MEMORIAS DEL XVI CONCURSO LASALLISTA DE INVESTIGACIN, DESARROLLO E INNOVACIN CLIDi 2014 CEN-9

Biodesulfuracin de dibenzotiofeno a partir de

Aspergillus niger y Penicillium notatum
M. A. CASTILLO COLLAZO, S. P. CORTS SNCHEZ, A. M. PALACIOS CANDIA, I. A.
SALINAS RANGEL Y T. VEREA SOTO

Resumen En este trabajo se analiz la capacidad de dos mtodos biolgicos de desulfuracin una alternativa a esta
hongos filamentosos, Aspergillus niger y Penicillium notatum, problemtica.
para metabolizar la molcula de dibenzotiofeno a partir de una La biodesulfuracin es un proceso en el cual participan
tcnica de Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin CLAR microorganismos, en este caso hongos, para la desulfuracin
(HPLC por sus siglas del idioma ingls) para la cuantificacin del carbn. El metabolismo de estos microorganismos se basa
de la concentracin del dibenzotiofeno, adems de las mediciones en que pueden oxidar los compuestos reducidos del azufre,
de biomasa. Encontrando una disminucin en la concentracin transformndolos en compuestos solubles de fcil
de la molcula de dibenzotiofeno (DBT) despus de dos semanas eliminacin.
con la posible formacin de subproductos.
La metabolismo de estos hongos tienen la capacidad de
transformar una gran variedad de compuestos orgnicos,
mineralizndolos, ya sea a travs de enzimas intracelulares o
I. INTRODUCCIN
excretndolas al medio, esto ofrece un gran potencial para su
El petrleo y otros combustibles fsiles constituyen ms del
uso en estos procesos y una ventaja sobre el metabolismo
60% de las fuentes de energa primaria, este hecho ha
bacteriano, puesto que est obligado a la internalizacin de
generado apreciables problemas ambientales en los ltimos
los compuestos, antes de ser degradados.
aos. Al quemarse, los combustibles fsiles producen xidos
Penicillium notatum es un hongo filamentoso que est
de azufre y de nitrgeno que, al combinarse con el agua de las
ampliamente distribuido en la naturaleza dnde se puede
nubes, se precipitan en forma de lluvia cida, esto puede
hallar en el suelo, la vegetacin cada y en el aire. Este
afectar a los bosques, eliminar la vida de los lagos y desertizar
organismo prefiere climas frescos y moderados, tiene mejor
grandes superficies terrestres. stas son algunas razones por
crecimiento en lugares hmedos y comnmente est presente
lo que es necesario llevar a cabo un proceso de eliminacin
donde hay una variedad de materia orgnica disponible. Vive
del azufre en los combustibles fsiles antes de su utilizacin
principalmente en las sustancias orgnicas biodegradables y
[1].
en materias primas si hallan el agua y los nutrientes
El contenido de azufre en los crudos mexicanos vara de un
necesarios, ya sean de origen vegetal o animal. Asimismo,
0.9% a un 7.0%. De este azufre alrededor del 40% se
este es uno de los hongos ms utilizados en la degradacin de
encuentra unido a molculas orgnicas siendo la ms
hidrocarburos del petrleo en muestras de suelo [3], pues
representativa el dibenzotiofeno. Este compuesto est
durante la biodegradacin, se ha comprobado que este tipo de
constituido por dos molculas orgnicas de benceno unidas a
hongos est equipado con la maquinaria metablica para
un tiofeno que contiene el tomo de azufre. El DBT es un
utilizar al contaminante como fuente de carbono y energa
compuesto con un peso molecular de 184. 26 g/mol; es
para su crecimiento, produciendo biomasa, subproductos,
soluble en disolventes no polares como hexano, y poco
dixido de carbono y agua [4].
polares como el acetonitrilo, la acetona y en alcoholes
Los Aspergillus son capaces de utilizar una enorme
calientes [2].
variedad de sustancias como alimento debido al gran nmero
La eliminacin del azufre de molculas orgnicas como el
de enzimas que producen. Se ha encontrado la presencia de
DBT es difcil de realizar tanto por mtodos fisicoqumicos
hongos de ste gnero en suelos contaminados con
como biolgicos dada la especificidad del mecanismo de
hidrocarburos. En la bibliografa se encuentra reportado que
eliminacin del azufre de molculas orgnicas como el DBT.
microorganismos de ste gnero pueden crecer sobre
Actualmente, los procesos fisicoqumicos tienen un elevado
hidrocarburos lineales y aromticos, incluyendo a los
costo por su alto requerimiento energtico, siendo los
aromticos heterocclicos que contienen azufre como el DBT.
Particularmente algunos hongos como Aspergillus niger
oxidan tiosteres y sulfuros orgnicos cclicos a sus
M. A. CASTILLO COLLAZO, S. P. CORTS SNCHEZ, A. M.
correspondientes sulfxidos y sulfonas [5]; stos datos
PALACIOS CANDIA, I. A. SALINAS RANGEL y T. VEREA SOTO
pertenecen a la carrera de Ingeniera Ambiental de la Facultad de Ciencias
permiten suponer que es posible metabolizar de alguna
Qumicas y realizaron el proyecto dentro del curso de INGENIERA DE manera los hidrocarburos, incluida la desulfuracin de DBT.
REACTORES Y MICROBIOLOGA (Email:
mario_castillocollazo@hotmail.com). II. CONCEPTOS BSICOS
El proyecto fue asesorado por el Dr. TOMS EDUARDO CHVEZ A.niger al igual que P. notatum, son hongos filamentosos
MIYAUCHI y la Maestra ANABELLE CERN NAVA.
cuyas enzimas relacionadas con la oxidacin del DBT son el
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citocromo P450 (CIP450) y las ligninolticas lacasa, siendo

sta ltima un fenol oxidasa extracelular producido por el
micelio de este ascomiceto.
Bioqumicamente, la lacasa es una enzima que oxida una
variedad de compuestos aromticos, es decir, cataliza la
remocin de un electrn y un protn de hidroxilos fenlicos o
de grupos amino aromticos, para formar radicales libres
fenoxilo y radicales amino, respectivamente. Si la oxidacin
se llevara a cabo por esta enzima oxidasa, el oxgeno sera el
aceptor final de electrones y el DBT el donador de estos. La
enzima lacasa oxida los sustratos al remover un electrn por
vez y genera radicales libres los cuales pueden polimerizarse.
La enzima almacena electrones de reaccin de oxidacin
individuales y en su estado totalmente reducido contiene un
total de cuatro electrones, as, la enzima puede transferir estos
electrones al oxgeno molecular para formar agua [6].
Adems del sistema enzimtico extracelular, los hongos
poseen otro intracelular donde se involucra el CIP450, esta
ruta intracelular est presente en todos los organismos
eucariotas, que lleva a cabo funciones del metabolismo
endgeno, es decir, la degradacin de sustancias del propio
organismo y la eliminacin de sustancias exgenas como son
drogas, sustancias carcingenas, pesticidas, etc. El CIP450,
clasificado como una enzima monooxigenasa, es el
componente final de una cadena de electrones que cataliza la
oxidacin de sustratos. Los electrones involucrados en la
oxidacin de los sustratos por el CIP450 pueden provenir de
la nicotinamida y la adenina dinucletido fosfato (NADPH),
que es una coenzima que participa en reacciones tanto
anablicas como catablicas.
Radwan en [7] reportar la presencia de hongos del gnero
Aspergillus en un estudio de biodegradacin de hidrocarburos
en suelos contaminados con petrleo. Del mismo modo
Pritchard en [8] sealan que microorganismos del gnero
Aspergillus pueden crecer sobre hidrocarburos lineales y
aromticos, incluyendo a los aromticos heterocclicos que
contienen azufre como el DBT.
De acuerdo a la literatura, la ruta metablica propuesta que
explica la oxidacin del tomo de azufre sin rompimiento de
enlaces se muestra en la figura 1.
Figura 1. La ruta metablica implica en primer lugar la
oxidacin del DBT hasta DBT sulfxido (DBTO) y
posteriormente de DBTO hasta DBT sulfona (DBTO2). La
degradacin de DBT se lleva a cabo, ya que el DBT se oxida
parcialmente, permaneciendo intactos los enlaces C-S, para
distinguirla de la desulfuracin del DBT, en que los enlaces C-S
se rompen. Adems, en este proceso finalmente no se extrae el
tomo de azufre de la molcula.
En el Apndice se muestra la curva de calibracin que se
realiz para la determinacin de la concentracin final del
DBT.
Del matraz 1 se tom la primera muestra despus de una
semana mientras que en el matraz 2, se tom la muestra en la
segunda semana. Antes de filtrar se pesaron los filtros, y
despus se filtraron, posteriormente se dejaron secando
durante un da en la incubadora a 28C y se determin la
biomasa de los hongos.
Para determinar la cantidad de DBT remanente por el
hongo, se extrajo 1 ml del lquido residual del filtrado y se
agreg 1 ml de acetonitrilo, finalmente se determin su
absorbancia en HPLC y con la curva de calibracin se
determin la concentracin del remanente.
IV. RESULTADOS
En la Figura 2 se observa que durante la primera semana
ambas cepas se encontraban en fase de adaptacin por lo que
el crecimiento fue mnimo; mientras que para la segunda
semana el crecimiento de stos fue superior a 10 veces su
peso anterior.

III. METODOLOGA
En este experimento utilizamos tres matraces, el control y dos
con el contaminante. En el matraz control aadimos 5 ml de
una cepa del hongo A. niger, con una cantidad aproximada de
1x106-1x108 esporas, en 80 ml de la solucin buffer; en los
dos matraces restantes (1 y 2), agregamos las mismas Figura 2. Biomasa del hongo
proporciones de cepa y de buffer adems de aadir 4 ml de la
solucin de DBT 0.02170 mM como sustrato. Asimismo, En la Figura 3 se aprecia la disminucin de la
todos los matraces se metieron a una incubadora a 28C. concentracin del DBT en diferente proporcin para cada
cepa, lo que indica la degradacin del sustrato por el hongo.
CASTILLO et al.: BIODESULFURACIN DE DIBENZOTIOFENO A PARTIR DE ASPERGILLUS NIGER
De acuerdo a los perfiles de crecimiento de hongo y
degradacin de DBT, se obtuvieron los parmetros cinticos
de acuerdo a la ecuacin de Monod para un crecimiento
microbiano en un sistema no estructurado no segregado, en el
cual se puede apreciar en el cuadro I.
donde representa la velocidad especfica de crecimiento, m
la velocidad mxima de crecimiento, S la concentracin de
sustrato y Ks constante de velocidad media.
Figura 3. Concentracin del DBT
CUADRO I
PARMETROS CINTICOS DE CRECIMIENTO DE MONOD
Hongo Ks [M] m [hr-1]
Aspergillus niger 9.097x10-6 0.0195
Penicillium 2.205x10 -6
0.01365
notatum
Por lo tanto, la ecuacin cintica que describe la
degradacin del DBT por A. niger (1) y P. notatum (2) se
muestra a continuacin:
(1)
(2)
V. CONCLUSIONES
Aspergillus niger y Penicillium notatum mostraron tolerancia
al DBT, por lo que es posible afirmar su capacidad de crecer
en presencia de este contaminante; sin embargo, no se lleva a
cabo la desulfuracin del DBT, es decir, no se rompen los
enlaces carbono-azufre de la molcula.
De acuerdo a la literatura, el metabolismo de los hongos
supone la oxidacin del DBT hasta la forma de DBT sulfona,
siendo esta molcula el producto final de la ruta de oxidacin
de tal manera que hay una disminucin en la concentracin
final del DBT como se mostr en los resultados.
CEN-11
Para comprobar la formacin de los subproductos
generados durante la oxidacin del DBT se tienen que hacer
ms estudios; stos nuevos compuestos azufrados, aumentan
su polaridad y modifican algunas de sus propiedades tales
como su punto de ebullicin, lo que permite que su separacin
se lleve a cabo por operaciones unitarias ms sencillas como
la extraccin con solventes o la destilacin fraccionada.
La investigacin en esta rea es de gran importancia para la
industria petrolera, ya que reducira los costos inherentes a la
adaptacin de tecnologas que permitan el cumplimiento de
las normativas ambientales cada vez ms exigentes de
nuestros mercados tradicionales y, por otro lado, facilitara la
introduccin de nuestros productos en nuevos mercados
aunque para este tipo de tcnica se tienen que cuidar ciertos
parmetros como: la eleccin del microorganismo, el tiempo
de conservacin, la manipulacin, la velocidad de
crecimiento, la ruta metablica, el tipo de subproductos, etc.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a nuestros padres por darnos la posibilidad de
estudiar en una institucin de prestigio como lo es la
Universidad La Salle. Los autores agradecen a la Maestra
Anabelle Cern Nava por su apoyo incondicional y
entusiasmo para el desarrollo del proyecto, as como al Dr.
Toms Eduardo Chvez Miyauchi por la inspiracin que nos
brind durante el desarrollo experimental.
APNDICE
En el cuadro II se muestran las concentraciones que
utilizamos de DBT, con acetonitrilo como disolvente, para
realizar la curva de calibracin, asimismo se puede observar
en la Figura 4 la curva de calibracin.
Figura 4. Curva de calibracin del DBT
REFERENCIAS
[1] C. Hernndez del Olmo, Desulfuracin de dibenzotiofeno con
Rhodococcus erythropolis IGTS8, 2014. Recuperado el 15 de Mayo de
2014, de http://biblioteca.ucm.es/tesis/qui/ucm-t28349.pdf
[2] C. M. Zuleta Vargas, Desulfuracin de dibenzotiofeno por hongos
aislados de suelos contaminados con hidrocarburos, 1998. Obtenido de
http://148.206.53.84/tesiuami/UAM3663.pdf
[3] R. Atlas Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an
environmental perspective, Microbiol. Rev., vol 45, No. 1, 180-209,
1981.
CEN-12 MEMORIAS DEL XVI CONCURSO LASALLISTA DE INVESTIGACIN, DESARROLLO E INNOVACIN CLIDi 2014

CUADRO II
CONCENTRACIONES DE LAS MUESTRAS PARA LA CURVA DE CALIBRACIN
Muestra Concentracin [M] rea [mVs]
1 0.0001 12434.04
2 0.00005 10824.15
3 0.000025 6582.59
4 0.0000125 3531.67
5 0.00000625 2399.72

[4] J. Eweis, et al. Principios de biorrecuperacin. Ed. Mac Graw Hill,

1999.
[5] A. Laborde y D. Gibson, Metabolism of dibenzothiophene by
Beijerinckia species, Applied and Environmental Microbiology, vol 34,
no. 6, 783-790, 1977.
[6] F. Villaseor Ortega, "Oxidacin del dibenzotiofeno mediante los
sistemas: enzima lacasa-ABTS o cido fosfotngstico-perxido de
hidrgeno y desulfuracin oxidativa del disel, 2004.
http://tesiuami.izt.uam.mx/uam/aspuam/presentatesis.php?recno=20018
1175&docs=200181175.pdf
[7] S. Radwan, N. Sorkhon, R. Fardoun y H. Al-Hasan, Soil management
enhacing hydrocarbon biodegradation in the polluted Kuwaiti desert,
Applied of Microbiology and Biotechnology, vol. 44, no. 1-2, 265-270,
2005.
[8] P. Pritchard, J. Mueller y D. Santavy, The potential Importance of
Biodiversity in environmental biotechnology applications:
Bioremediation of PAH-contaminated soil and sediments, Allsopp D.,
Colwell R. y Hawksworth D., (Eds.), Microbial diversity and ecosystem
function, Pub. CAB. International, Cambridge, UK. 1995.