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FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGIA MICROBIOLOGIA
Integrantes:
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Tacna Per
2017
INTRODUCCION
Contenido
CAPITULO I ..................................................................................................................................... 4
1. Qu es un microorganismo transgnico (MGM)? ................................................................. 4
2. Antecedentes de microorganismos transgnicos ..................................................................... 4
3. Creacin de microorganismos transgnicos ............................................................................ 5
4. Etapas en la clonacin de genes: ............................................................................................. 6
4.1. Obtencin y modificacin del gen de inters: ................................................................. 6
4.2. Eleccin del vector .......................................................................................................... 8
4.3. Recombinacin ................................................................................................................ 9
4.4. Introduccin del DNA Recombinante ........................................................................... 10
4.5. Deteccin del gen en las colonias (seleccin) ............................................................... 12
5. Aplicaciones de los microorganismos transgnicos en la medicina ...................................... 13
CAPITULO II.................................................................................................................................. 15
1. Produccin de insulina en E. Coli (intro) .............................................................................. 15
2. Insercin del gen de la insulina ............................................................................................. 15
2.1. La insulina: .................................................................................................................... 15
2.2. Gen de la insulina: ......................................................................................................... 18
3. Procedimiento ....................................................................................................................... 19
3.1. Corte del ADN: ............................................................................................................. 19
3.2. Ligamiento de ADN: ..................................................................................................... 20
3.3. Vector recombinante: .................................................................................................... 21
3.4. Formacin de colonias: ................................................................................................. 23
4. Medio de cultivo: .................................................................................................................. 24
5. Cultivo de crecimiento de E. coli.- ........................................................................................ 25
Capitulo III ...................................................................................................................................... 27
Conclusiones .................................................................................................................................... 29
Bibliografa ....................................................................................................................................... 29
CAPITULO I
Mtodo directo:
Se localiza la clula requerida, se aisla el ADN completo y este es
roto mediante endonucleasas de restriccin. Cada fragmento es
clonado en un vector e introducido en una clula compatible.
Finalmente se obtendr una genoteca, que contendr todo el
genoma de la clula. De todas las clulas que contienen plsmidos
con fragmentos del genoma donador, slo una tiene el gen de
inters. Dado que las endonucleasas de restriccin cortan al azar,
es probable que el fragmento este el gen de inters. (IES-Manuel
Romero, 2012)
Retrotranscripcion:
Se usa una enzima sobre el RNAm que est en el citoplasma y ya
ha sido modificado, se eliminan las secuencias no codificantes;
este primer transcrito ya es completo, una vez que sale del ncleo
solo tenemos la secuencia modificada, flanqueado por el promotor
y el terminador; al obtener este RNAm maduro solo se obtiene el
material gentico que codifica; solo es de inters la secuencia a
traducir.
El RNAm maduro al entrar en contacto con la RT
(Del retrovirus) produce el DNA, primero una cadena y luego se
copia a s misma y destruye el RNA; as se obtendr como una U,
una cadena nica de DNA con dos cadenas complementarias y una
cadena sencilla, esta se romper con una nucleasa de cadena
sencilla. (IES-Manuel Romero, 2012)
PCR
Esta tcnica "in vitro" imita la habilidad natural de la clula de
duplicar el ADN.
Usada para crear un gran nmero de copias de un segmento de
ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin, apareamiento
con cebadores y extensin por una ADN polimerasa
termoresistente.
Tcnica enzimtica tambin, en la que necesitamos saber solo
para conocer un gen un primer (Secuencia de inicio) y la
secuencia final
Se necesita una mezcla de reaccin que contenga Taq
polimerasa, cebadores o primers (marcan que se va a
seleccionar) y los nucletidos trifosfato. El aparato usado es el
termociclador. (Future-Medicos, 210)
Figura 01: Corte de ADN cromosmico con una
endonucleasa de restriccin
La liberacin de insulina por la clula beta se presenta en dos fases. La primera fase
o fase temprana se inicia al primer minuto posterior a la estimulacin por glucosa, su
pico mximo es entre 3 a 5 minutos, tiene una duracin mxima de 10 minutos y
representa la insulina almacenada en los grnulos de la clula beta. La segunda fase
o fase tarda inicia en forma lenta (a los 10 minutos), tiene una duracin de 4 horas (o
mientras persista la hiperglucemia), tiene una produccin continua en forma de
meseta con descenso lento y representa la insulina de nueva sntesis y produccin.
Para que finalmente los grnulos se fusionan a la membrana celular y son secretados
por exocitosis con participacin del calcio como activador de los microtbulos, K, y
Zn. La insulina en forma de monmeros, junto al pptido C, estos son difundidos
hacia los capilares en forma equimolar.
(Figura 03)
2.2.Gen de la insulina:
Ubicacin del gen de la insulina se encuentra en el gen 11 del cromosoma humano,
la proinsulina, precursora de la insulina, es codificada por el gen INS, localizado
en el cromosoma 11p15.5. (Figura 04)
Figura 04
3.2.Ligamiento de ADN:
Estos fragmentos se ligan a molculas de plsmido que han sido cortadas con la
misma enzima de restriccin, obtenindose un vector recombinante.
La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de
reconocimiento, dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen
secuencias nucleotdicas idnticas, son pegajosas (cohesivas), ya que pueden unirse
a colas complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrgeno
(Figura 06). Si molculas de DNA de diferente origen comparten los mismos sitios
de reconocimiento palindrmicos, ambas tendrn colas complementarias de cadena
sencilla cuando se traten con una endonucleasa de restriccin. Si estos fragmentos se
ponen juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de DNA de distinto
origen pueden formar molculas recombinantes estableciendo puentes de hidrgeno
entre los extremos cohesivos. Luego se utiliza la enzima DNA ligasa para unir
covalentemente los esqueletos azcar-fosfato de los dos fragmentos, producindose
as una molcula de DNA recombinante.
(Figura 06)
Figura 06.- Para formar molculas de DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes con
EcoRI y se mezcla para que se unan formando molculas recombinantes. Despus se utiliza la
enzima DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de DNA recombinante.
3.3.Vector recombinante:
El vector recombinante se transfiere a clulas husped bacteriano, generalmente por
transformacin, un proceso en el que las molculas de DNA cruzan la membrana de
la clula husped transfirindose a su interior.
(Figura 07)
(Figura 08)
3.4.Formacin de colonias:
La clula husped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formar colonias.
Puesto que las clulas de cada una de las colonias provienen de una sola clula
inicial, todas las clulas de la colonia, y los plsmidos que contienen, son
genticamente idnticas, o clones. Se rastrean las colonias para identificar las que
han incorporado el plsmido recombinante. Los vectores plasmdicos penetran en
las clulas de E. coli mediante un proceso de transformacin inducido por cloruro
clcico o mediante electroporacin a 3-24 kV /cm, que es eficaz en bacterias tanto
Gram-positivas como Gram-negativas.
Un paso importante para alcanzar altas productividades consiste en la seleccin de la
cepa de produccin adecuada. Para ello deben considerarse aspectos cinticos, el
genotipo y el fenotipo de las cepas. En general se buscan cepas con baja tasa de
mutacin o de insercin de secuencias provenientes del plsmido. Las cepas derivadas
de E. coli K-12 y E. coli B son las mas empleadas. Los avances en el conocimiento
de la fisiologa de E. coli y en el desarrollo de herramientas moleculares han permitido
la obtencin de cepas diseadas especficamente para la produccin de protena
recombinante. En particular, la cepa BL21 es preferida en el mbito industrial. (Phue
y col., 2005).
(R. Murray, S, Rothensal, & A,
Pfaller, 2013)
Despus de asegurarse de que el
gen transferido se expresa, se
producen grandes cantidades de la
bacteria transformada, y la
protena humana se recupera y se
purifica.
(Contretas Sanchez, 2008) (L.
Lara, 2011)
4. Medio de cultivo:
El medio de cultivo debe estar balanceado para la produccin de biomasa y PR. Para ello,
debe tomarse en cuenta la composicin de la biomasa.
Los principales componentes incluyen la fuente de carbono, nitrgeno, fosforo, azufre,
potasio, y magnesio. Es necesario tambin incluir cofactores enzimticos como Mb, Co,
Ni, Fe, Ca, Cu, Mn, entre otros. Los factores de crecimiento como la tiamina son
necesarios para un adecuado crecimiento. Aunque en cultivos en matraz agitado se
agregan mono y di fosfato de potasio para formar un amortiguador de pH, esto no es
necesario en cultivos en biorreactor, en los que el pH es controlado mediante la adicin
de acido o base. Tambin debe observarse que varios de los componentes del medio
pueden resultar txicos a ciertas concentraciones; por ejemplo, el amonio es toxico a partir
de 3 g/L (Shiloach y Fass, 2005). Esta cantidad de amonio puede ser limitante para cultivos
de alta densidad celular si se agrega en su totalidad al inicio del cultivo. Sin embargo, el
pH puede controlarse con hidrxido de amonio, que adems de servir como base es una
fuente de amonio fcilmente asimilable, reduciendo con ello la acumulacin de iones
amonio. El medio de cultivo puede contener fuentes complejas de nitrgeno, como
extracto de levadura o casaminoacidos. No obstante, existe una clara tendencia a eliminar
el uso de componentes complejos, ya que no permiten un control adecuado de la fisiologa,
y reducen la reproducibilidad del cultivo.
Tomando en cuenta un rendimiento de biomasa tpico de 0.5 g biomasa/g glucosa, se
requeriran al menos 200 g/L de glucosa para llegar a una concentracin celular de 100
g/L. La glucosa es toxica a concentraciones superiores a los 50 g/L, por lo que no puede
emplearse una concentracin de glucosa inicial tan alta (Shiloach y Fass, 2005; Lara y
col., 2008).
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo
de bacteria. Es muy util porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas.
Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se
distinguen mejor las colonias pequeas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el
lquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difcilmente observables. El
agar nutritivo contiene normalmente (w/v).
0.5 % Peptona
0.3 % extracto de carne/extracto de levadura
1.5 % agar 0.5% NaCl
Agua destilada
pH casi neutro (6.8) a 25 C.
Hoy en da, prcticamente todos los diabticos son tratados con algn tipo de insulina
recombinante, pues se han conseguido numerosos anlogos con diferentes cualidades (de
efecto retardado, ms potente).
(Figura 10)
Insulina
Hormona de crecimiento
Desde 1997, aplicando la tecnologa de ADN recombinante, BioSidus produce hGH (hormonas
decrecimiento) a partir de la fermentacin de bacterias que poseen el gen humano para
dichaprotena. (Castro, Vera, & Paez, 2013)
Esto motiv que, con posterioridad, otras compaas farmacuticas pudieran comercializar sin
problemas de patentes la verdadera hGH que se produca en E. coli mediante un nuevo proceso
que implicaba la secrecin de la hormona al periplasma bacteriano y evitaba la presencia de la
metionina N-terminal.
Vacuna anti-hepatitis B
La primera vacuna recombinante que se aprob para su uso farmacutico fue la vacuna contra el
virus de la hepatitis B. Hasta entonces la vacunacin contra esta enfermedad se haca con virus
atenuados. La vacuna recombinante se produce en levaduras recombinantes que portan un gen
que codifica una protena de la cubierta del virus. Algunas toxinas que se utilizan para vacunas
tambin se obtienen actualmente mediante Ingeniera Gentica. La categora ms importante de
los productos biofarmacuticos que estn actualmente en desarrollo es el de las vacunas, con casi
100 productos diferentes. La mayora se estn desarrollando para tratar o prevenir el cncer. El
resto se estn desarrollando contra el SIDA y diferentes infecciones, fundamentalmente del
aparato respiratorio. (Garcia, 2010)
Los organismos transgnicos (ratn, cabra, pollo, plantas) y las clulas recombinantes de mamfero
(CHO, NS0) son los ms adecuados para producir anticuerpos completos. Las bacterias slo
permiten obtener de forma muy eficiente fragmentos de anticuerpos. Una alternativa para
producir anticuerpos humanos completos es utilizar lo que se denomina presentacin en
bacterifagos (phage display). El producto inicial es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) en el
que un pequeo polipptido se utiliza para unir las regiones variables de las cadenas ligera y
pesada del anticuerpo, o un fragmento Fab a partir de los cuales se debe reconstruir un anticuerpo
completo y producirlo mediante un sistema de expresin idneo. (Garcia, 2010)
TNF-
El Factor de Necrosis Tumoral alfa (FNT-) es una citoquina pro-inflamatoria y de defensa del
husped, cuya produccin exagerada lleva a enfermedades inflamatorias crnicas.
El FNT- fue nombrado as por su habilidad para destruir clulas tumorales y causar necrosis
hemorrgica en tumores en ratones. (Vargas, 2009)
Son muchas las protenas de inters teraputico que se estn produciendo por tecnologas
recombinantes y que no son fciles de clasificar entre los anteriores epgrafes. Un caso tpico es el
TNF (factor de necrosis tumoral) que es una citotoxina producida de forma natural por macrfagos
activados que es capaz de provocar la muerte de los tumores.
Uricasa
El papel de albmina como una molcula portadora y su naturaleza inerte son las propiedades
deseables para ser usado como un estabilizador y transportador de polipptidos. El uso de
albmina como un componente de una protena de fusin para otras protenas estabilizadoras ha
sido descubierto en WO 93/15199, WO 93/15200, y EP 413 622. El uso de fragmentos N - terminal
de HSA para fusiones de polipptidos tambin ha sido descubierto (EP 399 666).
La fusin para dichos polipptidos es lograda por manipulacin gentica, de forma que el ADN que
codifica para HSA, o un fragmento de ella, es unido al ADN que codifica para dicho polipptido. Un
hospedero apropiado es luego transformado o transfectado con la secuencia del nucletido
fusionado, tal arreglo sobre un plsmido apropiado para expresar un polipptido de fusin.
Nomura y col. (1995) intent expresar la apolipoprotena E humana en S. cerevisiae como una
protena de fusin con HSA o fragmentos de HSA, usando una pre-secuencia de HSA por secrecin
directa
http://www.espatentes.com/pdf/2264146_t3.pdf
PEG-L-asparaginasa Leucemia linfoblastoide Oncaspar (Enzon, Inc., Rhone- Poulenc Rorer) E. coli
1994
Conclusiones
Bibliografa
Brizzi, M. (25 de Junio de 2013). Ingenieria gnetica y biotecnologia . Obtenido de Microorganismos
geneticos: http://ingeneticaybiotecnologia.blogspot.pe/2013/06/microorganismos-
transgenicos.html
Curtis, H., Barnes, N., Schnek, A., & Flores, G. (2008). Biologia. Chile: Editorial Medica
Panamericana.
Herveg, J. P., & Barcia, M. (Abril de 2006). Genemol. Recuperado el 23 de Diciembre de 2016, de
Universidad catholica de Louvain: http://genemol.org/biomolespa/organismo-
transgenicos/microorganismo.html
R. Murray, P., S, Rothensal, K., & A, Pfaller, M. (2013). Microbiologia medica. Barcelona: El sevier.
Rodriguez, E., Zumalacarregui, J., Otero, A., Calleja, A., Fuente, d. l., & Elias. (12 de Enero de 2008).
DATATECA- Universidad Nacional abierta y a distancia. Obtenido de Transgenicos en
biotecnologia: Microoganismos:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203022/CONTENIDO_EN_LINEA/OMG%20FINAL/
leccin_15_transgnicos_en_biotecnologa_microorganismos.html