Virus

PRODUCCIN DE MATERIAL LIBRE DE VIRUS

USO DE SEMILLA LIBRE DE VIRUS

Para muchas especies propagadas vegetativamente, como por ejemplo papa, ajo, batata, frutilla, algunos
frutales, etc., la principal fuente de virus es la infeccin crnica de las mismas plantas. En estas especies las
plantas infectadas con virus producen descendencia igualmente enferma que aumentan, en cada
multiplicacin, las mermas en los rendimientos. Con tales cultivos una de las formas ms exitosas de control
involucra el desarrollo de clones libres de virus. Para este fin se necesita identificar lneas o ejemplares
pertenecientes a la variedad deseada.
Si todos los ejemplares de la variedad se encuentran infectados como comnmente sucede, se deben realizar
intentos para liberar algunas plantas, o partes de ellas, del virus en consideracin.
Una vez obtenido el clon libre de virus, es necesario mantener una lnea madre, la que ser fuente de
propgulos para multiplicacin. En esta etapa se procura reproducir el material bajo condiciones en las que la
reinfeccin sea mnima o no tenga lugar (in vitro, invernculos, zonas aisladas, etc.). Posteriormente la
produccin es entregada para uso comercial.

Mtodos para obtener plantas libres de virus

1. Material libre de virus ocurriendo naturalmente

Ocasionalmente se pueden encontrar libres de virus plantas individuales de una variedad o grupo aislado en
un lugar. Si todos los ejemplares estn infectados, a veces se puede aprovechar la desigual distribucin del
virus en la planta. Esto no es raro en algunos virus de rboles frutales; sin embargo muchas variedades
agmicas pueden estar totalmente infectadas siendo necesario algn mtodo especfico para sanearlas.

2. Cultivo de meristemas

El cultivo de meristemas apicales, extensivamente utilizado en las ltimas dcadas, se aplica principalmente
para producir plantas libres de patgenos, principalmente virus. Tambin es importante para el
almacenamiento de germoplasmas a travs de la tcnicas de criopreservacin.

3. Termoterapia

El tratamiento con calor a vegetales para liberarlos de patgenos ha sido aplicado como tal antes del uso del
cultivo de meristemas. Muchos virus han sido eliminados por medio de esta tcnica. Los materiales usados
para los tratamientos pueden ser partes vegetales en dormancia, o bien en crecimiento vegetativo. En el
primer caso se suele utilizar agua caliente ( 35 a 54 C) durante minutos u horas, segn los casos. Para los
restantes el calor se aplica mediante aire ( 35 a 42 C).
La termoterapia puede utilizarse combinada con el cultivo de meristemas, siendo a veces la nica posibilidad
de regenerar plantas libres de virus. En los casos en que no es imprescindible, permite aumentar el tamao de
los explantos mejorando la tasa de regeneracin de plantas.

4. Quimioterapia

Debido a que la multiplicacin de virus y el metabolismo de los hospedantes estn ntimamente asociados, los
intentos que se han hecho para interferir selectivamente la replicacin viral no han dado resultados
satisfactorios. Sin embargo, desde hace algunos aos est siendo utilizada con xito el Ribavirn (1-b-d-
ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamida). Este producto, tambin denominado Virasole, no es fcil de
conseguir y su precio es elevado. En ensayos realizados utilizando ribavirn al medio de cultivo de meristemas
in vitro se ha conseguido mejorar significativamente la obtencin de plantas libres de virus.

5. Tratamiento con fro

En algunos pocos casos citados el tratamiento con fro parece tener un efecto similar al de la termoterapia
para eliminar virus de plantas.
 PRINCIPIOS Y PRCTICAS DE OBTENCION DE PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS SISTMICOS

EL CULTIVO DE MERISTEMAS: FUNDAMENTOS

Las plantas tienen la propiedad del crecimento abierto, que resulta de la presencia de zonas de tejido
embrionario, los meristemas, en los cuales la formacin de nuevas clulas continan mientras otras partes
llegan a la madurez. El trmino meristema apical alude al conjunto de clulas cuyas divisiones agregan
nuevos elementos al tallo (meristema apical del tallo) o a la raz (meristema apical de la raz).
El meristema apical del tallo en Angiospermas est compuesto por el corpus, conjunto de clulas iniciales y
derivadas inmediatas que se dividen en varios planos, y por la tnica, constituida por una o dos capas de
clulas que se dividen anticlinalmente, ubicadas sobre el corpus.
Adems de las que ocurren en el meristema, an hay divisiones en las regiones subyacentes al mismo que
tambin contribuyen al crecimiento del tallo. Esta porcin terminal del pice es la que se utiliza normalmente
para regenerar plantas libres de virus, mediante su cultivo in vitro, en medios adecuados. De tal manera se
denomina cultivo de meristemas a la siembra del conjunto formado por el verdadero meristema ms la
regin adyacente que incluye a uno o dos primordios foliares. Una ventaja que esta tcnica ofrece es que las
clulas constituyentes del meristema son genticamente estables y por lo tanto las plantas regeneradas son
idnticas a las plantas donadoras de los meristemas.
A partir del descubrimiento de Morel y Martin en 1952 de que se podan obtener plantas Dahlia sanas
cultivando meristemas de plantas sistemticamente infectadas por virus, se ha sucedido una ininterrumpida
serie de aplicaciones de esta tcnica para sanear diversos cultivos, especialmente en el caso de los que se
propagan agmicamente. Esto se basa en la observacin de que la concentracin de virus disminuye hacia el
pice siendo posible en muchos casos encontrar la zona del meristema apical, libre de partculas.
En general se acepta que esta situacin se debera a la ausencia de tejidos de conduccin en la zona
meristemtica y al hecho de que la activa divisin de sus clulas estara dejando a estas fuera del alcance del
virus.
El tamao de la zona libre vara con la especie y virus involucrados. As, en orqudeas es posible regenerar
plantas sanas cultivando brotes apicales de 5 mm. de longitud mientras que en papa no se obtienen plantas
sanas cuando los explantos exceden los 0,7 mm. de longitud.
De esto se deduce que para cada especie es necesario establecer el tamao adecuado de los explantos para
regenerar plantas libres de virus.
Si bien en algunos casos se obtienen plantas a partir del cultivo de domos solamente, en otros se necesitan
por lo menos que el mismo est acompaado de un primordio foliar.
Es claramente observable que hay que equilibrar dos situaciones que se contraponen. Por un lado, cuanto
mayor es el tamao del explanto, mayor es el desarrollo de las plantas, pero a su vez disminuye la
probabilidad de obtener plantas libres de virus. Desde luego, como este es el objetivo principal, el porcentaje
de regeneracin de plantas pasa a ser secundario.
Cuando se extrae un meristema para colocarlo en un medio artificial se le priva de la mayora de los nutrientes
minerales y orgnicos que reciben de otros rganos de la planta. Para que su potencia contine al cultivarlo in
vitro, es necesario suministrarle esos nutrientes al medio. Un adecuado equilibrio de reguladores de
crecimiento es esencial para conseguir regenerar las plantas. Adems del suministro exgeno de hormonas
es necesario tener en cuenta que en el mismo meristema tambin existe una determinada concentracin de
estas. Obviamente la disponibilidad de reguladores endgenos se relaciona con el tamao del explanto y
parece ser la causa determinante de que por debajo de ciertas dimensiones no haya desarrollo.

PRODUCCIN DE PAPA LIBRE DE VIRUS

En el caso de papa, como en todas las especies de propagacin agmica, los virus tienen una particular
importancia por su acumulacin en los materiales de propagacin y su incidencia en los rendimientos. Se citan
en esta especie ms de 20 virus que afectan el cultivo, pero solo 3 4 son de significativa importancia en la
Argentina (PVY, PLRV, PVX y PVS).
La nica herramienta disponible actualmente para obtener plantas libres de virus de manera eficiente y
confiable, es utilizando las tcnicas de cultivo de tejidos in vitro.

DESCRIPCIN Y REALIZACIN DE LA TCNICA

Luego de cosechados y suberificados, los tubrculos seleccionados de los cuales se desea extraer
meristemas son sometidos a tratamiento para romper dormicin en el caso de que sea necesario.
Luego de transcurridos 15 das en una cmara de brotacin a 20 C aproximadamente, los tubrculos
desarrollan brotes de 1 cm. de longitud. En este momento se procede a cortarlos. Inmediatamente se los
desinfecta sumergindolos unos segundos en alcohol y luego en hipoclorito de sodio al 2% durante 10 - 15
minutos. El recipiente que contiene estos brotes es introducido bajo cmara de flujo laminar ya acondicionada
para trabajar. Una vez transcurrido el tiempo de desinfeccin los brotes son lavados por lo menos 3 veces con
agua destilada estril para eliminar los restos de hipoclorito y colocados en una caja de Petri tambin estril.
De aqu se van tomando los brotes para realizar la extraccin de los meristemas. El trabajo se realiza bajo el
campo visual de una lupa binocular con luz puntiforme, utilizando herramientas tales como bistures, pinzas y
microcuchillas.

1.Extraccin del meristema

Sobre papel estril y con ayuda de una pinza que sostiene la base del brote se procede a cortar con un bistur
las hojas y primordios exteriores, cuidando de no daar el meristema apical y dejndolo limpio de tejidos
adyacentes.
Una vez descubierto el domo se lo extrae con 1-2 primordios foliares utilizando una microcuchilla. Por lo
general, el corte se realiza perpendicular al eje del meristema entre 0.1 y 0.2 mm por debajo de la superficie
del domo. El explanto adherido a la microcuchilla es transferido a un tubo con medio de cultivo. Es
conveniente depositarlo con el pice hacia arriba para facilitar el crecimiento armnico del tejido.
Inmediatamente despus se tapa el tubo con polietileno termocontrctil que permite el intercambio gaseoso
con el ambiente.

2.Incubacin

Los tubos sembrados se incuban en cmara de cra a 25 2 C con 70% de Humedad Relativa. La luz es
suministrada con tubos fluorescentes usndose una intensidad de 2000 lux y un fotoperodo de 16 horas.

3.Desarrollo del cultivo

En el transcurso del proceso de desarrollo se pueden realizar 3-4 repiques o subcultivos de los explantos en el
mismo medio, con una frecuencia variable entre 1 y 2 semanas. Se efectan lecturas peridicas para observar
el desarrollo y descartar tubos contaminados y meristemas muertos o que al cabo de cierto tiempo no hayan
experimentado ningn crecimiento. A los 75-80 das se obtienen las primeras plntulas completas. Estos
explantos, que por lo general poseen 4-5 nudos, son micropropagados en un medio adecuado.

4. Evaluacin de sanidad: mtodo de deteccin de virosis de papa

Con 1 2 de las plantas obtenidas en estas primeras micropropagaciones se inicia el control sanitario
mediante la aplicacin del test ELISA, hospedantes diferenciales y, eventualmente, microscopa electrnica
para detectar PLRV, PVY, PVX y PVS. Los mericlones que dan reaccin negativa en estas pruebas se
continan multiplicando in vitro, realizndose por lo menos 2 o 3 controles ms sobre los mismos.
Por otro lado, algunas microplantas de estos materiales son transferidas a tierra con el fin de que desarrollen
plantas de mayor porte con lo que se facilita la multiplicacin de eventuales partculas de virus remanentes
que no fueron detectadas en el material in vitro. De esta forma quedarn en evidencia al realizarse nuevos
controles.
Los controles de sanidad se llevan a cabo durante por lo menos un ao antes de destinar los materiales
definitivamente libres de virus a la multiplicacin masiva para su utilizacin en la produccin de minitubrculos.
 PRODUCCCIN DE AJO LIBRE DE VIRUS

El ajo, en Argentina, es una hortaliza cuyo cultivo sostiene importantes economas regionales. Su produccin
no slo satisface las necesidades del mercado interno por su consumo en fresco o industrial, sino que gran
parte de ella se exporta. El destino final del producto depende principalmente de la calidad obtenida. Dicha
calidad, fundametalmente la sanitaria, se responde directamente a la del material utilizado para la
implementacin del cultivo.
Entre los problemas sanitarios, las virosis constituyeron uno de los ms difciles de resolver. Sin embargo, el
desarrollo de esquemas de produccin masiva de ajo libre de virus ha permitido superar en gran parte este
inconveniente. Este esquema se inicia con la seleccin del material teniendo en cuenta cualidades
morfolgicas y/o fisiolgicas deseadas. Estos bulbos son identificados y cada bulbillo que lo compone es
preparado para el proceso de extraccin del meristema. Se elimina gran parte de la hoja de reserva y queda
as listo para ser esterilizado y llevado a cmara de flujo laminar donde se extraer el explanto
correspondiente.

1. Extraccin del meristema

Los trabajos de introduccin de los explantos (meristema con 1-2 primordios foliares) se realizan en los meses
de verano aplicndose la misma tcnica descripta para papa.

2. Incubacin

Los tubos sembrados se incuban de igual manera que los meristemas de papa pero, en general, a una
temperatura dos o tres grados menor.

3. Desarrollo del cultivo

Al cabo de 3-4 meses aproximadamente, entre el 50 y 80% de los meristemas ha desarrollado microplantas
completas. En algunos tipos clonales, como Colorados y Blancos, se efectan dos o tres micropropagaciones
antes de someter a las microplantas a un proceso de rusticacin. Luego las mismas son transplantadas en
macetas y colocadas en invernculo o jaula antifidos para su crecimiento.
Luego de 5-6 meses de cultivo, las plantas producen minibulbillos, generalmente uno. Sin embargo, en
algunos casos se obtienen 2-3 por planta. Estos minibulbillos se multiplican nuevamente en invernculo
antifidos con los controles de sanidad correspondientes. Recin al cabo de 2 ciclos se puede asumir
definitivamente que los materiales que dan reaccin negativa a las pruebas sanitarias estn libres de virus.
Los minibulbillos que se cosechan en este ciclo estn en condiciones de ser multiplicados a campo en zonas
aisladas de cultivos comerciales, tratando de preservar el estado sanitario original.

4. Evaluacin de sanidad: mtodo de deteccin de virosis de ajo

Las evaluaciones de sanidad se inician en la etapa de produccin "in vitro" en aquellos casos que permiten la
micropropagacin de los materiales introducidos, y se contina en la etapa de produccin en invernculo o
jaula antifido. Ellas incluyen observaciones visuales de sntomas, pruebas serolgicas como ELISA,
transmisin mecnica a un hospedante indicador y, eventualmente, microscopa electrnica.
La prueba ELISA se utiliza para detectar la presencia de virus pertenecientes al gnero Potyvirus en general o
a entidades individuales de dicho gnero como el Onion yellow dwarf virus y el Leek yellow stripe virus. Para
los Carlavirus como el Shallot latent virus y el Garlic common latent virus tambin se utiliza la prueba ELISA,
mientras que para un Carlavirus comn en los cultivos comerciales de Crdoba an no identificado, se usa
transmisin mecnica al hospedante indicador Chenopodium murale.
La reaccin positiva en el hospedante indicador consiste en el desarrollo de lesiones locales clorticas en las
hojas, visibles a partir del noveno da, que luego se tornan necrticas.
La comprobacin de la presencia de virus pertenecientes al gnero Potyvirus se realiza mediante la prueba
serolgica ELISA indirecto con antisuero monoclonal para Potyvirus, ya que esta tcnica detecta a todos los
miembros de este grupo.
Para la evaluacin de los materiales respecto al LYSV, OYDV, SLV y GCLV se desarrolla la tcnica DAS-
ELISA, con antisueros monoclonales o policlonales segn el caso.