Rhizobium:

I. Caractersticas Generales:

Rhizobium son bacilos Gram negativos que miden 0.5-1.0x1.2-3.0m. Se mueven por medio de
1-6 flagelos que pueden ser peritricales o subpolares. Las colonias generalmente son blancas o
color beige, circulares, convexas, semitranslcidas u opacas y mucilaginosas; generalmente
miden 2-4 mm de dimetro a los 3-5 das de incubacin en YMA. El crecimiento en medio de
carbohidratos generalmente est acompaado de reaccin cida y abundante cantidad de
gelatina polisacrida extracelular. Son quimio-organotrficas, utilizando una gran variedad de
carbohidratos y cidos orgnicos. Algunas cepas requieren biotina, cido nicotnico, pantotenato
o tiamina como factores de crecimiento. Las cepas de este gnero son rizobios de rpido
crecimiento productores de cido en medio YMA (Extracto de levadura, 0.4 g; Manitol, 10.0 g;
KH2PO4, 0.5 g; MgSO4.7H2O, 0.2 g; NaCl, 0.1 g; agar, 15 g; agua destilada, 1 litro; pH 7.0-
7.2).
http://www.biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap8/

Todos los rizobios son miembros del phylum Proteobacteria, pero en diferentes clases y
ordenes. La mayor parte de stos, son de orden VI, Rhizobiales, de la clase I,
Alfaproteobacteria. En este orden, los gneros Rhizobium, Azorhizobium. y Bradyrhizobium, se
incluyen en la familia Rhizobiaceae.

Estos microorganismos del suelo forman una asociacin simbitica con diferentes especies de
plantas y durante la simbiosis son capaces de llevar a cabo la fijacin del Nitrgeno Molecular.
En sta las bacterias se encuentran en las races de las plantas dentro e estructuras llamadas
Ndulos, es necesario saber que ni la planta ni estas bacterias, son capaces de fijar el Nitrgeno
Diatmico (N2) de manera aislada, para convertirlo en amonio.
Dentro de los ndulos, las bacteria se convierten en bacteroides que son clulas grandes, que se
encuentran en el suelo y que llevan a cabo la fijacin del Nitrgeno porque son capaces de
formar la enzima Nitrogenasa, responsable de la conversin de Nitrgeno Molecular en
Amonio. Gracias a esta simbiosis la planta recibe Nitrgeno que puede utilizar para s misma,
mientras que las bacterias utilizan molculas que le proporciona la planta.

Rhizobium Frank 1889, el gnero tipo de la Familia Rhizobiaceae Conn 1998, est representado
por bacterias de forma bacilar, Gram negativas, habitantes del suelo, que tienen la capacidad de
formar ndulos en varias leguminosas y en Parasponia spp. (e. j. P. andersonii, P. rigida). Esta
relacin simbitica es controlada genticamente tanto por la planta como por la bacteria y
ocurre a travs de una secuencia de estados de desarrollo que culminan en el establecimiento de
una simbiosis efectiva: el ndulo fijador de nitrgeno. El primer nombre dado a las bacterias de
los ndulos de las races de las leguminosas fue Phytomyxa, el cual lo propuso Schroeter en
1886, considerando la relacin de estas bacterias con los hongos mucosos. Sin embargo, en
1970, la Comisin Judicial del Comit Internacional de Nomenclatura Bacteriana (Opinin 34)
aprob como nombre genrico Rhizobium FranK 1889 (nombre conservado) en vez de
Phytomyxa Schroeter 1886 (nombre prioritario). Esto se hizo en base a que el nombre
RhIzobium, tiene la ventaja de enfatizar la importancia agronmica de las bacterias de los
ndulos de las races (rhiza: raz, bius: vida, Rhizobium: vida en las races) y a su vez guarda
tributo a la extensa literatura publicada con ese nombre (Mayz, 1997). Actualmente, adems de
Rhizobium, existen otros gneros de bacterias fijadoras de nitrgeno: Ensifer (Casida, 1982),
Bradyrhizobium (Jordan 1982), Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988) y Mesorhizobium (Jarvis et
al., 1997). Weir (2004) hace una revisin exhaustiva de la taxonoma actual de los rizobia.

El enigma de las leguminosas fue aclarado cuando Hellriegel y Wilfarth en 1888 probaron la
fijacin de nitrgeno en plantas noduladas, esto fue seguido por el aislamiento de la primera
bacteria de los ndulos por Beijerinck ese mismo ao. En 1932, Fred y colaboradores
publicaron una monografa que ha recorrido el mundo, donde revisaron y analizaron la
informacin existente sobre la simbiosis; sus consideraciones tuvieron una profunda influencia
en la prctica y teora subsiguientes. Para las dcadas posteriores y hasta la actualidad los
avances tecnolgicos han permitido estudios ms detallados y por lo tanto un mejor
conocimiento y entendimiento de la simbiosis leguminosas-rizobia.

Para que se establezca la relacin simbitica deben ocurrir las siguientes etapas: 1.
multiplicacin de las bacterias en la rizsfera, 2. colonizacin de la rizsfera, 3. adsorcin de las
bacterias a la raz, 4. ensortijamiento de los pelos radicales, ocurre en las races cuando la
infeccin es va pelos radicales y en algunas donde acontece va unin races laterales-raz
principal, 5. formacin de los hilos o zonas intercelulares de infeccin, 6. crecimiento del hilo
de infeccin hacia las clulas corticales o invasin directa de las mismas, y 7. diferenciacin
tisular y desarrollo del ndulo (Figura 2). Los cambios morfolgicos y fisiolgicos que ocurren
a nivel de los puntos de desarrollo nodular van acompaados de seales moleculares inducidas
por genes propios del proceso (genes Nod) (Mayz, 1997; Perret et al., 2000; Gonzlez y
Marketon, 2003; Gage, 2004).

El tipo y estructura nodular es dependiente de la planta hospedera, as se tienen:

a. ndulos determinados, en los cuales la actividad meristemtica cesa temprano en su
formacin y su aspecto final resulta del alargamiento de las clulas, este tipo de desarrollo
origina ndulos esfricos o globosos (Figura 3A), que pueden organizarse alrededor de la raz
para formar los denominados ndulos en collar (Figura 3B) (Hirsch, 1992; Mayz, 1997).

b.ndulos indeterminados, los cuales presentan un meristema persistente, que puede producir
ndulos ramificados o coraloides, puesto que constantemente se aaden nuevas clulas a la
parte distal del ndulo; de tal manera que todos los estados de desarrollo estn as
representados, debido a que ocurre un gradiente de formacin desde la parte distal, a la proximal
en el punto de unin a la raz. Este tipo de desarrollo da lugar a ndulos elongados o cilndricos
(Figura 3C) y ramificados o coraloides (Figura 3D) (Hirsch, 1992; Mayz, 1997). La utilizacin
del nitrgeno atmosfrico en la simbiosis, requiere de la integracin de las vas metablicas de
la fijacin (bacteroides) y de la asimilacin (planta hospedera) del nitrgeno. La bacteria emplea
compuestos carbonados oxidables suplidos por la planta para su metabolismo y desarrollo y
para la sntesis de ATP y del poder reductor usados en la reaccin de fijacin catalizada por la
nitrogenasa, la cual genera el nitrgeno asimilable (NH4 +), que es metabolizado en las clulas
nodulares a amidas o ureidos, que luego son exportados va xilema al resto de la planta, donde
son usados (Mayz, 1997).

El primer producto de la reaccin de fijacin es NH 3 (amonaco), pero este es rpidamente

protonado, formndose NH4+, lo cual es favorecido por el pK (9,25) de la reaccin, de tal
manera que amonio es la especie predominante a los pHs fisiolgicos y la que toma parte en las
reacciones de asimilacin (Sprent y Sprent, 1990).

El amonio es un inhibidor de la sntesis de nitrogenasa, por lo que es imperativa su rpida

asimilacin; en el citosol de las clulas infectadas, ste es asimilado en cido glutmico, en cuya
reaccin interviene la enzima octamrica ATP dependiente glutamina sintetasa o GS, y donde se
forma glutamina, la cual puede ser exportada o usada para restaurar el cido glutmico, a travs
de una reaccin con el cido 2-oxoglutrico (proveniente del ciclo de los cidos tricarboxlicos)
catalizada por la enzima monomrica NADH dependiente glutamato sintasa, tambin
denominada glutamina-2-oxoglutarato aminotransferasa o GOGAT (Sprent y Sprent, 1990;
Ortega et al., 2004).

Las leguminosas simbiticas pueden ser separadas en dos grupos de acuerdo a los productos
exportados desde los ndulos: las exportadoras de amidas (asparagina, glutamina) (Figura 4) y
las exportadoras de ureidos (alantona y cido alantoico) (Figura 5). El primer grupo incluye
varias especies de regiones templadas, entre estas Lupinus subcarnosus, Pisum sativum y
Medicago sativa y el segundo varias especies tropicales, tales como Glycine max, Phaseolus
vulgaris y Vigna unguiculata (Scott et al., 1976; Mifliny Habash, 2002; Harrison et al., 2003).

http://www.bioline.org.br/request?cg04001

La fijacin de nitrgeno puede ser puramente abitica o biolgica. Por la primera se forman
xidos como consecuencia de la combustin de compuestos orgnicos, descargas elctricas, etc.,
que son arrastrados al suelo por la lluvia o amonio por el proceso industrial Haber Bosch. Por la
segunda, la fijacin biolgica de nitrgeno (FBN), proceso llevado a cabo por organismos
procariticos, el N2 es reducido a amonio e incorporado a la bisfera. Por lo tanto la FIJACIN
BIOLGICA DEL NITRGENO es un proceso por el cual el nitrgeno gaseoso (N 2),
qumicamente muy estable, es convertido en amonaco (NH 3), compuesto qumicamente muy
activo y fcil de transformarse en otros que, a su vez, pueden ser incorporados (usados) por las
plantas y animales gracias a procesos metablicos propios de un reducido grupo de
microorganismos.

Entre estos microorganismos los ms eficientes son bacterias de los gneros

Bradyrhizobium y Rhizobium, tambin conocidas como rhizobios o bacterias rhizobiaceas, que
realizan la FIJACIN BIOLGICA DEL NITRGENO asociadas a las races de plantas
leguminosas.

Se trata de un proceso altamente consumidor de energa. El triple enlace que une los dos
tomos de nitrgeno es duro de romper. El trabajo es llevado a cabo por la enzima Nitrogenasa
con el consumo de 16 molculas de ATP por N2 reducido, segn la ecuacin:

N2 + 16ATP + 8e- + 8H+ = 2NH3 + 8H2 + 16ADP + 16Pi

PROCESO:
La necesidad de energa y esqueleto carbonado para la incorporacin del amonio resultante de la
fijacin, se suple, adems de por el fotosintetizado, a travs de una actividad enzimtica
importante en los ndulos, la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que reasimila una gran parte del
CO2 producido en la respiracin. El nitrgeno reducido se asimila en una reaccin catalizada
por las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (GOGAT), el llamado ciclo
GS/GOGAT. En el primer paso se forma glutamina a partir de amonio y glutamato y en el
segundo, de glutamina y cetoglutarato dos molculas de glutamato. De ellas, una se utiliza para
incorporar amonio, cerrando el ciclo, mientras que la otra es transferida al xilema para su
utilizacin por la planta, como amidas (asparragina y glutamina) en las leguminosas templadas,
o ureidos (alantona y cido alantoico), en las tropicales. Esta aparente complicacin en el
transporte nitrogenado de estas leguminosas que supone la degradacin de las purinas con
intervencin de varias enzimas (xantina deshidrogenasa, uricasa y allantoinasa) para producir
alantona y cido alantoico, presenta la ventaja de que los ureidos transportan en su molcula
ms N por C que las amidas y su grado de solubilidad en agua es ms adecuado para plantas que
crecen en ambiente tropical.

La entrada de aminocidos del citosol al bacteroide (glutamato es el mejor candidato), adems

de los cidos dicarboxlicos, y la salida del bacteroide al citosol (aspartato como mayoritario) es
esencial. El papel de este ciclado es facilitar, por un lado, la oxidaxin de los cidos
dicarboxlicos y, por otro, la asimilacin del amonio a asparragina

MECANISMO DE LA NODULACIN: Bioqumica de la simbiosis

Simbiosis Rhizobium-leguminosa
 El establecimiento de la simbiosis para atrapar el N 2 entre Rhizobium y la leguminosa es
un proceso complejo, donde la formacin de ndulos la captacin del N 2 se da en etapas
sucesivas:

1. Reconocimiento de la combinacin adecuada de organismos, tanto por parte de la planta

como de la bacteria, y adherencia de la bacteria a los pelos radicales.

2. Invasin del pelo radical y formacin de un canal (o hilo) de infeccin

3. Desplazamiento de las bacterias hacia la raz principal a travs del canal de infeccin.

4. Diferenciacin de las bacterias en un nuevo tipo al que se le llama bacteroides, dentro de las
clulas de la planta, y desarrollo del estado de fijacin de nitrgeno.

5. Divisin de las clulas bacterianas y vegetales y formacin del ndulo radical maduro.

A continuacin se describen estas etapas en ms detalle:

Las plantas leguminosas secretan compuestos especficos que atraen a los rizobios.
Entre estos compuestos se encuentran flavonoides y en respuesta a ellos los rhizobios activan
una serie de genes implicados en la nodulacin. El primer paso en la formacin de los ndulos
es la adherencia de la bacteria a la planta. En la superficie del rizobio se localiza una protena
especfica de la adherencia, la ricadesina. Es una protena que se une al calcio y puede actuar
captando complejos de calcio en la superficie de los pelos radicales. Otras sustancias, como las
lectinas, que son protenas que contienen carbohidratos, tambin cumplen una funcin en la
adherencia planta-bacteria. Las lectinas han sido identificadas en los extremos de pelos radicales
y en la superficie de las clulas de rizobio.

Despus de la unin, los pelos radicales se enroscan debido a la accin de sustancias

especfica secretadas por la bacteria, que se conocen como factores Nod.

Algunos pelos radicales se enroscan hasta 360 formando una estructura a la que se
llama "cayado de pastor". La bacteria penetra entonces en el pelo radical e induce la formacin,
por parte de la planta, de un tubo de composicin similar a la pared celular, conocido como
canal de infeccin, que avanza por el pelo radical. A continuacin, la infeccin alcanza a las
clulas de la raz adyacentes a los pelos radicales, y los factores Nod estimulan la divisin de las
clulas vegetales, produciendo finalmente el ndulo. Las bacterias son liberadas desde el canal
de infeccin al citoplasma de las clulas vegetales por un mecanismo similar al de endocitosis.

Los rizobios quedan separados del citoplasma por una membrana derivada de la planta
hospedadora y que se llama la membrana peribacteroidal (MPB). A continuacin hay una
divisin continua y sincronizada de los rizobios rodeados de MPBs. Al cesar la divisin las
bacterias se transforman en unas formaciones ramificadas, hinchadas y deformes, llamadas
bacteroides. Estos quedan rodeados, individualmente o en pequeos grupos por la MPB. A la
estructura que contiene estos grupos de bacteroides rodeados por la MPB se les llama
simbiosomas. Los bacteroides pueden llegar a ser hasta 40 veces ms grandes que los bacilos a
partir de los que se desarrollan, y hasta varios miles se encuentran en una sola clula vegetal. La
fijacin de nitrgeno no se inicia hasta que se han formado los bacteroides. El sistema vascular
de la planta se extiende dentro del ndulo y transporta nutrientes hacia y desde el ndulo.

Cuando el ndulo se deteriora las bacterias pasan al suelo. En algunos casos las formas
bacteroidales no tienen capacidad de divisin, pero los ndulos contienen siempre algunos
rizobios en estado de latencia. Estas formas proliferan en el suelo utilizando como nutrientes
algunos de los productos del ndulo destrudo y las bacterias pueden iniciar la infeccin en otras
races o mantenerse en estado libre en el suelo.
 Figura 1. Dinmica de formacin de un ndulo en la raz en una leguminosa causado por
Rhizobium.

1. Rhizobium libre.

2. Rhizobium atrado por el pelo radical.

3. Inicio de la infeccin por Rhizobium en el pelo radical.

4. Cayado del pastor (pelos radicales, infectados por Rhizobium)

5 y 6. El cordn de infeccin de Rhizobium invade la matriz de clulas corticales de la

leguminosa en la raz.

7. Rhizobium se reproduce en clulas haploides de la raz y pierde su pared celular se

sobreproduce auxina.

8. Resultado se da la hipertrofia radical y aparece el ndulo.

9. Rhizobium sin pared (Bacteroide) en las clulas corticales fija nitrgeno.

10. El ndulo con leghemoglobina fija N2.

II. Gentica:

El aspecto de la especifidad en la relacin rizobio-leguminosa ha promovido gran

cantidad de estudios para identificar la seales implicadas. Se conocen las seales que se
intercambian en la etapa temprana de la interaccin mientras que para las etapas subsiguientes
(infeccin, liberacin de los bacteroides, comienzo de fijacin de nitrgeno) se conocen algunos
componentes de la bacterias que son necesarios pero no cmo actan.

La primera seal implicada en la interaccin la provee la planta. Los rizobios son

capaces de notar la presencia de la raz de la leguminosa por medio de molculas de bajo peso
molecular (flavonoides, isoflavonoides y betanas) secretadas por la raz. Este proceso tiene
especificidad hasta cierto punto ya que las leguminosas secretan flavonoides especficos para
atraer a rizobios especficos. En respuesta a la seal de la planta los rizobios responden
sintetizando otras seales especficas, los factores Nod, dirigidos hacia la planta hospedadora.
Los genes de la bacteria implicados en la sntesis de los factores Nod son los genes nod
(nodulacin). Estos genes, a excepcin de nodD, no se expresan si no se encuentra la seal
inductora adecuada de la planta. El gen nodD se expresa constitutivamente y la protena NodD
tiene la capacidad de reconocer los flavonoides especficos secretados por la planta. Los
operones de los genes nod estn precedidos por un promotor que contiene una secuencia
consenso. A esta secuencia consenso se le llama caja de nodulacin (o caja nod) y que es
reconocida por la protena NodD. Una vez activada por los flavonoides, la protena NodD a su
vez va a activar la transcripcin de los genes de la nodulacin mediante su unin a las cajas nod.

La fijacin simbitica de nitrgeno en rizobio se lleva a cabo en los bacteriodes que se

encuentran en el citoplasma de las clulas del ndulo. La enzima nitrogenasa cataliza la
reaccin:

N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg-ATP > 2NH3 + H2 + 16 Mg-ADP + 16Pi

La Nitrogenasa es un protena de gran tamao que consiste de dos componentes, la

protena homodimrica que contiene Fe y es codificada por nifH, y la protena tetramrica que
contiene Fe y molibdeno (Mo), codificada por los genes nifD y nifK. La nitrogenasa de los
ndulos radiculares posee caractersticas similares a la enzima de las bacterias fijadoras de
nitrgeno en vida libre, incluyendo la sensibilidad al O 2 y la capacidad de reducir acetileno y N 2.
La formacin de H2 es parte del mecanismo de la nitrogenasa, pero representa una prdida
significativa de energa. En algunas especies de rizobio existe una hidrogenasa (codificada por
los genes hup) que es capaz de reciclar el H2 formado por la nitrogenasa, que resulta en un uso
ms eficiente de la energa. Es por ello, que se ha impulsado la transferencia de los genes hup a
todas las cepas de rizobio para la inoculacin en el campo.

Los bacteroides dependen totalmente de la planta para obtener la energa necesaria para
la fijacin de nitrgeno. Los principales compuestos orgnicos transportados al interior de los
bacteroides a travs de la membrana peribacteroidal son los intermediarios del ciclo del cido
ctrico, en particular los cidos de cuatro carbonos succinato, malato y fumarato. Estos cidos
son utilizados como donadores de electrones para la produccin de ATP y, tras su conversin en
piruvato, como ltima fuente de electrones para la reduccin del N 2. El primer producto estable
que se obtiene de la fijacin de N2 es el amonio, y varias pruebas indican que la asimilacin del
amonio para formar compuestos de nitrgeno orgnico en los ndulos radicales lo lleva
principalmente la planta. El amonio tambin se puede asimilar en los bacteroides y puede ser
transferido a la planta en forma de alanina.

Durante el proceso de simbiosis la planta tambin expresa protenas especficas del

ndulo a las que se llama nodulinas. Entre ellas, la leghemoglobina tiene la funcin de aportar
 O2 a los bacteroides y de controlar los niveles O 2. La leghemoglobina se localiza en el citosol de
las celulas de la planta infectada por bacteroides y es la que confiere el tpico color rojo o
rosado de los ndulos funcionales.

III. Utilidad en Biotecnologa:

AISLAMIENTO, PURIFICACIN, IDENTIFICACIN Y UTENTIFICACIN DE

Rhizobium sp.

La preparacin del inoculante comercial que ser utilizado por el productor agrcola,
comprende el cultivo en el laboratorio de las bacterias apropiadas y su incorporacin a un
soporte adecuado.

Seleccin de ndulos:

Observacin de ndulos:

Colectar las races de diferentes leguminosas (trbol, frjol, alfalfa, cacahuate, caupi,
chicharo, lupinos, cajanus, etc.).
Hacerle un lavado suficiente con agua de cao.
Seleccionar cuidadosamente los ndulos ms grandes, de color rosado con superficie
rugosa y estras claras o blancas ms acentuadas, con el cuidado de dejar un pequeo
fragmento de raz adherido al ndulo.
Desinfectar los ndulos sumergindolos en alcohol 10 seg. y en agua esterilizada 10
seg.; hacer est operacin dos veces y luego someterlo a un tratamiento con HgCl 2
acidulado, durante un periodo de 1 a 3 minutos segn sea el tamao del ndulo, por
ltimo efectuar 5 6 enjuagues con agua destilada estril.

Observacin del microsimbionte en mediante Tincin Gram:

En un tubo de ensayo macerar un ndulo seleccionado anteriormente con agua destilada

estril.
Tomar una gota de la mezcla de la suspensin (maceracin) y colocarlo sobre un porta
objeto, fijar la muestra y hacer la tincin Gram.
Observndose a inmersin un bacteria Gram negativa, bacteroide
 Aislamiento y purificacin de Rhizobium sp:

Por estra: De los ndulos desinfectados de procede hacer el aislamiento. Los ndulos
grandes como los de frjol, soya, cacahuate y caupi, se puede partir y hacer una
suspensin en agua destilada estril; los ndulos pequeos como los del trbol y alfalfa
se macetan en tubos de ensayos con una varilla de vidrio.

En el medio ELMARC se inocula con la ayuda de una asa microbiolgica, una muestra
de la suspensin de los ndulos y se hacen estras.

Una vez sembrada en las placas Petri se inoculan a 28 C por un periodo de 10 das, hay
que observar las placas cada 3 das para verificar la velocidad de crecimiento de las
cepas, ya que existen cepas de crecimiento rpido (3 4 das) y cepas crecimiento lento
(7 ms das).

Por la Tcnica de Burtn: Enumerar 5 placas petri esterilizada y colocar 2 gotas de

agua destilada dentro de las placas, a una distancia aprox. de 5 cm.; una de las gotas es
para hacer la dilucin y la otra es para enfriar el asa, enfriarla en la gota superior de la
segunda placa petri, tomar una alcuota de la primera gota inferior y colocarla en la
segunda y as sucesivamente, con la finalidad de ir diluyendo la muestra del ndulo
macerado.

Identificacin de la morfologa y el desarrollo de Rhizobium sp.

Los microorganismos presentan diferentes actividades fisiolgicas, que han

permitido a los investigadores su clasificacin. Aunque la nica prueba concluyente
para identificar a Rhizobium es que esta forma ndulos con su hospedero
correspondiente, el conocimiento microbiolgico y bioqumico de las especies del
gnero Rhizobium nos permite reconocerlas y agruparlas con base a su actividad y
comportamiento en los diferentes medios de cultivo.
 Morfologa macroscpica:
Las colonias que desarrollan por lo regular son de morfologa convexa, pulvinada o
cnica, varan de color, desde blanco opaco hasta translcido acuoso. Las colonias opacas
tienen desarrollo firme y algo de goma, mientras que las colonias densas son a menudo
gomosas y blandas, en ocasiones las colonias de ms edad pueden desarrollar centros
oscuros. Los contaminantes son de color rojo oscuro

Identificacin de bacterifagos por el mtodo de placas:

El mtodo de placas es denominado tambin "routine test dilution" (RTD) o ensayo
de dilucin rutinario (Adams, 1959). Consiste en demostrar la presencia de bacterifagos en
el filtrado final frente a su cepa de Rhizobium sensible provocando reas circulares claras
(calvas) en un medio agarizado. Se realiza la dilucin del bacterifago agregando 1 ml del
filtrado final a cada tubo con 9 ml. de FSB pH 7.1.
Se sembr 0.1 ml de Rhizobium sp. por incorporacin en medio extracto de levadura
manitol con indicador rojo de congo (LMA-RC). Se coloca una microgota de cada dilucin
del filtrado en la superficie del medio LMA-RC sembrada con la cepa, se incub a 28 C
durante 48 horas y se evala la ausencia de crecimiento en la ubicacin de cada microgota.
La figura muestra la accin del bacterifago aislado
aplicado sobre una capa de bacterias. La destruccin de
la masa bacteriana despus de la incubacin es debida a
la actividad ltica del bacterifago, la cual es una
funcin directa del nmero de partculas fgicas.
Esta prueba de tipificacin de fago parece ser ms
especfica que la prueba serolgica y puede ser
usada como una herramienta de caracterizacin ms
precisa de las cepas de Rhizobium en condiciones
naturales (Kowalski, 1974). Tambin, Adams (1959) seala que el uso de la Routine Test
Dilution (RTD) en tipos heterlogos de cepas es fcil de aplicar.

Morfologa Microscpica:
Colocar una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos, y en ella hacer una ligera
suspensin de la cepa a observar, dejar secar la gota a temperatura ambiente, y proceder a
fijarla con una ligera flama del mechero; una vez fijado el frotis se procede a teirlo con los
 colorantes de Gam. En este frotis se observa en la morfologa, inclusiones de
polihidroxibutirato y la reaccin postitiva o negativa que da la bacteria a la tincin.

Microfotografa de bacteria del gnero Rhizobium

Velocidad de crecimiento:
Las cepas fueron sembradas por estras paralelas en placas Petri conteniendo LMA-RC o el
mismo medio modificado segn la caracterstica a evaluar. A menos que se indique lo contrario,
las placas se incubaron a 28 C por 4 das para las cepas de crecimiento rpido y por 7 das para
las de crecimiento lento.

Las colonias se clasificaron de acuerdo a su apariencia segn las categoras sugeridas por el
CIAT (1988).
La velocidad de crecimiento se evalu determinando el tiempo de aparicin de las
primeras colonias. Si las primeras colonias aparecieron dentro de los 2-4 das de incubacin, las
cepas respectivas se consideraron de crecimiento rpido y si aparecieron dentro de los 5-7 das
se consideraron de crecimiento lento (Jordan, 1984).
 Produccin de cido o lcali:
Sembrar las cepas de Rhizobium en forma de S, en el medio extracto de levadura manitol agar
azul de bromotimol (ELMABT), incubar de tres a siete das y observar el viraje de color de este
medio: si no hay cambio el medio es neutro, azul indica alcalinidad y amarillo indica acidez; los
resultados de esta prueba permiten agrupar a las rizobias como cido portadoras o lcali
portadoras.

La produccin de acidez (o alcalinidad) se determin adicionando el indicador azul de

bromotimol (Beck et al., 1993). Segn el viraje de este indicador, las cepas se calificaron como
productoras de alcalinidad, ligera acidez o moderada acidez.

Prueba de la leche tornasolada:

La leche con tornasol es un medio diferecial que se emplea para determinar varias funciones
metablicas de un microrganismo:
- Fermentacin de la lactosa
- Actuacin sobre sustancias nitrogenadas de la leche.
- Reduccin del tornasol.
- Coagulacin.
- Peptonizacin (digestin del cogulo y proteinas de la leche por enzimas proteolticos).
- Formacin de gas.
Hacer tres repeticiones por cada cepa y sembrar en medio de leche tornasolada con una asada
del cultivo puro. Incubar a 28 C por un periodo de 15 das, y observar peridicamente sin agitar
los tubos.

Interpretacin de los resultados

Color rosado en el medio de cultivo: Fermentacin de la lactosa. La reaccin es cida.
No hay cambio de color en el medio de cultivo: No se ha producido fermentacin de la lactosa
ni utilizacin de sustancias nitrogenadas del medio.
Color azul en el medio de cultivo: No hay fermentacin de la lactosa, pero el microorganismo
ha utilizado las sustancias nitrogenadas del medio, produciendo reaccin alcalina.
Color blanco en el medio de cultivo: El color blanco indica que se ha producido una
peptonizacin de la protena de la leche (digestin). El tornasol se reduce a una leucobase.
Produccin de cogulo: Su presencia indica coagulacin de la leche.
Produccin de gas: La aparicin de burbujas en el medio indica la produccin de gas (C02 y
H2).

Crecimiento en glucosa peptona agar prpura de bromocresol (GPA):

Estriar las cepas en este medio, incubarlas a 28 C durante 24 horas, observar una vez pasado este
tiempo de incubacin. Esta prueba permite verificar la pureza de cultivos de Rhizobium, que se
desarrolla muy mal en este medio, por lo que el crecimiento bacteriano y el cambio de color en el
medio indica la presencia de contaminantes.

Crecimiento a diferentes concentraciones de cloruro de sodio:

Para estudiar la tolerancia al cloruro de sodio se ajust la concentracin de esta sal a 1% y 2%
(171.1 y 342.2 mM). El crecimiento en condiciones cidas o alcalinas se evalo ajustando el pH a
5.0 (con HCl 1N) y 9.0 (con NaOH 1N) (CIAT, 1988). Para observar el crecimiento bacteriano a
diferentes temperaturas las cepas se incubaron a 10C y 36C. En todos los casos el crecimiento
se calific como: escaso, normal, abundante y sin desarrollo, comparndolo con el obtenido en
condiciones normales (NaCl 0.01%, pH 6.8 y 28C)
 Tolerancia a la acidez:
En el medio de Kerser y Muiz, ajustado a un pH de 4.5, estriar las cepas e incubarlas durante un
periodo de siete das, al trmino se observa si hubo crecimiento.

Reduccin de tetrazolium:
Estriar las cepas en el medio de trifenila tetrazolium en promedio de tres repeticiones por cepa, e
incubar por siete das. Si al finalizar este periodo las colonias no presentaron cambio de
coloracin a rojo prpura, entonces la sal de tetrazolium no se redujo, y se dice que son colonias
Hup (-). Si hubo cambio de color en la coloracin de la colonia (rosa o rojo), hubo reduccin de
tetrazolium, y la cepa es entonces Hup (+).

Autentificacin de Rhizobium y prueba de inoculacin cruzada

Todas las leguminosas susceptibles de ser noduladas por la accin de una misma cepa de
Rhizobium forman lo que se llama grupo de inoculacin cruzada.

La importancia de confirmar que la colonia aislada es un cultivo puro, de un organismo en

particular, que puede formar ndulos sobre las races de las leguminosas, ya que esto se
considera como la nica prueba sobresaliente y un prerrequisito indispensable para que se
considere al organismo como Rhizobium.

Preparacin de las semillas:

Las semillas de frijol, soya, lenteja, trbol, alfalfa y caup se desinfectan ponindolas en matraz
pequeo, al que se le adiciona alcohol al 95 % por 30 segundos. Enseguida se enjuagan con agua
destilada y se adiciona HgCl2 al 0.1% durante uno o dos minutos. Hacer siete enjuagues con agua
destilada y esterilizada.

Las semillas se ponen a germinar en agar agua. El tipo de recipiente que se utiliza para la prueba
depende del tamao de la semilla y la planta. Para el caso del frijol, soya y cacahuate, se utilizan
jarras Leonard. Para trbol y alfalfa se emplean tubos de vidrio de 200 x 300 mm.

Preparacin de jarras de Leonar:

Este sistema consta de dos unidades: una superior, donde se encuentra el soporte de la planta y
otra inferior o reservorio que contiene la solucin de nutrientes a utilizar.

La parte superior consiste en una botella de aprox. 2700ml, a la que se le corta el fondo y
donde se le coloca el material de soporte (arena, vermiculita, etc.) que permanece hmedo por el
fenmeno de capilaridad, que se obtiene mediante una mecha de algodn que atravieza el pico
de la botella, con el extremo cerca de la superficie de la arena y el otro sumergido dentro del
reservorio.

La parte inferior es un frasco de un litro en el que el pico de la botella queda 5cm dentro
y el cuello de la misma perfectamente acoplado al cuello del frasco. Una vez listas, estas
unidades se envuelven con papel Manila grueso, esterilizado a 18 lb, por tres horas. Cuando ya
se tienen preparadas las jarras de Leonard, se lo siembra las semillas o plntulas dos por unidad,
para dejar finalmente a una planta.

Preparacin en tubos:
Existen diferentes medios a utilizar en esta prueba, aunque cualquiera de ellos debe llevar
agar en una proporcin de 8 a 12g por litro de medio. En este caso el medio que se utilizar
es el de Jensen, que previamente se licua para despus vaciar en tubos. En cada uno de ellos
se colocan 35 ml, y se les tapa con gasa y papel de aluminio. Los tubos se esterilizan a 15 lb
durante 18 min. Y se inclinan, antes de que haya solidificacin. Cuando el medio est
slido, las semillas germinadas pasan a los tubos colocndolas con una asa por la raiz en la
superficie inclinada y expuestos a radiacin solar.
 Inoculacin:
Las cepas puras de cada leguminosa se ponen a crecer en CELM hasta obtener una poblacin
aprox. de 109 bacterias/ml (verificar con la escala de Mac Farland); cuando se tiene la poblacin
se procede a la inoculacin de 1ml sobre la leguminosa presentes en la jarra de Leonard y en los
tubos de vidrio, previa preparacin de cuatro jarras de Leonard y cuatro tubos de vidrio
(solanum), en donde sern inoculadas y las dos restantes servirn de control en cada una de
ellas.

Posteriormente se comparan las diferencias de vigor de las plantas inoculadas y las no

inoculadas. Estas aparecern de 15 a 30 das despus de la siembra. Descubrir el sistema radial
de la planta y registra la presencia o ausencia de ndulos. La presencia de ndulos en el
tratamiento no inoculado invalida la autentificacin y se repetir el tratamiento con el mejor
control bacteriolgico.

Tambin se debe registrar el nmero, peso fresco de ndulos y el peso fresco de la planta
completa en cada tratamiento. Se determinar el contenido de nitrgeno de la materia seca
(procedimiento de Kjeldah)

INOCULANTES: TIPOS Y MEDIO DE SOPORTE

Un inoculante de Nitrgeno es un producto que incorpora Rhizobium de manera efectiva,

ya sea en suelo, en semilla o en ambos en el momento de la siembra.

En general, la inoculacin se puede recomendar para una zona agrcola que se sembrar con una
nueva especie de leguminosa. Para controlar la calidad de un inoculante de una leguminosa
especfica, es necesario mantener un nmero de Rhizobium de aproximadamente 10 6 bacterias/g
de inoculante (FAO, 1995) y determinar si es especfico para la leguminosa a prueba. As, un
producto microbiano o inoculante, debe por lo menos mantener la productividad de un cultivo
agrcola con menos dosis de fertilizante nitrogenado y con ello un ahorro en el costo de
produccin, minimizar la contaminacin de aguas superficiales y mantos acuferos y por
supuesto la conservacin del suelo, en un esquema de produccin sustentable.
Existen varios tipos de inoculantes, pero el ms comn es un soporte a base de turba
impregnada con un cultivo bacteriano. A pesar de que desde 1880 los inoculantes han sido
comercializados, como un producto biolgico requiere de un riguroso control de calidad de tipo
microbiolgico que garantice el xito esperado con la leguminosa seleccionada.
Una inoculacin efectiva se verifica con la formacin de ndulos radicales que fijan Nitrgeno
en la planta.

El desarrollo del inoculante requiere de:

 Seleccin de cepas
-Aislamiento y purificacin de cepas

-Ensayos de infectividad y efectividad

-Anlisis qumico para determinar Nitrgeno.

Produccin de biomasa de bacterias y formulacin del inoculante

-Optimizacin de caldos y procesos

-recuperacin de biomasa bacteriana

-Soportes y adyuvantes

-maduracin del inoculante

-Eleccin de envases

-transporte y mantenimiento del inoculo.

Ensayos en campo
-En distintas reas ecolgicas

-A distintas dosis de aplicacin en el campo.

Requisitos que debe reunir un inoculante

-El inoculante debe de contener 109 Rhizobium por gramo o mililitro de producto a la
fecha de evaluacin .

-Un inoculante de calidad debe de asegurar que ms del 80% de las plntulas inoculadas
generen tres o ms ndulos en las raices (15-20dias).

-El inoculo debe ser almacenado en condiciones de baja temperatura y en ambiente seco

-Los envases que almacenan el producto deben ser abierto solo antes de su uso.

-Estos envases no deben de estar rotos, ni hinchados (daados).

Factores relacionados al inoculante :

-Tipo de inoculante
-Mtodo de inoculacin

-Lapso de tiempo desde la inoculacin hasta la siembra

-Nmero y viabilidad de bacteria por semilla

-sistema de siembra

-variedad edafoclimatica

-sistema de labranza

-Disponibilidad de nutrientes del suelo.

Cuadro 1. GRUPOS DE INOCULACIN CRUZADA Y ASOCIACIONES

DE Rhizobium LEGUMINOSA
Especies de
Grupo de Inoculacin Gnero Leguminosa
cruzada Rhizobium hospedero incluida
R. meliloti

Grupo de alfalfa Medicago Alfalfa

Melilotus Trebol dulce

Trigonella Alholva
R. leguminosarum
Grupo del trebol Trifolium Trebol
biovar trifolii

Grupo del Chcharo R. leguminosarum Pisum Chcharo

biovar vicia Vicia Haba
Canthyrus Almorta

Lens Lenteja
R. leguminosarum Phaseolus Frijol
Grupo del frijol
biovar phaseoli

hoy R etli
Bradyrhizobium
Glycine
Grupo de la soya Japonicun Soya

Altramuz

Grupo del caup Bradyrhizobium Lupinus Cacahuate

Arachis
ssp Caup
Vigna
 Procedimiento de aplicacin de inoculo:

-La semilla debe de cubrirse uniformemente con el inoculo y debe cuidarse que este no
se desprenda durante la siembra.

-Para inoculantes convencionales la inoculacin debe de realizarse durante 24 horas

antes de la siembra.

-La semilla debe de ser protegida de las altas temperaturas y de los rayos solares
durante la siembra (evitar la siembra al medio da, utilizar material para cubrir).

-La siembra se realiza en suelos debidamente preparado , con la humedad adecuada,

obteniendo una buena implantacin del cultivo.

IV. Importancia:

Biofertilizantes
A pesar de que Rhizobium es un habitante comn en los suelos agrcolas, frecuentemente su
poblacin es insuficiente para alcanzar una relacin benfica con la leguminosa, o la cantidad de
N2 que fijan no resulta suficiente. En estos casos, es posible inocular la semilla con
microorganismos para asegurar la fijacin biolgica del N 2. El proceso de inoculacin consiste
en agregar a las semillas, antes de la siembra, una mezcla de bacterias fijadoras y otros
ingredientes que facilitan el crecimiento de las mismas.
El empleo de inoculantes de Rhizobium en las leguminosas es una de las contribuciones ms
importantes de la microbiologa a la agricultura. Estos inoculantes favorecen la fijacin
simbitica de nitrgeno y, en consecuencia, disminuye la dependencia a los fertilizantes
nitrogenados y la contaminacin ambiental por nitrgeno asociada al empleo de estos productos.
Lo ideal es seleccionar un Rhizobium altamente infectivo y efectivo para lograr una disminucin
mxima del fertilizante nitrogenado sin reducir el rendimiento de la leguminosa.
En la Argentina existen varias empresas e institutos pblicos que trabajan en investigacin y
desarrollo de inoculantes. Los objetivos de estas investigaciones son bsicamente:
1) Mejorar la eficiencia de fijacin de nitrgeno mediante el uso de bacterias muy
competitivas.
2) Desarrollar bacterias fijadoras ms eficientes y competitivas. Tambin se investiga sobre la
obtencin de cepas bacterianas con genes capaces de mejorar las limitaciones que presenta
el proceso de simbiosis y de fijacin de nitrgeno.
 3) Extender las ventajas de la simbiosis a otros cultivos (arroz, maz, etc.). En los cereales,
por ejemplo, se intenta inducir estructuras similares a los ndulos de leguminosas. Se han
realizado experimentos de transferencia de genes inductores de nodulacin a plantas de
arroz y se ha observado que se expresaban en las races de las plantas transgnicas
obtenidas.

http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/doc/El%20Cuaderno%2087.doc