Introduccin

Las isoformas de ciclooxigenasa (COX) -1 y -2 comparten 60-65% de identidad de secuencia

dentro de las especies y aproximadamente 85-90% de identidad de secuencia entre diferentes
especies. [1] Son enzimas bifuncionales que llevan a cabo dos reacciones secuenciales en sitios
activos espacialmente distintos, pero mecnicamente acoplados: la bisoxigenacin del cido
araquidnico (AA) a la prostaglandina G2 (PGG2) y la reduccin de PGG2 a PGH 2. COX-1 y
COX- 2 son homodmeros de subunidades de 70 kDa, y se requiere dimerizacin para integridad
estructural y actividad cataltica. Cada monmero contiene un COX y un sitio activo de peroxidasa
y consta de tres dominios estructurales: un dominio corto del factor de crecimiento epidrmico N-
terminal, un dominio de unin a la membrana y un dominio cataltico Cterminal globular grande.
Los monmeros de COX que forman el dmero, aunque idnticos en la enzima de reposo, difieren
unos de otros durante la catlisis. HCOXs funcionan, en la prctica, como heterodmeros
conformacionales que tienen un monmero cataltico (E cat) con un hemo unido y un monmero
alostrico (E allo) que carece de hemo. Estudios de la rotacin de sustrato AA en altas
proporciones de enzima a sustrato indican que los inhibidores de tipo no-sustrato se unen al sitio
COX de E allo para modular las propiedades de E cat La subunidad que no funciona puede
proporcionar soporte estructural, lo que permite que su socio monmero para catalizar las
reacciones COX. [2]
Las interacciones de complejidades variables entre ligandos y biomolculas (grandes) (es decir,
enzimas, ADN, receptores) se estudian a menudo usando un modelo simple de interacciones
ligando-biomolcula para determinar el modo de unin. Para sistemas ms complejos, como en el
caso de COX E allo / E cat, la probabilidad de observar una interaccin til para un compuesto
escogido al azar disminuye drsticamente. Exploramos an ms estas implicaciones en el diseo
de nuevos compuestos en un intento de potenciar la actividad de nuestros inhibidores selectivos de
COX-1 para desarrollar agentes teraputicos para experimentos in vitro e in vivo dirigidos a tejidos
y clulas especficos.
Los frmacos antiinflamatorios no esteroideos tradicionales (tNSAIDs) se dirigen a ambas
isoenzimas COX. Los coxibs, dirigidos principalmente a la COX-2, han sido el foco de varios
estudios dirigidos a desarrollar frmacos que carecen de toxicidad gastrointestinal.
Por el contrario, se han descrito pocos inhibidores selectivos de la COX-1, aunque varias
investigaciones farmacolgicas han demostrado la participacin consolidada de esta enzima en la
carcinognesis, la patognesis de la neuroinflamacin y el dolor. [1] En la actualidad, la inhibicin
selectiva de la COX-1 se considera una prometedora estrategia Cncer y enfermedades
neurodegenerativas derivadas de la neuroinflamacin. [1, 5-7] En muchos tipos de cnceres y
enfermedades neurodegenerativas, la eficacia del frmaco afecta fuertemente a la resistencia a
mltiples frmacos (MDR), un fenmeno que limita la acumulacin de clulas de frmaco debido a
la accin de la bomba de eflujo, Tal como por la glicoprotena P (P-gp), un miembro clave de la
superfamilia de transportadores de eflujo de casete de unin a ATP (ABC). Esto nos llev a disear
inhibidores selectivos de COX-1 [1, 3-5, 9] que tambin fueron capaces de residir durante un
tiempo ms largo dentro de la clula. Hasta ahora, ningn intento de correlacionar la actividad de
COX-1 y P-gp ha tenido xito.
Por lo tanto, los nuevos compuestos proyectados tienen un resto de reconocimiento de inhibidor de
COX, constituido por uno de los tres inhibidores selectivos bien conocidos tales como
indometacina, [10] P6, [3, 11] o mofezolac [12] (Figura 1) Y un fragmento reconocido por P - gp
como una funcionalidad adicional. En particular, la rodamina 6G (Rh6G) es un sustrato P-gp, y la
6,7-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (6,7-DM THIQ) es un elemento clave estructural de
elacridar (un derivado de la acridonecarboxamida inhibidor de la Pgp capaz de modular) y
tariquidar ( El Tariquidar es un inhibidor no competitivo que parece que se une a Pgp en la misma
zona que el ATP, inhibiendo la actividad ATPasa de esta) (Dos sustratos saturantes de P-gp o
compuestos similares a inhibidores). [13-16] La indometacina, P6 y mofezolac se unieron entonces
a un resto Rh6G o 6,7-DM-THIQ para explorar en primer lugar el reconocimiento del inhibidor COX
y, En segundo lugar, verificar si tales nuevas molculas retienen la actividad de sustrato / inhibidor
de P-gp.
(Dos sustratos saturantes de P-gp o compuestos similares a inhibidores). [13-16] La indometacina,
P6 y mofezolac se unieron entonces a un resto Rh6G o 6,7-DM-THIQ para explorar en primer lugar
el reconocimiento del inhibidor COX y, En segundo lugar, verificar si tales nuevas molculas
retienen la actividad de sustrato / inhibidor de P-gp.
Una serie de conformacionalmente restringido y regioisomeric indometacina anlogos ya se
describieron como multirresistentes moduladores.
La evaluacin de los efectos inhibidores de estos compuestos sobre la COX, la P-gp y la
resistencia a mltiples frmacos (MDR) indic que la modulacin de la P-gp resistente a mltiples
frmacos y la protena 1 resistente a mltiples frmacos por un nmero de AINEs no est asociada
con COX-1 y Actividad inhibidora de COX-2 [17] El ibuprofeno super la MDR en clulas de
sarcoma uterina resistentes a la doxorrubicina humana (MES-SA / Dx-5), expresando altos niveles
de la bomba de eflujo P-gp [18] Rh6G tambin se conjug con indometacina, P6 y mofezolac en un
intento de producir molculas fluorescentes dirigidas a la COX-1 expresada en tejidos sanos y
patolgicos /
Clulas. A continuacin se describe la sntesis de estos compuestos originales, su capacidad para
inhibir la actividad COX y su extensin de interaccin con la bomba de eflujo de P-gp expresada en
la lnea celular MDCK-MDR1. Los resultados de los experimentos de acoplamiento tambin se
discuten.
Resultados y discusin
Entre los tNSAID, con excepcin de la dosis baja de aspirina, slo unos pocos ejemplos de
inhibidores selectivos de COX-1 se han investigado en profundidad hasta el momento. [1] Para
este estudio, hemos identificado nuevos compuestos derivados de los conductores como la
indometacina (COX-1 IC50 = 0,099 mm; CO _ {2} - IC _ {50} = 4,2 mm), [9] P _ {6} (CO _
2 IC50> 50 mm), [3] y mofezolac [11] (COX - 1 IC _ {50} = 0,024 mm; COX-2 IC 50> 50 mm)
(Figura 1) para identificar an ms las entidades qumicas cruciales responsables de la inhibicin
selectiva de la COX. La indometacina se eligi como uno de los frmacos analgsicos y
antipirticos ms prescritos. Mofezolac es el ingrediente activo del frmaco analgsico Disopain,
comercialmente disponible en Japn. P6 representa un prototipo del andamio de isoxazol que
hemos estado estudiando. [5, 19, 20]P6 se convirti en P6-COOH (Figura 2; 32 y 58% de inhibicin
de COX-1 y COX-2 actividad, respectivamente, a 50 mm) Aadiendo el grupo carboxlico a la
cadena lateral de isoxazol P6.
Los tres inhibidores de la COX (indometacina, P6-COOH y mofezolac) se unieron al fragmento fluorescente
Rh6G [21] O al resto que interacta con la bomba de eflujo 6,7-DM-THIQ, [14] obteniendo los compuestos
7-9, 14-17 y 20 La parte inhibidora de la COX-1 de los compuestos y las fracciones Rh6G o 6,7-DM-THIQ se
acoplaron mediante un enlazador de la longitud apropiada [21, 22] para permitir en primer lugar la entrada de
la porcin inhibidora de la COX-1 en la porcin COX sitio activo para llegar a la radical tirosil
(Tyr385) (Figura 3] [21, 22] y, por tanto, bloquear la oxidacin auto-cataltica de AA a PGH2. En
segundo lugar, se seleccion la longitud del engarce para permitir que la funcionalidad aditiva
Rh6G o 6,7-DM-THIQ permaneciera fuera del sitio de constriccin formado por Tyr355, Arg 120 y
Glu 524 (Figura 3a). Los mismos residuos de aminocidos permiten un acceso ms fcil al sitio
activo COX-2, que tiene un bolsillo lateral ms grande que la isoforma COX-1 (Figura 3b)

Figura 3. Hiptesis de trabajo: molculas diana en los sitios activos a) COX-1 yb) COX-2 Los sitios
activos COX-1 y COX-2 se representan esquemticamente como canales hidrfobos estrechos
separados de la protena residual, constituidos en parte por el vestbulo ancho del dominio de
unin a la membrana con un sitio de constriccin compuesto por tres aminocidos (Arg 120, Tyr355
y Glu 524). El canal est situado en la interfase entre la regin que penetra en la membrana y la
Regin cataltica. Para la isoforma COX-1, Ile 523 (azul) cierra la cavidad lateral hidrfila situada
lateralmente. En la isoforma COX-2, existe una bolsillo. Hay una abertura de canal ms amplia en
COX-2, con el estrechamiento causado por Arg 120 y Tyr355 en COX-1.

Tabla 1. Construccin basada en fragmentos de los compuestos diana 7-9 y 14-17, derivados de
indometacina, P6-COOH y mofezolac.
Se utiliz el compuesto diana 17, que una los restos inhibidores de la COX y 6,7-DM-THIQ, para probar el
papel del enlazador en esta serie e identificar las caractersticas estructurales para disear nuevos compuestos
selectivos Inhibidores de la Cox
Qumica
Las sntesis de 1 - 3 se realizaron mediante una formacin de enlace amida entre el correspondiente uno de los
tres inhibidores de COX y una diamina, que se utiliz como enlace. La proteccin Mono-N-Boc del 1,4-
diaminobutano proporcion el correspondiente (4-aminobutil) carbamato de terc-butilo Que a su vez
reaccion con indometacina in situ activada con EDCl / HOBt, P6-COOH y mofezolac (Esquema 1) para dar
los aductos mono-N-Boc 1 -3. La desproteccin de N-Boc de 1 -3, precursores de 4-6, se realiz con alto
rendimiento (92-98%) por HCl (g). La conjugacin posterior de 4-6 con el resto de rodamina (Rh6G-COOH)
condujo a los compuestos objetivo 7-9 (Esquema 2). Se obtuvo Rh6G-COOH por hidrlisis del Rh6G (ster
etlico) comercialmente disponible en presencia de NaOH. [24]
Los compuestos de destino 14-16 se prepararon a partir del clorhidrato (13) de 5-amino-1- [6,7-dimetoxi-3,4-
dihidroisoquinolin-2- (1H) -il] pentan-1-on haciendo reaccionar los 6, 7-DM-THIQ (11) con cido 5-
aminovalrico protegido con NBoc (10), activando in situ con EDCl / HOBt, seguido de desproteccin con
HCl (g) (Esquema 3). La conjugacin posterior de 13 con indometacina, P6-COOH o mofezolac condujo a los
compuestos diana 14 - 16 (Esquema 4). El compuesto objetivo 17, obtenido por conjugacin de mofezolac y
6,7-DM-THIQ (11), se prepar para verificar la importancia de la distancia entre la porcin inhibidora de
COX-1 y 6,7-DM-THIQ (Esquema 5). Las primeras condiciones sintticas (Esquema 6) utilizadas para
preparar 14 produjeron la escisin del grupo 4-clorobenzolo, obtenindose as el compuesto 20, que se
incluy en la caracterizacin farmacolgica (Tabla 2)
Esquema 1 . Reactivos y condiciones: a) dicarbonato de di-terc-butilo, dioxano, RT; B) DIEA, EDCl,
HOBt, DMF seco, RT, durante la noche; c) HCl (g), se seca CH 2Cl2, RT, 1,5 h.

Esquema 2. Reactivos y condiciones: a) NaOH (aq), EtOH, reflujo, durante la noche; b)

PyBOP, TEA, CH 2Cl2 / DMSO, RT, 24 hr
Esquema 3. Reactivos y condiciones: a) dicarbonato de di-terc-butilo, dioxano, RT; B) 6,7 -
DM - THIQ (11), DIPEA, EDCl, HOBt, DMF seco, RT, 20 h; c) HCl (g), CH2Cl2 seco, RT, 1 ,5 h.

Esquema 4. Reactivos y condiciones: a) DIPEA, EDCl, HOBt, DMF seca, RT, 20 h

Esquema 5. Reactivos y condiciones: a) DIEA, EDCl, HOBt, DMF seca, RT, durante la noche
Esquema 6. Reactivos y condiciones: a) SOCl2, 0C; b) CH3OH anhidro, reflujo; c)
indometacina, HOBt, DCC, DIEA / CH2Cl2 anhidro; D) LiOH, THF, RT; e) DCC, DMAP (0 8C, 30
min) / CH2Cl2 anhidro; F) 6,7 - DM - THIQ (11), 16 h, RT.

Biologa
Todos los compuestos sintetizados se ensayaron para determinar su actividad inhibidora hacia las
enzimas COX-1 y COX-2, respectivamente (Tabla 2), usando un kit de ensayo de deteccin de
inhibidor COX (ovino) colorimtrico. COX es una enzima bifuncional que exhibe tanto la actividad
de la ciclooxigenasa como la peroxidasa. La indometacina inhibi selectivamente la COX-1 con SI
= 0,02 (Tabla 2). Rh6G-COOH no inhibi la actividad de COXs a 50 mm. Una Combinacin de
indometacina y Rh6G-COOH, con un enlazador de 1,4-diaminobutano, proporcion al compuesto
7, que no fue capaz de inhibir COX-1, aunque disminuy la actividad de COX-2 a 50 mm por 28%.
Por otra parte, se encontr que el compuesto 8 era altamente selectivo para COX-1, con IC50 = 6,0
mm y una falta total de eficacia hacia la COX-2 a concentraciones de hasta 50 mm, aunque se
encontr que la conjugacin del resto Rh6G Con P6 para dar el compuesto 8 da como resultado
una prdida de fluorescencia (datos no mostrados). Se encontr que el Compuesto 9 era un
inhibidor pobre, con actividad slo hacia COX-1 (16% de inhibicin a 50 mm)
Dentro de la serie de derivados de 6,7-DM-THIQ, el derivado de indometacina 14 era
completamente inactivo hacia ambas isoformas de COX, y su anlogo (20) mostr slo un 10% de
inhibicin de COX-1. El compuesto 15, derivado de P6-COOH, afect ligeramente slo a la
actividad de COX-1 (23% de inhibicin a 50 mm). El derivado 16 de Mofezolac, a una
concentracin de 50 mm, mostr 33 y 13% de inhibicin de COX-1 y COX-2, respectivamente. El
elemento estructural comn en todos los compuestos diana era la distancia aproximada entre los
fragmentos de unin a COX y P-gp. Esto se eligi sobre la base de los resultados obtenidos de la
construccin de imgenes agentes fluorescentes para la visualizacin selectiva de COX-2 en la
inflamacin y el cncer. [21, 22] Tal longitud de unin result ser adecuada para permitir que 8
tuviera el resto P6 prximo al residuo Tyr385 en el sitio cataltico de COX-1 y el resto de Rh6G
voluminoso en la proximidad de la entrada del canal hidrfobo largo del dominio de unin a la
membrana COX (Figura 4). En ausencia de un enlazador, como con el compuesto 17, se
observaron 48% y 69% de inhibicin de la actividad COX-1 y COX-2, respectivamente, a una
concentracin de 50 mm (COX-2 IC50 = 0,95 mm).
TABLA 2 Actividad inhibidora de la COX de los compuestos diana 7-9, 14-17 y 20
[A] Actividad inhibidora hacia COX-1 y COX-2 determinada a concentraciones de compuesto
de 50 mm usando un kit de ensayo de deteccin de inhibidor COX (ovino) colorimtrico. [B]
Los valores son la media ?? SEM de tres experimentos separados; n / A. : No activo, es
decir, no se observ actividad inhibidora a 50 mm.

Figura 4. Modos de unin del compuesto 8 (a, amarillo) y del compuesto 17 (c, violeta) en los
sitios activos COX-1 y COX-2, respectivamente. Dos dimensiones de la proyeccin de b) 8
COX-1 y d) 17-COX-2 interacciones generadas con MOE(entorno operativo molecular) . [42]
Slo se muestran y se etiquetan los residuos situados dentro de 4,5 \ mu del ligando unido.
Los enlaces de hidrgeno discutidos en el texto se representan como lneas negras
discontinuas. Los restos del sitio de constriccin (Arg 120, Tyr 355 y Glu 524), que separan
el vestbulo del sitio activo COX situado encima de l, estn subrayados y coloreados de
rojo.

Estudios de acoplamiento
El sitio COX activo tanto de la COX-1 como de la COX-2 se encuentra Terminal de un largo canal
hidrfobico que se extiende desde la superficie de la protena al interior de la protena (Figura 3).
La porcin inicial del canal tiene un gran volumen, o vestbulo, que se estrecha en un sitio de
constriccin compuesto por residuos Arg 120, Tyr355 y Glu 524. El sitio de constriccin constituye
una compuerta que debe abrirse y cerrarse para que los sustratos e inhibidores pasen dentro o
fuera del sitio COX activo anteriormente localizado. Todos los inhibidores de la COX se unen en el
sitio activo por encima del sitio de constriccin y los residuos del sitio de restriccin juegan un papel
importante en la unin de los inhibidores que contienen cido carboxlico a travs de una
combinacin de apareamiento de iones y enlaces de hidrgeno.
Para obtener ms informacin sobre la probable naturaleza de las interacciones de unin del
compuesto 8 dentro del sitio activo de la COX-1, se realizaron estudios de acoplamiento utilizando
la COX-1 ovina en el complejo con inhibidor unido indometacina- (R) a etil etanolamida (PDB ID:
2OYE). [27] Se ha seleccionado este estructura cristalina, debido a que la cadena lateral de Arg
120 adopta una conformacin alterada significativamente para acomodar el inhibidor, en relacin
con la conformacin ms extendida observado en la mayora de otras estructuras cristalinas de la
COX-1. Una consecuencia de este reajuste estructural es la disrupcin del sitio de constriccin Arg
120-Tyr 355-Glu 524 y la expansin potencial de la entrada al canal hidrofbico principal. Las
investigaciones de acoplamiento se llevaron a cabo utilizando el programa de acoplamiento
automatizado GOLD 5.2.2 [28, 29] en combinacin con la funcin de puntuacin de ChemPLP,
seguido de rescursin con ChemScore. [3, 19, 30-34] Conformaciones alternativas del Arg1 20,
Tyr355 , Glu 524 y Ser530 se han observado previamente en estructuras cristalinas de COX
complejadas con varios inhibidores, resaltando la plasticidad innata del sitio activo. [26, 35, 36] En
consecuencia, los Arg 120, Tyr355, Glu 524 y Ser530 Las cadenas laterales se dejaron moverse
durante los experimentos de acoplamiento.
Se realiz una validacin inicial del protocolo de acoplamiento comparando la conformacin,
posicin y orientacin (pose) del inhibidor indometacina- (R) - a-etil-etanolamida, Tal como se
obtuvo de acoplamiento con la estructura de cristal de rayos X determinada experimentalmente. La
correcta reinstalacin del inhibidor cristalizado observado fue un requisito mnimo para determinar
si el programa era aplicable a este sistema. La conformacin del ligando superior pronosticada por
el programa GOLD estaba muy cerca de la conformacin de la estructura cristalina. La desviacin
cuadrtica media (RMSD) entre la postura acoplada y su conformacin unida en la estructura
cristalina fue de 0,63 \ mu, indicando que GOLD pudo reproducir la postura correcta.
Como se ilustra en la Figura 4a, el resto P6 de 8 se inserta completamente en la cavidad de unin
de la COX-1, mientras que la funcionalidad de la amida secundaria voluminosa Rh6G se proyecta
a travs del sitio de constriccin en la base del sitio activo y en el vestbulo ancho en la membrana-
Dominio vinculante. La posicin y orientacin del resto P6 en el sitio activo de COX - 1 se asemeja
estrechamente al modo de unin B previamente obtenido para el isoxazol 3- (5 - bromofuran - 2 - il)
- 5 - metil - 4 - fenilisoxazol selectivo de COX - 1 ( Br-P6). [9] En particular, el nitrgeno N2 isoxazol
de 8 est dentro de la distancia de enlace de hidrgeno del grupo g-OH de Ser530, que adopt una
posicin descendente durante la simulacin de acoplamiento flexible. [3] Los tomos de N2 O
estn separados por 3,2 y muestran una geometra favorable para la unin de hidrgeno. El
anillo de fenilo en la posicin 4 del isoxazol est en estrecho contacto con varias cadenas laterales
hidrfobas, incluyendo Leu 352, Ile 523, Tyr355 y Phe 518. El resto de clorofurilo est orientado
hacia el pice del sitio activo de COX-1 y forma van Der Waals con los residuos Met 522, Phe 518,
Leu 352, Trp387, Tyr385, Leu 384 y Phe 381. El enlace amida del enlazador que conjuga el resto
P6 hace dos enlaces de hidrgeno, uno con el grupo OH de Tyr355 (dN O = 2,9 ) y el otro con
el resto guanidinio de Arg 120 (dO N = 2,7 \ lambda), que se sabe que juega un papel
importante en los sustratos de unin y los inhibidores que contienen cido carboxlico. El enlazador
tambin est implicado en interacciones hidrfobas con Ile 89, Leu 93, Val116, Val349, Leu 359 y
Leu 531. Adems, la porcin de Rh6G interacta con mltiples residuos hidrofbicos, incluyendo
Ile89, Pro84, Pro86, Leu 115, Val119, Leu123 y Gly471, que proporcionan una fuerza de unin
considerable. El oxgeno de carboxilato de O2 de Glu524 es de 2,5 \ alpha a partir de la carga
positiva sobre el nitrgeno etlico de amonio de la fraccin Rh6G, neutralizando as las cargas
enterradas. El ncleo Rh6G est anclado adicionalmente a la regin de vestbulo de COX-1 a
travs de una interaccin de catin favorable entre su anillo benzofusionado y Arg 79, as como a
travs de un enlace de hidrgeno asociado formado tambin por el mismo residuo de aminocido
con el anillo central O1 tomo de Rh6G.
En particular, en la estructura COX-1 con el compuesto 8 unido, a pesar que la cadena lateral de
Arg120 reorienta para formar un enlace de hidrgeno con el ligando, est en posicin para
conservar el puente salino con Glu524. En esta conformacin, Arg 120 ya no interacta con el
grupo OH de Tyr355, que a su vez interacta con el ligando, dejando el fondo del sitio de unin a
COX-1 en una conformacin abierta. Nuestro reajuste estructural predicho de Arg 120 est de
acuerdo con la observado en la estructura cristalina de la indometacina- (R) -a-etil-etanolamida
complejada con COX-1,
Que este residuo adopta una conformacin significativamente alterada para acomodar el ligando
en comparacin con las estructuras cristalinas de diferentes complejos de ligando de COX-1
(incluyendo AINEs y sustratos de cidos grasos). Para racionalizar la alta actividad inhibitoria del
compuesto 17 hacia COX-2, tambin se llevaron a cabo experimentos de acoplamiento con el sitio
de unin a COX-2 (PDB ID: 6COX) [26]. La diferencia principal entre los dos sitios COX activos es
la sustitucin de dos residuos de isoleucina (Ile434 e Ile523) en COX-1 por dos aminocidos
menos voluminosos (Val434 y Val523) en COX-2. Esta doble sustitucin abre un bolsillo lateral
polar, ampliando el volumen del sitio COX-2 activo. Adicionalmente, la sustitucin de His513 en
COX-1 por Arg 513 en COX-2 permite la unin de hidrgeno con el resto sulfonilo de inhibidores de
COX-2. Una segunda diferencia, en la parte superior del canal, es la sustitucin de Phe503 en
COX-1 por Leu503 en COX-2. El residuo ms pequeo en COX-2 permite que Leu384 cree un
espacio extra en la parte superior del sitio de unin en COX-2, permitiendo as que los inhibidores
ms grandes se unan.
GOLD predijo con xito una postura de unin plausible para 17 dentro del bolsillo de unin de
COX-2. Como se ilustra en la Figura 4c, la funcionalidad mofezolac del ligando se inserta
completamente en la cavidad de unin de COX-2, mientras que la porcin voluminosa de 6,7-DM-
THIQ se proyecta a travs del sitio de constriccin en la base del sitio activo y en el ancho Lobby
en el dominio de unin a la membrana. En particular, el nitrgeno N2 isoxazol de 17 est acoplado
en un enlace de hidrgeno con el grupo OH de Ser530 (dN2 O = 2,7 ). El anillo de p-
metoxifenilo en la posicin 3 del anillo de isoxazol se dirige hacia la parte superior del sitio activo
de COX-2 y forma interacciones hidrfobas con los residuos Leu352, Phe381, Leu384, Tyr385,
Trp387, Phe518, Met522 y Gly526. El grupo pmetoxi acepta un enlace de hidrgeno del grupo
Tyr385 OH (dO O = 3,3 ). Es importante destacar que el anillo de p-metoxifenilo en la posicin
4 sobresale hacia el bolsillo lateral de COX-2 y hace contactos hidrfobos con los restos His90,
Tyr355, Ala516, Phe518 y Val523. El grupo p-metoxi est dentro de la distancia de enlace de
hidrgeno del tomo de nitrgeno del residuo His90 (dO N e2 = 3,2 ). Adems, la amida C = O
del comp. 17 forma un enlace de hidrgeno con el grupo guanidinio de Arg 120 (dNH2 O = 3,0 \
lambda). Finalmente, el resto 6,7-DM-THIQ se extiende dentro de la regin del vestbulo de la
enzima y hace contactos hidrfobos con los residuos Val89, Leu93, Ile112, Tyr115, Val116, Tyr355
y Leu359.
La comparacin de los complejos 8 / COX-1 y 17 / COX-2 revela sorprendentes similitudes y
diferencias en la unin de los ligandos (Figura 5). Curiosamente, los dos inhibidores se unen en
conformaciones muy similares, con su nitrgeno N2 isoxazol y enlace de hidrgeno a Ser530 en
ambas isoenzimas. Sin embargo, 17 hace dos enlaces de hidrgeno con la hendidura de unin de
COX-2: uno entre el metoxi oxgeno en el fenilo en C3 del isoxazol y el grupo hidroxi Tyr385 y el
otro entre el oxgeno del metoxi en el fenilo en C4 del isoxazol y El tomo de nitrgeno del anillo
His90 imidazol.
La selectividad del compuesto 8 para la COX-1 es probable que se deba a las interacciones
favorables del resto Rh6G con los residuos de los sitios de constriccin y de vestbulo,
contribuyendo significativamente a la estabilidad del complejo.
Figura 5. Superposicin de las mejores posiciones de 8 (amarillo) y 17 (violeta) en los sitios
COX-1 y COX-2 activos, respectivamente.

los compuestos diana 7-9 y 15-17, que contenan cada uno un fragmento P-gpinteracting, tambin
se estudiaron por su capacidad para modular la actividad de la bomba de eflujo midiendo la
acumulacin de calcena en clulas MDCK-MDR1 que sobreexpresan P-gp y determinando la
permeabilidad aparente a travs de un Caco -2 monocapa de clulas. Los compuestos 7 y 9, a
pesar de portar el resto Rh6G, no interaccionaron con el transportador de eflujo, como lo
demuestran sus valores bajos de EC50 (Tabla 3). Los valores de CE50 se determinaron ajustando
el porcentaje de aumento de fluorescencia frente a log [dosis]. [39] Todos los otros compuestos (8
y 15-17) mostraron una interaccin significativa con P-gp (EC50 valores que van desde 0,42 hasta
4,61 mm). El ensayo de permeabilidad realizado sobre los mismos compuestos (Tabla 3)
proporcion valores BA / AB (Papp, permeabilidad aparente)> 2, lo que indica que son sustratos de
P-gp. [40]

Tabla 3. Resultados del ensayo de calcena-AM y determinacin de Papp

Conclusiones
En este estudio, se prepar un conjunto de nuevas molculas para permitir el avance del
conocimiento del reconocimiento molecular del sitio activo de la COX, complementado por
experimentos de simulacin de acoplamiento que aportaron informacin adicional sobre el modo
de unin de estos compuestos. Dos compuestos fueron identificados como altamente selectivos
COX-1 y COX-2 inhibidores, respectivamente (8, COX-1 IC50 = 6,0 mm, 17, COX-2 IC50 = 0,95
mm). Los estudios de acoplamiento molecular racionalizaron esta fuerte actividad inhibidora de
COX-1 y COX-2. El resto diarilisoxazol (P6) de 8 se inserta completamente en la cavidad de unin
de COX-1, mientras que la funcionalidad de Rh6G voluminosa se proyecta a travs del sitio de
constriccin en el vestbulo ancho en el dominio de unin a la membrana. La porcin Rh6G
interacciona con mltiples residuos hidrfobos, proporcionando una fuerza de unin considerable.
Por otra parte, el inhibidor selectivo COX-2 17 rompe el sitio de constriccin en la boca del sitio
activo y proyecta su fraccin 6,7-DM-THIQ dentro de la regin del vestbulo no unida de forma
estrica. Se esperaba que Rh6G y 6,7-DM-THIQ, presentes en 8 y 17, respectivamente, confieren
una modulacin de actividad P-gp opuesta a los dos compuestos. Por el contrario, 8 y 17 retenido
COX-1 o COX-2 actividad inhibitoria, respectivamente, pero ambos se comportaron como sustratos
de P-gp (BA / AB> 2, Tabla 3). Todos estos resultados se han tenido en cuenta para estudios
posteriores