotantes (llamadas as porque debido a su grosor (50-80 m) no
se colocan en un portaobjetos para su procesado) se tien en placas con pocillos. Cada pocillo se llena
con un reactivo y las secciones flotantes se van cambiando cuidadosamente de pocillo en pocillo con
la ayuda de un pincel.
Con estas secciones llevaremos a cabo la tincin con Tionina de Laskey, que es un colorante que
tie de azul los componentes celulares que contienen cido ribonucleico (ARN). El protocolo de esta
tincin es el siguiente:
1.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.
2.- Etanol de 70, 5 minutos.
3.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.
4.- Teir con tionina de Laskey durante 10 segundos. CUIDADO!! hay que mantener con el
pincel las secciones para no perderlas de vista, ya que el colorante es muy oscuro y tie muy rpido.
5.- Paso rpido por agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
6.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.
7.- Etanol de 96, tres baos de 1 minuto hasta que deje de eliminar colorante.
8.- Etanol 100, 2 minutos.
9.- Histo-clear, 2 minutos.
10.- Montaje. Se colocan las secciones en un portaobjetos, se estiran bien con el pincel, se
cubren con una gota de medio de montaje (Eukitt) y se pone el cubreobjetos encima evitando que se
formen burbujas de aire.
Prctica 2: Tincin, montaje y observacin
B.- Tincin. B.2.- Tras la obtencin de secciones de un tejido animal en el microtomo de
rotacin se procede a realizar la tincin. Previamente debemos proceder a la eliminacin de la parafina
que impregna el tejido (desparafinado) e hidratar de nuevo el tejido (hidratacin) que se haba
53
TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA
deshidratado en el proceso de inclusin. Para desparafinar e hidratar las secciones tenemos que
pasarlas por los siguientes lquidos: histo-clear (10 min); etanol 100 (5min); etanol 96 (5min); etanol
70 (5min) y agua destilada (5 min).
Una vez rehidratado el tejido procedemos a realizar la tincin, en este caso sobre el
cristalizador. Para ello, se colocan los portaobjetos sobre el puente y se van echando los diferentes
lquidos con una pipeta Pasteur de plstico (cada reactivo con su pipeta correspondiente) hasta cubrir
las secciones. Una vez transcurrido el tiempo de tincin se vaca cada lquido en el cristalizador y se
escurre cada porta sobre un papel de filtro antes de aadir el siguiente reactivo.
Con estas secciones llevaremos a cabo la tincin con hematoxilina-eosina que es una tincin
clsica y general muy utilizada en estudios de morfologa tisular y en anatoma patolgica. Se utilizan
dos colorantes: la hematoxilina de Mayer, que es un colorante bsico y teir de azul los componentes
cidos de las clulas (cidos nucleicos: ncleo), y la eosina es un colorante cido y teir de rojo o de
rosa los componentes bsicos (protenas: citoplasma, matriz extracelular). El protocolo de esta tincin
es el siguiente:
1.- Teir con hematoxilina de Mayer, 10 minutos.
2.- Lavar con agua corriente (cubeta debajo del grifo), 4 minutos.
3.- Teir con eosina, 35 segundos.
4.- Lavar con etanol de 96 hasta eliminar el exceso de colorante. Para ello, echaremos el etanol
sobre los cortes con una pipeta inclinando un poco el portaobjetos para que el etanol caiga al
cristalizador. A continuacin, pasamos el portaobjetos con las secciones teidas a la batera de
deshidratacin.
5.- Cubeta de etanol 100, 5 minutos.
6.- Cubeta de histo-clear, 3 minutos.
7.- Montaje. Se aaden unas gotas de medio de montaje (Eukitt) sobre las secciones y se pone el
cubreobjetos encima evitando que se formen burbujas de aire.
C.- Observacin. Observacin de las preparaciones obtenidas en el microscopio ptico de
campo claro. Observacin de preparaciones sin teir en el microscopio ptico de campo oscuro y en el
microscopio ptico de contraste diferencial de interferencia (DIC) o de Nomarski.
CUESTIONES
1.- En nuestro laboratorio de tcnicas histolgicas pretendemos estudiar la estructura del
msculo esqueltico de ratn mediante la realizacin de una tincin hematoxilina-eosina sobre
secciones de 10 micras de grosor.
a.- Describe con detalle los diferentes pasos del proceso que va desde que extraemos el tejido
del animal hasta que lo observamos al microscopio ptico.
b.- Tras realizar la tincin sobre las secciones de msculo esqueltico qu componentes
celulares se teiran y por qu?
c.- En qu tipo de microscopio podramos observar las preparaciones obtenidas?
54
5. TCNICAS DE
CENTRIFUGACIN Y
ELECTROFORESIS
Introduccin
55
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
RCF, pues es dependiente del radio del rotor. No obstante, la mayora de las centrfugas actuales
permiten especificar tanto RPM como RCF. Adems, en los libros de instrucciones de las centrfugas
aparecen tablas o nomogramas para determinar las rpm que debemos seleccionar para un valor fijo de
RCF cuando rotor y radio son conocidos.
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de mtodos que permiten obtener fracciones
enriquecidas en orgnulos (ej., mitocondrias, ncleos), fracciones de membrana (ej., membrana total,
membrana plasmtica) o complejos multiproteicos (ej., citoesqueleto) mediante dos etapas. En la
primera tiene lugar la rotura celular (lisado) mediante procedimientos mecnicos suaves que pueden
emplear o no detergentes (sonicacin, homogenizadores, etc). En esta prctica realizaremos una lisis
hipotnica sin detergentes, al emplear una solucin con una osmolalidad muy inferior al citoplasma de
las clulas; esto genera la entrada de agua y la lisis celular. En la segunda etapa se separa la fraccin
deseada mediante diversos criterios, como por ejemplo diferencias en densidad (ej., centrifugacin
diferencial). La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la
suspensin que difieren, entre s y con el medio, en cuanto a su densidad. Si se centrifuga en
condiciones suaves (poco tiempo, baja velocidad) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas.
Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones ms
intensas sedimentarn las partculas ms densas; el proceso se puede continuar indefinidamente.
En la prctica de hoy vamos a emplear un protocolo de centrifugacin
diferencial con un modelo celular muy sencillo: el eritrocito humano. Los
eritrocitos han perdido su ncleo, membranas internas y mitocondrias, de modo
que pueden ser utilizados para la produccin de fantasmas, vesculas obtenidas
despus de liberar el contenido citoplasmtico mediante hemolisis y que
constituyen un preparado casi puro de membrana plasmtica. Dentro de esta
membrana plasmtica existen tanto protenas integrales como perifricas; las
primeras, embebidas en la membrana plasmtica, y las segundas, unidas a su
cara interna formando un entramado de protenas perifricas denominado
citoesqueleto. Dentro de las integrales tenemos la protena transportadora de
aniones, el transportador de glucosa y las glicoforinas, y dentro de las
citoesquelticas la espectrina, la actina y la protena de la banda 4.1 (Figura 1).
56
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
Electroforesis
57
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
Objetivos:
Utilizar un protocolo sencillo de fraccionamiento diferencial para purificar membranas
plasmticas de eritrocitos humanos para que los/as alumnos/as se familiaricen con las tcnicas
de centrifugacin.
Que el/la estudiante ponga en prctica los fundamentos tericos adquiridos en el seminario
sobre electroforesis y que conozca una de sus aplicaciones: el anlisis de mezclas de protenas y
los datos que se pueden extraer de dicho anlisis.
58
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
Instrumental:
Equipo de electroforesis MiniProtean de la casa comercial BioRad (ver foto superior), que
trabaja con un sistema de mini geles que requiere poca muestra, es ms rpido y mantiene una
alta resolucin en la separacin de las protenas. Incluye un juego de cristales (pequeos y
grandes), separadores, peines de 10 pocillos, marcos para sujetar los cristales y casting stands
para generar 8 geles de SDS-PAGE. Tanque y tapa (ver foto superior).
Microfuga Bata y guantes (medianos y
Fuente de alimentacin (capacidad pequeos)
200V, 500 mA) Contenedor de residuos biolgicos
Agitador magntico con capacidad y qumicos
para hervir muestras. Bandeja con cristal para la tincin
Microondas de los geles
blancos
Reactivos
Cloruro sdico Solucin de tincin basada en azul
Cloruro potsico de coomassie G-250 Biosafe
Fosfato de sodio monobsico Marcadores de peso molecular
Fosfato de sodio dibsico Acrilamida
Bisacrilamida
59
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
Tris Glicerol
SDS (sodio dodecil sulfato) Azul de bromofenol
TEMED Glicina
Persulfato de amonio EDTA
2-mercaptoetanol ( -ME) cido clorhdrico (HCl)
Soluciones
Solucin 1: Tris/HCl 1,5 M pH 8,8, 100 mL. Pesar 18,15 g de Tris. Disolver el Tris en
50 mL de agua destilada. Aadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a
8,8. Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL). Estable por meses a
4C.
Solucin 2: Tris/HCl 1 M pH 6,8, 100 mL. Pesar 12,1 g de Tris. Disolver el Tris en 50
mL de agua destilada. Aadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a 6,8.
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL). Estable por meses a
4C.
Solucin 3: SDS 10% (w/v), 100 mL. Pesar 10 g de SDS. Aadir agua destilada hasta
completar el volumen de 100 mL. El SDS es un polvo fino neurotxico, por lo tanto se
debe usar mscara, guantes y gafas de proteccin. Almacenar a RT.
Solucin 4: Glicerol 50% (v/v), 100 mL. Mezclar un volumen de 50 mL de glicerol al
100% con 50 mL de agua destilada. Almacenar a RT.
Solucin 5: Azul de Bromofenol 1% (w/v), 10 mL. Pesar 100 mg de azul de
bromofenol. Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver. Filtrar
la solucin en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto. Almacenar a
RT.
Solucin 6: Acrilamida 30% (100 mL). La solucin de acrilamida al 30% (w/v) es una
mezcla de acrilamida (29,2 g) y bisacrilamida (0,8 g). Pesar ambos reactivos y aadir
agua destilada hasta 100 mL. Filtrar en papel de filtro Whatman N1 La acrilamida en
polvo y en solucin es neurotxica, por lo tanto se debe usar mscara, guantes y lentes
de proteccin para su manipulacin, o mejor comprarla ya preparada. Estable por meses
a 4C.
Solucin 7: Persulfato de amonio al 10% (w/v), 5 mL. Pesar 0,5 g de persulfato de
amonio. Disolver en 5 mL de agua destilada. Almacenar a -20C.
Solucin 8: Tampn de electroforesis 1X, 1 L. Pesar 3 g de Tris (25 mM), 14,4 g de
glicina (192 mM) y 1 g de SDS (0,1%). Aadir agua destilada hasta completar 1 L. El
pH debera ser de aproximadamente 8,3. Se puede preparar una solucin 10 veces
60
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
Protocolo:
61
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
62
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
63
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS
Pregunta 1:
Representar el logaritmo del peso molecular de los marcadores en el eje Y frente a
la movilidad relativa de dichos marcadores (distancia migrada por el
marcador/distancia migrada por el frente de azul de bromofenol) en el eje X.
Calcular el peso molecular de las bandas 1, 2, 3, 4.1 y 4.2. Empleando el Atlas
Proteico Humano (http://www.proteinatlas.org) obtener los pesos moleculares de
dichas protenas y comparar los resultados obtenidos en la prctica con los de la
base de datos.
Pregunta 2:
La protena representada a continuacin es la protena transportadora de aniones
de eritrocitos (banda 3). Imagine que ha purificado dicha protena en estado
oxidado y que las cistenas 317 y 201 estn implicadas en la formacin de puentes
disulfuro intra- e intermoleculares (entre diferentes monmeros). Dibuje un
esquema del patrn de bandas, con sus pesos moleculares correspondientes, que
esperara tras una SDS-PAGE de esta protena en presencia y ausencia de -ME.
64
6. MEDIO FSICO Y TCNICAS
DE CARTOGRAFA
PRCTICA
Se realizar una salida a una zona prxima a la ciudad para hacer el estudio del medio fsico de un
emplazamiento, mediante la caracterizacin de los distintos factores del medio y de sus interrelaciones
Fecha de la salida
rea de estudio
Cartografa utilizada
Datos do emplazamiento
Posicin fisiogrfica
Coordenadas geogrficas
Pendiente
Altitud
Estudio del relieve. Corte topogrfico
Materiales geolgicos
67
MEDIO FSICO Y TCNICAS DE CARTOGRAFA
68
7. MTODO CIENTFICO Y
TCNICAS DE MUESTREO
1. INTRODUCCIN
71
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
generados en la sesin anterior. Una vez lleguis a estas coordenadas procederis a la adquisicin de
datos inmediatos (i.e. orientacin, pendiente, altitud, pedregosidad, estima de la cobertura vegetal por
estratos), para proseguir a el muestreo de rboles en parcelas de radio de 20 metros.
72
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
73
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
asiduidad en el campo un impermeable y un pantaln plstico son una opcin ptima (lo venden en
cualquier ferretera a un precio muy razonable). El problema del plstico es la falta de transpiracin, por
ello si pensis salir con frecuencia al campo o trabajar en all en el futuro es posible que os compense
realizar una inversin en otras opciones. Como dijimos existe una gama amplsima de tejidos donde
elegir, adems de las caractersticas previamente comentadas (ligeras, cmodas y que transpiren) tened
en cuenta la resistencia a la abrasin y a las posibles roturas ocasionadas por la vegetacin. Tanto el
plstico como algunas prendas de alta montaa no estn diseadas para trabajar entre vegetacin que
posea pinchos o espinas (lo que es habitual en nuestra geografa, p.e. Ulex sp. o Rubus, sp.), que se
rasgarn rpidamente perdiendo su impermeabilidad. Los cortavientos encerados renen todas estas
caractersticas y resultan muy difciles de rasgar (pudiendo ser reparados cuando esto ocurre), en el
mercado existen multitud de marcas y precios tanto de chaquetas como de cubrepantalones. Es
interesante que las chaquetas tengan bolsillos externos de rpido acceso as como bolsillos carpeteros,
etc. Cuando hay lluvia o riesgo de la misma llevad siempre una muda completa.
En cuanto al calzado llevadlo resistente y cmodo. Comprad botas que se ajusten a vuestras
necesidades, prestando atencin a los diferentes tipos de suelas, que son la parte ms importante de la
bota, deben dar agarre al tiempo que ser duraderas. La seleccin de una bota de cualquier marca que
tenga suela Vibram es acertada. Si optis por botas con membrana de Goretex, sed conscientes que si
se os llega a romper la membrana, al tener que impermeabilizar externamente la bota, los tejidos
interiores dan peores resultados que en botas sin membrana. Independientemente de la opcin escogida,
las polainas de cordura son muy aconsejables cuando llueve, protegen tanto la bota como la parte baja
del pantaln, que en ocasiones queda al descubierto del cubrepantaln. No uses nunca calzado nuevo
para una salida al campo. Cuidaos los pies, prestad atencin a que no tengis arrugas en los calcetines
para evitar las ampollas. Los calcetines con tefln son una correcta solucin al problema de las
ampollas. Lleva siempre unos calcetines de repuesto.
Una solucin de emergencia, o para ahorrar inversiones, que sirve tanto para tejidos de algodn (p.e. un
pantaln vaquero) como para cualquier calzado de piel (p.e. unos deportivos) es el uso de sprays
impermeabilizantes que podris encontrar en cualquier tienda de deportes o armera.
Aunque haga buen tiempo es siempre aconsejable llevar un chubasquero. En los das de sol no olvides
una gorra o sombrero y las gafas de sol. En los das de fro un cuello de tejido polar es un buen aliado, y
con fro extremo un pasamontaas.
74
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
Llevad con vosotros un pequeo botiqun con desinfectante, gasas, esparadrapo, apsitos adhesivos,
tijeras, pinzas, analgsicos, pomada antiestamnica, pomada para las quemaduras, vaselina, proteccin
solar y repelente de insectos.
75
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
2. MATERIAL Y MTODOS
76
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Guate para establecer los vrtices por las esquinas del edificio
01 20 17 13
16
12
15 14
19 18
03 08 10
02 05
11
04 09
06 07
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
78
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No
incluyas los tejos ni el pino.
79
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera
01 02
04 10
05
03
07
06
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.
02 04 06 08 10 12 14 16
01 03 05 07 09 11 13 15
81
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Camina y toma las coordenadas por el borde de piedra del estanque.
15
16 14
17 13
01 11
18 12
0310
02 09
04 08
05 07
06
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Toma la coordenada en el centro de los pies de cada una de las cepas de camelia.
01
02 03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
02 03 14 15
05 16
04 12 13 17
06 10 11 18
01
07 19
08 09
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.
09
08
07
06
05
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html 04
03
02
01
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
21 20 10
09
24 19 11 12
22 23 25 26 07 08
14 13 27 28 05 04
18 17 01 06
15 16 02 03
86
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.
12 11 16 15
10
13 14
09
18 17 06
05
07
04
19 08 03
01 02
87
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
88
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
ZONA: 13 Piscina
TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 8 robles (Quercus robur) que
estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 13) seguido de
un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 08), p.e. 13_01.
Para los 8 rboles (i.e. 01-08) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Slo es
necesario que identifiques la primera coordenada de cada rbol, y posteriormente pulsa 9 veces
seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne un cdigo
por defecto.
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles. En el plano se representan tres rboles que ya no existen.
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
02
07 04 01
08
06 03
05
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.
01 03 05 07 09 11 13 15
02 04 06 08 10 12 14
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Guate para establecer los vrtices por la proyeccin de las terrazas ms salientes.
04 05
16 01
02 03
15 14 07
12 13 09 06
08
11 10
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Guate para establecer los vrtices por las esquinas del edificio.
13
15 12
17 14
16 10
18 19 11
01 06 09 08 Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
20
04
02 05 07
03
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles. En el plano se representa un rbol que ya no existe.
02 01
03
04
05
06
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
07
08
09
10
11
12
13
14
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
ZONA: 18 FEUGA
TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 13 pltanos (Platanus orientalis)
que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 18) seguido
de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 13), p.e. 18_01.
NOTAS: Cuidado con los coches, trabaja siempre sobre la isleta. Elige una orientacin del
tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los rboles.
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Guate para establecer los vrtices por la proyeccin de las terrazas.
11 01
09 10
03
02
08 07 04
06 05
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No
incluyas los rboles de la acera.
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Al registrar las coordenadas, localiza el GPS sobre el centro de la parte superior de
cada una de las camelias
15 17 19 21 23 25
14 16 18 20 22 24
01 03 05 07 09 11 13
02 04 06 08 10 12
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
TAREA: Polilneas. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 nodos que estn marcados
en la ampliacin del plano adjunto que corresponden a una escultura. La escultura tiene tres
partes, le corresponden 5 a cada parte (dos extremos, el centro y dos intermedio). Identifcalos
con el cdigo de la zona (i.e. 22) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado
en el plano (sitate con atencin para no confundir el 1 con el 5), p.e. 22_01.
Para los 5 primeros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada rbol, y posteriormente pulsa
9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne
un cdigo por defecto.
NOTAS:
15
03
14 02 04
06
07
11
01
13
12 08 05
10 09
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.
01
11
15
12 07
16 14 08
10
02
13 09
06
04
03 05
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa.
100
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles. En el plano se representan dos rboles que ya no existen. No confundas los
madroos con los tejos.
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
08
07
06
09 05
10 04
11 03
12 02
01
13
14
15
101
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.
01 10
04 05 08
09
02
03 06 07
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa.
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
3. RESULTADOS
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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO
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8. CONTENIDOS DE
BIBLIOTECA
PRCTICAS
CATLOGO DE LA BUSC
1. Haz una bsqueda en el Catlogo de la BUSC de libros de Botnica general.
1. N de registros:
3. Selecciona y guarda los registros que respondan a libros de botnica general publicados despus del ao
2000
1. N de registros:
4. Busca un artculo de revista sobre lquenes de Portugal escrito por Graciela Paz Bermdez y Regina
Carballal Durn y publicado en la revista Nova Hedwigia
1. Seleccinalo y gurdalo.
2. Exporta los registros guardados a tu correo electrnico.
3. Tenemos el artculo en papel, dnde?
4. Busca en SFX si tenemos acceso al texto completo del artculo
5. Elabora una bibliografa con los documentos previamente seleccionados libros y artculos- empleando el
formato de cita bibliogrfica Harvard o Vancouver y lo envas a la USC Virtual
115
CONTENIDOS DE BIBLIOTECA
BASES DE DATOS
7. Entra en la base de datos del CSIC ICYT, y expn los pasos que diste para entrar.
8. Busca artculos sobre algas de agua dulce relacionados con Galicia a partir del ao 1998
1. N de registros:
2. tienen enlace al texto completo? Cuntos?
3. Tenemos las revistas en la Biblioteca Universitaria, dnde?
4. Si queremos consultar los artculos en papel cmo tenemos que hacer?
Nota:
116