Dozarea activitii lactat dehidrogenazei

Principiul metodei
L-lactat: NAD+ oxidoreductaza catalizeaz reacia reversibil:
CH3-CO-COOH (piruvat) +NADH + H+ CH3-CHOH-COOH (lactat)
+
+ NAD

Viteza de reacie este determinat prin scderea densitii optice la 340 nm ca urmare a
oxidrii NADH (compusul care absoarbe la 340 nm este NADH, NAD + nu absoarbe). O unitate
enzimatic oxideaz 1mol de NADH ntr-un minut la 25C, n condiii definite.

Reactivi si solutii necesare:

- tampon K2HPO4/KH2PO4 0,1M, pH 7,7
- solutie piruvat de sodiu 0,63 mM preparat n soluia tampon 1
(masa molecular=110 g/mol)
pentru 15 ml soluie masa de subst dizolvat=0,63*10-3*110*0,015= 0,001g piruvat
- soluie NADH/Na2 13 mM preparat n soluie NaHCO3 1%
(masa molecular = 709 g/mol)
pentru 300 l soluie masa de subst dizolvat=0,013*709*0,3*10-3= 0,0028g
- extractul proteic cu activitate lactate dehidrogenazic

Modul de lucru:
n cuva de quartz a spectrofotometrului se pipeteaz amestecul de reacie al probei, iar
n cuva martor (sau blanc) se pipeteaz urmtoarele:

Reactivi Cantitate (l)

Martor Proba
Solutie piruvat 0,63 mM 900 900
Apa distilata 45 -
EPT - 30
Solutie NADH 13 mM - 15
Volum final 945 945

Citirea densitii optice la 340 nm se face la 25C, timp de 5 minute la un interval de 10

secunde de la adugarea soluiei de NADH. Densitatea optic la 340 nm caracteristic NADH
scade n timpul reaciei pe msur ce coenzima se oxideaz.

Calculul rezultatelor:
Se traseaz grafic variaia densitii optice (DO) la 340 nm (pe ordonat) n funcie de
timp (pe abscis). Se determin poriunea de curb n care viteza crete proporional n timp. Se
calculeaz D.O. 340nm/min de pe aceast poriune a curbei.
Activitatea enzimatic (prescurtat AE) se msoar n U/ml. Activitatea enzimatic se
calculeaza astfel:
DO340nm/min 106 0,945 ml
A.E. (U/ml) = dilutie
6,22 103 M -1cm-1 cm 103 0,03 ml

A.E. = (DOiniial DOfinal)/5minute x 5,064 x diluia = ..... U/ml

unde NADH=6,22 x 103 M-1cm-1 reprezint coeficientul de extincie molar a NADH la 340nm,
0,945 mL reprezint volumul total de reacie; 106 = transformarea din moli n micromoli;
0,03 mL este volumul de extract proteic; 103 = transformarea din litru n mililitri.