Análisis de Bacterias en Carnes, Pescados y Mariscos

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
REA ACADMICA CIENCIAS DE LA SALUD
FACULTAD DE BIOANLISIS - XALAPA
LICENCIATURA EN QUMICA CLNICA
EXPERIENCIA EDUCATIVA:
Microbiologa Sanitaria
TEMA:
Anlisis de Bacterias en Carnes, pescados y mariscos
EQUIPO 3
INTEGRANTES:
Castaeda Hernndez Dania Karina

Mendoza Calles Csar Amador
Rosendo Gmez Hugo Eduardo
Zamora Crdoba Vernica
M. C. Ana Rosa Castillo Guerrero

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INDICE
CARNES
INTRODUCCIN .. 3
FUNDAMENTO.. 4
MATERIALY METODOS.. 6
CUADRO DE IDENTIFICACIN.. 10
PESCADOS
INTRODUCCIN ..37
FUNDAMENTO ..37
CUADRO DE IDENTIFICACIN.. 48
MARISCOS
INTRODUCCIN.. 49
FUNDAMENTO.. 49
CUADRO DE IDENTIFICACIN ..49
REFERENCIAS ..59
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CARNES
INTRODUCCIN
La carne es el producto pecuario de mayor valor. Posee protenas y aminocidos, minerales, grasas y cidos
grasos, vitaminas y otros componentes bioactivos, as como pequeas cantidades de carbohidratos. Desde el punto
de vista nutricional, la importancia de la carne deriva de sus protenas de alta calidad, que contienen todos los
aminocidos esenciales, as como de sus minerales y vitaminas de elevada biodisponibilidad.
Mientras en el mundo desarrollado el consumo de carne no ha registrado importantes variaciones, el consumo

anual per cpita de carne en los pases en desarrollo se ha duplicado desde 1980. El crecimiento demogrfico y el
incremento de los ingresos, junto con los cambios en las preferencias alimentarias, han producido un aumento de la
demanda de productos pecuarios.
Pronsticos realizados por la FAO, sealan que la produccin mundial de carne se habr duplicado para el
ao 2050 y se prev que la mayor parte del crecimiento se concentrar en los pases en desarrollo. El creciente
mercado de la carne representa una importante oportunidad para los productores pecuarios y los elaboradores de
carne de estos pases. No obstante, el incremento de la produccin ganadera y la elaboracin y comercializacin
inocuas de carne y productos crnicos conformes a las normas higinicas supone un serio desafo [1].
La industria crnica en Mxico es muy importante, existen muchos establecimientos dedicados al

procesamiento de la carne, desde microindustrias, pequeas y medianas, hasta empresas transnacionales que
compiten por un mismo mercado. Los productos crnicos gozan de gran aceptacin por parte del consumidor, en
nuestros das no existe una ama de casa que deje el refrigerador de su hogar sin estos productos, se han hecho casi
indispensables al momento de comprar la despensa; adems por su gran variedad se pueden consumir solos,
acompaados, en el desayuno, comida, cena, das de campo, etc.
El principal problema para estos productos es de tipo microbiolgico, debido a las malas prcticas de manejo
e higiene durante el proceso y hasta su consumo, pues como se sabe la carne fresca por su contenido nutricional y su
alto valor de actividad de agua est considerada dentro del grupo de los alimentos altamente perecederos, al igual
que la mayora de los productos elaborados con ella; sin embargo, de acuerdo a sus caractersticas particulares, el
tipo de microorganismos presentes puede variar [2].
A pesar de que el msculo como tal, es prcticamente estril, los alimentos preparados con base en carne son
muy susceptibles a la contaminacin y ofrecen las condiciones necesarias para el crecimiento de microorganismos
involucrados en daos y enfermedades de origen alimentario. En este tipo de productos, sobre todo frescos o con
procesos defectuosos, los microorganismos se multiplican rpidamente, especialmente a temperaturas por encima de
la de refrigeracin, resultando en prdidas de calidad y/o problemas de salud pblica.
La contaminacin se incrementa en carnes picadas porque ellas generalmente provienen de recortes

sumamente manipulados, en los cuales existe una gran rea superficial y las condiciones para el crecimiento y
desarrollo de microorganismos, son mayores, ocasionando grandes deterioros [3].
Los tipos de microorganismos y la cantidad de ellos, presentes en los productos elaborados con base en
carne, dependen de las condiciones sanitarias del medio ambiente del cual provenga el alimento, de las propiedades y
calidad microbiolgica de algunos ingredientes adicionados, del cuidado de quien procesa y maneja el producto y de
las condiciones posteriores de almacenamiento, manejo y distribucin del mismo.
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En productos crnicos los tratamientos del procesamiento, en general, reducen el nmero de bacterias, pero
solo el tratamiento de esterilizacin en latas, elimina completamente los microorganismos. El procesamiento puede
tambin introducir microorganismos adicionales y seleccionar el tipo que puede proliferar y causar dao durante el
almacenamiento. Adems, puede tambin involucrar el uso de ingredientes no crnicos que pueden servir como
nutrientes o inhibidores para el crecimiento microbiano.
La flora final, sin embargo, depende de factores tales como composicin e ingredientes no crnicos,
temperatura de procesamiento, ahumado, tajado, empaque y, por ltimo, condiciones de almacenamiento.
Por lo anterior, es fundamental mantener estrictas condiciones higinicas y elaborar los productos crnicos
siempre utilizando las buenas prcticas de manufactura ya sea que el alimento se elabore a escala industrial o en
pequea escala. Para conocer las condiciones higinicas de los alimentos se han usado organismos indicadores para
estimar tres factores: seguridad microbiolgica, condiciones de saneamiento durante el procesamiento y la calidad del
producto, para ello los indicadores ms usados son los mesfilos aerobios, coliformes, Staphylococcus aureus,
Enterococcus, hongos y levaduras, Clostridium perfringes y Pseudomonas entre otros [4].
FUNDAMENTO
El Codex Alimentarius define la carne como todas las partes de un animal que han sido dictaminadas como
inocuas y aptas para el consumo humano o se destinan para este fin [5]. La carne se compone de agua, protenas y
aminocidos, minerales, grasas y cidos grasos, vitaminas y otros componentes bioactivos, as como pequeas
cantidades de carbohidratos. La carne deber ser inocua y apta para el consumo humano, y todas las partes
interesadas, incluidos el gobierno, la industria y los consumidores, contribuyen al logro de ese objetivo.
La FAO considera que la produccin primaria es una fuente importante de peligros relacionados con la carne.
Hay cierto nmero de peligros presentes en las poblaciones de animales de matanza, por ejemplo E. coli O157:H7,
Salmonella spp, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes y diversos peligros qumicos y fsicos, y su control
durante la produccin primaria a menudo presenta dificultades considerables. El picado destruye las barreras
naturales de la carne, lo cual le permite entrar en contacto con el O2 en sus tejidos profundos; esta accin dispersa
los cmulos de grmenes distribuidos en la superficie de la carne.
El suministro de informacin pertinente sobre los animales destinados a la matanza facilita la aplicacin de
programas de higiene de la carne basados en el anlisis de riesgos y permite que los procedimientos de inspeccin se
adapten a la variedad y la prevalencia de enfermedades y defectos de una poblacin animal determinada. Ello puede
ser especialmente importante en situaciones en las que la presencia de ciertos agentes zoonticos no es detectable
mediante pruebas organolpticas o de laboratorio ordinarios y en las que tal vez haya que adoptar medidas
especiales, como por ejemplo la posible exposicin a quistes de Trichinella spiralis o Cysticercus bovis.
De acuerdo a la NOM-009-ZOO [6], se define como contaminante Materia indeseable entre las que se
incluyen sustancias o microorganismos que hacen que la carne, sus productos y subproductos, no sean aprobados
para el consumo humano. Por lo cual es importante hacer el procedimiento correcto de proceso sanitario para lograr
el mayor control de calidad posible, y que los lugares responsables de estas actividades sean lo ms ticos para
garantizar que todo se hace conforme a la normatividad ya establecida y evitar problemas sanitarios.
ANLISIS MICROBIOLGICO
En este trabajo se realiza una compilacin de los anlisis que se llevan a cabo especialmente en carnes,
cuando se tenga sospecha de que estn contaminados o cuando lamentablemente ya se hayan dado casos de
enfermedades debido al consumo de sta. Se analizar la presencia de bacterias, parsitos o virus que son de
importancia clnica para salud del ser humano, para lo cual detallaremos el procedimiento para dicho anlisis.
1. Salmonella.
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Los miembros del gnero Salmonella han sido muy estudiados como patgenos cuando se encuentran
presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en
las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del mtodo analtico utilizado para su deteccin.
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clnicas y los mtodos empleados para estos
casos se adaptaron posteriormente para su deteccin en alimentos. Las modificaciones a los mtodos consideraron
dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes en un alimento
debido al proceso a que est sujeto (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad
inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.
La determinacin de la presencia o ausencia de Salmonella, en cierta cantidad de masa o volumen especfico

de producto, se lleva a cabo acorde a lo descrito en el presente mtodo, requiriendo 5 etapas sucesivas. Las cuales
son:
Etapa de pre enriquecimiento
Enriquecimiento selectivo
- Aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales
- Identificacin bioqumica
- Serotipificacin.
La Salmonella puede presentarse en concentraciones bajas y en algunas ocasiones ir acompaada de una gran
cantidad de biota microbiana y de otras Enterobacterias y otros gneros bacterianos. Es por lo que se hace necesario
el pre-enriquecimiento para permitir la deteccin de un nmero bajo de bacterias o clulas estresadas de Salmonella.
MATERIAL
Para la Toma de la muestra [7].
Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapn esmerilado de material esterilizable, no txico y de tamao
acorde con la cantidad de muestra deseada.
Bolsas de polietileno estriles de varias medidas.
Hieleras de poliestireno o de otro material aislante
Papel aluminio.
Papel estraza.
Etiquetas auto adheribles.
Cinta testigo.
Marcadores indelebles.
Algodn.
Cerillos o encendedor
Instrumentos para toma de muestra: muestreadores, cucharones, esptulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero
inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados).
Lmparas de alcohol.
Frasco con etanol o Isopropanol al 70 %.
Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio, para toma de muestra.
Hielo o bolsas refrigerantes.
Bata, cubreboca, cofia y guantes estriles.
Para el anlisis microbiolgico [8].

Aislamiento de Salmonella
Material Medios de cultivo
Asa de platino, nquel o desechables de 3 mm de dimetro o 10 l Agua peptonada amortiguada
Pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml, 10 ml RVS
Matraz Erlenmeyer de 500 ml MKTTn
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Matraz Kitazato de 1000 ml XLD

Cajas Petri estriles de vidrio de 15 mm x 100 mm EH
Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm ASB
Tubos de ensayo de 20 mm x 100 mm Agar Verde Brillante
Gradilla Agar nutritivo
Mechero de Bunsen o Fisher TSI
LIA
Agar Urea de Christensen
Indol
MTODOS
I. Relativo a la muestra.
Toma de la muestra [9].
La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra
deben abrirse nicamente al momento de introducir sta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los
envases y evitar que la tapa se contamine.
La toma de muestra de productos envasados con presentacin comercial para venta al menudeo se llevar a
cabo en forma aleatoria y no asptica, tomndose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus anlisis,
envindose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.
Tratndose de muestrear productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir stos y extraer la
muestra en condiciones aspticas para evitar la contaminacin microbiana.
Si la muestra a obtener est expuesta al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones
estrictamente aspticas.
Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deber ser diferente de la que
se enva para su anlisis.
Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los
alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea
normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en
que se muestrearon, esto nicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a
temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeracin.
En el caso de muestras lquidas o semilquidas se deber agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y
despus efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.
En muestras slidas cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estriles
como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc.
En muestras de productos a granel, sta se obtendr de varios puntos del contenedor para obtener una muestra
representativa.
Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes
de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el
flujo.
Etiquetado.
Es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus de colocar en l la
muestra, mediante rtulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:
a) Fecha
b) Lugar
c) Hora del muestreo
d) Nmero de lote
e) Temperatura de la toma de muestra si es que procede.
La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en forma
tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.
Conservacin y transporte.
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El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteracin o
contaminacin, evitando su exposicin a la luz solar directa.
Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se
transportarn bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 C y deben mantenerse a esa temperatura hasta el
momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recoleccin.
En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0C, empleando para conservarla hielo
seco. Para la refrigeracin es recomendable el empleo de recipientes con lquido refrigerante o hielo potable
contenido en bolsas de plstico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases
o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.
En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presin que puedan ejercer otros recipientes o una
cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en
contacto con el exterior de la envoltura.
En el caso de muestras no perecederas, evitar que se daen, humedezcan o contaminen con otras.
Los productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura
ambiente, siempre y cuando sta no exceda de 45C
Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no est permitido el empleo de sustancias qumicas.
Las muestras que se entreguen al laboratorio debern acompaarse de un informe que adems de contener la
identificacin de la muestra, incluya los siguientes datos:
a) Nmero de unidades y/o cantidad.
b) Clave nica que permita la identificacin del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor.
c) Indicar nombre genrico y especfico del producto, as como la marca comercial y cualquier otra
informacin que se considere importante.
d) Observaciones, en donde se seale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos
antes de efectuar la toma de muestra o algn otro dato que sea significativo para determinar los anlisis
microbiolgicos que sean necesarios.
La muestra testigo podr eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las
especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnacin.
II. Procedimiento Analtico.

Este mtodo se basa en el anlisis de 25 g de la muestra analtica en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta
cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se recomienda una muestra de 25 g o ms.
1. Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en
homogeneizador peristltico (stomacher).
2. Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique
otro) y licuar si es necesario durante un min.
3. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y
dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.
4. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 0,2 con
hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles.
5. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 2 h a 35C.
6. Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas
(pescado, carne y hueso).
a) Productos procesados trmicamente y productos secos: si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede
omitirse. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para
emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaciones que
para el coco. La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin del alimento. Los detergentes
no sern necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar 24 2 h a 35C.
b) Para productos crudos o altamente contaminados: pesar porciones de 25 g de producto en dos vasos para
licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y el producto puede pesarse directamente en
matraces Erlenmeyer estriles de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito cistina o 225 ml de caldo Tetrationato
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(sin verde brillante) a cada muestra analtica. Licuar por dos min y pasar aspticamente a matraces Erlenmeyer de
500 ml. Dejar reposar y ajustar el pH si es necesario, a 6,8 0,2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N
estriles. Adicionar 2,25 ml de solucin de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solucin yodo-yoduro a la muestra que
se enriquecer con caldo Tetrationato. Homogeneizar e incubar 24 2 h a 35C.
7. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente,
transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo Tetrationato y a otro con 10 ml
de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo Tetrationato puede emplearse el medio
Vassiliadis-Rappaport.
Pre-enriquecimiento.
La preparacin de la suspensin inicial requiere pesar, en condiciones aspticas, 25 g de muestra, en un vaso de
licuadora. Agregar 225 mL de agua peptonada amortiguada estril y licuar por 2 min. Aflojar la tapa a 1/4 de
vuelta e incubar durante 24h 2h a 36C 1C. Terminado este paso se procede a obtener la dilucin 1:10.
En una situacin atpica y justificada, si la porcin de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25 g, se deber
utilizar la cantidad necesaria de medio de pre enriquecimiento para obtener una dilucin 1:10.
En casos excepcionales, cuando es necesario analizar ms de una porcin de 25 g de un lote especfico de
alimento y teniendo evidencia de que si hay mezcla de tales porciones no afecta el resultado, las muestras
pueden ser compuestas es decir, si 10 muestras de 25 g sern examinadas, combinar las 10 porciones para
obtener 250 g y adicionar 2.25 L del caldo de pre enriquecimiento precalentado a 36C 1C.
Sin embargo, se debe tomar en cuenta que para inocular el caldo selectivo RVS y MKTTn aumentarn las
porciones de 10 mL a 100 mL teniendo que inocular 1mL y 10mL respectivamente.
Enriquecimiento Selectivo.
Transferir 0.1 mL del cultivo de pre-enriquecimiento a un tubo del 10mL de caldo RVS y 1 mL a un tubo
conteniendo 10 mL de caldo MKTTn.
Incubar el caldo RVS a 41.5 C 1 C por 24 h 3 h y el caldo MKTTn a 36 C 1 C por 24 h 3 h.
Seleccin en Medios Slidos.

Para el aislamiento, inocular a partir de los cultivos obtenidos en el punto anterior, sembrar por estra simple 3 placas
de los siguientes medios selectivos:
Agar XLD para el aislamiento de colonias tpicas y Agar ASB para aislamiento de colonias lactosa positivas y
cualquier otro medio selectivo slido complementario. Se incuba a 36 C 1 C durante 24 h 3 h.
Agar EH para el aislamiento de microorganismo Gram negativos entricos, especialmente de Salmonella y
Shigella. Se incuba a 35 C 2 C durante 18 a 24 h para observar la proporcin del crecimiento y el tamao de
las colonias, la pigmentacin y la selectividad. Si son negativas, incubar nuevamente durante 18 a 24 horas ms.
Agar Verde Brillante es un medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp.,
excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi. Se incuba a 35 C 2 C durante 48 h.
Identificacin Bioqumica.
Para la confirmacin, tomar de cada agar selectivo al menos 1 colonia considerada como tpica o en total 3
colonias sospechosas si no existe la primera posibilidad.
En casos epidemiolgicos, identificar al menos 5 colonias sospechosas, si en una placa se encuentran menos de
5 colonias tpicas o sospechosas, confirmar todas las colonias que se encuentren en el medio.
Mantener las placas de agares selectivos y nutritivos entre 2 C y 8 C, hasta la conclusin del anlisis.
Antes de realizar las Pruebas bioqumicas es necesario estriar cada colonia seleccionada en cualquier agar nutritivo,
preferiblemente sin agua de condensacin, de tal manera que permita el aislamiento de colonias. Incubar las placas
inoculadas a 36C 1C durante 24h 3h.
Una vez obtenido el crecimiento de colonias se procede a las pruebas bioqumicas como se describe a continuacin:
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A partir del agar nutritivo, con un asa recta estril, tocar ligeramente el centro de la colonia seleccionada e
inocular en tubos de agar inclinado de TSI y LIA. Sembrar por picadura en el fondo y estra en la superficie
inclinada.
Incubar los tubos de TSI y LIA a 36C 1C por 24h 3h. Dejar los tapones flojos de los tubos para mantener
condiciones de aerobiosis mientras se incuban evitando excesiva produccin de H 2S.
Para los cultivos de TSI que se consideran presuntivos para Salmonella spp, continuar como se indica en
Identificacin de Salmonella spp para determinar la especie, incluyendo Salmonella arizonae.
a) Prueba de urea de Christensen.
Con un asa estril inocular tubos de agar urea de Christensen. Debido a que algunas veces los tubos de agar urea de
Christensen sin inocular, pueden virar a rojo prpura (prueba positiva), debe incluirse, un tubo de este agar sin
inocular como control en una prueba negativa. Incubar 24 h 2 h a 36 C 1 C.
b) Caldo L-lisina descarboxilasa.

Si la prueba de LIA fue satisfactoria, no es necesario repetirla. Si la reaccin de LIA fue dudosa, utilizar caldo lisina
descarboxilasa para la determinacin final de lisina descarboxilasa. Inocular el caldo con pequea cantidad de cultivo.
Cerrar la tapa fuertemente e incubar a 36C 1C por 24h 3h.
c) Deteccin de -galactosidasa.
Colocar la colonia seleccionada en un tubo conteniendo 0.25 mL de solucin salina, agitar para obtener una
suspensin
homognea. Adicionar una gota de tolueno y agitar. Colocar el tubo en un bao de agua a 36 C 1 C dejar reposar
por aproximadamente 5 min. Adicionar 0.25 mL del agente de deteccin de la -galactosidasa y mezclar. Colocar
nuevamente el tubo en el bao de agua a 36C 1C y dejar por 24 h 3 h. Examinar el tubo a intervalos de tiempo.
d) Prueba de Indol.
Inocular un tubo conteniendo 5 mL del caldo triptona con una suspensin homognea de la colonia sospechosa.
Incubar a 36 C 1 C por 24 h 3 h despus de la incubacin adicionar de 0.2 mL a 0.3 mL de reactivo de Kovac,
sin agitar y
resbalando por las paredes.
e) Prueba de VP (Voges Proskauer).

Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estril conteniendo 3 mL del medio VP. Incubar 36 C
1 C por 24 h 3 h. Despus de la incubacin adicionar dos gotas de solucin de creatina, tres gotas de solucin
-naftol y al final dos gotas de solucin de KOH, agitar despus de cada reactivo.
Pruebas Serolgicas.
La aglutinacin con el antisuero polivalente Poly A-I & Vi, puede usarse como resultado confirmatorio de la
presencia de Salmonella spp para las cepas probadas por TSI y LIA, existen cepas que no aglutinan con el
polivalente, pero que dan reacciones tpicas en TSI y LIA, para stas es necesario confirmar usando la batera
completa de bioqumicas.
Eliminacin de las cepas autoaglutinables.

Deposite una gota de solucin salina, en un portaobjetos perfectamente limpio. Disperse con un asa, parte de la
colonia a probar en la gota, de manera que se obtenga una suspensin homognea y turbia. Rote suavemente la
lmina por 30s a 60s. Observe el resultado sobre un fondo oscuro, preferiblemente con la ayuda de una lupa. Si las
bacterias se agrupan en grumos de diferentes tamaos, la cepa se considera como autoaglutinable debern
identificarse por pruebas bioqumicas complementarias y no someterse a la serotipificacin.
NOTA: Tambin es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua y luego mezclar esta solucin
con una gota de la solucin salina.
Deteccin de los antgenos Poly A-I & Vi.

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Empleando una colonia pura no autoaglutinable, proceda, empleando una gota de la solucin salina en una lmina de
vidrio, disperse con el asa hasta obtener una suspensin homognea y agregue una gota del antisuero O. Si se
produce
aglutinacin, la reaccin se considera positiva del antisuero O en lugar de la solucin salina. Si se produce
aglutinacin, la reaccin se considera positiva.
Para fines de vigilancia sanitaria, enviar el cultivo al laboratorio de referencia CCAyAC de la COFEPRIS para su
identificacin serolgica o molecular.
III. Morfologa de las Colonias.

Agar Caractersticas tpicas
Agar de xilosa, lisina, desoxicolato Colonias rosas con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella
(XLD) spp pueden producir colonias con un centro negro muy grande o
completamente negras.
Agar Entrico Hektoen (EH) Colonias azul-verdes o azules, con o sin centro negro. Muchos cultivos
de Salmonella spp pueden producir colonias con un centro negro muy
grande o completamente negras, despus de haber sido incubadas a
36C 1C durante 24h 3h.
Agar Bismuto Sulfito (ASB) Colonias cafs, grises o negras algunas veces pueden presentar brillo
metlico y el medio circundante a la colonia generalmente es caf al
principio y a medida que se prolonga el tiempo de incubacin, pueden
aparecer de color negro. Despus de haber sido incubadas a 36C
1C durante 24h 3h o hasta 48h.
Agar Verde Brillante (VB) Colonias incoloras rosadas o fucsia, transparentes u opacas, sobre el
medio coloreado de rosado a rojo, las bacterias fermentadoras de la
lactosa dan colonias amarillas.
Agar Caractersticas atpicas

Agar de xilosa, lisina, desoxicolato Muy pocos cultivos atpicos de Salmonella spp, producen colonias
(XLD) rosas salmn o amarillas respectivamente con o sin centro negro. En
ausencia de colonias tpicas, en EH y XLD, seleccionar 2 o ms
Agar Entrico Hektoen (EH) colonias atpicas.
Nota: Existen algunas cepas de Salmonella spp con un

comportamiento bioqumico diferente al resto del gnero, por ejemplo
S. Paratyphi A al crecer en XLD genera colonias rosas con el centro
ms obscuro y no produce H2S. Otras salmonelas atpicas producen
cido a partir de la lactosa y al crecer en XLD dan colonias amarillas
con o sin el centro negro.
Agar Bismuto Sulfito (ASB) Algunos cultivos producen colonias verdes con un halo oscuro muy
pequeo. Si despus de 48h de incubacin (como se explic
anteriormente), no hay colonias tpicas sospechosas en ASB,
seleccionar 2 o ms colonias atpicas.
CUADROS DE IDENTIFICACIN.
TSI Tendido Fondo Gas H2S

Salmonella typhi K A - + (-)
Otras Salmonellas K A + +++ (-)
A= cido (amarillo); K= alcalino (rojo)
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Gas +=ruptura del medio; H2S += ennegrecimiento del medio

( )= reacciones ocasionales
LIA Tendido Fondo Gas H2S

Salmonella spp K KoN - + (-)
Salmonella typhi K K - +o-
Salmonella paratyphi K A +o- -o+
Nota: considerar como negativos los cultivos que produzcan claramente un color amarillo en el
fondo del tubo.
A= cido (amarillo); K= alcalino (prpura)
Gas +=ruptura del medio; H2S += ennegrecimiento del medio
( )= reacciones ocasionales
Pruebas Bioqumicas complementarias para Salmonella spp

Medios Reacciones positivas
Urea de Christensen Mantiene su color amarillo-anaranjado original.
Reaccin alcalina, de color prpura, por
Caldo L-lisina descarboxilasa
descarboxilacin de la lisina.
El color amarillo es indicativo de reaccin
Deteccin de -galactosidasa
positiva, la cual se hace evidente en 20 minutos.
Prueba de Indol Formacin de un anillo de color rojo.
Prueba de VP Desarrollo de color rojo ladrillo.
Pruebas Serolgicas
Deteccin de los antgenos Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera
Poly A-I & Vi positiva del antisuero O en lugar de la solucin salina.
Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera

positiva.
2. Listeria monocytogenes.
Listeria monocytogenes es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de Listeriosis. Es
uno de los patgenos ms virulento causante de infecciones alimentarias, con una tasa de mortalidad entre un 20% a
30%, ms alta que casi todas las restantes txico infecciones alimentarias. L. monocytogenes es un bacilo corto Gram
positivo, que presenta diploformas dispuestas en "V" y anaerobio facultativo capaz de proliferar en un amplio intervalo
de temperaturas de 1 C a 45 C, no presenta cpsula ni espora. Tiene flagelos pertricos, gracias a los cuales
presenta movilidad a 30C o menos, pero es inmvil a 37C, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan.
Este mtodo permite determinar la presencia o ausencia de L. monocytogenes en los productos de consumo,
se efecta por medio de un pre-enriquecimiento selectivo y despus su aislamiento en placas de medio de cultivo
selectivo y diferencial principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica, con la
confirmacin mediante pruebas bioqumicas y fisiolgicas [11].
NOTA: con la finalidad de proteger la salud del personal de laboratorio, se debe considerar que:
Las pruebas para la determinacin de L. monocytogenes debern ser realizadas en laboratorios debidamente
equipados y por microbilogos expertos, cuidando la eliminacin de los desechos potencialmente contaminados.
Las mujeres embarazadas no debern manipular los cultivos de L. monocytogenes bajo ninguna circunstancia.
MATERIAL
12
Papel aluminio.
Papel estraza.
Cinta testigo.
Algodn.
Lmparas de alcohol.

Materiales
Asa de platino o nquel de 3 mm de dimetro o 10 l
Pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml, 10 ml
Matraz Erlenmeyer de 500 ml
Cajas Petri estriles de vidrio de 15 mm x 100 mm
Tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm
Tubos para serologa de 10 mm x 75 mm o de 13 mm x 100 mm
Gradilla
Mechero de Bunsen o Fisher
Aceite de inmersin
Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersin en aceite
Medios de cultivo
Caldo de Fraser medio, con reduccin de la concentracin de agentes selectivos
Caldo Fraser, con la completa concentracin de agentes selectivos
Agar Oxford
Agar PALCAM
ASTEL
CSTEL
Agar sangre de cordero
Caldo carbohidrato (Ramnosa y Xilosa)
Agar movilidad
Solucin de Perxido de hidrgeno
MTODOS
13
representativa.
flujo.
Etiquetado.
a) Fecha
b) Lugar
d) Nmero de lote
14

Este mtodo se basa en el anlisis de 25 g de la muestra analtica en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta
cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se recomienda una muestra de 25 g o ms.
Debe realizarlo un microbilogo experimentado, en un ambiente controlado, aislado de reas de produccin de
alimentos.
Se debe tener especial cuidado en la disposicin de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto
con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos.
Esta tcnica por ningn motivo debe aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso
de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada.
Enriquecimiento primario.
Tomar una muestra representativa tanto de la superficie externa como del interior.
Transferirlo al Caldo Fraser medio, a fin de obtener una relacin 1:10. Pesar 25 g o mL a frascos de dilucin con
225 mL del Caldo Fraser medio, para obtener una dilucin 1:10 (masa-volumen o volumen-volumen).
Homogeneizar por 1 min o 2 min en licuadora o homogeneizador peristltico dependiendo del tipo de muestra.
Incubar a 30 C 1 C por 24 h 2 h.
Nota: una coloracin obscura puede aparecer, durante la incubacin.
Enriquecimiento secundario.
Transferir 0.1 mL del enriquecimiento primario, a un tubo conteniendo 10 mL del Caldo Fraser.
Incubar el medio inoculado a 48 h 2 h a 36 C 1 C.
Seleccin en Medios Slidos.

1. Inocular a partir de los cultivos obtenidos en el Enriquecimiento primario, sembrar por estra cruzada 2 placas de los
siguientes medios selectivos:
Agar Oxford
Agar PALCAM
2. Inocular a partir de los cultivos obtenidos en el Enriquecimiento secundario, sembrar por estra cruzada 2 placas de
los siguientes medios selectivos:
Agar Oxford
Agar PALCAM
3. Invertir las placas e incubar un juego de agar Oxford y PALCAM a 30 C 1 C y el otro a 36 C 1 C.
NOTA: Las placas con agar PALCAM se pueden incubar en condiciones de micro-aerofilia (CO2 5% -12%; O2
5%-15%).
15
4. Despus de la incubacin por 24 h si se observa un crecimiento pobre o si no se observan colonias volver a

incubar
por 18 h a 24 h. Observar las placas para detectar la presencia de colonias presuntivas de Listeria spp.
Pruebas auxiliares confirmatorias.

a) Agar ASTEL.
Tomar de cada placa de agares selectivos, 5 colonias sospechosas de Listeria spp. Si alguna de las placas tiene
menos de 5 colonias presuntivas, tomar para su confirmacin todas las colonias que hayan crecido.
Sembrar por estra cruzada, para obtener colonias aisladas en cajas con ASTEL.
Incubar estas placas a 36 C 1 C por 18 h a 24 h o hasta que el crecimiento sea satisfactorio (no ms de 72h).
b) Luz de Henry.
Esta prueba tiene carcter informativo.
Examinar las placas de ASTEL con colonias tpicas, con el sistema ptico de Henry se trata de hacer incidir luz
transmitida oblicuamente con una lmpara de luz blanca lo suficientemente potente como para iluminar la placa
en un ngulo de 45.
Se recomienda el uso de cepas (positivo y negativo). La placa puede ser observada a simple vista, pero es
preferible el uso de un microscopio de diseccin o lupa.
c) Catalasa.
Tomar una colonia aislada y suspenderla en una gota de solucin de perxido de hidrgeno.
La inmediata formacin de burbujas indica una reaccin positiva.
Precaucin: la agitacin del reactivo con la suspensin del microorganismo debe hacerse con un asa de plstico o
palillo
de madera estril, evitando el contacto con el reactivo.
d) Tincin de gram.
Realizar la tincin de Gram a 1 colonia aislada obtenida en ASTEL.
e) Prueba de movilidad.
Tomar 1 colonia aislada de ASTEL, y suspenderla en un tubo conteniendo CST con extracto de levadura.
Incubar a 25 C 1 C por 8 h a 24 h o hasta que se observe el medio turbio.
Depositar una gota de este cultivo entre un portaobjetos y cubreobjetos y examinar en el microscopio.
Nota: Cultivos incubados a la temperatura de 25 C 1 C pueden ser falsos positivos al exhibir dicho movimiento: se
recomienda siempre comparar el cultivo de prueba con cepas conocidas de cocos, bacilos largos o cortos con una
movilidad rpida de nado y que no es caracterstico de Listeria spp.
f) Prueba alternativa de movilidad.

Utilizando un asa recta, inocular agar de movilidad picando 1 colonia obtenida en ASTEL.
Incubar por 48 h a 25 C 1 C.
Examinar el crecimiento alrededor de la picadura.
Si el crecimiento no es suficiente, incubar por 5 das adicionales y observar la picadura al trmino de ese tiempo.
Confirmacin de L. monocytogenes.
a) Prueba de hemlisis.
Si las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas, as como la catalasa son indicativos de Listeria spp, inocular una
placa con agar sangre de carnero al 5% para determinar la actividad hemoltica. Las placas NO deben presentar agua
de condensacin en la superficie del medio.
Dibujar una cuadrcula de 20 a 25 espacios en el anverso de la placa de agar sangre de carnero al 5%.
Tomar 1 colonia aislada obtenida en ASTEL e inocular por picadura un cuadro por cada cultivo a probar.
Simultneamente utilizar cepas control positiva (L. monocytogenes) y negativas (L. innocua).
Despus de la incubacin a 36 C 1 C por 24 h 2 h, examinar las cepas de prueba y los controles.
16
Examinar las placas con una luz brillante para poder comparar las cepas de prueba con los controles.
b) Utilizacin de Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa).

Utilizando un asa bacteriolgica, inocular cada uno de los caldos de carbohidratos a probar usando colonias
aisladas en ASTEL.
Incubar a 36 C 1 C por 5 das.
Si despus de 48 h de incubacin no se observa una reaccin positiva clara, dejar incubar hasta 5 das
(alternativamente pueden utilizarse sistemas de bioqumicas miniaturizadas o mtodos de biologa molecular).
c) Prueba de CAMP.
En una placa de agar sangre de carnero al 5% sembrar una estra de la cepa de S. aureus y otra lnea paralela
de R. equi, de tal forma que queden paralelas y diametralmente opuestas para que entre estas pueda estriarse la
cepa sospechosa de Listeria, sin que lleguen a tocarse entre s.
Simultneamente probar cepas control: L. monocytogenes, L. innocua y/o L. ivanovii.
Incubar las placas a 36 C 1 C por 12 h a 18 h.

Despus de 24 horas: colonias pequeas (1 mm) grisceas, rodeadas por un halo
oscuro.
Oxford
Despus de 48 horas: las colonias se tornan oscuras con posible brillo verdoso de
aproximadamente 2 mm, con halos negros y centros hundidos.
Para placas incubadas en anaerobiosis dejarlas expuestas al aire por 1h, para que
recuperen su color de rosa a prpura.
Despus de 24 h se observan colonias muy pequeas, grisceas o verde olivo de

PALCAM aproximadamente 1.5 mm a 2 mm de dimetro, a veces con centros negros, pero
siempre con halos oscuros.
Despus de 48 h las colonias se observan de color verde de aproximadamente 1.5

mm a 2 mm de dimetro, con el centro hundido y rodeadas de un halo negro.
Las colonias tpicas se observan de 1 mm a 2 mm de dimetro, convexas, incoloras y
ASTEL opacas con borde entero. Si no se obtiene un buen aislamiento, proceder a sembrar
nuevamente otra colonia sospechosa de los medios selectivos.
Pruebas auxiliares complementarias

Pruebas Reacciones positivas
Las colonias aparecen de color azul-gris a azul. Se
Luz de Henry
recomienda el uso de cepas (positivo y negativo).
Catalasa Formacin inmediata de burbujas.
Tincin de Gram Se observan bacilos cortos Gram Positivos.
Se observan como bacilos cortos con un movimiento
Prueba de movilidad
giratorio (trumbling).
Debido al tpico movimiento de Listeria spp como resultado
Prueba alternativa de movilidad
un crecimiento caracterstico en forma de sombrilla.
17
Confirmacin de Listeria monocytogenes

L. monocytogenes produce una zona ligeramente clara
alrededor del punto de la picadura (-hemlisis).
L. innocua no muestra una zona clara alrededor de la
Prueba de hemlisis
picadura.
L. ivanovii usualmente se observa una zona ancha, clara y
delimitada de -hemlisis.
Produccin de cido y cambio de color a amarillo cuando se
utiliza base caldo purpura de bromocresol adicionado con
Utilizacin de Carbohidratos
cada uno de los carbohidratos, dentro de las primeras 24 h a
48 h.
La hemlisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se
incrementa cerca de la estra de S. aureus.
La hemlisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estra de
Rhodococcus equi.
Las especies restantes de Listeria no son hemolticas en
esta prueba.
Prueba de CAMP
3. Staphylococcus aureus.
Es una bacteria altamente vulnerable a tratamientos trmicos y a varios agentes sanitizantes. La presencia de
esta bacteria en los alimentos procesados o en los equipos donde se procesan, es generalmente un indicador de
sanitizacin inadecuada o manejo inadecuado durante la produccin. S. aureus produce enterotoxinas
termorresistentes que al ingerirse pueden causar intoxicaciones alimentarias. Es actualmente responsable de un alto
porcentaje de los brotes de intoxicacin alimentaria a nivel mundial [12].
Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos estn:

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una enfermedad de origen alimentario.
Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este microorganismo enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin post-proceso la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies
inadecuadamente sanitizadas.
18
Los alimentos sujetos a contaminacin post-proceso con tipos enterotoxignicos de Staphylococcus aureus
representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que normalmente restringe el crecimiento del
Staphylococcus aureus y la produccin de enterotoxinas. Este tipo de alimentos se vuelven ms peligrosos, si adems
son sujetos a un inadecuado manejo o son mantenidos a temperaturas de conservacin inapropiadas.
Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelera y productos
de leche, son los ms comnmente asociados con intoxicacin estafilocccica.
MATERIAL
Papel aluminio.
Papel estraza.
Cinta testigo.
Algodn.
Lmparas de alcohol.

Materiales
Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas.
Pipetas Pasteur
Gradilla
Probetas
Varillas de vidrio de 3.5 mm x 20 cm
Cmara hmeda: caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en
forma de V rodeada de algodn humedecido con agua
Medios de cultivo
Agar Baird Parker
Solucin de Telurito de potasio
19
Emulsin de yema de huevo

BHI
Solucin reguladora de fosfatos
Agua peptonada
Solucin salina 0.85%
Agar Azul de Toluidina-ADN
Plasma de Conejo con EDTA
Agua peptonada amortiguada
Perxido de hidrgeno al 3%
Caldo rojo de fenol (glucosa y manitol)
Aceite de parafina o mineral estril
Solucin trazable para verificacin de potencimetro
MTODOS
representativa.
flujo.
Etiquetado.
a) Fecha
b) Lugar
d) Nmero de lote
20

Este mtodo permite hacer una estimacin del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efecta
directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmacin mediante las pruebas de
coagulasa y termonucleasa.
Este mtodo es adecuado para el anlisis de alimentos en los cuales se esperen ms de 100 clulas de
Staphylococcus aureus por gramo.
Preparacin de la muestra.
Tomar diferentes porciones de la muestra, transferir 25g o mL a frascos de dilucin con 225mL de solucin
reguladora de fosfatos, fosfatos o agua peptonada amortiguada, para preparar una dilucin 1:10.
Cuando no se disponga de 25g de muestra se deber justificar y utilizar la cantidad necesaria de solucin
reguladora de fosfatos, para obtener una dilucin 1:10.
Homogeneizar por 1 min o 2 min en licuadora u homogeneizador peristltico.
Seleccin en medios slidos.

Transferir por medio de una pipeta estril, 0.1 mL de la muestra directa si es lquida, o 0.1 mL de la suspensin
inicial (dilucin 10-1) en el caso de otros productos, por duplicado a cajas de agar Baird Parker. Repetir el
procedimiento para las diluciones siguientes si son necesarias.
21
Nota: Si se sospecha que el alimento contiene bajas cuentas de S. aureus, se deber aumentar el lmite de deteccin,
en un factor igual a 10 inoculando 1 mL de la muestra directa si sta es lquida, o de cada dilucin distribuida en 3
placas como sigue: 0.4 mL, 0.3 mL y 0.3 mL sobre la superficie de las placas de Agar Baird Parker, por duplicado. En
ambos casos evitar usar cajas hmedas.
Cuidadosamente distribuir el inculo tan pronto como sea posible, sobre la superficie del agar con varillas
estriles de vidrio en ngulo recto, utilizando una para cada placa y dilucin.
Mantener las placas con las tapas hacia arriba hasta que el inculo sea absorbido totalmente por el agar.
Invertir las placas e incubar por 44 h a 48 h a 36 C 1 C.
Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias tpicas y atpicas de S. aureus si no es posible,
seleccionar las placas de las diluciones ms altas no obstante tengan ms de 150 colonias. Seleccionar por
muestra 5 colonias tpicas para su confirmacin o 5 colonias atpicas, para la realizacin de la tincin de Gram,
en el caso de observar bacilos positivos, la colonia se tomar como negativa para S. aureus, por lo contrario, si
se observan cocos se seguir con su confirmacin.
Cuando las placas tengan menos de 15 colonias tpicas se debe agregar la nota de "valor estimado" al reporte de
los resultados.
Si fue inoculado 1.0 mL en 3 placas, tratar stas como una sola y seguir los procedimientos de confirmacin.
Pruebas confirmatorias.
a) Prueba de coagulasa.
Seleccionar y sembrar cada colonia tpica en tubos con 0.5 mL de BHI y en tubos con AST.
Utilizar simultneamente un control positivo de S. aureus y un control negativo de S. epidermidis.
Incubar a 35 C 1 C en bao de agua, durante 20 h a 24 h.
Mantener los cultivos en AST a no ms de 27 C 1 C para pruebas posteriores.
Agregar a 0.1 mL del cultivo anterior a 0.3 mL de plasma de conejo con EDTA (a menos que el fabricante indique
otras cantidades).
Incubar a 37 C 1 C en bao de agua y observar peridicamente a intervalos de 1 h durante las primeras 4 h a
6 h si no hay formacin de cogulo, observar hasta las 24h.
Para cada lote nuevo de reactivo se deber realizar la prueba de coagulabilidad del plasma de conejo aadiendo
una gota de cloruro de calcio al 5% a 0.5mL de plasma reconstituido, formndose un cogulo en 10s-15s.
b) Prueba de termonucleasa.
Preparar portaobjetos con 3mL de agar azul de toluidina ADN.
Con ayuda de una pipeta Pasteur hacer orificios equidistantes en el agar.
En un bao de agua hirviendo calentar durante 15 min, 0.3mL de cultivo en BHI.
Utilizando una pipeta Pasteur transferir una gota del cultivo a un orificio del medio, repetir para cada cepa
incluyendo testigos positivo y negativo.
Incubar a 35C 1C en cmara hmeda de 4h a 24h.
Pruebas adicionales.
a) Prueba de catalasa.
A partir de un cultivo en AST realizar la prueba de la catalasa en un portaobjetos, emulsificar una porcin del
cultivo con una gota de perxido de hidrgeno al 3%.
b) Utilizacin anaerbica del manitol.

Inocular un tubo con caldo para la fermentacin adicionado de manitol al (0.5%), con un inculo abundante.
Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite mineral de al menos 25mm.
Incubar hasta 5 das a 36C 1C.
Incluir los controles positivos y negativos.
c) Utilizacin anaerbica de la glucosa.

22
Inocular un tubo con caldo para la fermentacin adicionado de glucosa al (0.5%), con un inculo abundante.
Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite mineral de al menos 25mm.
Incubar hasta 5 das a 36C 1C.
Incluir los controles positivos y negativos.

Colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro de 1 mm a 2
Baird Parker mm y muestran una zona opaca, hmedas y CON un halo claro (debido a la
actividad de la lecitinasa) alrededor de la colonia.
Agar Caractersticas Atpicas

Colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro de 1 mm a 2
Baird Parker
mm y muestran una zona opaca, hmedas y SIN halo claro alrededor.
Pruebas confirmatorias
Cuando el cogulo se forma completamente y es firme al invertir el
Prueba de coagulasa
tubo.
La aparicin de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm
Prueba de termonucleasa
alrededor de la perforacin.
Pruebas adicionales
Prueba de catalasa Produccin de burbujas de gas.
Tincin de Gram Cocos Gram positivos, agrupados en racimos.
Utilizacin anaerbica del Un cambio en la coloracin del indicador indica la utilizacin
manitol anaerbica del manitol y la presencia S. aureus.
Utilizacin anaerbica de la Un cambio en la coloracin del indicador indica la utilizacin
glucosa anaerbica de la glucosa y la presencia S. aureus.
Caractersticas S. aureus S. epidermidis Micrococcus

Actividad de catalasa + + +
Produccin de coagulasa + - -
Produccin de termonucleasa + - -
Utilizacin anaerbica de manitol + + -
Utilizacin anaerbica de glucosa + - -
+, La mayora de las cepas son positivas (ms del 90%).
-, La mayora de las cepas son negativas (ms del 90%).
Interpretacin:
1. Las pruebas de termonucleasa o coagulasa positiva son consideradas como resultados
confirmatorios de S. aureus.
2. Si al menos el 80% de las colonias tpicas seleccionadas fueron coagulasa positiva y/o
termonucleasa positiva tomar el nmero total de las colonias contadas como presuntivas de S.
aureus.
3. En otros casos, calcular el nmero de colonias presuntivas de S. aureus a partir del porcentaje
obtenido de colonias coagulasa y/o termonucleasa positivas confirmadas.
23
4. Promediar los resultados de los duplicados.

5. Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (tpicas o
atpicas) calcular el nmero de S. aureus para cada dilucin como se especifica en los puntos
anteriores, calcular la cuenta de S. aureus considerando el factor de dilucin, calcular el logaritmo
en base diez de cada dilucin y realizar la resta de stos, si la diferencia entre los logaritmos de las
dos diluciones es menor a 0.3, reportar el promedio de las dos diluciones. Si por el contrario la
diferencia entre los logaritmos es mayor a 0.3 reportar el valor ms bajo.
4. Clostridium perfringens.
Es un organismo bacilar, gram positivo, esporulado, anaerobio estricto; su crecimiento ptimo se presenta en
condiciones de temperatura entre 37-45 C. es capaz de proliferar en presencia de NaCl al 2% (pero no al 6.5%);
aunque las clulas vegetativas son fcilmente inactivadas por el calor, sus esporas presentan termorresistencia
(pueden hervir varias horas conservando su viabilidad) [13].
Los brotes de C. perfringens son causados por ingestin de carnes o productos crnicos preparados, incluye:
aves, carne cruda de vaca o ternera, salsas o jugos de carnes. La intoxicacin por esta bacteria tambin es llamada
de las cafeteras.
MATERIAL
Papel aluminio.
Papel estraza.
Cinta testigo.
Algodn.
Lmparas de alcohol.

Materiales
Pipetas Pasteur
24
Gradilla
Medios de cultivo
Agua peptonada al 1%
Agar Triptosa sulfito cicloserina con yema de huevo
Agar Triptosa sulfito cicloserina sin yema de huevo
Caldo hgado cocido
Medio fluido de Tioglicolato
Medio acidificado de leche fierro
Agar gelatina lactosa
Agar movilidad nitratos
Caldo para esporulacin
Caldo Tioglicolato ms 1% de salicina
Caldo Tioglicolato ms 1% de rafinosa
Caldo Tioglicolato ms 1% de glucosa
Caldo Tioglicolato ms 1% de arabinosa
Caldo Tioglicolato ms 1% de manitol
Caldo Tioglicolato ms 1% de lactosa
Agar de esculina inclinado
MTODOS
representativa.
flujo.
Etiquetado.
25

a) Fecha
b) Lugar
d) Nmero de lote

Actualmente existen 2 mtodos diferentes para el aislamiento, numeracin e identificacin de C. perfringens [14]:
a) Aislamiento y numeracin presuntiva en agar sangre neomicina y confirmacin por la reaccin de Naegler y la
neutralizacin de la reaccin antitoxina de C. perfringens tipo A.
b) Aislamiento y numeracin en placas de tipo agar triptosa sulfito cicloserina y fermentacin de carbohidratos.
sta tcnica analtica tienen como principio el de inocular diluciones decimales de en placas de agar TSC, agar
triptosa-sulfito cicloserina, en donde el Clostridium perfringens se manifiesta por la reduccin de sulfitos a sulfuros,
los cuales reaccionan con las sales de hierro, produciendo color negro de sulfuro ferroso.
ste mtodo especifica el mtodo de recuperacin de C. perfringens mediante el mtodo de cultivo convencional y es
aplicable a cualquier alimento en el cual C. perfringens est viable y presente.
26
Pesar en condiciones de asepsia, 25 g del alimento y aadir 225mL de diluyente, en este caso de agua
peptonada al 0.1% dilucin 1:10.
Homogeneizar durante 1-2 minutos a velocidad baja y efectuar diluciones decimales hasta 10-4 con la menor
aireacin posible, en caso de no tener colonias sospechosas en agar TSC, guardar en refrigeracin
especficamente la dilucin 1:10

Por duplicado, colocar en las cajas de TSC con yema de huevo 1mL de cada dilucin, agitar perfectamente y
dejar que se absorba por completo la muestra.
Verter 8mL de agar TSC sin yema de huevo a cada placa.
Incubar a 35+ 2 C por 24h.
Seleccin en medios slidos Mtodo alternativo.

Inocular 0.1mL de cada dilucin sobre placas de agar TSC con yema de huevo y distribuir con varilla.
Despus de que el inculo se ha absorbido, aadir una sobrecapa de 8mL de agar TSC sin emulsin con yema
de huevo. Dejar solidificar.
Colocar las placas sin invertir dentro de una jarra para anaerobios con generador y catalizador para incubar de
20-24 h a 35 C
Selecciona las placas que contengan entre 20-200 colonias negras.
Contar y calcular el nmero de colonias de clostridios por g de alimento
Verificar la manera de efectuar los clculos en la tcnica analtica de S. aureus tomando en cuenta el volumen
inoculado en cada placa TSC el cual puede ser de 1 mL o 0.1 mL.
Identificacin bioqumica.
Seleccionar 10 colonias tpicas e inocular en medio fluido del Tioglicolato desaireado y enfriado.
Incubar de 15-24 horas a 35 + 2 C.
Despus examinar el desarrollo microbiano de cada cultivo mediante tincin de Gram y comprobar la pureza de
las colonias desarrolladas.
Si existe evidencia de contaminacin, seleccionar colonias caractersticas y sembrarlas nuevamente sobre placas de
agar TSC con yema de huevo e incubar anaerbicamente durante 24 horas a 35 + 2 C.
Este procedimiento tambin es usado para aislar C. perfringens de los tubos de Caldo hgado cocido o medio de
carne.
a) Prueba de leche-fierro.
Inocular medio de leche-fierro con 1 mL del cultivo del Tioglicolato fluido-del paso anterior.
Incubar a 46+ 1 C durante 2 horas.
Es recomendable utilizar tubos largos para esta prueba, con el fin de evitar derramamientos accidentales.
Esta prueba es suficiente para casos de prueba presuntiva.
b) Gelatina-lactosa.
Inocular por picadura los tubos con medio gelatina lactosa y medio movilidad nitratos, a partir de cultivos puros de
caldo Tioglicolato fluido o colonias aisladas en el agar TSC.
Incubar durante 24 h a 35 + 2 C.
Posteriormente en el caso especfico de la gelatina lactosa
Enfriar el tubo 1 hora a 5C y observar si hubo licuefaccin de la gelatina; si el medio de gelatina lactosa
permanece slido, incubar adicionalmente 24 h a 35 + 2 C y observar.
c) Movilidad de nitratos
Como C. perfringens no es mvil, observar los tubos de movilidad-nitratos, para ver si el crecimiento solamente
est a lo largo de la picadura.
27
Por otra parte C. perfringens reduce nitratos a nitritos; para lo cual se aaden 0.5 mL de reactivo A y 0.2 mL del
reactivo B.
d) Caldo de esporulacin.
Inocular caldo para esporulacin, 1 mL de caldo Tioglicolato fluido. Incubar 24 h a 35 + 2 C
Refrigerar los cultivos esporulados por si se requieren pruebas adicionales.
e) Fermentacin de salicina y rafinosa.

Inocular el caldo Tioglicolato que contiene salicina o rafinosa con una asada del cultivo de caldo Tioglicolato
enriquecido.
f) Fermentacin de otros carbohidratos.

Inocular el caldo Tioglicolato adicionado del carbohidrato seleccionado, con una asada del cultivo de caldo
Tioglicolato enriquecido.
Incubar durante 24 h a 38 + 1 C
Posteriormente examinar el medio despus de adicionar un indicador cido-base.
g) Hidrlisis de Esculina.
Tomar una asada de caldo Tioglicolato enriquecido e inocular por estra nicamente la pendiente del tubo de agar
esculina.

TSC con yema Colonias con dimetro aproximado de 2 a 4 mm opacas con una zona
de huevo blanca alrededor de la colonia debido a la actividad de la lecitinasa.
Colonias con color amarillo grisceo, con zonas opacas de 2-4mm de
TSC, Bioqumica
dimetro, por la actividad de la lecitinasa.
Identificacin Bioqumica
Prueba Comportamiento
Movilidad -
Reduccin de nitratos +
Licuefaccin de la gelatina a 22 C +
Fermentacin de la glucosa +
Fermentacin de la rafinosa +, gas y acidez
Fermentacin de la sacarosa +
Fermentacin de la arabinosa -
Fermentacin del manitol -
Fermentacin de la salicina -
Fermentacin de la lactosa +
Fermentacin tormentosa de la leche +
Hidrlisis de la esculina -
28
5. Campylobacter jejuni.
Las especies del gnero Campylobacter agrupan bacilos Gram negativos curvos, espirilados o en forma de S
que presenta un flagelo nico en uno o ambos extremos. En cultivos de varios das (ms de tres) degeneran en
formas esfricas u ovoides (cocoides) que han perdido su viabilidad [15].
La campilobacteriosis es una zoonosis de distribucin mundial. Campylobacter se halla habitualmente como

comensal del tracto gastrointestinal de vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, roedores silvestres o domsticos
y toda variedad de aves de corral.
Muchos de los casos de enteritis humana han sido asociados al contacto con animales, agua contaminada o
alimentos de origen animal. En pases desarrollados, la diarrea por Campylobacter es ms frecuente en los meses de
verano, siendo afectados todos los grupos tnicos de ambos sexos. Se considera que un alto porcentaje de
infecciones es provocado por consumo de carne de ave mal cocida. En pases en vas de desarrollo la enfermedad
parece ser ms frecuente en nios de corta edad.
MATERIAL
Papel aluminio.
Papel estraza.
Cinta testigo.
Algodn.
Lmparas de alcohol.

Materiales
Pipetas Pasteur
Gradilla
29
Medios de cultivo
Agua peptonada al 0.1%
Agar selectivo para Campylobacter
Caldo nitrato
Medio SIM
Prueba de oxidasa
MTODOS
representativa.
flujo.
Etiquetado.
a) Fecha
b) Lugar
d) Nmero de lote
30

Preparacin de la muestra [16].
Para el caso de muestras solidas colocar 25 g de la muestra, para muestras liquidas 25 mL de la muestra
Transferir la muestra pesada o medida a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estril.
Adicionar 90.0 mL de diluyente estril al 0.1% a la licuadora o bolsa Stomacher.
Homogenizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora o velocidad mnima.

Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el nmero de diluciones est en funcin de la procedencia de la
muestra) en tubos de 16 X 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.
Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1,10-2, 10-3 y 10-4 a cajas Petri con agar selectivo para Campylobacter.
Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estril, en forma de L,
iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de inoculacin por extensin en superficie).
Mantener las placas en su posicin hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos
aproximadamente.
Invertir las placas e incubar en condiciones micro-aeroflicas 42-43C, durante 24 a 48 horas.
Despus de incubar observar las colonias caractersticas de este microorganismo en el agar selectivo para
Campylobacter. Estas se presentan como gotas de agua extendidas a lo largo de la estra.
a) Prueba de oxidasa.
Colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa.
Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.
31
Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en agar Skirrow y depositarlo en el papel filtro anterior.
b) Prueba de catalasa.
Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%.
La formacin inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva.
Precauciones: la emulsin debe realizarse con un asada platico o palillo de madera estril evitando el contacto
del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre, cualquier contaminacin con
eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas.
c) Reduccin de nitratos.
Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos.
Incubar a 35C por 5 das.
Para la lectura se debe agregar 0.2 mL de reactivo A y 0.2 mL de reactivo B.
En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2 mL del reactivo B y 0.2 mL del reactivo C.
Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos).
Si esta coloracin no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja
confirma una prueba negativa (presencia de nitratos).
d) Movilidad.
Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37 C

Colonias planas grisceas, no hemolticas, translcidas y de borde
Selectivo
continuo o discretamente irregular.
Prueba Comportamiento
Oxidasa +
Catalasa +
Reduccin de nitratos +
Produccin de H2S +, +
Hidrlisis de hipurato +
Crecimiento a 37 C y 42 C +, +
Crecimiento aerobio -
Movilidad +
6. Escherichia coli O157:H7.

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patgeno emergente asociado a enfermedades
transmitidas por alimentos, que puede causar enfermedades severas en el hombre como colitis hemorrgica (CH),
sndrome urmico hemoltico (SUH) y prpura trombocitopnica trombtica.
La gravedad de las enfermedades producidas, especialmente cuando afectan a la poblacin infantil, y las
bajas dosis infectivas que caracterizan no slo a los brotes sino tambin a los casos espordicos (menos de 100
UFC/g), le han permitido ser clasificado como uno de los patgenos transmitidos por los alimentos de ms alto riesgo
para la salud pblica. El ganado vacuno es sealado como el principal reservorio de STEC, y a la carne picada
insuficientemente cocida como el vehculo ms frecuente de los brotes [17].
32
MATERIAL
Papel aluminio.
Papel estraza.
Cinta testigo.
Algodn.
Lmparas de alcohol.

Materiales
Pipetas Pasteur
Gradilla
Medios de cultivo
Solucin salina bufferada con 0.05% de Tween 20
Solucin fisiolgica
Solucin de novobiocina
Caldo triptona soja modificado con novobiocina
Agar MacConkey sorbitol con cefixima-telurito
Medio Cromognico
Agar tripticasa de soja
Agar TSI
Agar Citrato de Simmons
Agar SIM
Caldo Voges Proskauer - rojo de metilo
Caldo sorbitol al 1 % en medio base con indicador
Medio urea de Christensen
Medio para lisina descarboxilasa
33
Medio para ornitina descarboxilasa
MTODOS
II. Relativo a la muestra.
representativa.
flujo.
Etiquetado.
a) Fecha
b) Lugar
d) Nmero de lote
34
III. Procedimiento Analtico.

Pesar 65 g 2 g de la muestra, colocar en una bolsa de Stomacher
Agregar 585 ml 11.7 ml de caldo TSBm+n
Homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher
Incubar a 42 C 1C durante 15 h a 22 h.
Incluir un control positivo, otro negativo y un medio sin inocular como controles para cada grupo de muestras
analizadas.
Nota: En el caso de carne de vaca cruda molida, y carne de vaca cruda molida mezclada con pollo o cerdo, pasteles o
empanadas rellenos con carne cocidos, y recortes de carne, se pueden combinar 5 muestras de 65 g para obtener
una
muestra compuesta (pool) de 325 g 32.5 g. Llevar a dilucin 1:4 con 975 ml 19.5 ml de caldo TSBm+n y
homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher.
Prueba de tamizaje (test de Screening).

Del caldo de enriquecimiento realizar el test de screening siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las muestras que dan un resultado negativo en el test de screening se consideran NEGATIVAS para E. coli
O157:H7/NM.
Las muestras que dan un resultado positivo en el test de screening se consideran PRESUNTIVAMENTE
POSITIVAS para E. coli O157:H7/NM y se contina con la concentracin inmunomagntica.
Concentracin inmunomagntica: Procedimiento para Kit marca Dynabeads anti-E. coli O157 y equipo Dynal
MPC-S
NOTA: en caso de utilizar otro kit comercial seguir las especificaciones del fabricante.
Colocar el nmero de tubos Eppendorf que sean necesarios en el Dynal MPC-S (concentrador magntico de
partculas), sin el plato magntico.
Resuspender Dynabeads anti E. coli O157 hasta que desaparezca el pellet. Tomar con la pipeta 20 l y colocar
en los tubos.
Agregar con pipeta 1 ml del preenriquecimiento. Cerrar la tapa.
35
Agitar en vrtex 15 segundos y luego invertir el Dyna MPC-S unas cuantas veces (aprox. 20 veces). Incubar a
temperatura ambiente por 10 minutos con suave agitacin para evitar depsitos.
Insertar el plato magntico, invertir varias veces, hasta observar un botn en la pared que contacta el imn. Dejar
en reposo 3 minutos.
Abrir los tubos utilizando el abridor, aspirar el sobrenadante con precaucin de no desprender las perlas de la
pared que contacta con el imn.
Remover el plato magntico.
Seleccin en medios especficos.

Dispensar 50 l de las partculas concentradas.
En una placa de CT-SMAC y sembrar en forma aislada con un ansa o esptula de Drigalsky.
Incubar las placas a 35C 1C durante 18 h a 24 h.
Dispensar 50 l de las partculas concentradas 3.3.3.11. en una placa de medio cromognico para E. coli O157 y
sembrar en forma aislada con un ansa o esptula de Drigalsky. Incubar las placas a 35C 1C durante 18 h a
24 h.
NOTA: Dependiendo del tipo de alimento y su flora microbiolgica la incubacin del caldo de enriquecimiento por 20 h
a 24 h puede aumentar el crecimiento de otras bacterias en los agares selectivos, dificultando el aislamiento de E. coli
O157.
La inoculacin de los medios selectivos con diluciones de las partculas concentradas, o con la siembra de un
volumen menor a 50 l, puede aumentar la posibilidad de obtener colonias aisladas de E. coli O157, aunque esto
puede aumentar tambin el lmite de deteccin de la tcnica.
a) Prueba de urea de Christensen.
Con un asa estril inocular tubos de agar urea de Christensen. Debido a que algunas veces los tubos de agar urea de
Christensen sin inocular, pueden virar a rojo prpura (prueba positiva), debe incluirse, un tubo de este agar sin
inocular como control en una prueba negativa. Incubar 24 h 2 h a 36 C 1 C.
b) Prueba de Indol.
Inocular un tubo conteniendo 5 mL del caldo triptona con una suspensin homognea de la colonia sospechosa.
Incubar a 36 C 1 C por 24 h 3 h despus de la incubacin adicionar de 0.2 mL a 0.3 mL de reactivo de Kovac,
sin agitar y
resbalando por las paredes.
c) Prueba de VP (Voges Proskauer).

Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estril conteniendo 3 mL del medio VP. Incubar 36 C
1 C por 24 h 3 h. Despus de la incubacin adicionar dos gotas de solucin de creatina, tres gotas de solucin
-naftol y al final dos gotas de solucin de KOH, agitar despus de cada reactivo.
Identificacin Serolgica.
a) Deteccin del antgeno somtico O
Ltex anti-O157: kit de ensayo comercial MicroScreen E. coli O157 o equivalente. Seguir instrucciones dadas por el
fabricante. Antisuero anti-O157
Colocar separadamente dos gotas de 20 l de solucin fisiolgica (SF) en una placa de vidrio
Mezclar una asada del cultivo en TSA con SF
Observar las dos suspensiones iluminando la placa con luz de una lmpara.
Nota 1: Si la muestra aglutina por s misma no se debe continuar con el ensayo. Una muestra autoaglutinada
corresponde a una cepa rugosa, la cual puede revertir al estado liso realizando sucesivos pasajes en agar sangre o en
agar Mueller Hinton.
36
Agregar 15 l del suero anti-O157 a una de las dos suspensiones y mezclar.

Mover la placa mediante rotacin suave durante un minuto.
Observar la apariencia de las suspensiones con luz de una lmpara.
Nota 2: La suspensin sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo.

Nota 3: En cada ensayo se deben realizar control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas.
b) Deteccin del antgeno flagelar H7.

Colocar separadamente dos gotas de 20 l de solucin fisiolgica (SF) en una placa de vidrio
Mezclar una asada del cultivo en TSA con SF
Observar las dos suspensiones iluminando la placa con luz de una lmpara.
Comentario: Si la muestra aglutina por s misma no se debe continuar con el ensayo.
Agregar 15 l del suero anti-H7 a una de las dos suspensiones y mezclar (la suspensin sin el agregado de
antisuero se utiliza como control negativo).
Mover la placa mediante rotacin suave durante un minuto.
Observar la apariencia de las suspensiones con luz de una lmpara.
Nota: En cada ensayo se debe realizar el control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas.

Colonias planas grisceas, no hemolticas, translcidas y de borde
Selectivo
continuo o discretamente irregular.
Prueba E. coli E. coli O157:H7
Fermentacin de glucosa + +
Fermentacin de lactosa + +
Fermentacin de sacarosa + +
Formacin de H2S - -
Produccin de gas + +
Utilizacin de citrato - -
Produccin de Indol + +
Movilidad Puede tener los 2 movilidad
Fermentacin de sorbitol + -
Produccin de ureasa -/+ -/+
Actividad lisina descarboxilasa + (90%) + (100%)
Actividad -glucuronidasa + -
Identificacin Serolgica
Prueba E. coli E. coli O157:H7
Antgeno somtico O
Suspensin + antisuero Aglutinacin
Positivo O157
Suspensin + SF No presenta aglutinacin
Suspensin + antisuero No presenta aglutinacin
Negativo
37
Antgeno flagelar H7
Suspensin + antisuero Aglutinacin
Positivo H7
Suspensin + antisuero No presenta aglutinacin
Negativo
Identificacin de Microorganismos en Pescado

Introduccin:
Industria pesquera o sector pesquero es la actividad econmica del sector primario que consiste en pescar y producir
pescados, mariscos y otros productos marinos para consumo humano o como materia prima de procesos Segn
estadsticas de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura (FAO), la produccin
pesquera mundial en 2001 fue de 130,2 millones de toneladas. Adems de las capturas comerciales, 37,9 millones de
toneladas fueron producidas en acuicultura (plantas acucolas).
Es la captura de peces y otros organismos en aguas salada (mar), salobre (esteros) o dulce (lagos, lagunas, estanque
o ros). La mayor produccin proviene del mar, donde cada pas tiene una zona econmica exclusiva para navegar y
pescar, de 370.4 km (200 millas nuticas) de extensin de la costa hacia mar adentro. Fuera de ese lmite, la captura
de especies marinas es libre, pues se consideran aguas internacionales. [18]
La mayor parte de la pesca la realizan los pases desarrollados, gracias a sus poderosas flotas y al potencial
cientfico, tcnico y econmico con el que cuentan, que les ha permitido desarrollar una extensa red de centros
docentes para la industria pesquera, as como de instalaciones de investigacin cientfica y tecnolgica, en donde
tienen cuadros altamente calificados de cientficos e ingenieros pesqueros que han confeccionado los mtodos
modernos de explotacin de los recursos pesqueros, preocupndose principalmente por aprovecharlos para
suministrar productos alimenticios a su poblacin y aumentar las fuentes de trabajo. [19]
Los productos crnicos marinos o dulceacucolas, en comparacin con los de otro origen, presentan caractersticas
diferenciales principalmente en 1) una alta diversidad de especies que son comercializadas; 2) se presentan a la
inspeccin en cantidades muy grandes debido a la concentracin en los puntos de desembarque (de hasta ms de
500 toneladas por da en un solo lugar para un solo producto); 3) raramente son el origen de enfermedades en el
hombre, pero son extremadamente perecederos, motivo por el cual son muy vulnerables a manejarse en estado
alterado, lo que representa un alto riesgo para la salud de los consumidores. Lo anterior nos obliga al aseguramiento
de la calidad de los productos de la pesca y sus derivados (inspeccin e investigacin), con lo que finalmente se
garantice que sean productos alimenticios seguros y saludables que compitan nacional e internacionalmente con
productos de otro origen. [20]
Fundamento:
Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, aunque tambin de origen
qumico como las intoxicaciones. La incidencia de estas enfermedades, sigue constituyendo uno de los problemas de
salud pblica ms extendidos en el mundo contemporneo y permanecen como una de las causas principales de
morbilidad, que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria.
Entre los alimentos involucrados resaltan los pescados frescos-refrigerados y congelados, debido a que estos
productos en su origen estn sometidos a una contaminacin microbiolgica y qumica, entre otras, y que aunado a la
forma de consumo generan enfermedades para el consumidor.[21]
Especificaciones sanitarias [21]
Los productos objeto de este ordenamiento, deben cumplir con las siguientes especificaciones:
Fsicas:
Parsitos
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

Parsitos 2/ kg/ unidad de muestra
38
Materia extraa
Los pescados frescos-refrigerados y congelados debern estar exentos de materia extraa.

Qumicas

Nitrgeno amoniacal en 100 g 30 mg
Microbiolgicas

Mesoflicos aerobios UFC/g 10 000 000
Coliformes fecales NMP/g 400
Staphylococcus aureus UFC/g 1 000
Vibrio Cholerae O 1 toxignico en 50 g* Ausente
Salmonella spp en 25 g Ausente
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretara de Salud sin perjuicio de las atribuciones de otras
Dependencias del Ejecutivo, determinar los casos en los que se habr de identificar la presencia de este agente
biolgico.
Contaminacin por metales pesados

Cadmio (Cd) 0,5
Mercurio (Hg) 1,0
Mercurio como metil mercurio* 0,5
Plomo (Pb) 1,0
* Es necesario nicamente en los casos en que el mercurio total supere el nivel de referencia establecido, con la
finalidad de aceptar o rechazar el lote.
Contaminacin por plaguicidas
Los productos objeto de esta Norma no deben contener residuos de plaguicidas como Aldrin, Dieldrin, Endrin,
Heptacloro y Kapone u otros prohibidos en el Catlogo de Plaguicidas publicado en el Diario Oficial de la Federacin.
Aditivos alimentarios.
Los aditivos alimentarios permitidos para los pescados congelados, son los siguientes:
Antioxidantes: ascorbato de potasio y ascorbato de sodio en una cantidad no mayor de 1g/kg expresado como el
cido
Retenedores de humedad: fosfato tribsico de calcio, polifosfato tetrapotsico, pirofosfato tetrasdico, polifosfato de
sodio, fosfato monopotsico, fosfato monosdico, trifosfato pentapotsico y trifosfato de sodio; en una cantidad no
mayor de 5 g/kg expresado como P2O5, solos o combinados.
Mtodos de prueba: [21]
Para la verificacin de las especificaciones fsicas, qumicas y microbiolgicas que se establecen en esta Norma se
deben aplicar los mtodos de prueba sealados en el Captulo de referencias y en el apndice Normativo A. Para la
determinacin de Vibrio Cholerae aplicar el mtodo establecido en el apndice Normativo A de la NOM-031-SSA1-
1993 de Moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. La determinacin de
nitrgeno amoniacal se efectuar con el mtodo contemplado en la NOM-087-SSA-1993. Aves frescas refrigeradas y
congeladas enteras y troceadas. Especificaciones sanitarias.
Tcnicas y Procedimientos para la Investigacin de Vibrio cholerae [22]
Material y reactivos:
Licuadora y vasos de licuadora estriles.
Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca.
Varilla de vidrio de 3mm de dimetro y 20cm de largo, con un doblez terminal en ngulo recto de 4cm.
Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad.
Balanza analtica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad.
39
Incubadoras de 39-40C.
Bao de agua de 42 0,2C y 35-37C.
Cucharas estriles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.
Cajas Petri estriles de 15 x 100 mm de plstico.
Pipetas estriles de 1 ml con graduacin de 0,01 ml, de 5 y 10 ml con graduacin de 0,1 ml.
Asas bacteriolgicas de 3 mm de dimetro de nicromel o platino.
Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm.
Tubos para bioqumicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.
Tijeras y pinzas estriles.
Lmpara (para observar reacciones serolgicas).
Mecheros.
Papel pH (rango 1-14) con un mximo de graduacin de 0,4 unidades de pH por cambio de color.
Potencimetro.
Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable.
Aparato de filtracin y membranas de 0,45 micras.
Medios de cultivo
Agua Peptonada Alcalina (APW)
FORMULA
Peptona 10 g
Cloruro de sodio 10 g
Agua destilada 1 000 ml
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que despus de esterilizar ste sea de 8,5 0,2. Esterilizar en
autoclave 10 minutos a 121C.
Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)
FORMULA
Extracto de levadura 5 g
Proteosa peptona 10 g
Sacarosa 20 g
Tiosulfato de sodio.5H2O 10 g
Citrato de sodio.2H2O 10 g
Sales biliares 3 g
Bilis de buey 5 g
Citrato frrico 1 g
Azul de bromotimol 40 mg
Azul de timol 40 mg
Agar 15 g
Preparar en un matraz por lo menos tres veces ms grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los
ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitacin constante hasta ebullicin e inmediatamente retirar del
calor. No esterilizar. Enfriar a 50C y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45C antes de usar.
Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)
SOLUCION 1:
FORMULA
Peptona 10 g
Extracto de carne 5 g
Solucin Stock de colorante 1 000 1 ml
40
Agar 15 g
Agua destilada 900 ml
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el agar.
Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121C. Enfre de 48-55C.
SOLUCION STOCK DE COLORANTES 1 000 X:
FORMULA
Azul de bromotimol 4 g
Rojo de cresol 4 g
Etanol al 95% 100 ml
Para obtener un color firme del medio usar una solucin colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los
colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solucin al 4% (peso/volumen). Agregue 1 ml de
esta solucin a cada litro de agar mCPC, la cual tendr al final 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo cresol por
litro.
SOLUCION 2:
FORMULA
Celobiosa 10 g
Colistina 400 000 UI
Polimixina B 100 000 UI
Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. Enfre y agregue los antibiticos. Esterilice por filtracin,
agregue la solucin 2 a la solucin 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.
Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal)
FORMULA
Triptona o tripticasa 10 g
Agar 20 g
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolucin del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. Esterilice en
autoclave 15 minutos a 121C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfre el medio de 45-50C y distribuya
en cajas Petri estriles.
Agar Gelatina (GA)
FORMULA
Peptona 4 g
Gelatina 15 g
Agar 15 g
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolucin de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 0.2. Esterilice en
autoclave 15 minutos a 121C. Enfre de 45-50C y distribuya en cajas Petri estriles.
Agar Gelatina con Sal (GS)
FORMULA
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de cloruro de sodio por cada litro. Suspenda los ingredientes y
hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 0,2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121C. Enfre
de 45-50C, coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminacin de Vibrio spp tal como V. alginolyticus,
use de 25-30 g de agar por litro.
Caldo Glucosa de Hugh-Leifson
FORMULA
Peptona 2 g
Extracto de levadura 0,5 g
41
Dextrosa 10 g
Prpura de bromocresol 0,015 g
Agar 3 g
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Ajuste el pH a 7,4 0,2. Coloque en tubos y esterilice en
autoclave 15 minutos a 121C.
Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina)
FORMULA
BASE
Peptona 5 g
Dextrosa (D-glucosa) 1 g
Prpura de bromocresol 0.02 g
Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 g de L-aminocido a 1 litro de base. Como control, use base sin
suplemento (aminocido). Para Vibrio spp haloflicos, adicionar 15 g de cloruro de sodio por litro. Ajuste el pH de tal
manera que despus de la esterilizacin sea de 6,5 0,2. Distribuya en tubos y esterilice en autoclave 10 minutos a
121C.
Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3, T1N6,T1N8 y T1N10
FORMULA
Triptona o tripticasa 10 g
Cloruro de sodio 0,10,30,60,80 o 100 g
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue cloruro de sodio, para T1N1 use 10 g de cloruro
de sodio (1% w/v concentracin de cloruro de sodio); as respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3%
w/v concentracin de cloruro de sodio). Distribuya en tubos de tapn de rosca de 16 x 150 mm, tape los tubos.
Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121C. Ajuste el pH a 7,2 0,2.
Caldo Soya Tripticasa (TSB)
FORMULA
Peptona de tripticasa (Triptona) 17 g
Peptona de fitona (Soytona) 3 g
Fosfato dipotsico 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolucin. Distribuya 225 ml en matraces de 500 ml o
tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121C. El pH final debe ser de 7,2 0,2.
Agar Soya Tripticasa (TSA)
FORMULA
Peptona tripticasa (Triptona) 15 g
Peptona de fitona (Soytona) 5 g
Agar 15 g
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolucin del agar. Para Vibrio spp
haloflicos, agregar 15 g de cloruro de sodio. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en autoclave durante 15
minutos a 121C. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50C y distribuya en cajas Petri. El pH final
debe ser de 7,3 0,2.
42
Agar de Hierro Kligler (KIA)
FORMULA
Peptona polipeptona 20 g
Lactosa 20 g
Dextrosa 1 g
Citrato frrico amoniacal 0,5 g
Tiosulfato de sodio 0,5 g
Rojo de fenol 0,025 g
Agar 15,0 g
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolucin del agar. Distribuir en tubos de tapn de rosca. Esterilizar en
autoclave durante 15 minutos a 121C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7,4 0,2.
Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS)
FORMULA
Peptona 5 g
Triptona 10 g
Glucosa 1 g
L-Arginina(hidrocloruro) 5 g
Citrato frrico amnico 0,5 g
Agar 13,5 g
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolucin del agar, y distribuir en cantidades de 5 ml a
tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a 7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 121C. Deje solidificar
el medio inclinado.
Agar Triple Azcar y Hierro (TSI)
FORMULA
Polipeptona 20 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1 g
Sulfato ferroso amnico 0,2 g
Rojo de fenol 0,025 g
Agar 13 g
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullicin, agitando ocasionalmente hasta
completa disolucin. Enfriar a 60C y ajuste el pH de 7,3 0,1.
Agar de Hierro y Lisina (LIA)
FORMULA
Peptona o gelisato 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
L-Lisina 10,0 g
43
Citrato frrico amnico 0,5 g

Agar 15,0 g
Agua destilada 1 000 g
Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullicin con agitacin frecuente hasta
conseguir la disolucin completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121C. Enfriar de 50-60C y ajustar el pH de
6,7 0,1. Distribuir en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrian en posicin inclinada, de tal
modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.
Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP)
FORMULA
Peptona 7 g
Glucosa 5 g
Fosfato dipotsico 5 g
Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia. Para Vibrio spp haloflicos, agregar 15 g ms de cloruro de sodio
(para una concentracin final del 2%). Filtrar, enfriar a 20C y diluir a 1 litro. Distribuya en tubos. Esterilizar en
autoclaves durante 12 - 15 minutos a 121C. Ajustar el pH de 6,9 +/- 0,2.
Medio para prueba de movilidad (semislida)
FORMULA
Peptona 10 g
Extracto de carne 3 g
Agar 4 g
Calentar con agitacin y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolucin del agar. Para Vibrio spp haloflicos agregar 15 g
ms de cloruro de sodio (para una concentracin final del 2%). Distribuir en tubos con tapn de rosca. Esterilizar en
autoclave 15 minutos a 121C. Ajustar el pH de 7,4 0,2.
Soluciones y reactivos
Prueba de rojo de metilo.
REACTIVO
FORMULA
Rojo de metilo 0,1 g
Alcohol etlico 300 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, aadir 5 gotas de la
solucin a 5 ml del cultivo problema.
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como
prueba Negativa.
Prueba de Vogues-Proskauer.
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

REACTIVO
FORMULA
Alfa naftol 5 g
Alcohol etlico absoluto 100 ml
Aadir 0,6 ml de la solucin de alfa naftol y 0,2 ml de una solucin acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloracin roja en 15 minutos constituye una reaccin Positiva.
Prueba de oxidasa.
44
REACTIVO
FORMULA
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g
Conservar en frasco oscuro a 5-10C. El reactivo se conserva durante 14 das.
Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35C. Agregar 0,3 ml de reactivo.
Resultado: La reaccin positiva se observa por la produccin de un color azul en un minuto.
Reaccin de indol.
REACTIVO DE KOVAC
FORMULA
P-dimetilaminobenzaldehdo 5.0 g
Alcohol amlico.o alcohol isoamlico 750 ml
Acido clorhdrico concentrado 25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehdo en el alcohol amlico y agregar el cido clorhdrico lentamente, gota a gota y
agitando. Debe conservarse en frasco mbar con tapn esmerilado; el color del reactivo va del amarillo al caf claro.
Se debe conservar a 4C.
Procedimiento:
Determinacin de V. cholerae en pescados.
1. Se debern preparar las siguiente diluciones 10-1 , 10-2 y 10-3 .

2. Se toma carne del rea de las vsceras incluyendo stas.
3. Incubacin de las muestras entre 35C - 37C.
4. De cada submuestra tomar 25 g, cortar en piezas pequeas e introducirlas en un vaso de licuadora de 500 ml
de capacidad que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 minutos a la
mxima velocidad. Esta es la dilucin 1:10. De esta dilucin preparar la dilucin 1:100 y 1:1000, en 9 o 90 ml
de agua peptonada alcalina. [21]
5. Incubar las tres diluciones entre 35C y 37C.
6. Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35C. Agregar de 0,2 a 0,3 ml del reactivo. El
desarrollo de un color intenso constituye una prueba Positiva para indol.
7. Despus de la incubacin, y sin agitar, transferir el inculo de la pelcula (crecimiento superficial) con un asa
de 3-5 mm de dimetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar con
tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina
(mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clsico de V. cholerae. Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 horas de
35-37C y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40C. [22]
Morfologia colonial [22]

Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las caractersticas coloniales que a continuacin se describen,
seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aplicarlas con estra cruzada para aislar en agar
T1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentracin de NaCl) e incubar durante 12-18 horas a 35-37C. Es
necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias, antes de las pruebas
bioqumicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal (GS) en el segundo da. Los resultados sern
confiables si las placas de aislamiento muestran colonias puras.
a.- Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clsico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la
fermentacin de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translcidos.
Nota: Las especies de vibrio no producen colonias pequeas de color crema en agar TCBS. Las colonias de V.
mimicus, que estn estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa negativas). La mayora
de las dems especies de vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes.
45
b.- Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae El Tor son prpuras (negativas para la fermentacin de la celobiosa). El
V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes translcidos. La mayora de las
dems especies de vibrio no crecen fcilmente en agar mCPC.
Diferenciacin: [22]
Diferenciacin de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios.
a.- TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). Inocular las colonias individuales en medios de cultivo TSI
(Agar de Triple Azcar y Hierro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar inclinado. Incubar los
tubos inoculados, con el tapn no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-37C. Se recomiendan estos medios
porque las reacciones permiten efectuar una diferenciacin presuntiva entre la mayora de las especies de vibrio,
Aeromonas, Plesiomonas shigella y otras bacterias.
b.- Caldo triptona al 3% de NaCl (T1N3).
Inocular las colonias en los caldos T1N0 y T1N3 e incubar durante 18 a 24 horas de 35-37C. El V. cholerae y el V.
mimicus crecern en T1N0 y T1N3. Algunas especies de bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones
similares a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayora de las especies vibrio spp,
incluyen algunos V. cholerae No. 01, crecern en T1N3 nicamente de la familia vibrionaceae crece solamente en
T1N3.
Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar la tolerancia
de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una lnea recta en el centro de un sector de
las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 horas de 35-37C. El V. cholerae
y el V. mimicus crecern. El vibrio spp haloflico crecer en ambas placas, porque ellos no requieren de sal. Slo en la
placa con GS. Para leer la reaccin de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observar un halo
opaco alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos.
c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson.
Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo con una
capa de aceite mineral estril o vapor lquido (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos centmetros de grueso.
Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas de 35-37C. Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la
oxidacin como para la fermentacin. Las especies de pseudomonas, que comnmente se aslan del pescado y los
mariscos con mtodos de enriquecimiento que se usan para las especies de vibrio, utilizan la glucosa slo para la
oxidacin
d.- Prueba de oxidasa.
Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga
carbohidratos fermentables. Un mtodo fcil consiste en colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y
humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una
asa de platino estril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos
oxidasa positivos, el papel se tornar prpura oscura o azul en pocos segundos. Las especies patgenas de vibrio son
oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii).
Identificacin y confirmacin [22]
a.- Leer los resultados de las prueba bioqumicas de TSI, KIA, AGS, T1N0 y T1N3 o GA y GS, y caldo glucosa de
Hugh-Leifson.
46
b.- Hacer una tincin de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar.
Nota: Los cultivos puros que se sometern a las dems pruebas serolgicas y bioqumicas para el V. cholerae son
sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. mimicus o son celobiosa
negativos (verde-prpura) en agar mCPC, crecen en caldo T1N0 o en placas con GA; presentan reacciones
caractersticas en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos gram negativos y producen
cido a partir de la glucosa, tanto en la oxidacin como en la fermentacin, en el caldo de cultivo de Hugh-Leifson.
c.- Pruebas bioqumicas.
Las reacciones bioqumicas para identificacin de V. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran en el cuadro
anexo. La frmula para todos los medios bioqumicos deber contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de
medios convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 2% de NaCl como diluyente. Para el V. cholerae se puede
usar solucin salina fisiolgica (0,85% de NaCl) como diluyente.
d.- Prueba serolgica de aglutinacin.

Usar antisuero de diagnstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) para el
antgeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y negativos, y los
controles salinos para cada antisuero usado. Seguir las instrucciones del antisuero. Como es posible que los
antgenos de los antisueros estn relacionados entre s, hay que realizar pruebas bioqumicas para confirmar que el
cultivo puro sea de V. cholerae 01 o No. 01.
Nota: Anticuerpos monoclonales estn disponibles, pero el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con bacterias de
otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales ser para el antgeno del complejo 01
1.- Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01, pero no en solucin salina fisiolgica simple, son de V.
cholerae del grupo 01 si las reacciones bioqumicas confirman que el cultivo puro es de V. cholerae. Los cultivos que
se aglutinan con este antisuero para grupos especficos pueden ser clasificados segn el subtipo con anticuerpos
Inaba y Ogawa.
- Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, tienen los 3
factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
- Los cultivos que aglutinan con el antisuero polivalente, pero no aglutinan con antisueros Inaba y Ogawa, no se
pueden tipificar con estos antisueros.
2.- Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con mtodos bioqumicos y que no aglutinen con el
antisuero del grupo 01 son V. cholerae 0:1. El suero para la clasificacin de V. cholerae No 0:1 segn el tipo se puede
obtener de R.J. Siebeling.
3.- Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solucin salina, no se pueden clasificar segn el
tipo. Sin embargo, si se usa un medio ms rico, como en TSA o agar infusin cerebro corazn (BHI), se puede
eliminar esta autoaglutinacin.
e. Caractersticas mnimas para la identificacin de V. cholerae.
Las caractersticas que permiten suponer la presencia de V. cholerae como mnimo son las siguientes:
1.- Morfologa.
Bacilo o bacilo encorvado, esporognico y gram negativo.
2.- Aspecto en TSI.
Estra cido, picadura cido, gas negativo y H2S negativo.
3.- Prueba de Hugh-Leifson.
Fermentacin de la glucosa y oxidacin positiva.
4.- Citocromo-oxidasa positivo.
5.- Prueba de la dihidrolasa arginina: negativo.
6.- Prueba de la lisinadescarboxilasa: positivo.
7.- Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clsico y V. mimicus.
8.- Crecimiento a 42C: positivo.
9.- Prueba de halofilia con NaCl.
47
0%: positivo, 3%: positivo, 6%: usualmente negativo. Algunas cepas de V. cholerae NO 01 se desarrollan a 0% de
NaCl.
10.- Fermentacin de la sacarosa: positivo para V. cholerae (negativo para V. mimicus).
11.- Prueba de ONPG: positivo.
12.- Fermentacin de la arabinosa: negativo.
13.- 0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 g 0/129
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio EN AGAR KIA, TSI Y AGS.
Microorganismos KIA TSI AGS
Estra Picadura Estra Picadura Estra Picadura
V.cholerae K A A(K)* A K a
V.mimicus K A K(A)* A K A
V.parahe-molyticus K A K A K A
V.algino lyticus K A A A K A
V.vulnificus K o A A K(A)* A K A
V.hidrophyla K o A A K o A A K K
V.shigelloides K o A A K o A A N N
* = Raramente
K = Alcalino
A = Acido
a = Ligeramente cido
N = Neutro
Procedimiento al trasluz para la deteccin de parsitos. [21]
Para detectar los parsitos se coloca una muestra sobre una lmina acrlica de 5 mm de espesor, de 45% de
traslucidez y una fuente luminosa de 1500 lux a una distancia de 30 cm por encima de la lmina.
La infestacin parastica podr detectarse mediante este procedimiento al trasluz, por examen visual.
Materia extraa [21]
Residuos de orina en alimentos.
Determinacin con luz ultravioleta
Observar el rea manchada manteniendo el cuarto oscuro, utilizando una fuente de luz ultravioleta de 366 nm.
Analizar y marcar con un lpiz el rea empleando la luz ultravioleta. Cuando sea detectado el olor a orina se debe
reportar como tal.
Prueba de ureasa
Colocar la muestra en 1 o 2 membranas en un vaso de precipitados de 5 ml mantener la muestra cubierta con agua
tibia. Proceder a exprimir las membranas tratando de obtener la mayor cantidad de lquido que sea posible.
Colocar 2 o 3 gotas del microcultivo en la base del cilindro. Agregar una pequea gota de mezcla de ureasa
(suspensin de 25 mg de tabletas de ureasa, en 0,5 - 0,7 ml de agua). Adicionar una pequea gota de cido
hexacloroplatnico en solucin al 10%; cubrir la preparacin y agitar, despus abrirla cuando las gotas se encuentren
en el centro de la base del cilindro. El amonaco se presenta como cristales de hexacloroplatinato de amonio
formadas, en las gotas trabajadas.
Los cristales se observan y detectan por medio del microscopio en la lente 100X. Esto se puede observar a los treinta
minutos de la preparacin en varias formas de cristales. Algunos de los componentes orgnicos son voltiles, en otros
el agua favorece la formacin de cristales en las gotas trabajadas. El cido hexacoloroplatnico puede cristalizar. Sin
embargo, los cristales presentes son diferentes a los del hexacloroplatinato de amonio.
48
49
MARISCOS
INTRODUCCIN
Cules son los riesgos de consumir pescados o mariscos crudos?
El consumo de productos del mar crudos o insuficientemente cocinados est relacionado con un mayor riesgo de
padecer enfermedades por bacterias patgenas (Ej. Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Listeria
monocytogenes, Clostridium botulinum tipo E), virus y parsitos.
Las bacterias patgenas pueden proceder del hbitat de los peces (contaminado o no con aguas residuales) y/o
manipulacin durante el procesamiento y preparacin. Estas bacterias son sensibles al calor y por lo tanto se
destruyen fcilmente con las temperaturas de coccin.
Anisakis , es un parsito que habita naturalmente un gran nmero de peces (Ej. merluza, caballa, jurel, sardina,
salmn. La parasitacin puede llegar a afectar entre el 40% y el 80% de las piezas capturadas, dependiendo de la
especie y de su procedencia. El parsito se inactiva sometiendo el pescado a coccin a temperaturas sobre 60 C, al
menos durante 15 minutos, o si es congelado a -20 C durante ms de una semana o a -35C por 15 horas.
Es importante considerar, que algunas personas tienen un mayor riesgo de padecer enfermedades transmitidas por
consumo de pescados o mariscos crudos o insuficientemente cocinados. Estos grupos susceptibles incluyen a las
siguientes personas:
Mujeres embarazadas
Nios pequeos
Adultos mayores
Personas con problemas del sistema inmunolgico
Personas con acidez estomacal disminuida
Este grupo de personas deben evitar adems los pescados y mariscos ahumados refrigerados. En el caso de los
mariscos ahumados refrigerados pueden consumirse cocinados en un guiso. Adems, pueden consumir los mariscos
ahumados enlatados o envasados.
FUNDAMENTO
Las infecciones por mariscos son debido a intoxicaciones.
En la intoxicacin por mariscos, los ingredientes txicos son toxinas producidas por organismos similares a algas
llamados dinoflagelados, que se acumulan en algunos tipos de productos de mar. Existen muchos tipos
diferentes de intoxicacin por mariscos. Los mejor conocidos son la intoxicacin paraltica por mariscos, la
intoxicacin neurotxica por mariscos y la intoxicacin amnsica por mariscos.
ANALISIS MICROBIOLOGICO Los metabolitos producidos por los microorganismos (trimetilamina y cidos grasos) se
pueden usar como indicadores de una alteracin inminente de los productos de pesca.
CUADRO DE IDENTIFICACIN
RECUENTO DE ORGANISMOS PSICROTROFOS PRESENCIA-AUSENCIA DE Vibrio cholerae y
relacionados
Mantener las muestras a 5C hasta el momento de Preparar la dilucin 1/10 de la muestra en diluyente e
procesarlas. Tomar 10 g de la muestra molida, o el incubar durante 4 - 6 horas a 30C. Agregar igual
50
material obtenido por extraccin de una capa superficial volumen de agua peptona alcalina de concentracin
o por hisopado, y colocarlo en una bolsa plstica con 100 doble. Incubar a 37C durante 6 horas. Sembrar por
mL de peptona al 0,1% u otro diluyente. Agitar y agotamiento en estra sobre agar TCBS. Incubar a 37C
masajear la superficie durante 2 minutos. Si se trata de durante 24 horas. Observar las colonias de 2 a 3 mm de
una muestra congelada colocarla en una bolsa plstica dimetro, color amarillo, lisas, con centro opaco, periferia
estril y una vez descongelada extraer con una jeringa traslcida, sin halo negro. AGUA PEPTONA ALCALINA
estril 10 mL de lquido. Medir el volumen del lquido (doble concentracin). Triptona 30 g, extracto de
remanente. Hacer diluciones decimales (10-1 a 10-6) en levadura 10 g, cloruro de sodio 20 g, agua 1 litro, pH 8,6.
el mismo diluyente. Depositar 0,1 mL de las diluciones en AGAR TCBS. Peptona 10 g, extracto de levadura 5 g,
sendas placas de agar para recuento en placa o agar- tiosulfato de sodio 10 g, citrato de sodio 10 g, bilis 8 g,
glucosa-triptona-levadura y distribuir el inculo con una sacarosa 20 g, cloruro de sodio 10 g, citrato de hierro 1
varilla de vidrio en L. Incubar a 17C durante 16 hs y g, azul de bromotimol 0,04 g, azul de timol 0,04 g, agar
luego 3 das a 7C. Contar las colonias de las placas que 15 g, agua 1 litro, pH 8,6. Calentar a ebullicin para
presentan 30 a 300 de bacterias o de las que muestran disolver los ingredientes, enfriar a 50C y volcar en cajas
15 a 150 colonias fngicas. Multiplicar el nmero de Petri estriles
obtenido por el factor de dilucin correspondiente para
obtener las ufc/g o cm2.
PRESENCIA-AUSENCIA DE Vibrio parahaemolyticus RECUENTO DE Pseudomonas spp

Preparar la dilucin 1/10 de la muestra en diluyente Preparar la dilucin 1/10 de la muestra en solucin
salado e incubar durante 4 - 6 horas a 30C. Agregar diluyente y dejar durante 4 - 6 horas a 30C. Agregar un
igual volumen de caldo Horie de concentracin doble. volumen igual de caldo NF de doble concentracin e
Incubar a 37C durante 24 horas. Sembrar por incubar a 42C por 24 horas. Sembrar 0,1 mL sobre agar
agotamiento en estra sobre agar TCBS. Incubar a 37C CFC e incubar a 25C durante 48 horas. Observar las
durante 24 horas. Observar las colonias de 2 a 3 mm de colonias irregulares, incoloras o de tonos verde azulado o
dimetro, redondas, opacas, verdosas o azuladas, sin pardo. Son bacilos Gram-negativos, con flagelos polares,
centro de color negro y rodeadas de un halo verde. oxidasapositivos, oxidantes de glucosa y no
DILUYENTE SALADO. Peptona 1 g, cloruro de sodio 20 fermentativos. CALDO NF. Triptona 30 g, cloruro de
g, agua 1 litro. Esterilizar a 120C durante 20 minutos. sodio 10 g, agua 1 litro, pH 7,2. Esterilizar a 120C
CALDO DE HORIE. Triptona 10 g, extracto de carne 6 g, durante 20 minutos. Enfriar a 50C y agregar 100 mL de
cloruro de sodio 60 g, azul de bromotimol 0,06 g, violeta nitrofurantona al 0,2% en polietiln-glicol. AGAR CFC.
de etilo 0,002 g, agua 1 litro, pH 9,0. Calentar a 100C Peptona 16 g, hidrolizado de casena 10 g, sulfato de
durante 30 minutos. Enfriar y agregar 20 mL de potasio 10 g, cloruro de magnesio 1,4 g, agar 15 g, agua
arabinosa al 25% esterilizada por filtracin 1 litro, pH 7,2. Esterilizar a 120C durante 20 minutos.
Enfriar a 50C y agregar la mezcla de cetrimida 10 mg,
fucidina 10 mg y cefaloridina 50 mg disueltos en 5 mL de
etanol al 50%. Agitar y verter en cajas de Petri
PRESENCIA-AUSENCIA DE Aeromonas spp. PRESENCIA-AUSENCIA DE Shigella spp.
Mantener las muestras a 5C hasta el momento de Colocar dos porciones de 25 de muestra en sendos
procesarlas. Inocular 1 mL de la dilucin 1/10 de la recipientes 225 mL de diluyente estril, agitar bien e
muestra en 9 mL de diluyente y dejar durante 6 horas a incubar 2 a 4 hs a 30C. Aadir, a ambos, igual volumen
la temperatura ambiente. Agregar 10 mL de medio de de medio de enriquecimiento concentrado. Incubar uno a
enriquecimiento concentrado. Incubar a 30C durante 24 37C y otro a 42C. durante 24 horas. Sembrar alcuotas
horas. Sembrar por agotamiento en estra sobre agar AD. en placas de agar XLDN incubando una a 37C y otra a
Incubar a 30C durante 24 horas. Despus inundar la 42C. Si se observan colonias sin centro negro pero con
placa con solucin de yodo durante 2 minutos. Si se halo rojo se presume la presencia de Shigella sp
observan colonias con un halo claro sobre el fondo rojo
prpura se presume la presencia de especies de
Aeromonas sp. AGAR AD. Triptona 2,5 g, extracto de
levadura 1 g, dextrina 5 g, cloruro de sodio 1,5 g, cloruro
de potasio 1 g, sulfato de magnesio hidratado 0,1 g,
51
cloruro frrico 0,05 g, desoxicolato de sodio 0,005 g, agar

7,5 g, agua 500 mL. Disolver y agregar 4,5 mL de azul de
bromotimol al 1% y 4,5 mL de NaOH 5N diludo al 1%
(pH 8). Esterilizar a 120C durante 15 minutos. Enfriar a
50C, aadir 5 mL de ampicilina al 0,1% esterilizada por
filtracin y volcar en cajas de Petri
Los crustceos (camarones, etc) son cocidos, pelados a mano y congelados. Este proceso facilita la recontaminacin
con estafilococos, listerias y patgenos fecales (1). Las especies de Vibrio son anaerobios facultativos, crecen en
medios alcalinos con sales biliares y algunas son halfilas estrictas. V. cholerae, V. mimicus, V. vulnificus y V.
parahaemolyticus habitan los ambientes marinos costeros templados.
52
Siembra e incubacin de muestras o cepas a. La bsqueda activa se realiza sembrando en placa de agar sangre o
agar soya y agar TCBS, debido a que generalmente el laboratorio ha sido alertado por la historia clnica del paciente.
La siembra en los medios slidos se realiza con la tcnica adecuada para obtener colonias aisladas. b. Incubar 18 hrs.
a 35C, en atmsfera normal. c. Si no se obtiene desarrollo, agregar caldo NaCl al 1% al tubo original, incubar 2-3 hrs.
a 35C y resembrar en placas. Incubar hasta 48 hrs. d. Si no se obtiene desarrollo la cepa se informar como no
viable.
e. Si hay desarrollo en agar TCBS, anotar reaccin de sacarosa: colonias amarillas = sacarosa positiva colonias
verdes = sacarosa negativa. La inclusin de sacarosa en el agar TCBS, ayuda a diferenciar preliminarmente las
especies de Vibrio, ya que se producen colonias amarillas en V.cholerae, V.fluvialis y V.alginolyticus, mientras que
V.parahaemolyticus, V.mimicus y la mayora de los V.vulnificus, producen colonias verdes indicando que no han
fermentado sacarosa. Se debe hacer notar que la prueba de oxidasa no debe realizarse a partir de un cultivo en agar
TCBS, esta prueba se har de agar sangre o agar soya. Es comn que los cultivos puros de Vibrio en cualquier
medio, tengan una morfologa mltiple de las colonias, las que pueden ser hmedas, convexas a planas, extendidas a
delimitadas, ocasionalmente rugosas. 3. Identificacin bacteriana Desde el cultivo puro de la placa de agar sangre
observar y anotar la hemlisis, hacer prueba de oxidasa y sembrar batera de identificacin: TSI-LIA-Ornitina-Arginina,
arabinosa, maltosa, NaCl 0%, NaCl 1%. Todos los medios se incuban a 35C por 18 hrs., en atmsfera normal. Las
pruebas negativas se dejan en estufa por 18 hrs. adicionales. Anotar los resultados de la lectura de pruebas
bioqumicas e interpretar utilizando las tablas de identificacin de vibrios. (Tabla N 1, 2 y 3) Conservar la cepa en
caldo glicerol al 20% y congelar a 70C. [23]
Tabla 1. Propiedades del gnero Vibrio y diferenciacin de otros gneros fenotpicamente similares.
53
a : El nmero indica el porcentaje de cepas que son positivas despus de 48 h. de incubacin a 36C.
54
* Recomendado para la identificacin de rutina de Vibrio, al medio estndar se le agrega 1% de NaCl **HIB: Caldo
infuso-corazn La mayora de las cepas clnicas de origen humano de V.parahaemolyticus, producen una hemolisina
directa termostable (TDH) codificado por dos genes, tdh y tdh2x. Estas toxinas son raramente encontradas en cepas
ambientales de V.parahaemolyticus. Esta hemolisina puede ser detectada observando la hemlisis en los eritrocitos
del agar Watgatsuma, test difcil de realizar. (Test de Kanagawa: placas de agar con eritrocitos O humanos con una
incubacin a 35 C durante 48- 72 h.) Al igual que la toxina del clera, TDH puede ser detectada por una prueba de
ltex comercial (Oxoid), pero no hay productos comerciales que detecten la segunda hemolisina observada en las
cepas de V.parahaemolyticus. Se han desarrollado ensayos por PCR para TDH y TRH pero no se encuentran
comercialmente disponibles.
Sistemas de tipificacin
Los esquemas de tipificacin forman dos grupos, uno tradicional y otro molecular. Entre las tcnicas tradicionales; la
serotipificacin es la ms utilizada, aunque los esquemas descritos son para V.cholerae, V.parahaemolyticus y
V.vulnificus y comercialmente disponibles, solo para los dos primeros mencionados. Un gran nmero de mtodos de
tipificacin molecular ha sido exitosamente usado para detectar la migracin clonal de V.parahaemolyticus. Sin
embargo, estas son herramientas epidemiolgicas o taxonmicas que no se encuentran comercialmente ni fciles de
adaptar en un laboratorio clnico. Entre ellos se encuentra la deteccin por PCR y la electroforesis de campo pulsado
(PFGE), que ha sido utilizada extensivamente para V.cholerae y V.parahaemolyticus.
Lectura de pruebas presuntivas: Agar TCBS: colonias sacarosa negativa (verdes) Oxidasa: positiva TSI: K/A-,- LIA:
K/K-,- MIO: +,+,+ o +,-,+ * * El MIO no es muy sensible para la prueba de indol de Vibrio
55
Medios de cultivo y reactivos 1. Agua Peptonada Alcalina La viabilidad de Vibrio spp. se mantiene intacta a pH alcalino
y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperacin de Vibrio spp. de materia
fecal y de otras muestras. El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el pH final es de 8.6 0.2 a 25C.
56
Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo. Peptona (Difco) 10g Na Cl 10g Agua 1000ml Ajustar pH
a 8.6, distribuir 6-8 ml por tubo y esterilizar a 121C por 15 minutos 2. Agar Tripticasa soya (TSA) Es un medio
utilizado para propsitos generales que favorece el desarrollo y el aislamiento de una gran variedad de
microorganismos aerobios, anaerobios facultativos y estrictos. Se prepara segn las recomendaciones del fabricante.
Se autoclave 15 minutos a 121 C 3. Agar TCBS Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae. El
medio contiene: tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa y est disponible comercialmente. Se prepara segn las
indicaciones del fabricante. No se debe autoclavar. Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimol) vira a
amarillo con pequeas variaciones de pH por la acidificacin de la sacarosa. 4. Agar conservacin de cepas Extracto
levadura 3g Peptona 10g NaCl 20g Agar 10g Agua 1000ml Ajustar pH a 7.0 Distribuir 3 ml en tubo de Khan. Esterilizar
a 121C por 15 min. Sembrar dos picadas, poner tapn de goma, guardar a temperatura ambiente y en oscuridad. 5.
Caldo Tolerancia Na Cl 0-1-6% Triptona 1g Agua 100ml Agregar 1- 6 g de NaCl segn la concentracin que se quiera
preparar. Ajustar pH a 7.2 y esterilizar a 121C por 15 minutos. 6. Caldo Base Fermentacin Peptona 10g Extracto
carne 3g NaCl 10g Bromocresol prpura solucin al 1.6% en etanol 2.5ml Agua 1000ml Ajustar pH a 7.0-7.2, distribuir
4 ml por tubo y esterilizar a 121C por 15 minutos. 7. Preparacin de Azucares Preparar solucin de azcar al 20% en
agua destilada Filtrar por filtro 0,45 micrones. Guardar en refrigeracin Agregar al caldo base de fermentacin la
cantidad suficiente para una concentracin final de 1% 8. Prueba de la Oxidasa Principio El objetivo de esta prueba es
buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa que es una enzima de la cadena respiratoria perteneciente al
grupo de las hierro porfirinas. Se encuentra presente en los gneros Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, etc., pero no
en los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Materiales Se detecta utilizando el tetrametil-p-fenilendiamina
(reactivo de oxidasa) que contiene este compuesto que va a ser oxidado por la enzima. Se prepara una solucin al 1%
en agua destilada. Tambin existen discos comerciales. Son estables por un ao en oscuridad a 4C. Procedimiento
A. En un tubo de Khan preparar una suspensin espesa del microorganismo en estudio en aproximadamente 0.2 ml
de agua destilada, colocar un disco del reactivo. B. Si hay escaso nmero de colonias sospechosas, se puede
humedecer el disco con una gota de agua y luego colocar sobre el mismo material de una de las colonias en estudio.
C. En un trozo de papel filtro se impregna el reactivo de oxidasa y a partir de la placa de agar sangre o TSA se toma
una asada de la bacteria problema y se pone sobre el papel filtro. Tras unos 30 segundos, se observa si ha ocurrido
algn cambio. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra. 9. Agar TSI (Hierro Tres
Azucares) I. Principio El medio fue diseado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de
carbono y producir sulfuro de hidrgeno (H2S). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de
lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formacin de H2S. Si el
microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern de color amarillo. Si el organismo
fermenta lactosa y/o sacarosa, la estra permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve
alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirn
productos alcalinos y el medio TSI permanecer rojo. La produccin de H2S se manifiesta por un ennegrecimiento del
medio. Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volmenes de 3.0
ml en tubos con tapa a rosca de 12 x 120; autoclavar a 121C por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5
a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Conservar
refrigerado. Procedimiento A. Con un asa estril tomar la cepa en estudio. B. Punzar el fondo en el centro. C. Retirar
el asa y estriar sobre la superficie del agar. D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire. E. Incubar a 35C
por 18 a 24 horas. Resultados Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, sacarosa y/o
lactosa (E. coli). Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente (Shigella spp.). Estra
alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). Precipitado negro en el fondo:
produccin de H2S (Salmonella spp). Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.).
Consideraciones El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados
cido/cido, mientras que lecturas tardas pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. 10. Agar LIA (Lisina Hierro)
Principio La decarboxilacin de la lisina a cadaverina produce una alcalinizacin del medio y un viraje al violeta del
indicador prpura de bromocresol. Como la reaccin tiene lugar en medio cido, es necesaria la fermentacin previa
de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al
amarillo en todo el medio. La formacin de H2S produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.
Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepcin de Morganella morganii, desaminan la lisina a cido -
cetocarbnico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.
Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volmenes de
57
3 ml en tubos con tapa a rosca de 12 x 120. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estra y
fondo. Conservar refrigerado. Procedimiento A) Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar.
Incubar a 35C por 18 a 24 horas en atmsfera normal. Resultados Los microorganismos que decarboxilan la lisina
producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no decarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un
viraje al amarillo. La formacin de H2S se indica por la aparicin de una coloracin negra. 11. Prueba del Indol
Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con un medio rico en triptofano,
el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehdos para formar un compuesto
coloreado. El ensayo constituye un mtodo rpido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de
la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente til en la identificacin preliminar de
Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).
Materiales
A. Caldo triptfano
Peptona 20.0 gr Cloruro de sodio 5.0 gr Agua destilada 1000 ml A este caldo se le incorpora triptofano en
una concentracin del 1%. El medio se esteriliza a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y
guardar a 4-8C para su conservacin. B. Reactivo de Erlich p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 g alcohol etlico,
95% 95.0 ml cido clorhidrco, concentrado 20.0 ml Se disuelve el aldehdo en el alcohol (puede requerir un
calentamiento suave), luego se agrega lentamente el cido. El reactivo de color amarillo es estable por un ao.
Identificar el reactivo con una etiqueta indicando la fecha de expiracin y guardar refrigerado en botellas color
caramelo. Procedimiento 1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene
triptofano. 2) Incubar a 35C por 18 a 24 horas. 3) Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo.
4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. 5) En la reaccin positiva se observa un anillo de
color rojo, cuando la prueba es negativa, se observa un anillo amarillo. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de
un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no
hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.
12. Test de Decarboxilasa-Dihidrolasa Principio La decarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan
el extremo carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminocidos que se ensayan
en la identificacin de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilacin de lisina y ornitina da
cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por accin de una dihidrolasa. El test se debe
acompaar con un tubo control que contiene el medio base sin aminocido. Como la decarboxilacin es una reaccin
anaerbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos etapas: por
fermentacin de la glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La
acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la formacin de las
aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. Materiales El medio basal ms
comnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio est disponible comercialmente. Las
concentraciones de aminocidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base en
4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminocidos a 3 porciones del medio. El pH se debe ajustar despus de
agregar el aminocido y antes de esterilizar a 6 6,2. Fraccionar en volmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca
y autoclavar a 121C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y conservar refrigerado.
Procedimiento A. Tomar la cepa en estudio con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos. B.
Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril. C. Incubar a 35C en atmsfera normal. D. Efectuar las
lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y
prpura a prpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se
vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). 13. Prueba de Voges-
Proskauer Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido pirvico un
microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales cidos lctico,
actico o frmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales
acetona (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de VogesProskauer (VP) detecta estos productos
metablicos. En presencia de oxgeno e KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo .La
sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de -naftol antes del agregado de KOH. Materiales A.
Preparacin del medio El medio est disponible comercialmente. Para la preparacin del caldo RMVP, ver el
58
procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. B. Preparacin de solucin de -naftol Disolver 5.0 gr de -
naftol en una pequea cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. La solucin debe ser incolora.
El reactivo es estable por 1 ao. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera en
frascos color caramelo. C. Preparacin de la solucin de KOH Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego
llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre bao de agua fra para evitar recalentamiento). El reactivo es estable
por 1 ao. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Procedimiento A. Tomar una asada de la cepa en
estudio e inocular un tubo de caldo RM/VP. B. Incubar a 35C por un mnimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la
suspensin a otro tubo. D. Agregar 0.6 ml del reactivo de -naftol. E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH. F. Agitar el
tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos. G. Observar la formacin de un color rosado a rojo. Resultados Ensayo
positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
Crecimiento en NaCl
Principio Es una prueba que se usa para diferenciar distintas especies del gnero Vibrio. Materiales Peptona 20g
Agua destilada: Completar a 100ml Ajustar el pH a 8-8,2 con solucin de NaOH al 30% Agregar NaCl al 1, 6, 8 y 10%
y fraccionar 3 ml en tubos de 13x100, con tapa a rosca, esterilizar 15 minutos a 121C. Procedimiento A) Hacer una
suspensin de la bacteria en un tubo de agua peptona sin NaCl. B) Con esa suspensin, se siembran los tubos con
0,1, 6, 8, 10% de NaCl Resultados Ensayo positivo: desarrollo de turbidez por crecimiento Ensayo negativo: ausencia
de turbidez por falta de crecimiento Control Vibrio cholerae al 0% y 1% de NaCl + Vibrio cholerae al 8 y 10% de NaCl
.[24]
59
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11. NOM-143-SSA1-1995 Bienes y Servicios. Mtodo de Prueba Microbiolgico para Alimentos. Determinacin de
Listeria Monocytogenes [Internet]. Mxico, DF (1994). Diario Oficial de la Federacin. [Citado el 29 Mayo de 2017]
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21.- Secretaria de salud, NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-027-SSA1-1993, BIENES Y SERVICIOS. PRODUCTOS
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22.- Secretaria de saud, NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-031-SSA1-1993, BIENES Y SERVICIOS. PRODUCTOS
DE LA PESCA. MOLUSCOS BIVALVOS FRESCOS-REFRIGERADOS Y CONGELADOS. ESPECIFICACIONES
SANITARIAS. [internet], [citado el 31 de mayo de 2017] Disponible en:
23.- [Online]. [cited 2017 05 29. Available from:

http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/12%20pescados%20y%20mariscos.pdf.
24.- Wally silva SC. [Online].; 2008 [cited 2017 05 29. Available from:
http://bvs.panalimentos.org/local/File/manual_vibrio_parahaemolyticus_2008.pdf.

Análisis de Bacterias en Carnes, Pescados y Mariscos

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REA ACADMICA CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE BIOANLISIS - XALAPA

LICENCIATURA EN QUMICA CLNICA

Anlisis de Bacterias en Carnes, pescados y mariscos

Castaeda Hernndez Dania Karina

M. C. Ana Rosa Castillo Guerrero

Mientras en el mundo desarrollado el consumo de carne no ha registrado importantes variaciones, el consumo

La industria crnica en Mxico es muy importante, existen muchos establecimientos dedicados al

La contaminacin se incrementa en carnes picadas porque ellas generalmente provienen de recortes

La determinacin de la presencia o ausencia de Salmonella, en cierta cantidad de masa o volumen especfico

Para el anlisis microbiolgico [8].

Matraz Kitazato de 1000 ml XLD

II. Procedimiento Analtico.

Seleccin en Medios Slidos.

b) Caldo L-lisina descarboxilasa.

e) Prueba de VP (Voges Proskauer).

Eliminacin de las cepas autoaglutinables.

Deteccin de los antgenos Poly A-I & Vi.

III. Morfologa de las Colonias.

Agar Caractersticas atpicas

Nota: Existen algunas cepas de Salmonella spp con un

TSI Tendido Fondo Gas H2S

Gas +=ruptura del medio; H2S += ennegrecimiento del medio

LIA Tendido Fondo Gas H2S

Pruebas Bioqumicas complementarias para Salmonella spp

Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera

Para el anlisis microbiolgico [8].

II. Procedimiento Analtico.

Seleccin en Medios Slidos.

4. Despus de la incubacin por 24 h si se observa un crecimiento pobre o si no se observan colonias volver a

Pruebas auxiliares confirmatorias.

f) Prueba alternativa de movilidad.

b) Utilizacin de Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa).

III. Morfologa de las Colonias.

Agar Caractersticas tpicas

Despus de 24 h se observan colonias muy pequeas, grisceas o verde olivo de

Despus de 48 h las colonias se observan de color verde de aproximadamente 1.5

Pruebas auxiliares complementarias

Confirmacin de Listeria monocytogenes

Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos estn:

Para el anlisis microbiolgico [8].

Emulsin de yema de huevo

II. Procedimiento Analtico.

Seleccin en medios slidos.

b) Utilizacin anaerbica del manitol.

c) Utilizacin anaerbica de la glucosa.

III. Morfologa de las Colonias.

Agar Caractersticas tpicas

Agar Caractersticas Atpicas

Caractersticas S. aureus S. epidermidis Micrococcus

4. Promediar los resultados de los duplicados.

Para el anlisis microbiolgico [8].

Es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus de colocar en l la

II. Procedimiento Analtico.

Seleccin en medios slidos.

Seleccin en medios slidos Mtodo alternativo.

e) Fermentacin de salicina y rafinosa.

f) Fermentacin de otros carbohidratos.

III. Morfologa de las Colonias.

Agar Caractersticas tpicas

La campilobacteriosis es una zoonosis de distribucin mundial. Campylobacter se halla habitualmente como

Para el anlisis microbiolgico [8].