Evidenierea izoenzimelor lactat dehidrogenazei prin electroforez

1. Dozarea concentraiei proteinelor: prin metoda Bradford sau Lowry

2. Pregtirea gelurilor:

Tampon Tris/HCl 1,5M pH 8,8: 9,08g Tris/ 50 ml ap distilat

Tampon Tris/HCl 0,5M pH 6,8: 3,02g Tris/ 50 ml ap distilat
Amoniu persuflat (APS) 10%: 0,050 g/ 500 ul ap distilat

Gelul de migrare 7,5% Gel de concentrare 4%

PAA 30% - 2,5 ml PAA 30% - 0,67 ml

Tris-HCl 1,5M pH=8,8 - 2,5 ml Tris-HCl 0,5M pH=6,8 - 1,25 ml
Ap distilat - 4,9 ml Ap distilat - 2,975 ml
APS 10% - 100 ul APS 10% - 50 ul
TEMED - 6 ul TEMED - 6 ul

Gelurile se pregtesc n acceai zi sau cu o zi nainte i se las la frigider la 4C.

Acestea se fixeaz n tancul de electroforez peste care se toarn tamponul de
electroforez 1 X i se ncarc probele.

Tampon electroforez 1X (1 litru): - 2,4 g Tris (0,02 M)

-11,6 g Glicina (0,15 M)

3. Pregtirea probelor:
Probele se pregatesc n funcie de cantitatea de protein care se ncarc pe un gel.
De obicei se ncarc n jur de 50 ug de protein n fiecare godeu.
innd cont de cantitatea de protein care se va ncarca per godeu, probele se dilueaz
corespunzator n funcie de concentraia proteic.
Diluiile se realizeaz cu tamponul n care au fost lizate probele.
Se adaug tampon de ncrcare concentrat de cinci ori (5X), adic 5 ul/prob la volum
final 25 ul.

Tampon ncrcare 5X (vol final 10 ml):

- 2,5 ml Tris/HCl 0,5M pH=6,8 => Tris/HCl 0,125 M
- 1g SDS => SDS 10%
- 2,5 ml B-mercaptoetanol => B-mercaptoetanol 25% (v/v)
- 5 ml glicerol => glicerol 50% (v/v)
- 2,5 mg bromfenol => albastru de bromfenol 0,025%

4. ncrcarea probelor n gel:

- se utilizeaz seringa Hamilton
- cantitatea de proba care se ncarc ntr-un godeu este de 25 ul
5. Migrarea:
- migrarea se face la 4oC la 70V, pentru 30 min pn probele intr n gelul de concentrare
- apoi la 90V, constant, pentru nc 90 min

6. Colorarea benzilor
Reactivi i soluii
- soluie tampon Tris-HCl 0,1 M pH 9,2
- lactat de litiu 0,1 M = rol de substrat
- NAD+ 50 mg% (50 mg/100 ml) = rol de cofactor
- nitroblue tetrazolium (NBT) 5 mg% (5 mg/100 ml) = acceptor final de hidrogen
- fenazin metosulfat (FMS) 0,5 mg% (0,5 mg/100 ml) = acioneaz ca intermediar

Modul de lucru:
- se spal gelul de 2 ori cu apa distilat cte 2 min
- se pune soluia tampon n care au fost adugate lactat de litiu, NAD +, NBT i FMS i se
las 15 minute la 37oC la ntuneric pe agitator
- se spal cu ap distilat i se face poz la gel
- se densitometreaz benzile obinute