CINTICA DE LA PRODUCCIN DE ACIDO LCTICO

POR FERMENTACI~NSUMERGIDA CON LACTOSUERO

COMO SUSTRATO
Kinetic of the Lactic Acid Production by Submerged Fermentation with Whey as Substrate

Miguel Jakymec, Hctor Morn, Gisela Pez, Jos R. Ferrer, Zulay Mrmol y Eduardo Ramones
Laboratorio & Tecnologa de Alimentos, Escuela de Ingeniera Qumica, Facultad de Ingeniera, Universidad del Zulia.
Apartado 4011 -A 526.Maracaibo, estado Zulia, Venezuela. E-mail: gpaez@luz.ve

RESUMEN New Brunswick Fermentor model Bioflo 4000,at three different

Se estudi la cintica de produccin del cido Ictico, a partir 90.64 g/L. Maximum lactic acid yield was 10% at an initial lac-
del suero de leche, utilizando Lactobacillus bulgar~cus,mediante
fermentacin por carga. El suero de leche fue desproteinizado
(bajando el pH a 4,5, calentando durante 20 min) y suplementa-
do con 20 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona trpsi-
ca de casena y 1 g/L de Tween 80 como antiespumante. La
fermentacin se llev a cabo a 42C y a 100 rpm de agitacin and Tsao ecuation (Ks = 1.27*10-~ for the best modelling).
en un fermentador New Bninswick modelo Bioflo 4000, a tres
concentraciones iniciales de lactosa diferentes: 27,98g/L, 49,89
g/L y 90,64glL. El mximo rendimiento de cido Ictico fue
lo%, para una concentracin inicial de lactosa de 49,89g/L. La
cintica de la produccin de biomasa fue ajustada por el modelo
logstica, obtenindose en la mejor simulacin un valor de p,,,
= 0,884h.', la de produccin de cido Ictico por la ecuacin de
Luedekin y Piret, obtenindose en la mejor simulacin los si-
guientes coeficientes a = -1,348*10"y fl = 1,29'10", y la de
consumo de sustrato por la ecuacin de Hanson y Tsao, obte-
nindose en la mejor simulacin un coeficiente Ks = 1,27*10-~.
Palabras clave: Fermentacin Ictica, lactosuero, produccin
de cido lctico, cinetica.
ABSTRACT
Kinetic of the lactic acid production in batch fermentation was
studied from whey, using Lactobacillus bulgaricus. Whey was
deproteinized (by adjusting the pH to 4,5,heating for 20 min)
and supplemented with 20 glL yeast extract, 10 g/L tripsic ca-
sein peptone and 1 g/L Tween 80 as antifoam. The fermenta-
tion was performed at 42C and agitation speed 100 rpm in a
Recibido: 03 11 1 11999. Aceptado: 28 1 1 1 / 2000
initial lactose concentrations: 27.98 glL, 49.89 g/L and
tose concentration of 49,89g/L. Biomass production kinetics
was adjusted by a logistic model (pmax = 0.884 h.' for the best
modelling), lactic acid production by the Luedekin and Piret
ecuation (a = -1.348'10.~ and fl = 1.429*10-~ for the best mo-
delling) and sustrate consumption was adjusted by the Hanson
Key words: Lactic acid fermentation, whey, lactic acid produc-
tion, kinetic.
El suero es el lquido residual de la transformacin de la
leche en queso. Es el subproducto ms abundante en las in-
dustrias lcteas. El suero es un producto muy utilizado en el
campo de la alimentacin animal (hasta un 20% en peso del
alimento), en la fabricacin de algunos tipos de bebidas y de
alimentos enriquecidos para el hombre. Desde el punto de vis-
ta nutricional la protena presente en el suero es el componen-
te ms valioso, contiene tambin las vitaminas y minerales no
retenidos en el proceso de coagulacin de la leche y lactosa,
de gran uso en la industria farmacutica y alimenticia. Sin em-
bargo la cantidad de suero que se apmvecha es muy poca
comparada con su produccin. La produccin de suero en la
regin Zuliana fue para 1997,162.387toneladas [6].
A travs de procesos de bioconversin pueden obtener-
se del suero productos con un alto valor comercial, uno de
estos productos es el cido Ictico, utilizado en las industrias
alimenticia, farmacutica, textil, como materia prima en la
produccin de polmeros biodegradables, en el procesamien-
to del papel y en la sntesis de barnices y pinturas. El cido
Cintica de la produccin de cido Ictico por fermentacin 1 Jakymec, M. y col.
Ictico puede ser obtenido por fermentacin del suero con
bacterias del gnero Lactobacillus, entre estas el Lactobaci-
llus bulgaricus. La medicin del crecimiento del microorganis-
mo, el consumo del sustrato y la produccin del cido funda-
menta la determinacin de los parrnetros que describen el
bioproceso.
Existen varios modelos que permiten una descripcin
adecuada de procesos de fermentacin con iactosa como
sustrato, como una va sencilla de conversin en cido Ictico
asumiendo que la produccin de este cido est parcialmente
asociada con el crecimiento microbiano. La simulacin de los
datos experimentales de un cultivo de Lactobacillus bulgari-
cus en suero de leche correlaciona el bioproceso con estos
modelos.
El objetivo de esta investigacin fue estudiar la produc-
cin del cido Ictico empleando suero de leche como sustra-
to, estableciendo el modelo cintico de la fermentacin.
METoDoLOG~AEXPERIMENTAL
Microorganismo
Se trabaj con Lactobacillus bulgaricus, obtenido liofili-
zado del Chr. Hansen's Laboratorium N S de Dinamarca.
El microorganismo liofilizado se reactiv en leche, duran-
te 2 das a 40C. De los tubos de reactivacin, se tom 1 mL,
transfirindose a tubos con 9 mL de agar de leche descrema-
da. Se dej crecer durante 24 h; refrigerndose a 4C para su
conseivacin.
Medio de cultivo
El suero de leche, de la ltima etapa de produccin de
queso ricota, fue suministrado por la empresa Venelacteos
ubicada en Maracaibo, estado Zulia. Se caracteriz midiendo
los slidos totales, cenizas, nitrgeno, protenas, fsforo y lac-
tosa y desproteiniz bajando el pH a 4,5 con cido fosfrico y
calentando a 90C durante 20 minutos. Se enfri y filtr en pa-
pel Whatman nmero 42.
El medio empleado en las fermentaciones fue el siguien-
te: suero desproteinizado, diluido con agua destilada para ob-
tener una concentracin de 27,98 g/L; suero desproteinizado
con adicin de lactosa hasta una concentracin de 90,64 g/L y
suero desproteinizado con 4989 g/L de lactosa (concentracin
de lactosa en el suero fresco). En todos los casos el medio se
suplement con 20 glL de extracto de levadura y 10 g/L de
peptona trpsica de casena 1; el pH inicial se ajust a 59, con
una solucin de NaOH al 10%.
Fermentacin
Se realizaron fermentaciones por carga y por duplicado
en el fermentador New Brunswick modelo Bioflo 4000 (New
Brunswick, New Jersey. USA), con 3 L de medio de cultivo,
previamente esterilizados a l l S Y Cdurante 20 minutos, sin ai-
reacin, sin control de pH, manteniendo la temperatura a
42C y la agitacin a 100 rpm, con Tween 80 (1 g/L) como
antiespumante. La inoculacin se realiz bajo condiciones
aspticas.
Inculo
El inculo fue un 10% del volumen total de medio, a par-
tir de cultivo bacteriano refrigerado. Se dej adaptar y reprodu-
cir durante 12 horas en estufa a 42C sin agitacin, para cada
fermentacin.
A cada inculo preparado se le realiz un contaje en pla-
cas para garantizar entre 10" 10' unidades formadoras de
colonias por mL de inculo.
Mtodos de anlisis
Lactosa: Se determin utilizando el mtodo espectroco-
larimtrico de Dubois [4].
Slidos totales y cenizas: Se determinaron empleando
los mtodos de la A.O.A.C. [3].
Nitrgeno: Se determin por el mtodo de Kjeldahl [3].
Protehas: Se determinaron como porcentaje de nitrge-
no multiplicado por 638 [3].
Fsforo: Se determin por el mtodo espectrocolorim-
tic0 del molibdo-vanadato de amonio [3].
Biomasa: Se determin turbidimtricamente midiendo
la absorbancia del medio a una longitud de onda de 490 nm
en un Spectronic 20, Bausch & Lomb (Rochester, New York
USA) [a].
cido Ictico: La concentracin de cido Ictico fue de-
terminada por cromatografa en fase gaseosa, empleando un
cromatgrafo Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut USA), equi-
pado con una columna capilar Carbowax, para cidos grasos,
de 15 m de longitud y 0,25 mm de dimetro. La temperatura
en el puerio de inyeccin fue de 200C, la del horno fue 190C
y la del detector fue 250C [7 11. Se emple nitrgeno como
gas de arrastre a una presin de 14 psig. El volumen inyecta-
do por anlisis fue de 1 pL.
Para calibrar el equipo se utiliz un estndar de 1% plv,
el cual tuvo un tiempo de retencin de 1,267 min.
Como tratamiento previo a la inyeccin en el cromat-
grafo, las muestras fueron centrifugadas a 5000 rpm durante
30 minutos y filtradas usando papel millipore de 0,2 m, para
prevenir la obstruccin de la columna.
Cintica
Se ajustaron los datos experimentales a las ecuaciones
cinticas propuestas para la produccin de biomasa, cido Ic-
tic0 y el consumo de sustrato.
 Revista Cientifica, FCV-LUZ / Vol. XI, N", 53-59, 2001

Biomasa TABLA I
COMPOSICI~NDEL SUERO
Entre las ecuaciones descritas para la produccin de
Biomasa [2, 7, 111se tienen: Suero Suero
Fresco Desproteinizado
dX S
-=xPmax-
dt K, + S
(Ecuacin de Monod) Lactosa (g/L) 45,95 46,94
Slidos Totales, (g/L) 52,5 61,O
dX
-= X(p ,
,, h P ) (Ecuacin de Luedekin y Piret) (2) Cenizas (g/L) 4,5 3,O
dt
dX
-=XO
dt
[ 2).
1-- (Modelo Logstico)
Nitrgeno (%)
Protenas (%)
0,147
0,94

dX 1 PH 5,11
-= XP (Ecuacin de Amrane y Prigent) (4) Fsforo @/L) 0,357
dt ced'
1+ - --
P ,S, -c
S= Concentracin de sustrato (glL).
Produccin de cido Ictico
Y, = Rendimiento, gramos de biomasalgramos de sustrato.
Los modelos disponibles que describen la produccin de
cido Ictico [2, 7, 111son: Y,= gramos de biomasa /gramos de producto.
q= Cociente metablico (h.')
dP u -dX
= (Ecuacin de produccin sencilla) (5)
dt dt P= Concentracin de producto (cido Ictico) (g/L),
Po = Concentracin inicial de cido Ictico (g/L)
(Ecuacin de Luedekin y Piret) (6)
, ,P
, = Mxima concentracin de cido Ictico alcanzada en
la fermentacin (g/L).
=K ~SX (Ecuacin de Hanson y Tsao) (7)
dt Ks= Constante de saturacin de sustrato (Ug h h.').

P (Modelo Logistico) m= Coeficiente de mantenimiento celular (h.')

h= Coeficiente de inhibicin de la ecuacin de Luedekin -
Consumo de sustrato Piret (Ug h).
Las ecuaciones usadas con mayor frecuencia para el c, d' = Coeficientes constantes de la ecuacin de Amrane-Pri-
consumo de sustrato [2,7,11] son: gent (6').

Kp= Constante de inhibicin por producto (Ug h h.').

(Ecuacin de Monod)
n= Constante adimensional.
dS p= Constante de produccin (h.').
- = KsSX (Ecuacin de Hanson y Tsao) (10)
dt
dS 1 dX 1 dP
-=-- +-- (Ecuacin de Yeh y col.)
df Y, dt Y, dt
La caracterizacin del suero se muestra en la TABLA l.
~dS
1 dP
-=-- dX + - + rnX (Ecuacin de Aborhey El suero desproteinizado tiene una composicin ligeramente
dt Y, dt Y, dt y Williamson) superior en lactosa, slidos totales y cenizas que el suero sin
desproteinizar. El pH del suero ( 5 , l l ) lo define como un suero
cido. La desproteinizacin fue efectiva, ya que se baj el con-
donde:
tenido de protenas de 0,94% a 0,03%, es decir, se precipitan
X= Biomasa (g/L). el 96,8% de las proteinas remanentes.
Xo = Concentracin inicial de biomasa (glL). En la FIG.1 se muestra el mximo crecimiento microbia-
X, = Mxima concentracin de biomasa alcanzada en la no a las 8 horas, independientemente de la concentracin ini-
fermentacin (g/L). cial de lactosa [ l , 2, 71. Se obtuvo una mayor cantidad de bio-
masa y una mayor velocidad de crecimiento a la mayor con-
t= Tiempo (h).
centracin inicial del sustrato, sin embargo los rendimientos de
p= Velocidad especfica de crecimiento (h.'). biomasa expresados en gramos de biomasa producida por
gramos de sustrato consumido fueron de 2,65; 2,23 y de 1,23
p,, = Mxima velocidad especifica de crecimiento (h.').
Cintica de la produccin de cido Ictico por fermentacin 1Jakymec, M. y col.

60 -

S
3 40 -

O 2 4 6 8 1O 12
Tiempo (h)

FIGURA 1. CINTICA DE CRECIMIENTO DE L. bulgaricus A DISTINTAS CONCENTRACIONES DE LACTOSA.

FERMENTACION EN EL BlOFLO 4000. T: 42C Y 100 RPM.

O 2 4 6 8 10
Tiempo (h)
+So= 27,98 gL +So= 49,89 g/L So= 90,64 g/L
FIGURA 2. CINTICA DE LA PRODUCCIN DE CIDO LCTICO. *
para concentraciones iniciales de sustrato de 27,98; 49,89 y La ecuacin que mejor ajust las diferentes curvas de
90,134 giL respectivamente. El rendimiento disminuy al au- biomasa vs tiempo result ser la del modelo logistico, con un
mentar la concentracin inicial de lactosa. coeficiente de regresin de 0,998.
La FIG. 2 muestra la produccin de cido lctico. Estas Donde:
curvas muestran que la mayor concentracin de cido se ob-
tiene Dara el suero des~roteinizadosuolementado sin adicin
- pmaxpara 27,98 ~ I L(iactosa) = 0,553 h.'

de lactosa, el rendimiento de cido lctico fue de un 10,3%, - pmax para 49,89 gil (lactosa) = 0,884 h.'
expresado como gramos de cido lctico producido por gra-
mos de sustrato consumido: el rendimiento en el suero despro-
- O8r,,
,1-. nara - --
-. 9n,fid
- . nll --
= - llsctnam\
-,= n-,731 --
. .h.'.
teinizado suplementado con lactosa a 90,64 glL fue de 5,2% y En la FIG. 4 se obsewa el ajuste de los puntos logrado
el del suero des~roteinizadodiluido fue de 1.3%. por esta ecuacin. La linea continua es la representacin del
-
modelo de los datos experimentales. El modelo ioastico fue
En la FIG. 3 Se Puede observar que a valor de capaz de modelar el crecimiento desde el inicio hasta el final
concentracin inicial de sustrato, mayor es la cantidad consu- de lafermentacin, ventaja que no presentan algunas ecuacio-
mida y tambin mayor es la velocidad de consumo de sustra- nes comunes, las cuales slo pueden modelar el perodo de
to. crecimiento exponencial.
 Revista Cientfica, FCV-LUZ 1Vol. XI, N" 1, 53-59, 2001

Tiempo

FIGURA 3. CINETICA DE CONSUMO DE LACTOSA.

Datos experimentales So= 29,98 g1L

Datos experimentales So= 49,89 g/L
FIGURA 4. SIMULACIN POR
5

-
Tiempo (h)

A
1o

Simulacin del modelo

Datos experimentales So= 90,64 g/L
EL MODELO LoG~STICODE LOS DATOS DE BIOMASA.
El pmaxqueda la ecuacin para cada caso, representa la res, slo es vlida en el perodo de produccin exponencial de
mxima velocidad especifica de crecimiento del microorganis- cido lctico.
mo a esas condiciones de crecimiento P].
El modelo de Monod no present ajustes individuales P = a(x-xo)+~I;x(,,dt+po
satisfactorios para cada cuiva de biomasa vs tiempo.
Donde:
La ecuacin de Luedekin y Piret fue exitosa en represen-
tar los datos de una fermentacin individual, dando una buena - Para So = 27,98 g1L a = 5,855'10.' y p =-1,835"10"
correlacin (coeficiente de correlacin igual a 0,999) para la - Para So = 49,89 gR a =-1,348^10" y p = 1,429*10"
fermentacin con So = 27,98 glL. Esta ecuacin mostr ser
aolicable slo en la zona de crecimiento exponencial. - Para So = 90,64 glL a = 4,624*10" y = 2,401*10-~

La ecuacin de Amrane y Prigent no dio un resultado sa-
tisfactorio.
En relacin a los datos de produccin de cido lctico vs
tiempo, la ecuacin que ajust mejor los datos fue la de Lue-
dekin y piret. ~~t~ ecuacin, igualque la ecuacin que ajus.
ta la produccin de biomasa propuesta por los mismos auto-
En esta ecuacin, el trmino jiX(t)dt fue evaluado nu-
mricamente. Para todos los ajustes el coeficiente de correla-
cin fue mayor 0,999.
En la FIG. 5 se observa el ajuste de los puntos logrado
por la ecuacin de Luedekin y Piret. La lnea continua repre-
senta convenientemente las curvas de cido Ictico vs tiempo.
Cintica de la produccin de cido Ictiw por fermentacin1 Jakymec, M. y col.
1.5
'.O
Datos experimentales So=l
A Datos experimentales So=3
o 4
O 4
Tiempo (h)
+ Datos experimentales So= 27,89 giL
A Datos experimentales So= 90,64 giL
FIGURA 6. SIMULACI~N DEL MODELO DE HANSON Y TSAO PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO.
La ecuacin ajusta bien la zona exponencial de produccin de
cido, pero no es muy efectiva para ajustar la produccin en la
fase de adaptacin y en la etapa estacionaria.
En los modelos de produccin de cido Ictico sencillo y
de Hanson y Tsao fueron efectivos en la zona de produccin
exponencial de cido, al igual que la ecuacin de Luedekin y
Piret, pero esta ltima present un mejor coeficiente de corre-
lacin. El modelo logstica para la produccin de cido lctico
se desplaz en el tiempo. Este modelo no tiene un parmetro
para representar el tiempo de adaptacin, sin embargo ajust
bien la produccin de biomasa, porque el perodo de adapta-
cin fue de una sola hora, mientras que para cido Ictico fue
de dos horas.
En cuanto a la parte de consumo de sustrato, la ecua-
cin que mejor ajust los datos de concentracin de sustrato
vs tiempo fue el modelo propuesto por Hanson y Tsao. Sin
i Datos experimentales So=2
-a- Simulacin del modelo
8 12
i Datos experimentales So= 4939 g L
4Simulacin del modelo
embargo, las curvas ms comunes, con la excepcin del mo-
delo de Monod, ajustaron relativamente bien los datos experi-
mentales, dando resultados particularmente buenos para la
concentracin inicial de sustrato de 49,89 glL.
(Ecuacin de Hanson y Tsao)
Donde:
- Para So = 27,913 g1L Ks = 9,42*10-~U g h
- Para So = 49,89 g/L Ks = 1,27*10-~Ug h
- Para So = 90,64 glL Ks = 1,39*10-~U g h
En la FIG. 6 se observa el ajuste que realiza la ecuacin
de Hanson y Tsao a los puntos de concentracin de sustrato
vs tiempo. En esta ecuacin, el trmino nuevamente fue eva-
luado numricamente.

Los modelos obtenidos simulan efectivamente los datos
experimentales, sin embargo la simulacin es particularmente
buena para el suero sin suplementar con lactosa y sin diluir
(So = 49,89 gfL), y considerando que los rendimientos en ci-
do y en biomasa son mejores para este caso que para el suero
suplementado con lactosa, podemos asegurar que tal suple-
mentacin no fue necesaria. Tambin se observ que cuando
el proceso de crecimiento termina, cesan tambin el consumo
de lactosa y la produccin de cido Ictico.
CONCLUSIONES
Se obtuvo un mximo rendimiento de cido Ictico
(10,3%) para el suero de leche desproteinizado sin suplemen-
tar con lactosa.
La produccin del cido Ictico origina una disminucin
del pH en el medio; este bajo pH afecta el crecimiento, el con-
sumo y la misma produccin, lo que explica el comportamiento
del Lactobacillus bulgaricus durante la fermentacin.
La concentracin inicial de lactosa no afecta la duracin
de la fermentacin.
El Lactobacillus bulgaricus creci con un alto rendi-
miento en el suero de leche. Este rendimiento disminuy al
incrementar la concentracin de lactosa en el medio. El mi-
croorganismo no fue capaz de consumir totalmente la lactosa
del medio.
Las ecuaciones que mejor representan el proceso de
fermentacin de suero de leche fueron:
- Modelo Logstico para produccin de biomasa.
Para So = 27,98 gIL,, ,p = 0,553 h.'
Para So = 49,89 g/L, pmax= 0,884 h.'
Para So = 90,64 glL, p, = 0,723 h.'
- Luedekin y Piret para produccin de cido Ictico
Para So = 27,98 gfL a = 5,855'10" y B = -1,835*10"
Para So = 49,89 gfL a =-1,348"1o2 y p = 1 ,429"102
Para So = 90,64 giL a = 4,624*102 y 0 = 2,401*10-~
- Hanson y Tsao para consumo de sustrato.
Revista Cientfica, FCV-LUZ1Vol. XI, N", 53-59, 2001
Para So = 27,98 glL Ks = 9,42*10-~Ug h
Para So = 49,89 glL Ks = 1,27*1 Ug h
Para So = 90,64 g/L Ks = 1,39*t Ug h
[l] AMRANE, A,; PRIGENT, Y. lnfluence of Media Composi-
tion on Lactic Acid Production rate fro Whey by Lactoba-
cillus helveticus. Biotechnol. Lett. 15 (3): 239-244.
1993.
[2] AMRANE, A,; PRIGENT, Y. Mathematical Model for Lac-
tic Acid Production from Lactose in Batch Culture: Model
development and simulation. J. Chem. Tech. Blotech-
nol. 60: 241-246. 1994.
[3] A.O.A.C. W i c i a l Methods of Analysis. 1 5 edition.
~ As-
sociation of Official Analytical Chemists. Arlington, Vir-
ginia. 1990.
[4] DUBOIS, M.; GILLES, A,; HAMILTON, J.K.;REBERS,
P.A.; SMITH, F. Colorimetric Method for determination of
sugars and related substances. Anal. Chem. 28 (3):
350-356.1 956.
[5] MERCIER, P.; YERUSHALMI, L.; ROULEAU, D.; DO-
CHAIN, D. Kinetics of Lactic Acid Fermentation on Glu-
cose and Corn by Lactobacillus arnylophillus. J. Chem.
Tech. Biotechnol. 55: 111-121. 1992.
[6] Ministerio de Agricultura y Cria. Anuario Estadstico.
Regin Zuliana. 1997.
[7] MORESI, M.; TRUNFIO, A,; PARENTE, E. Kinetic of
Continuous Whey Fermentation by Kluyverornyces fragi-
lis. J. Chem. Tech. Biotechnol. 49: 205-222. 1990.
PIRT, S. Principies of Mlcrobe and Cell Cultivatlon.
[S]
1'' edition. Blackwell Scientific Publications London: 274
pp 1975.
[9] ROY, D.; LEDUY, A,; BOULET, J. Kinetic of growth and
lactic acid production from whey permeate by Lactobacil-
lus helveticus. Chem. Eng. 65 (4): 597-603. 1987.
[lo] SEVGI, O.; MUSTAFA, O. Effects of Substrate Concen-
tration on Growth and Lactic Acid Production by Mixed
Cultures of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus
therrnophilus. J. Chem. Tech. Biotechnol. 54: 57-61.
1992.
[Il] STEVERINK, A. Gas-chromatographic Method for the
Determination of Volatile Fatty Acids (Cl-C,) and Lactic
Acid. Analyst, February, 1984.