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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE CIENCIAS QUMICAS

ESCUELA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA


AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

Prctica No 4

REACCIONES DE CARACTERIZACIN DE PROTENAS.

DATOS GENERALES

Alumnos:

Cinthia Padilla (2550)

Leyster Almeida (2551)

Michelle Medina (2579)

Nota Informe:................... Nota Defensa:..................


OBJETIVOS.-

Objetivos Generales.-

Identificar protenas por medio de reacciones de caracterizacin

Objetivos Especficos.-

1. Establecer la presencia de carbono, hidrogeno, oxigeno, azufre y nitrgeno utilizando


pruebas sencillas.
2. Verificar la solubilidad de las protenas utilizando diferentes soluciones.
3. Evidenciar la presencia de determinados aminocidos en las protenas utilizando reacciones
especficas de coloracin.

TEORA

PROTENAS

Las protenas son biomolculas formadas bsicamente por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno.
Pueden adems contener azufre y en algunos tipos de protenas, fsforo, hierro, magnesio y cobre
entre otros elementos.

Las protenas son cadenas de aminocidos que se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional
que les permite llevar a cabo miles de funciones. Las protenas estn codificadas en el material
gentico de cada organismo, donde se especifica su secuencia de aminocidos, y luego son
sintetizadas por los ribosomas.

Las protenas desempean un papel fundamental en los seres vivos y son las biomolculas ms
verstiles y ms diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre ellas
funciones estructurales, enzimticas, transportadora, entre otras. (Luque, V. 2017)

Las protenas son identificadas por medio de reacciones de coagulacin (desnaturacin), de


precipitacin y de coloracin.

1. PROPIEDAD DE SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS

La solubilidad de las protenas depende, no solo de la variedad de grupos residuales de cidos


aminados y de la manera en que se pliega la cadena peptdica, sino tambin de las propiedades del
sistema solvente en el cual se encuentra la protena. Los cuatros factores principales que afectan la
solubilidad se relacionan todos con las estructuras secundaria y terciaria de las protenas.

Estos factores son: a) la fuerza inica, b) el pH, c) la temperatura, y d) la constante dielctrica del
solvente. Naturalmente, la hidrlisis de los enlaces peptdicos para valores extremos de pH tambin
modifica la estructura primaria.

2. REACCIONES DE COLORACIN
Las reacciones de coloracin se deben a la presencia de determinados aminocidos o de ciertos
grupos amnicos en la molcula proteica. Por este motivo son tambin llamadas reacciones
estructurales

2.1 REACCIN XANTOPROTEICA

El ensayo recibe el nombre del griego xanthos (amarillo). Tratando una disolucin de protena con
cido ntrico concentrado, la protena precipita (color blanco) y al calentar se disuelve dando color
amarillo. El color amarillo se debe a la formacin de nitrocompuestos aromticos; por tanto, se
forma debido a la presencia de anillos aromticos en la molcula proteica. Si se neutraliza con un
lcali el color pasa aanaranjado oscuro En las protenas los constituyentes responsables para la
reaccin son la tirosina, el triptfano y la fenilalanina.

2.2 REACCIN DE MILLON

El reactivo Millon es una mezcla de nitrato y nitrito mercrico, obtenido disolviendo mercurio
metlico en cido ntrico. Aadido a una disolucin de protena, sta precipita y al calentar el
precipitado toma color rojo ladrillo.

La caracterstica de la reaccin es el cambio de color del precipitado. El precipitado blanco inicial


es debido a la sal de mercurio (metal pesado) del reactivo. La reaccin se da con substancias
aromticas portadoras de grupos fenlicos. En las protenas, el constituyente responsable es la
tirosina (debido al grupo hidroxifenilo). El pigmento formado parece ser una mezcla de sales
complejas de mercurio con derivados 3- nitroso-o-benzoquinnicos.

2.3 REACCIN HOPKINS COLE (REACCIN GLIOXILICA)

Si se aade a una disolucin de protena unas gotas de disolucin de cido glioxlico, seguidamente
se lleva al fondo una capa de cido sulfrico concentrado, se forma un anillo violeta en la unin de
los dos lquidos, si existe triptfano en la protena investigada puesto que el grupo indol es el
determinante del resultado positivo del ensayo al condensarse al cido glioxlico.

2.4 REACCIN DEL AZUFRE

El azufre de la molcula proteica, por la accin del lcali y del calor, se convierte en sulfuro, que,
por la presencia de la sal de plomo, da como resultado el sulfuro de plomo (precipitado de color
negro). Los aminocidos responsables son cisteina, cistina, metionina.

2.5 REACCIN DE BIURET

Esta reaccin la producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos ya que se debe a la
presencia del enlace peptdico -CO-NH-.
El reactivo del Biuret (sulfato de cobre(II) + NaOH), se coordina con los enlaces peptdicos
formando un complejo de color violeta (Biuret), cuya intensidad de color depende de la
concentracin de protenas. Cuando una protena se pone en contacto con el lcali concentrado, se
forma una sustancia compleja denominada Biuret, que en contacto con una solucin de sulfato
cprico diluido, da una coloracin violeta caracterstica.

La reaccin debe su nombre por el hecho de haber sido verificada, inicialmente, con Biuret,
producto de condensacin de la urea. El pigmento responsable por el color producido en la reaccin
es un complejo de cobre.

3. TERMOCOAGULACIN

La termocoagulacin de las protenas es tanto ms rpida e intensa, cuanto ms prximos estuviesen


de su punto isoelctrico. Para la mayora de las protenas animales el punto isoelctrico es
aproximadamente 5. Cuando el pH del medio est muy alejado del punto isoelctrico (escala cida o
alcalina), no habr coagulacin.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES

- Tubos de ensayo (5)


- Gradilla
- Reverbero
- Pinza para tubo
- Pipeta de 10 mL
- Esptula
- Pera de succin
- Varilla de agitacin
- Vaso de precipitacin

REACTIVOS

- Casena
- Sosa cal (mezcla fundente)
- Sol. HCl 6 N
- Sol. Acetato de plomo 0.1 M
- Sol. NaOH 6 N
- Sol. de casena al 1%
- Sol. Na2CO3 al 0.5 %
- Sol. HCl 0.2%
- Vaso de precipitacin - HNO3
- H2SO4 1N
- Sol. NaOH 1%
- Sol. CH3COOH 1,5%
- Sol. NaOH 10%
- Agua
- Reactivo de Millon
- Reactivo Glioxlico
- H2SO4
- Sol. Acetato de plomo al 10%
- Sol. Sulfato de cobre al 1%

GRFICOS

Reaccin Xantoprotica.

Reaccin de Biuret.-

Reaccin de los aminocidos azufrados.

PROCEDIMIENTO

A. ANLISIS

1. PRESENCIA DE CARBONO, HIDRGENO, OXGENO


Se coloca 0,2 g de casena en polvo en un tubo limpio y seco, se calienta gradualmente hasta
carbonizar la muestra. La carbonizacin indica la presencia de oxgeno e hidrgeno.

2. PRESENCIA DE AZUFRE

Se calienta 0.2 g de casena con 1 g de sosa cal (mezcla fundente) en un tubo de ensayo. Se deja
enfriar el tubo, luego se aade de 5 mL de HCl 6N al residuo. Se coloca un papel filtro impregnado
de acetato de plomo 0.1 M sobre la boca del tubo. Si hay aparicin de una mancha caf obscura de
PbS formado, se determina la presencia de azufre.

3. PRESENCIA DE NITRGENO

Se coloca 0.2 g de casena en polvo en un tubo de ensayo y se aade 2 mL NaOH 6 N, calentar


cuidadosamente. Note el olor de amonaco y el efecto que sus vapores sobre el papel tornasol rojo.

B. SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS

Se rotulan cuatro tubos de ensayo y se colocan en cada tubo 1 mL de solucin de casena al 1%, se
aade en orden respectivo 2 mL de: NaOH al 10%, Na2CO3 al 0.5%, HCl al 0.2% y agua. Observe
y anote. La mayor solubilidad de las muestras se sealan con: (-) insoluble; () parcialmente
insoluble y (+) soluble.

C. REACCIONES DE COAGULACIN (DESNATURALIZACIN)

Se coloca en un tubo de ensayo, cerca de 2 mL de cido ntrico concentrado y aadir lentamente y


con cuidado por las paredes, 2 mL de la solucin de protena, sin mezclar. En la interfase aparece
un anillo blanco. Esta es la reaccin de Heller.

D. TERMO COAGULACIN

Se aade a un tubo de ensayo conteniendo 5 mL de solucin proteica, 3 gotas de solucin de cido


sulfrico 1 N y se calienta a ebullicin. Se adiciona al lquido todava caliente, gota a gota, y
agitando, hidrxido de sodio al 1%. En un momento dado se dar la coagulacin de las protenas. Se
contina la adicin de la solucin de hidrxido de sodio, gota a gota y agitando hasta disolucin
completa del precipitado. Se calienta nuevamente hasta ebullicin, no habr coagulacin. Se aade
al lquido todava caliente, gota a gota y agitando cido actico al 1,5%. En un momento dado
aparecen cogulos de protena.

E. REACCIONES DE COLORACIN

REACCIN XANTOPROTEICA

Se coloca en un tubo de ensayo 2 mL de solucin proteca y 10 gotas de cido ntrico concentrado.


Se forma un precipitado blanco. Se hierve por 1 o 2 minutos; el precipitado se vuelve amarillo o se
disuelve, dando una solucin amarilla. Adicionando solucin de NaOH al 10% gota a gota, y
agitando hasta alcalinizar, el color cambia para anaranjado.

REACCIN DE MILLON
Se coloca en un tubo de ensayo 2 mL de solucin de protena, y se aade 5 gotas del reactivo de
Millon. Se forma un precipitado blanco que al calentar se vuelve rojizo. Evite realizar la reaccin en
medio fuertemente alcalino (hay la precipitacin de xido mercrico) o con exceso de reactivo (hay
decoloracin).

REACCIN GLIOXILICA

Se mezcla en un tubo de ensayo 1 mL de reactivo glioxlico y 2 mL de solucin de protena; aadir


cuidadosamente por las paredes, cido sulfrico concentrado, sin mezclar. En el lmite de
separacin de los lquidos, aparece un anillo violeta. La reaccin en general es muy lenta. La
reaccin no se da en presencia de nitratos, nitritos, cloratos y exceso de cloruros. El cido sulfrico
debe ser muy puro.

REACCIN DE BIURET

Se coloca en un tubo de ensayo 2 mL de una solucin de protena, aadir 5 gotas de NaOH al 10% y
3 gotas de sulfato de cobre al 1%. La reaccin es positiva cuando aparece una coloracin rosa, o,
ms, frecuentemente, violeta o lila.

REACCIONES

REACCIN XANTOPROTEICA

REACCIN DE BIURET

RESULTADOS

SOLUBILIDAD

Solvente Sustancia
Casena
NaOH +
+/-
HCl +/-
Agua -

+ = soluble

+/- = parcialmente soluble

-= insoluble

OBSERVACIONES

Anlisis

CASENA
PRESENCIA DE Se determin la presencia de
CARBONO, carbono mediante la
HIDRGENO, OXGENO coloracin negra del fondo
del tubo de ensayo que es
smbolo de la combustin, y
se verifico la existencia de
oxgeno e hidrgeno por el
vapor presente en las
paredes del tubo.

Se evidenci la presencia de
PRESENCIA DE AZUFRE azufre por la aparicin de
una mancha color caf en el
papel filtro.
Se evidenci el cambio de
PRESENCIA DE color del papel tornasol de rojo
NITRGENO a morado, y se pudo notar el
olor caracterstico del
amoniaco

SOLUBILIDAD

SOLVENTE SUSTANCIA GRFICO


CASENA
NaOH Se observ la solubilidad total
de la casena en NaOH. No se
observ turbidez ni presencia
de precipitados.
Se observ la presencia de
grumos o partculas
suspendidas en la solucin, las
cuales no se mezclaron con el
resto de la solucin.

HCl Se observ la formacin de


una solucin turbia de color
blanquecino, con partculas
sueltas que no se mezclaron en
la disolucin

Agua Se observ la formacin de dos


capas visibles a simple vista,
indicando que la solubilidad no
haba ocurrido.
REACCIONES

CASENA GRFICO
REACCIONES DE Se observ la formacin de dos
COAGULACIN fases en la disolucin, de las
(DESNATURALIZACIN) cuales, una era amarillenta y la
otra blanquecina.

CASENA GRFICO
REACCIN DE Se observ la aparicin de
TERMOCOAGULACIN cogulos blancos que indican
la desnaturalizacin.

REACCIONES DE COLORACIN

CASENA GRFICO
REACCIN Se evidenci la formacin de
XANTOPROTEICA un precipitado de color blanco
en un principio, el cual luego
se torn de color amarillo en su
totalidad.

CASENA GRFICO
REACCIN DE Se observo la presencia de un
GLIOXILICA anillo color violeta que
separaba las dos sustancias, es
decir se dio la separacin del
cido con la casena.

CASENA GRFICO
REACCIN DE BIURET Se presenci un cambio de
coloracin de transparente a
violeta, que evidencia la
presencia de protenas.

CONCLUSIONES

1. Se estableci la presencia de carbono, hidrogeno y oxgeno a travs del vapor, humo y


coloracin negruzca que provoc la carbonizacin de la protena casena; la presencia de
azufre debido a la aparicin de una mancha caf obscura de PbS formado en el papel filtro;
la presencia de nitrgeno por su peculiar olor nauseabundo.
2. Se verific la solubilidad parcial de la protena casena en presencia de Na2CO3 y HCl
agua a travs de una conformacin un poco turbia de su contenido en los medios antes
mencionados, no se solubilizo en agua y se solubilizo completamente en NaOH.
3. Se evidenci la presencia de los aminocidos en la protena casena a travs de la
reaccin xantoproteica que gener una coloracin amarillenta en la solucin conformada; a
travs reaccin glioxilica por la presencia del anillo morados formado en la superficie; y a
travs de la reaccin de biuret por la conformacin de fase lila en la superficie. Tambin se
determin la presencia de aminocidos de las protenas a travs de su desnaturalizacin por
efecto del cido ntrico que provoc la aparicin de un anillo blanco en su interfase; a travs
de la termo coagulacin por la aparicin de cogulos blancos.

CUESTIONARIO

1. Describa la casena

Polvo fino o granular de color blanco ligeramente crema, olor y sabor caractersticos de un
compuesto nitrogenado y tiene una solubilidad casi nula en agua.

Es el conjunto de polipptidos, se encuentra en la leche en forma de un complejo soluble de calcio y


fsforo. Representa un 80% de la protena presente en la leche de bovinos, mientras que dicho
porcentaje es sensiblemente menor (50%) en la leche de cerda.
Se obtiene sometiendo la leche descremada principalmente a alguno de los dos mtodos siguientes:
precipitacin enzimtica o acidificacin, originando casena renina o casena cida respectivamente,
tras su proceso de obtencin se lava, seca y muele para refinar las partculas.

Tiene capacidad de retencin de agua, gelificante, emulsificante y estabilizante. Es estable al calor y


aporta valor nutricional proteico a los productos en los que se incorpora. Soluble en lcalis.
(DILAC, 2017)

2. Indique cuales son las propiedades fsicas y qumica de las protenas.

Propiedades fsicas

Las protenas son incoloros e inspidos.


Ellos son homogneas y cristalino.
Las protenas varan en forma, que pueden ser simples estructura cristaloide a estructuras
fibrilares largos.
estructuras de protenas son de dos patrones distintos Las protenas globulares y protenas
fibrilares.
Las protenas globulares son de forma esfrica y se producen en las plantas. protenas
fibrilares son filiforme, se producen generalmente en animales.
En general las protenas tienen pesos moleculares grandes que oscilan entre 5 x 10^3 y 1 X
10^6.
Debido al enorme tamao, protenas exhiben muchas de las propiedades coloidales.
La tasa de difusin de las protenas es extremadamente lenta.
Las protenas exhiben efecto Tyndall.
Las protenas tienden a cambiar sus propiedades, como la desnaturalizacin. Muchas veces
el proceso de desnaturalizacin es seguido por coagulacin.
La desnaturalizacin puede ser el resultado de cualquiera de los agentes fsicos o qumicos.
Los agentes fsicos incluyen, agitacin, congelacin, calentamiento, etc. Los agentes qumicos
son como los rayos X, radiaciones radiactivas y ultrasnicas.
Protenas como los aminocidos exhiben, es decir, la propiedad anftera, pueden actuar
como cidos y lcalis.
Como las protenas son anfteras en la naturaleza, pueden formar sales con ambos cationes
y aniones en base a la carga neta.
La solubilidad de las protenas depende del pH. Solubilidad ms baja se ve en el punto
isoelctrico, la solubilidad aumenta con el aumento de la acidez o alcalinidad.
Todas las protenas muestran el plano de luz polarizada a la izquierda, es decir, levgiro.
(Admin, 2017)

Propiedades qumicas

Las protenas cuando se hidrolizan con agentes alcalinos da lugar a la hidrlisis de ciertos
aminocidos como arginie, cistena, serina, etc., se pierde tambin la actividad ptica de los
aminocidos.
Las protenas con reaccin con alcoholes dan sus correspondientes steres. Este proceso se
conoce como esterificacin.
Los aminocidos reaccionan con aminas para formar amidas.
Cuando los aminocidos libres o protenas se dice que reaccionar con los cidos minerales
como HCl, se forman las sales de cido.
La reaccin del Sanger Las protenas reaccionan con el reactivo para producir FDNB
derivado de color amarillo, DNB aminocido.
Prueba Xanthoproteic En hirviendo protenas con HCl conc. HNO3, color amarillo se
desarrolla debido a la presencia de un anillo de benceno.
La prueba de Folin Esta es una prueba especfica para el aminocido tirosina, donde el
color azul se desarrolla con cido phosphomolybdotungstic en solucin alcalina debido a la
presencia de grupo fenol. (Admin, 2017)

3. Explique la desnaturalizacin de las protenas.

Se conoce como desnaturalizacin a la Perdida por parte de las protenas de su estructura de orden
superior (Secundaria, Terciaria, cuaternaria), y queda una cadena polipeptidica reducida a un
polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija. En una protena cualquiera, la
estructura nativa y la desnaturalizada solo tienen en comn la estructura primaria, es decir la
secuencia de aminocidos que la componen, los dems niveles de organizacin estructural
desaparecen si se desnaturalizada. La desnaturalizacin trae diversas consecuencias como: el
cambio en las propiedades hidrodinmicas es decir el aumento de la viscosidad, a la vez que
disminuye el coeficiente de difusin, por otro lado, se produce una disminucin de su solubilidad,
debido a que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie, y finalmente se
produce la perdida de las propiedades biolgicas. Una protena desnaturalizada cuenta nicamente
con su estructura primaria, por este motivo, en muchos casos el proceso de desnaturalizacin es
reversible, ya que es la estructura primaria la que contiene la informacin necesaria y suficiente
para adoptar niveles superiores de estructuracin. (Jimnez, D. 2014)

Los agentes desnaturalizantes son aquellos factores qumicos o fsicos que producen la
desnaturalizacin de las protenas. Entre los ms comunes podemos citar:

Temperatura
pH
polaridad del disolvente
Fuerza inica

4. A qu se debe las reacciones de coloracin


Las protenas se colorean porque sus cristales contienen grupos que absorben luz, aparte de eso en
las reacciones de coloracin en el caso de la reaccin de Millon su cloracin rojiza ladrillo se debe a
la presencia de grupo hidrxifenilo ya que se vuelve rojo gradualmente por la reaccin entre el
mercurio (1) con el grupo , de la tirosina, en la de Biuret debido al grupo de la unin
peptdica produce una coloracion rosada, en el ensayo xantoproteico se debe su coloracin
amarillenta naranja a que las protena contiene aminocidos que llevan el anillo bencnico
especialmente si tiene tirosina, en la reaccin de Hopkins se forma el anillo violeta debido a la
existencia de triptfano en la protena, en el ensayo del azufre por la formacin de un
precipitado negro ya que contienen los aminocidos cisteina y metionina por la formacin de
precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando
reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino , y finalmente a travs de la reaccin
glioxilica por la presencia del anillo morado debido a la reaccin con cido sulfrico
concentrado. (Tadeo, J. 2013)
5. Explique el principio de la reaccin de Millon

R. de Milln: Solucin de mercurio y cido ntrico; contiene nitrato y nitrito de los iones mercurio
(I) y mercurio (II), es decir, Hg(NO2)

El reactivo de Milln reconoci a la tirosina (aminocido neutro) y a la albmina (protena que


contiene a la tirosina entre sus 585 aminocidos) por presentar un grupo hidroxi-fenilo que posee
ninguna sustitucin en la posicin 3 y 5 de su anillo aromtico. El mecanismo de reaccin se basa
en que en presencia de un medio cido (cido ntrico del reactivo), las protenas se desnaturalizan
dando un precipitado blanco la cual se debe a la adicin del .

Dicha adicin sucede en la posicin 3 o 5 y se explicacin ya que el grupo , aumenta la


densidad electrnica del anillo, donde los pares no compartidos del oxgeno se deslocalizan hacia el
anillo y su densidad electrnica aumenta en la posicin meta (a partir del radical).

En esa posicin hay mayor estabilidad por la fuerte atraccin que sufre el nitrgeno por los
electrones deslocalizados del oxgeno. Este mecanismo tambin sucede en la sntesis de hormonas
tiroideas.

Luego, debido al calentamiento, el precipitado blanco se vuelve rojo gradualmente por la reaccin
entre el mercurio (1) con el grupo , de la tirosina. (Snchez, L. 2017)

6. Cmo identificar azufre en los aminocidos azufrados?

Se puede identificar el azufre mediante:

Reaccin con acetato de Plomo alcalino

Los Aminocidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formacin de
precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con
Acetato de Plomo en medio alcalino. (Tadeo, J. 2013)
Bibliografa

Luque, V. (2017) ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTENAS. Recuperado


el 24 de Junio del 2017 de: http://www.uv.es/tunon/pdf_doc/proteinas_09.pdf
DILAC (2017) CASENA. Dilac products. Recuperado el 24 de Junio del 2017 de:
http://www.dilac.com.mx/dilac/productos_files/caseina.pdf
Admin (2017). Caractersticas y propiedades de las protenas. Recuperado el 24 de Junio
del 2017 de: https://www.desalud.net/caracteristicas-y-propiedades-de-las-proteinas/
Jimnez, D. (2014) DESNATURALIZACION DE PROTEINAS. Bogota- Colombia.
Recuperado el 24 de Junio del 2017 de:
https://www.academia.edu/6880544/Desnaturalizacion_de_proteinas
Snchez, L. (2017) Prueba de milln. Recuperado el 24 de Junio del 2017 de:
https://es.scribd.com/doc/261205712/Reactivo-de-Millon
Tadeo, J. (20013). ENSAYOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS.
Recuperado el 24 de Junio del 2017 de:
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/organica/guia_9_ami
noacidos.pdf

ANEXOS

Equipo 1

Equipo 2

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