ELECTROFOREZA N GEL DE POLIACRILAMID N SISTEM DENATURANT

- SDS-PAGE -

Separarea macromoleculelor n cmp electric se numete electroforeza. Aceasta

este o metod fizico-chimic, analitic i preparativ care se bazeaz pe fenomenul
migrrii unor particule ncrcate electric, ntr-un mediu lichid sau solid, sub aciunea
unui cmp electric extern. Metod foarte comun de separare a proteinelor prin
electroforez utilizeaz gelul de poliacrilamid dsicontinuu ca suport i dodecil sulfat de
sodiu (SDS) pentru a denatura proteinele. Prezena SDS, un detergent anionic, n
tamponul de electroforez i n gelul de poliacrilamid, confer moleculelor proteice o
sarcin electric net negativ i interaciunea SDS protein determin anularea
conformaiei spaiale a proteinei i disocierea subunitilor (denaturarea proteinei). Un
lan polipeptidic leag o cantitate de SDS proporional cu masa sa molecular.
Sarcinile negative ale SDS sunt atrase puternic ctre anod (electrodul ncrcat pozitiv)
ntr-un cmp electric.
Gelul de poliacrilamid este un gel cu proprieti optime de separare
electroforetic, stabil, transparent i flexibil. Acest gel se obine prin polimerizarea
acrilamidei n prezena N,N- metilen-bisacrilamidei (agent de reticulare), a persulfatului
de amoniu (APS) ca iniiator al polimerizrii i a N,N,N,N- tetrametiletilendiaminei
(TEMED) drept catalizator al reaciei de polimerizare.
Gelul de poliacrilamid reprezint o reea tridimensional format din lanuri
liniare legate covalent ntre ele prin intermediul agentului de reticulare. Practic, gelul de
poliacrilamid poate fi considerat o sit molecular n care mrimea porilor depinde de
concentraiile iniiale ale monomerilor i de condiiile n care se desfoar reacia de
polimerizare (sistem catalitic, temperatur). Termenul de mrime a porului semnific, de
fapt, rezistena opus de reeaua tridimensional a gelului la deplasarea moleculelor
(dimensiunile macromoleculelor proteice sunt substanial mai mici dect dimensiunile
fibrelor din constituia gelului). Astfel, se pot separa molecule cu mas molecular
cuprins ntre cteva sute i cteva milioane de daltoni.
Gelul de poliacrilamid limitea moleculele mai mari s migreze la fel de rapid ca
moleculele mai mici. Datorit faptului c raportul sarcin-mas este aproape acelai
ntre polipeptidele denaturate cu SDS, separarea final a proteinelor depinde aproape
in totalitate de diferenele ntre masele moleculare ale polipeptidelor. ntr-un gel cu
densitatea uniform, distana de migrare relativ a unei proteine (Rf) este invers
proporional cu logartmul masei sale. Daca proteine cu mase cunoscute sunt migrate in
acelai timp cu proteine necunoscute, relaia dintre Rf i mas poate fi reprezentat i
masele necunoscute pot fi astfel estimate.
Separarea proteinelor prin SDS-PAGE poate fi utilizat pentru a estima
masa molecular relativ, pentru a determina abundena relativ a proteinelor majore
dintr-o prob, i pentru a determina distribuia proteinelor n cadrul fraciilor colectate.
De asemenea, puritatea unei proteine poate fi determinat prin aceast tehnic,
urmrindu-se progresul procesului de fractionare i purificare a proteinei respective.
Diferite metode de colorare a gelurilor pot fi folosite pentru a detecta proteine rare sau
pentru a pune n eviden anumite izoforme. Tehnici specializate, precum Western
blotting i electroforez bi-dimensional prezint ca etap intermediar separarea prin
SDS-PAGE.
Protocolul de lucru n vederea turnrii gelului de poliacrilamid are urmtoarele
etape de lucru:
1
Prepararea gelului de poliacrilamid
Compoziia necesar obinerii gelului de interes se toarn ntr-un sistem format
din dou placi verticale de sticl ntre care se fixeaz un spaiator de grosime.
Se utilizeaz un sistemul bifazic de geluri de poliacrilamid, ce permite
separarea proteinelor cu mas molecular cuprins ntre 40 i 200 kDa. La partea
inferioar a sistemului se gsete gelul de separare (Running gel). Acest gel permite
separarea moleculelor proteice pe baza masei lor moleculare. n funcie de masa
molecular a proteinei de interes, ce urmeaz a fi separat, se alege porozitatea
gelului, care este dat de raportul dintre acrilamid i bisacrilamid. Astfel, pentru
proteine cu mas molecular mare se aleg geluri cu porozitate cuprinse ntre 6-8%, iar
pentru cele cu mase moleculare mici, geluri de 10-15%.
La partea superioar se afl gelul de concentrare (Stacking gel). Gelul de
concentare are aceleai componente ca i gelul de separare. Diferena este dat de
porozitatea gelului, care n acest caz este ntre 3-4.5% i pH = 8,8 fa de 6,8 ct este
pH gelului de separare.
Nivelul soluiei, care prin polimerizare va forma gelul de separare, trebuie s fie
la 1 cm sub dinii pieptnului, pentru a permite concentrarea probei aplicat pe godeu.
La partea superioar se introduce pieptenele pentru formerea godeurilor n gelul
de concentrare n care se vor pipeta probele ce vor fi separate electroforetic.
Polimerizarea este complet dup 30 minute.

Reactivi i aparatura pentru prepararea gelului

Tampon Tris/HCl pH 8,8 SDS 0,4%: 9,08g Tris + 0,2g SDS/50ml 1,5M
Tampon Tris/HCl pH 6,8 SDS 0,4%: 3,02g Tris + 0,2g SDS/50ml 0,5M
Gelul de migrare 10% Gel de concentrare 4,5%

PAA 30% - 2,93 ml PAA 30% - 0,75 ml

Tris/HCl/SDS pH=8,8 - 2,31 ml Tris/HCl/SDS pH=6,8 - 1,245 ml
A.D. - 3,5 ml A.D. - 2,85 ml
APS 10% - 50 ul APS 10% - 15 ul
TEMED - 5 ul TEMED - 6 ul

Protocol de lucru
Se pregatete primul gel de separare (10%) conform tabelului de mai sus
Se toarn gelul ntre cele dou geamuri ale aparatului de electroforez, cu 1
cm mai jos de marginea superioar a geamurilor
Dupa ce s-a turnat gelul, deasupra se puna ap sau butanol ca s nu se
evapore.
Se las la polimerizat 30 de minute
Dupa ce gelul a polimerizat se scoate apa MilliQ dintre geamuri prin
rsturnare i cu ajutorul unei hrtii de filtru
Se toarn pn sus cel de-al doilea gel de separare (4,5%) conform tabelului
de mai sus
Se pune pieptnul pentru formarea godeurilor i se are n vedere s nu existe
bule. Se las la polimerizat.
Dup polimerizarea gelului de concentrare ansamblul de geamuri ntre care
se afl gelul mpreun cu suportul de susinere se infoar n folie de plastic

2
 ntr-un ervetel umed pentru a se evita deshidratarea gelului i se pstreaz
la frigider pn a doua zi
A doua zi se desface folia de plastic din jurul geamurilor
Se indeparteaz pieptenele iar n godeurile formate se pune tampon de
electroforez
Se efectueaz o premigrare n absena probelor timp de 30 minute la voltaje
constat 70 V n tamponul de electroforez
Probele de lucru sunt omogenizate i amestecate cu tamponul de ncrcare
5X. Apoi sunt ncrcate n volum de 25 l/godeu cu ajutorul unei seringi
Hamilton.
n cuva de migrare este turnat un volum de 1 litru din soluia tampon de
electroforez (pH 8,3) conine:
- Tris 0,025 M (FW=121,1),
- glicin 0,192 M (FW=75,07),
- SDS 0,1%.
Migrarea are loc pn cnd indicatorul albastru de bromfenol ajunge la partea
inferioar a gelului. Timpul de migrare este n general 1h i 30 minute la voltaj
constant V=90.

Prepararea probelor
Probele se dilueaz cu tamponul de prob (de 5 ori). Acest tampon are n
compoziia sa EDTA (un chelator de ioni divaleni, reducnd activitatea enzimelor
proteolitice care necesit ioni de calciu i magneziu ca i cofactori), SDS (acre disrupe
structura bi- i tridimensional a proteinelor), glicerol (permite crearea unei densiti
adecvate probei pentru a putea fi aplicat pe godeu, adic face proba mai dens dect
tamponul de migrare, i deci proba va rmne pe fundul godeului n loc s pluteasc),
albastru de bromfenol (pentru urmrirea progresului electroforezei pe baza formrii
frontului de migrare) i -mercaptoetanol (pentru ruperea punilor disulfurice din
structura proteinei i migrarea ei n uniti monomerice naintea ncrcrii probelor pe
gel, acestea fiind denaturate termic la 100 0C, timp de 3 minute). ncrcarea probelor se
face cu o microsering Hamilton 40l/godeu.

Tamponul pentru prob (5X) are urmatoarea compoziie:

- Tris - HCl 0,5 M (pH 6,8)
- SDS 10%,
- glicerol 50% (v/v),
- mercaptoetanol 25% (v/v),
- albastru de bromfenol 0,03%.

Migarea proteinelor.
Dup migrare gelul este imersat n soluia de colorare ce conine 0,2%
Coomassie Blue R-250, 40% metanol i 10% acid acetic timp de o or cu agitare.
Decolorarea gelului se realizeaz cu soluie coninnd 20% acid acetic i 40% metanol.
Gelurile sunt fotografiate cu un sistem de video-documentare/camer foto i benzile
sunt densitometrate cu programe software adecvate (GelQuant.NET, ImageLab,
ImageJ).