Mrcio de Souza Dias

Diversidade e potencial de utilizao de bactrias fixadoras de N2 em Brachiaria

brizantha

ALFENAS - MG
2015
 Mrcio de Souza Dias

Diversidade e potencial de utilizao de bactrias fixadoras de N2 em Brachiaria

brizantha

Dissertao apresentada Universidade

Jos do Rosrio Vellano - UNIFENAS,
como parte das exigncias do Programa
de Ps-Graduao em Cincia Animal,
rea de concentrao em Produo
Animal, para a obteno do ttulo de
Mestre.

Orientadora:Dra. Ligiane Aparecida Florentino

Coorientador: Dr. Adauton Vilela de Rezende

ALFENAS - MG
2015
 Dias, Mrcio de Souza
Diversidade e potencial de utilizao de bactrias fixadoras de N2
em Brachiaria brizantha.Mrcio de Souza Dias.Alfenas, 2015.

62f.

Orientadora: Prof. Dra Ligiane Aparecida Florentino

Dissertao (Mestrado)- Programa de Ps-graduao

em Cincia animal- Universidade Jos do Rosrio Vellano, Alfenas,
2015.

1.Bactrias promotoras do crescimento vegetal 2. Bactrias

diazotrpicas 3. Recuperao de pastagens I. Ttulo

CDU : 579.8 :633.2(043)

Primeiramente a Deus, por estar presente em
todos os momentos da minha vida e por me
guiar nesta caminhada. Ao meu querido pai
(in memorian) que foi um exemplo de homem
e famlia. minha me, que sempre acreditou
em mim, minha irm, esposa e filhos pelo
apoio companheirismo e carinho.

DEDICO
 AGRADECIMENTOS

Universidade Jos do Rosrio Vellano - UNIFENAS, ao programa de ps-graduao em Cincia

Animal e Laboratrios de Microbiologia e de Fertilidade do Solo, pelas instalaes, e na figura das
pessoas, todos os funcionrios, professores e colegas do curso de ps-graduao, que me recepcionaram
com respeito, pelos ensinamentos e agradvel convivncia.

minha orientadora, Professora Dra. Ligiane Aparecida Florentino, e ao meu coorientador professor
Dr. Adauton Vilela de Rezende, pela oportunidade, pelos ensinamentos e confiana.

A CAPES/PROSUP, pela concesso da bolsa de estudos.

Aos membros da banca examinadora, Dra. Giselle Prado Brigante, Dra. Ligiane Aparecida Florentino
e Dr. Adauton Vilela de Rezende pela disponibilidade, contribuies e sugestes apresentadas.

Aos professores Dr. Joo Evangelista Fiorini, Dra. Nelma de Mello Silva Oliveira, pelas
orientaes e contribuies ao trabalho.

Aos colegas e amigos do Laboratrio de Microbiologia do Solo, pelos ensinamentos, auxlio no

cumprimento das atividades, pelo apoio, conselhos, incentivo e amizade, em especial aos funcionrios
Luciana Rosa Alves Rufino, Lucimara Silva, Csar A. Cunha, Paulo Csar Garcia Naves.

Aos colegas do curso de ps-graduao, Denner Lemos, Max Rossi, Mariana Spinelli; e aos colegas de
graduao, Flvia Romam, Larissa Compri, Gustavo Quiroga, Gustavo Matheus Barbosa, Rosane Veiga
Rose, pela amizade, companheirismo, pelo auxlio na conduo do experimento e pela tima
convivncia.

Aos amigos Tnia Venga, Jaqueline dos Santos, Adriana Maria Francisco, Sheila Silvrio Neves, Nilton
Oliveira Silva, Joo Batista Neves, Fran Ruffino, Drcio Rabelo, Hyelen Talita, Fabiano Dias Moreira,
Sidnei Marques, Elton Bueno, Alexandra Maria Dias, Marcos Donizete Silva, Anglica Rodrigues,
Rosana Mara Gonalves, Danusa Dias, Climene Cristina Siqueira, Marli Woelbert, Luiz Gonzaga
Ribeiro Neto, Wanderley Ferreira , Claudiomir da Silva dos Santos, J Alves, Anglica P. Todescato,
Ndia Cristina S. Mello, Camila Chioda de Almeida, Heber Garcia Bueno, Teresinha de Souza Tavares,
Elisngela Santos, Elton dos Santos, Renata Tavares, Marcos Bueno Miguel, Narayana de Deus N.
Bregagnoli, Pastor Carlos Roberto Pereira Silva pelo apoio, incentivo e pela amizade.
A todos os meus queridos professores do curso de ps-graduao, Dra. Ligiane Aparecida Florentino,
Dr. Adauton Vilela de Rezende, Dra. Patrcia Frana, Dr. Kleber Pelcia, Dra. Laura rfo, Dr. Paulo,
Dr. Amoracir, Dra. Roberta Bessa, Dra. Adlia Cel, pelo apoio, incentivo, ensinamentos, conselhos e
carinho.

Ao meu companheiro, amigo, referncia e pai, Maurcio Cndido Dias (in memrian), que sempre estar
comigo. Por todo amor, dedicao e ensinamentos; minha me, Anair de Melo Dias, minha querida
e amada irm Vera Lcia de Souza Dias, pelo incentivo e companheirismo, e s minhas tias Rosngela
Nannetti Dias e Aparecida Melo, pela compreenso, incentivo e carinho.

minha esposa Juliana Ramalho Bolognani Dias, pelo carinho, amor, e pacincia ao longo de toda esta
caminhada e aos meus queridos e amados filhos Mrcio Vincius Bolognani Dias e Carlos Eduardo
Bolognani Dias, por todas as vezes que sentia o fardo pesado e eles me recompensavam com um olhar,
um abrao, um sorriso.
"Jamais considere seus estudos como uma obrigao, mas como uma oportunidade invejvel
para aprender a conhecer a influncia libertadora da beleza do reino do esprito, para seu
prprio prazer pessoal e para proveito da comunidade qual seu futuro trabalho pertencer"
(A. Einstein)
 RESUMO

O objetivo desta pesquisa foi analisar a diversidade de bactrias diazotrficas associadas

e endofticas de Brachiaria brizantha, estudar o potencial destas em solubilizar fosfatos
inorgnicos de ferro e alumnio, produzir cido-3-indolactico (AIA) e avaliar o efeito da
inoculao destes isolados em Brachiaria brizantha cv MG 05 Vitria. As bactrias foram
isoladas de amostras de solos cultivados sob B. brizantha e partes de tecido vegetal desta
gramnea, nos perodos seco e chuvoso, nos municpios de Alfenas e Machado, Sul de Minas
Gerais. Foram utilizados cinco meios de cultura semisslidos e semisseletivos: FAM
(Azospirillum amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A.
amazonense) e NFb (Azospirillum spp.). Os testes de solubilizao de fosfato e produo de
AIA foram realizados in vitro e foram utilizados como critrio de seleo dos 22 isolados
bacterianos utilizados na inoculao de B. brizantha cv MG 5 Vitria, cultivada em vasos
contendo 20 dm3 de solo. Foram realizados dois cortes, em que foram avaliados os seguintes
parmetros: altura (Al), largura (LF) e comprimento da folha (CF), nmero de perfilhos (NP),
comprimento (CR) e massa seca da raiz (MSR), matria seca (MS), produtividade de matria
seca (PMS), fibra em detergente neutro (FDN) e cido (FDA) e a protena bruta na matria seca
(PBMS). Foi obtido um total de 332 isolados, sendo a maioria endofticos. O maior nmero e
diversidade foram provenientes do municpio de Alfenas. No perodo chuvoso foi verificado
maior nmero e diversidade de isolados em ambos os Municpios, quando comparado ao
perodo da seca. Trinta e cinco isolados solubilizaram fosfato de ferro e 78 produziram AIA,
destacando-se os isolados UNIFENAS 100-17, 21, 40 e 78, capazes de desempenhar ambas as
funes simultaneamente. A inoculao de estirpes diazotrficas de origem endofticas e
rizosfricas influenciaram no desenvolvimento de B. brizantha cv MG 5 Vitria, contribuindo
para a produo de MS, PMS e PBMS nas duas alturas de corte destacando-se os isolados
UNIFENAS-100-16, 21, 78 cujo teor de PBMS foi superior a 7%.

Palavras-chave: Bactrias promotoras do crescimento vegetal, bactrias diazotrficas,

recuperao de pastagens
 ABSTRACT

The objective of this research was to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria
associated and endophytic B. brizantha, study the potential the solubility of inorganic
phosphates of iron and aluminum, produce acid-3-indole acetic (AIA) and to evaluate the effect
of inoculation of these isolates in Brachiaria brizantha cv MG 05 Victoria. The bacteria were
isolated from soil samples grown under Brachiaria and parts of plant tissue this grass, the dry
and wet periods in the municipalities of Alfenas and Machado, southern Minas Gerais. Five
semisolid culture media and semi-selective were used: FAM (Azospirillum amazonense), JMV
(Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) and NFb (Azospirillum
spp.). The phosphate solubilization tests and AIA production were performed in vitro and were
used as of 22 bacterial isolates selection criteria used in the inoculation of B. brizantha cv MG
5 Victoria, grown in pots containing 20 dm3 of soil. There were two cuts, in what form evaluated
the following parameters: height (Al), width (LF) and leaf length (CF), number of tillers (NP),
length (CR) and root dry mass (MSR) dry matter (DM), dry matter yield (PMS), neutral
detergent fiber (NDF) and acid (ADF) and crude protein in dry matter (PBMS). A total of 332
isolates were obtained, most endophytic. The greatest number and diversity were from the city
of Alfenas. During the rainy season was verified greater number and diversity of isolates in
both municipalities, when compared to the dry season. Thirty-five isolates solubilized iron
phosphate and 78 produced AIA, especially the isolated UNIFENAS 100-17, 21, 40 and 78,
able to do both simultaneously. The inoculation of nitrogen fixing strains of endophytic origin
and rhizospheric influenced the development of B. brizantha cv MG 5 victory, contributing to
the production of MS, PMS and PBMS in the two cutting heights highlighting the UNIFENAS-
100-16 isolated, 21, PBMS 78 whose content was more than 7%.

Key words: Bacteria promoting plant growth, nitrogen fixing bacteria, pasture recovery
 LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1

Tabela 1. Valores mdios referentes pluviosidade, temperatura mnima e mxima no

municpios de Alfenas e Machado, nos meses de julho e dezembro de 2013. ......................... 35

Tabela 2. Caractersticas qumicas dos solos das reas de estudo dos municpios de Alfenas e
Machado. .................................................................................................................................. 36

Tabela 3. Nmero e diversidade de bactrias fixadoras de N2 isoladas de amostras de solo

cultivado sob Brachiaria brizantha e de tecidos vegetais (endofticas) desta gramnea, nos
municpios de Alfenas e Machado, nos perodos seco e chuvoso. ........................................... 38

Tabela 4. ndice de solubilizao (IS) de fosfato de ferro (FePO4.2H2O) em meio slido GELP
por bactrias diazotrficas de Brachiaria brizantha. ............................................................... 40

ARTIGO 2

Tabela 1. Resultado da anlise qumica do solo utilizado no experimento em vasos. ............ 52

Tabela 2. Altura (Al), Largura (LF) e comprimento da folha (CF), nmero de perfilhos (NP) e
matria seca (MS) de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria cutivada sob diferentes
tratamentos no primeiro corte e segundo corte. Massa seca radicular (MSR) e crescimento
radicular (CR) segundo corte. ................................................................................................... 54

Tabela 3. Porcentagem de matria seca total (MS), produtividade de matria seca g/vaso (PMS)
de B. Brizantha cv MG05 Vitria cultivada sob diferentes tratamentos no primeiro corte e
segundo corte. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente cido(FDA) e protena bruta na
matria seca (PBMS) segundo corte......................................................................................... 58
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIA cido-3-indolactico
Al Altura
BDA Batata Dextrose Agar
BPCV Bactrias Promotoras de Crescimento Vegetal
CF Comprimento da Folha
CR Crescimento Radicular
DIC Delineamento Inteiramente Casualizado
FBN Fixao Biolgica de Nitrognio
FDA Fibra em Detergente cido
FDN Fibra em Detergente Neutro
IAM cido ndole-3-acetamida
IpyA cido-3-pirvico
IS ndice de Solubilizao
LF Largura da Folha
MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
MS Matria Seca Total
MSR Matria Seca Radicular
NI Nmero de Isolados
NP Nmero de Perfilhos
PB Protena Bruta
PBMS Protena Bruta na Matria Seca
PMS Produtividade de Matria Seca
RPCPs Rizobactrias Promotoras de Crescimento de Plantas
SRCV Substncias Reguladoras do Crescimento Vegetal
 SUMRIO

CAPTULO 1 ...................................................................................................................... 15
1. INTRODUO .............................................................................................................. 16
2. REFERENCIAL TERICO ......................................................................................... 17
2.1 Fixao biolgica de nitrognio ............................................................................ 17
2.2 Associaes de diazotrficos com espcies vegetais ............................................ 17
2.3 Bactrias promotoras de crescimento vegetal ....................................................... 19
2.4 Solubilizao de fosfato ........................................................................................ 20
2.5 Produo de cido-3-indolactico ......................................................................... 21
2.6 Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria ............................................................... 22
2.7 Anlise bromatolgica de pastagens.....................................................................23
2.8 Uso de inoculantes ou biofertilizantes .................................................................. 25

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 26

CAPTULO 2 ...................................................................................................................... 31
ARTIGO 1:Diversidade de bactrias diazotrficas em pastagens B. brizantha ........... 32
INTRODUO .................................................................................................................. 33
MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 35
RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 38
CONCLUSES................................................................................................................... 42
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................... 42
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 42
ARTIGO 2: Bactrias diazotrficas e as caractersticas morfolgicas e bromatolgicas
de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria ........................................................................ 49
INTRODUO .................................................................................................................. 50
MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 51
RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 54
CONCLUSES................................................................................................................... 61
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................... 61
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 61
 15

CAPTULO 1
 16

1 INTRODUO

O solo constitudo por organismos microscpicos e macroscpicos que desempenham

diferentes funes como a decomposio e mineralizao da matria orgnica, a ciclagem de
nutrientes e a fixao biolgica de nitrognio (FBN), processos estes que garantem a
manuteno e o equilbrio no ecossistema terrestre (Moreira & Siqueira, 2006). O potencial de
utilizao da FBN tem sido intensamente estudado devido ao fornecimento de nitrognio,
contribuindo assim para a sustentabilidade agrcola, onde os solos apresentam baixo nvel de
fertilidade, principalmente em regies tropicais.
A degradao das pastagens no Brasil est em torno de 70%, fenmeno este que pode
ser explicado, principalmente, pela baixa fertilidade natural dos solos e pela falta de reposio
de nutrientes (Macedo, 2005). Cerca de 78% do ar atmosfrico constitudo por gs nitrognio
(N2), entretanto, nessa forma, este elemento no est disponvel nutricionalmente para a maioria
dos seres vivos. Apenas uma pequena parcela de procariotos que possuem a enzima nitrogenase
capaz de reduzir o N2 para a forma inorgnica NH3, forma de nitrognio disponvel para os
vegetais e outros organismos.
Os procariotos que realizam esse processo so denominados fixadores de nitrognio
(N2) ou diazotrficos, e o processo que mediam, a FBN. Esses procariotos estabelecem
associao ou simbiose com espcies vegetais podendo fornecer o nitrognio total ou parcial
para o desenvolvimento da planta. Como exemplo de associao em gramneas forrageiras,
como a Brachiaria sp. temos as bactrias associativas endofdicas facultativas do gnero
Azospirillum que podem ser encontradas na rizosfera, interior das razes, colmos e folhas.
Bactrias desse gnero podem ainda contribuir para o crescimento vegetal por meio de
produo do hormnio cido-3-indolactico (AIA) (Reis Jnior et al., 2004).
As bactrias fixadoras de N2, podem ser encontradas em vida livre, em associao com
diversas espcies vegetais ou em simbiose com leguminosas. Algumas espcies de bactrias
associativas, alm de colonizar abundantemente a rizosfera, podem tambm ocorrer
endofiticamente, ou seja, invadir o crtex e colonizar tecidos internos em diversas espcies
vegetais sem formar ndulos. Embora tambm possam ser encontrados em dicotiledneas, os
resultados demonstram que esta ocorrncia mais generalizada em gramneas e outras
monocotiledneas.
O manejo da FBN em gramneas depende, entre outros, da identificao da(s) espcie(s)
que contribui(em) significativamente para o processo. Como elas no formam estruturas
 17

anatmicas diferenciadas (como os ndulos de leguminosas), sua localizao e ocorrncia na

rizosfera e no interior dos tecidos vegetais pesquisada colocando-se amostras de solo,
rizosfera, raiz ou outro material vegetal em meios de cultura seletivos para cada espcie.
Nesse contexto, este estudo foi realizado com o objetivo de analisar a diversidade e o
potencial de bactrias fixadoras de nitrognio associadas Brachiaria brizantha cv MG5
Vitria.

2 REFERENCIAL TERICO

2.1 Fixao biolgica de nitrognio

A FBN um processo essencial para a manuteno da vida, pois o nitrognio o

constituinte bsico das protenas, vitaminas e sais minerais, os quais so fundamentais na
nutrio animal, sendo estes sintetizados pelas plantas a partir de carboidratos produzidos no
processo da fotossntese e de ons como NH4+ e NO3- absorvidos do solo. As principais fontes
desses ons no solo so: a fixao biolgica de nitrognio (175 X 106 ton N ano-1), a fixao
industrial (49 X 106 ton N ano-1) e a fixao atmosfrica (10 X 106 ton N ano-1) (Moreira &
Siqueira, 2006).
Apenas algumas espcies de bactrias possuem a enzima nitrogenase que com a
participao de Fe, Mg, Mo e ATP capaz de transformar N2 em NH3, ocorrendo assim a
reduo de N2 e consequentemente o processo FBN pelo qual o nitrognio presente na
atmosfera incorporado pelas plantas na forma de nitrato ou amnia (Dbereiner, 1979). Estas
espcies de bactrias podem viver livremente no solo ou em simbiose e associaes com
algumas espcies vegetais e at animais. O nitrognio obtido atravs de simbioses muito
menos sujeito a lixiviao, no s porque translocado diretamente para a planta, mas, tambm
porque a FBN autorregulada, isto , o nitrognio s fixado quando este elemento est
limitando o sistema.

2.2 Associaes de diazotrficos com espcies vegetais

Algumas espcies de diazotrficos podem, alm de colonizar abundantemente a

rizosfera, ocorrer endofiticamente, ou seja, invadir o crtex e colonizar tecidos internos em
 18

diversas espcies vegetais sem formar ndulos. Embora tambm possam ser encontrados em
dicotiledneas, os resultados demonstram que esta ocorrncia mais generalizada em
gramneas e outras monocotiledneas. Espcies mais comumente encontradas so: Azospirilum
spp. (A. lipoferum, A. brasilense, A.amazonense, A. halopraeferans, A. irakense), Azotobacter
paspali, Bacillus polimixa, B. azotofixans, Azoarcus indigens, A.communis, Acetobacter
diazotrophicus (syn. Gluconobacter diazotrophicus), Herbaspirillum seropedicae, H.
rubrisubalbicans e Burkholderia spp.. Espcies dos gneros Azoarcus, Acetobacter e
Herbaspirillum so consideradas obrigatoriamente ou predominantemente endofticas, uma vez
que sua ocorrncia praticamente restrita aos tecidos internos vegetais.
Experimentos conduzidos pelo mtodo de incorporao do 15N2 confirmaram que vrias
gramneas tropicais se beneficiam de nitrognio fixado biologicamente (Vinhal-Freitas, 2010).
Bactrias diazotrficas isoladas de gramneas foram identificadas como pertencentes ao
gnero Burkholderia (Van et al. , 1996; Baldani et al., 2000) e a espcie de Burkholderia isolada
de leguminosas apresentou alta similaridade com isolados de gramneas (Moulin et al., 2001).
Estes resultados mostram uma interessante relao ecolgica entre a fixao de nitrognio em
gramneas e leguminosas que deve ser estudada no sentido de verificar como isto atua na
sustentabilidade dos ecossistemas.
O manejo da FBN em gramneas depende, entre outros, da identificao da (s) espcie
(s) que contribui (em) significativamente para o processo. Como elas no formam estruturas
anatmicas diferenciadas (como os ndulos de leguminosas), sua localizao e ocorrncia na
rizosfera e no interior dos tecidos vegetais pesquisada colocando-se amostras de solo,
rizosfera, raiz ou outro material vegetal em meios de cultura seletivos para cada espcie. A
ocorrncia de espcies endofticas (que ocorrem dentro dos tecidos) pesquisada
desinfestando- se superficialmente a amostra com produtos como Cloramina-T ou gua
sanitria, entre outros. Frequentemente, mais de uma espcie e at mais de um gnero so
encontrados na mesma espcie vegetal. Alm disso, outras espcies no detectadas pelos meios
de cultivo utilizados ou espcies no cultivveis podem tambm estar ocorrendo. No entanto,
alguns resultados mostraram correlao com a incidncia de determinadas espcies e as
demandas nutricionais da planta. Por exemplo, o nmero de clulas de Azospirillum spp.
constante no solo e na rizosfera (ecto + endorhizosfera) de milho durante todo o ciclo da planta,
porm quando as bactrias da ectorrizosfera so eliminadas atravs da esterilizao superficial
com Chloramina-T, verifica-se que o nmero destas bactrias na endorhizosfera da raiz
aumenta bastante na florao e posteriormente no enchimento de gros, justamente quando a
demanda de nitrognio e de outros nutrientes pela planta maior (Magalhes et al., 1979). Alm
 19

disso, os nmeros totais de Azospirillum spp. no interior das razes se correlacionaram com o N
acumulado em trigo (Baldani et al., 1983).
Apesar da pesquisa sobre diazotrficos associativos no Brasil ter se iniciado na dcada
de 50 por Dbereiner e colaboradores, com os gneros Azotobacter e Beijerinckia, ela s foi
intensificada a partir da descoberta de novas espcies de Azospirillum (Dobereiner, 1978), que
coincidiu com a chamada crise do petrleo, despertando o interesse por alternativas
biolgicas aos fertilizantes nitrogenados utilizados na agricultura. A partir de ento, vrias
espcies novas tm sido descobertas e ensaios de inoculao de diazotrficos associativos em
plantas tm sido realizados no Brasil e em outros pases.
Os clculos da contribuio de N fixado para gramneas esto em torno de 25 a 50 kg N
ha-1 o que equivale ao suprimento mdio de cerca de 17% das demandas da cultura (Moreira,
2010). Considerando a importncia que as espcies produtoras de gros, como trigo, arroz e
milho, entre outras, so a principal fonte de carboidrato da dieta humana e o alto potencial
fotossinttico das gramneas C4 nos trpicos, esta taxa de FBN, mesmo baixa, representa uma
grande economia nos custos de produo, o que justifica estudos visando seu manejo.

2.3 Bactrias promotoras de crescimento vegetal

As bactrias promotoras de crescimento vegetal (BPCV) so aquelas capazes de

promover o desenvolvimento da planta de forma direta ou indireta. Estas bactrias promotoras
do crescimento so encontradas na rizosfera e tambm so conhecidas como rizobactrias
promotoras de crescimento de plantas (RPCPs).
Na promoo do crescimento de forma direta, as bactrias sintetizam um composto ou
facilitam a absoro de certos nutrientes do meio ambiente, fornecendo desta forma para a
planta nitrognio fixado, fsforo solubilizado do solo e fitormnios como as auxinas (Glick &
Bashan, 1997). Tambm pode ocorrer como efeito direto, a reduo do potencial de membrana
das razes (Bashan & Levanony, 1991) e sntese de algumas enzimas que regulam o nvel de
hormnio na planta (Glick et al., 1998). Na promoo indireta do crescimento, a bactria
diminui ou previne os efeitos deletrios de organismos patgenos (Glick & Bashan, 1997), pela
sntese de siderforos (Leong, 1986) e antibiticos.
As substncias sintetizadas pelas bactrias, conhecidas como substncias reguladoras
do crescimento vegetal (SRCV) so compostos orgnicos naturais, que influenciam em
processos fisiolgicos nas plantas, sendo que estas substncias tambm podem ser produzidas
 20

no s pelo micro-organismo, mas tambm pela prpria planta, como as auxinas. Fatores como
disponibilidade de nutrientes, temperatura, pH, composio e quantidade de substrato na
rizosfera afetam a sntese de SRCV (Moreira & Siqueira, 2006).
A maior parte dos estudos envolvendo as BPCV esto relacionadas com a aplicao na
agricultura. Estudos mostram que alm da capacidade de fixar nitrognio, algumas estirpes dos
gneros Bradyrhizobium e Rhizobium apresentam potencial de utilizao de como BPCV em
no leguminosas, como o rabanete (Raphanus sativus L.), na produo de fitormnios,
solubilizao de fosfato e produo de siderforos (Antoun et al., 1998). Juntamente com
resduos orgnicos, Bacillus subtilis, uma BPCV, apresentou potencial para incrementar a
nutrio e crescimento de algodo (Gossypium L.) e soja (Glycine max L.) (Araujo, 2008).
As BPCV tambm so utilizadas associadas a bactrias nodulferas para o melhor
desenvolvimento do vegetal. Silva et al.(2007) observou que quando inoculado BPCV,
Paenibacillus e Bacillus, na simbiose entre caupi (Vigna unguiculata L.) e Bradyrhizobium
(BR2001), ocorreu um aumento na nodulao e como consequncia, promovendo uma melhor
fixao de nitrognio. Petersen et al., (1997), observou que a inoculao de Paenibacillus
polymyxa, juntamente com Rhizobium etli em sementes de feijo (Phaseolus vulgaris L.)
aumentou a densidade de rizbio na superfcie da raiz, mostrando a ao indireta de P. polymyxa
sobre o rizbio, e tambm o aumento do nmero de ndulos e de razes laterais da planta.
Apesar da importncia, as pesquisas sobre a utilizao de BPCV ainda so pouco difundidas.

2.4 Solubilizao de fosfato

O Fsforo (P), assim como o nitrognio, um elemento exigido em grande quantidade

para o crescimento dos vegetais. Este elemento constituinte de biomolculas, como cidos
nucleicos, coenzimas e outros. Ao mesmo tempo, um dos nutrientes que mais limita a
produo agrcola, por ser encontrado nos solos em formas altamente insolveis. Quando
disponvel nos solos de forma solvel, as plantas podem absorver o P na soluo de solo como
nions de fosfato, predominantes nas formas de HOP42- e H2PO4- (Wakelin et al., 2004).
Esta baixa disponibilidade nos solos devido a sua ligao a outros componentes
qumicos. Geralmente, em solos cidos, a maior parte deste elemento se encontra ligado a xido
de ferro e alumnio e em solos alcalinos ou neutros, este elemento se liga ao clcio (Moreira &
Siqueira, 2006). Estudos de Barroso & Nahas (2005) sobre as fraes de fsforo encontrados
 21

em solos brasileiros sob pastagem, cultivo de milho, mata e florestas, demonstraram que a mais
frequente foi a de fosfato de ferro, seguida de fosfato de alumnio e fosfato de clcio.
Alguns fungos e bactrias possuem a capacidade de disponibilizar este fosfato ligado a
outro elemento, processo responsvel por aumentar a disponibilidade de P no solo. Estudo com
diferentes espcies bacterianas quanto a sua capacidade de solubilizao mostram que espcies
de Rhizobium, Pseudomonas e Bacillus apresentam o maior potencial de solubilizao
(Rodrguez & Fraga, 1999).
Segundo a literatura, estes micro-organismos solubilizam o fosfato inorgnico por dois
mecanismos principais, sendo pela produo de cidos orgnicos ou pela secreo de prtons
(H+) (Illmer et al., 1995). A solubilizao do fosfato tambm varia de acordo com a natureza
do mineral de fosfato fornecido e a composio meio que o micro-organismo inoculado
(Gyaneshwar et al., 1998). Em campo, esta eficincia varia de acordo com o tipo de solo e a
cultura (Rodrguez & Fraga, 1999).
Inicialmente, Gerretsen (1948) observou que a quantidade de fsforo assimilado pelas
plantas inoculadas com micro-organismos rizosfricos foi maior do que o tratamento sem
inoculao, demonstrando a capacidade dos micro-organismos em solubilizar fsforo
inorgnico, contribuindo assim para o desenvolvimento da planta. Dentre os micro-organismos
solubilizadores de fosfato, merecem destaque as bactrias fixadoras de nitrognio atmosfrico,
que, alm de fornecer o N para o desenvolvimento vegetal, podem tambm contribuir com o
fornecimento de P para as plantas (Rodriguez & Fraga, 1999; Marra et al., 2012).

2.5 Produo de cido-3-indolactico

As auxinas so compostos que estimulam o crescimento, sendo o cido-3-indolactico

(AIA) a principal auxina encontrada nas plantas. Nas plantas, o AIA produzido no meristema
apical do caule, folhas jovens, flores, frutos em desenvolvimento e sementes, sendo que tambm
encontrado nas razes. O seu transporte ocorre unidirecionalmente, atravs de clulas
parenquimticas do floema e parenquimticas que circulam os tecidos vasculares (Raven et al.,
2001) Este fitormnio o mais estudado e tambm o que tem maior ocorrncia de produo
pelas bactrias.
Entre as BPCV, tem sido demonstrado que o aumento da proliferao da raiz est
relacionada com a biossntese de AIA. Dobbelaere et al. (1999), estudando mutantes de
Azospirillum, constatou que o aumento da raiz est relacionado com a biossntese de AIA pela
 22

bactria, aumentando absoro de nutrientes e a liberao de exudados. Estudos de Kaneshiro

e Kwoleck (1985) demonstraram que a inoculao de mutantes espontneos de B. japonicum
que produzia mais AIA resultou em um aumento do volume do ndulo da raiz.
Estudos com estirpes de Azospirillum brasilense mostraram a existncia de pelo menos
trs vias biossintticas de AIA, sendo duas dependentes de triptofano, via do cido indole-3-
acetamida (IAM) e a via do cido indole-3-piruvato (IpyA), e uma via independente de
triptofano (Princen et al., 1993). A via do cido indole-3-pirvico (IPyA) a via principal para
a produo de AIA na presena de triptofano exgeno (Dobbelaere et al., 1999). O aminocido
L-triptofano funciona como um precursor fisiolgico na biossntese de auxina em plantas e em
micro-organismos (Khalid, 2004).
Chagas-Junior et al. (2009), avaliou em meio de cultura a produo de AIA por bactrias
isoladas de solos da Amaznia, verificando que as 92 estirpes produziram AIA sem a adio de
triptofano, porm, em 52 isolados, a adio e a elevao da concentrao de triptofano
aumentaram a produo deste fitormnio. Prinsen et al.(1993) elucidou que 90% do AIA
produzido por Azospirillum brasiliense sintetizado pela via no dependente de triptofano.

2.6 Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria

As pastagens representam um dos maiores ecossistemas do Brasil, sendo caracterizadas

como complexas, com seus componentes biticos a abiticos organizados, os quais interagem
entre si, determinando assim, a amplitude das respostas de plantas e animais (Da Silva et al.,
2008).
As gramneas so classificadas basicamente em duas categorias: C3 (temperadas) e C4
(tropicais como o capim marandu), as quais levam em considerao a sua adaptao ambiental
e a sua eficincia fotossinttica, respectivamente. Em termos de digestibilidade, teor de protena
e consumo, as forrageiras temperadas apresentam melhor qualidade (Moreira, 2006), j as
forrageiras tropicais proporcionam maior eficincia fotossinttica, o que consequentemente as
tornam mais produtivas em termos de matria seca (Valle, 2001).
Dentre as diversas variedades de plantas forrageiras, a mais utilizada a do gnero
Brachiaria, a qual pertence famlia das poceas, reunindo cerca de 100 espcies, as quais so
de grande importncia econmica, sendo distribuda por regies tropicais e subtropicais,
ocupando desta forma, a maior parte das pastagens cultivadas (Valle et al., 2009).
 23

A B. brizantha (Hochst.) Stapf. cv. MG05 Vitria uma gramnea forrageira com
caractersticas especficas, como sendo uma gramnea perene, poliploide, de reproduo
apomtica (Bogdan, 1977). Excelente vigor vegetativo, alta produtividade, com crescimento
entouceirado e talos prostrados que podem se enraizar quando em maior contato como o solo,
podendo atingir at 1,60m de altura. Suas folhas so lanceoladas com pouca pubescncia, com
inflorescncia em forma de pancula que mede de 40 a 50cm. A MG05 Vitria apresenta uma
ampla adaptao edafoclimtica e pode ser recomendada para regies onde o perodo de seca
pode chegar a 5 meses e em regies com precipitaes superiores a 3.000 mm anuais.
Uma de suas caractersticas a capacidade de adaptao a solos cidos e arenosos e com m
drenagem sendo a mais importante a sua boa produo de matria seca. Apresenta um teor em
torno de 13% de protena bruta e digestibilidade em torno de 62,3%.
Embora as diferentes espcies de Brachiaria sejam tolerantes ao manejo inadequado e
deficincia da disponibilidade de nutrientes, estes e outros fatores contribuem no aumento da
degradao de reas cultivadas com a respectiva gramnea. Por outro lado, uma pastagem bem
manejada favorece a maior cobertura vegetal, contribuindo assim com a conservao do solo e
gua (Bonfim-Silva et al., 2011).

2.7 Anlise bromatolgica de pastagens

Quando se analisa as condies de pastagens tropicais, observa-se que as mesmas

apresentam um potencial elevado no que se refere produtividade de forragem por rea,
entretanto, o teor de protena baixo, com alto teor de fibra, o que consequentemente evidencia
a sua baixa digestibilidade.
Para que se possa fazer a anlise do potencial de produo e crescimento de uma
determinada forrageira, necessrio determinar o teor de substncias nutritivas por meio de
anlises qumicas bromatolgicas (Silva & Queirz, 2002).
Segundo Souza (2002), a cultivar B. brizantha vem se destacando no cenrio nacional
cujos rendimentos esto entre 10 a 18 toneladas de MS ha-1 ano-1, com valores nutricionais
considerveis.
Em relao aos teores de MS, constata-se que diferentes intervalos de corte, e com o
avano da idade das plantas, ocorre o seu aumento, os quais podem variar de 16,0 a 26,6% em
intervalos de 15 a 60 dias de crescimento (Costa et al., 2007).
 24

As maiores alteraes que podem ocorrer na composio qumica das forrageiras so as

decorrentes da maturidade da planta, onde, medida que esta amadurece, a proporo de
celulose, lignina e hemicelulose, decrescem, e outras fraes indigestveis se elevam,
contribuindo assim com a queda na digestibilidade (Mari, 2003).
O conhecimento quanto variao da composio qumica em plantas forrageiras em
seus estdios fenolgicos um dos fatores que devem ser considerados quando se pretende
realizar o manejo adequado, onde a maturao da gramnea promove a reduo nos teores de
protena bruta e elevao no teor de matria seca, celulose e lignina, o que interfere na
aceitabilidade da gramnea pelos animais. Cortes ou pastejos menos frequentes proporcionam
maior produo da forragem, porm ocorrem alteraes na sua composio qumica (Lista et
al., 2007).
Na avaliao do valor nutritivo e da composio bromatolgica de plantas forrageiras,
fatores como fibra em detergente cido (FDA), fibra em detergente neutro (FDN), protena
bruta (PB) apresentam um papel importante na anlise quanto qualidade da gramnea (Van
Soest, 1994), pois a digestibilidade est diretamente relacionada aos teores de FDA (lignina e
celulose) e FDN (celulose, hemicelulose e lignina) presentes na forrageira, onde o aumento
significativo do teor de fibras diminuiu a digestibilidade da matria seca. Quanto menor for o
teor de FDA constituinte da matria seca (MS), maior ser o valor energtico, onde nas
gramneas, valores mdios em torno de 35% so considerados bons para efeitos de
digestibilidade (Mesquita et al., 2002).
Estudos realizados por Mesquita et al. (2002), em relao ao estabelecimento de
pastagens formadas por Brachiaria concluram que a FDN da Brachiaria decumbens
apresentou variao entre 68,1 a 72,4% e a protena bruta entre 6,2 e 7,6%.
Quando se avalia a digestibilidade de um volumoso deve-se levar em considerao os
teores de FDA, pois valores elevados do mesmo diminuem a digestibilidade da MS (Branco,
2006).
A altura da planta, a relao entre colmo e folha, a dinmica do perfilhamento a
expanso foliar, entre outros fatores, podem ter relao direta em relao produtividade e
qualidade da forragem (Costa & Paulino et al., 2007).
 25

2.8 Uso de inoculantes ou biofertilizantes

O termo biofertilizante usado para definir todos os produtos que contenham micro-
organismos, os quais apresentem a capacidade de influenciar de forma positiva o
desenvolvimento das plantas (Reis, 2006).
A utilizao de inoculantes ou biofertilizantes, contendo bactrias diazotrficas tem
como objetivo proporcionar um nmero suficiente de clulas capazes de promover a rpida
colonizao da rizosfera, o que permitiria um aumento na produtividade, segundo Catroux
(1991).
Deaker et al. (2004) descreve a necessidade dos inoculantes apresentarem determinadas
caractersticas, como qual a estirpe utilizada e sua competitividade, o nmero de clulas
necessrias ou viveis para a rpida colonizao da rizosfera e do tecido vegetal (razes),
obtendo assim o maior potencial de utilizao destes organismos.
A produo de inoculantes utilizando-se de veculos no txicos, solveis em gua e
associadas a estirpes competitivas deve ser levada em considerao para novos estudos e para
o desenvolvimento de novos biofertilizantes, no se esquecendo da responsabilidade social,
ambiental e inovao tecnolgica (Fernandes Jnior, 2006).
Segundo Reis, (2006) para que se obtenha sucesso quanto ao uso da inoculao,
necessrio que se faa a seleo de estirpes eficientes e que estas sejam tolerantes ao estresse,
j que as bactrias diazotrficas so encontradas em diferentes tipos de solo e sua sobrevivncia
est condicionada a fatores como a salinidade, seca e o pH do solo.
Ferreira et al. (1987) observaram que estirpes do gnero Azospirillum atuam no
crescimento vegetal atravs do processo de reduo do nitrato, o que contribuiria com a planta
para que a mesma no dispensasse energia na reduo do nitrato amnia, o que permitiria um
ganho de energia, a qual seria gasta em outros processos vitais planta.
No entanto, embora os benefcios apresentados, observa-se que os estudos de FBN ainda
so incipientes para as gramneas do gnero Brachiaria spp, uma vez que ainda no se encontra
disponvel no mercado estirpe aprovada como inoculante para este gnero pelo Ministrio da
Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA, 2011).
 26

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 31

CAPTULO 2
 32

ARTIGO 1
(Artigo formatado de acordo com as normas da Revista Cincia Rural- ISSN 0103-8478 B1- a ser submetido)

Diversidade de bactrias diazotrficas em pastagens Brachiaria brizantha

(Diversity of diazotrophic bacteria in pasture Brachiaria brizantha)

Mrcio de Souza Dias1; Ligiane Aparecida Florentino2; Adauton Vilela de Rezende 3.

Resumo O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade de bactrias diazotrficas

associadas e endofticas de Brachiaria brizantha em duas pocas do ano e estudar a capacidade

destas em solubilizar fosfatos inorgnicos e produzir cido-3-indolactico (AIA). As bactrias

foram isoladas de amostras de solos cultivados sob B. brizantha e partes do tecido vegetal desta

gramnea, coletadas nos municpios de Alfenas e Machado, nos perodos seco e chuvoso. Foram

utilizados cinco meios de cultura semisslidos e semisseletivos: FAM (Azospirillum

amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) e

NFb (Azospirillum spp.). Foi obtido um total de 332 isolados, sendo a maioria endofticos. Os

isolados foram agrupados de acordo com as caractersticas morfolgicas, que foram utilizadas

para estimar a diversidade utilizando-se o ndice de Shannon. Os testes de solubilizao de

fosfato e produo de AIA foram realizados in vitro para todos os isolados. O maior nmero e

diversidade foram provenientes do municpio de Alfenas. No perodo chuvoso foi verificado

maior nmero e diversidade de isolados em ambos os Municpios, quando comparado ao

perodo da seca. Trinta e cinco isolados solubilizaram fosfato de ferro e 78 produziram AIA,

destacando-se os isolados 100-17, 100-21, 100-40 e 100-78, capazes de desempenhar ambas as

funes simultaneamente.

Palavras-chave: Fixao biolgica de nitrognio, degradao pastagens, bactrias promotoras

crescimento vegetal.

________________________
1
Universidade Jos do Rosrio Velano UNIFENAS. 2*Faculdade de Agronomia UNIFENAS. E-mail:
ligianeflorentino@gmail.com (Autor para correspondncia). 3Faculdade de Agronomia UNIFENAS, Alfenas,
MG.
 33

Abstract - The objective of this study was to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria

associated and endophytic B. brizantha in two seasons and study the capacity the solubility of

inorganic phosphates and produce acid-3-indole acetic (AIA). The bacteria were isolated from

soil samples grown under Brachiaria and parts of the plant tissue of this grass, collected in the

cities of Alfenas and Machado, the dry and wet periods. Five semisolid culture media and semi-

selective were used: FAM (Azospirillum amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb

(Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) and NFb (Azospirillum spp.). A total of 332

isolates were obtained, most endophytic. Isolates were grouped according to the morphological

characteristics that were used to estimate the diversity using the Shannon index. Phosphate

solubilization and AIA tests were performed in vitro production of all isolates. The greatest

number and diversity were from the city of Alfenas. During the rainy season was verified

greater number and diversity of isolates in both municipalities, when compared to the dry

season. Thirty-five isolates solubilized iron phosphate and 78 produced AIA, highlighting the

isolated 100-17, 100-21, 100-40 and 100-78, able to do both simultaneously.

Key words: Biological nitrogen fixation, degradation pastures, promoting bacteria plant

growth.

INTRODUO

Estima-se que cerca de 70% das pastagens cultivadas no Brasil encontram-se em

processo de degradao, fenmeno este que pode ser explicado, principalmente, pela baixa

fertilidade natural dos solos das regies tropicais e pela falta de reposio de nutrientes

(MACEDO, 2005), sendo que o nitrognio considerado o elemento mais limitante

produtividade de Brachiaria spp. (VASCONCELOS, 2006).

Nesse sentido, o uso da biotecnologia da fixao biolgica do nitrognio atmosfrico

(N2) (FBN), mediada pelas bactrias diazotrficas ou fixadoras de N2, apresenta-se como uma
 34

alternativa substituio na utilizao de fertilizantes nitrogenados, reduzindo os custos de

produo e tambm possveis impactos ambientais provocados pelas reaes bioqumicas deste

elemento no solo.

No entanto, a FBN tem sido mais difundida no cultivo de leguminosas, formando uma

interao simbitica, evidenciada pela formao de ndulos radiculares e/ou caulinares

(MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Mas, diversos estudos indicam o benefcio da inoculao

com as bactrias diazotrficas em diferentes gramneas forrageiras (DIDONET et al., 1996;

CAVALLET et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2007). Nesse caso, no ocorre a formao de

ndulos e essas bactrias podem se estabelecer na rizosfera dessas plantas, formando uma

associao, ou serem encontradas no interior dos tecidos (endofticas).

A inoculao de estirpes bacterianas diazotrficas em Brachiaria spp. indicam que

estas podem fornecer parte do N necessrio ao desenvolvimento vegetal, suprindo at 40 kg N

ha-1 (BODDEY & VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013). Alm do fornecimento do nitrognio,

estudos indicam que essas bactrias podem contribuir para a promoo do crescimento vegetal

por meio da produo de hormnios, como o cido-3-indolactico (AIA), solubilizao de

fosfatos inorgnicos e controle de patgenos (BASHAN & HOLGUIN, 1997; CAVALLET et

al., 2000; REIS JNIOR et al., 2004).

Apesar dos benefcios apresentados, observa-se que os estudos de FBN ainda so

incipientes para as gramneas do gnero Brachiaria spp. Nesse sentido, o objetivo deste estudo

foi analisar a diversidade de bactrias diazotrficas associadas e endofticas de Brachiaria

brizantha e a capacidade destas em solubilizar fosfatos inorgnicos de ferro e alumnio e

produzir o hormnio AIA.

 35

MATERIAL E MTODOS

As amostras de solo e de tecido vegetal (razes) utilizadas no estudo foram coletadas

em reas de pastagens cultivadas com B. brizantha, sendo trs nos municpios de Alfenas (P01:

S 21 27,638' e W 045 55, 692'; P02: S 21 23,921' e W 045 56, 199'; P03: S 21 23,167' e

W 045 56, 474') e trs no municpio de Machado (P01: S 21 39.836' e W 045 59.707'; P02:

S 21 38.883' e W 046 01.681'; P03: S 21 37.707' e W 046 01.385'), localizados na regio Sul

do Estado de Minas Gerais, nos perodos seco e chuvoso, respectivamente, julho e dezembro

de 2013 (tabela 1).

Tabela 1. Valores mdios referentes pluviosidade, temperatura mnima e mxima no

municpios de Alfenas e Machado, nos meses de julho e dezembro de 2013.

Perodo de seca Perodo chuvoso
Parmetros
Alfenas Machado Alfenas Machado

Pluviosidade (mm) 26,4 43,0 158,6 148,0

Temperatura mnima (C) 16,7 12,0 23,2 19,0

Temperatura mxima (C) 18,2 29,0 24,5 32,0

Dados obtidos em: http://www.inmet.gov.br

As amostras de solos foram coletadas na camada de 0-20 cm, seguindo a metodologia

adotada por GUIMARES et al., (2012). Esses mesmos pontos foram utilizados para coleta de

razes de B. brizantha. O material coletado (solo e razes) foram conservados em caixas trmicas

a 4C. As amostras de solos foram submetidas a anlises das caractersticas qumicas conforme

mtodos compilados em EMBRAPA (2011) (tabela 2).

 36

Tabela 2. Caractersticas qumicas dos solos das reas de estudo dos municpios de Alfenas e

Machado.
pH (H2O) P K Ca+ Mg+ Al+ H + Al SB t T V m MO
Local
mg dm-3 cmolc dm-3 % dag Kg-1

Alfenas

P01 5,6 0,5 30 2,4 0,8 0 2,8 3,3 3,3 6,1 54 0 34

P02 6 1 42 3,7 1,0 0 3,1 4,7 4,7 7,8 60 0 43

P03 5,5 0,5 114 2,4 0,8 0,1 3,8 3,5 3,6 7,3 48 3 42

Machado

P01 5,3 1 128 1,8 0,8 0,5 7,2 2,9 3,4 10,1 29 15 35

P02 5,2 0,5 68 0,7 0,6 0,6 4,7 1,5 2,1 6,2 24 28 45

P03 5,6 0,5 120 1,6 0,7 0 2,5 2,6 2,6 5,1 51 0 33

O isolamento das bactrias diazotrficas foi realizado por meio da inoculao das

amostras (solo e razes), em frascos contendo meios de cultura semisslidos e semisseletivos:

NFb (Azospirillum spp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) (DBEREINER

et al., 1995), JMV (Burkholderia spp.) (REIS et al., 2004) e FAM (Azospirillum amazonense)

(MAGALHES & DBEREINER, 1984).

A metodologia utilizada para realizao da inoculao do solo e das razes nos

diferentes meios de cultivo foi de acordo, respectivamente, com DINIZ et al. (2012) e SANTOS

et al. (2013). Aps o isolamento, procedeu-se a purificao e as bactrias foram inoculadas

novamente nos meios de origem para confirmao da capacidade de fixao de N2, evidenciada

pela formao da pelcula na superfcie dos meios. Posteriormente, procedeu-se a

caracterizao morfolgica em meio batata dextrose Agar (BDA), contendo azul de

bromotimol, em que foram avaliados os seguintes parmetros: tempo de crescimento (rpido,

intermedirio, lento), alterao do pH do meio (neutro, cido, cido/alcalino, alcalino), cor

 37

(amarelo, creme), forma (regular, irregular), absoro de indicador (sim, no), produo de

exopolissacardeo (escassa, baixa, mdia, alta). Essas caractersticas foram utilizadas para

agrupar os isolados e estimar a diversidade pelo ndice de Shannon-Weaver, sendo determinada

pela frmula a seguir:

= [ ln ]

em que: H = ndice de Shannon-Weaver; ni = nmero de grupos formados com as diferentes

caractersticas culturais; N = nmero total de isolados; ln = logaritmo na base natural.

Os isolados foram avaliados quanto capacidade de solubilizar fosfato de ferro

(FePO42H2O) e de alumnio (AlPO4.2H2O), utilizando-se respectivamente os meios GELP e

GES (SYLVESTRES-BRADLEY, 1982) e seguindo-se a metodologia adotada por MARRA et

al. (2012). A cada trs dias, por um perodo de 12 dias, com o auxlio de um paqumetro digital,

foi medido o dimetro da colnia e do halo de solubilizao, obtendo-se assim o ndice de

solubilizao (IS) de acordo com BERRAQUERO et al. (1976), que classifica os isolados em

baixa (IS < 2 mm), mdia (2 IS < 4 mm) e alta (IS > 4mm) capacidade de solubilizao. Foi

utilizado o delineamento inteiramente casualizado (DIC) e os valores de IS foram comparados

pelo teste de Skott-Knott a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa Sisvar (FERREIRA,

2011).

Devido ao grande nmero de isolados, a produo de AIA foi determinada conforme

metodologia descrita por BRICK et al. (1991) e CATTELAN(1999). Utilizaram-se quatro

repeties, sendo avaliadas a presena ou ausncia da produo de AIA, de acordo com a

formao de halo avermelhado ao redor das colnias bacterianas.

 38

RESULTADOS E DISCUSSO

Foi obtido um total de 332 isolados, dos quais, 203 oriundos do municpio de Alfenas,

sendo 135 de origem endoftica e 68, do solo. No municpio de Machado foram obtidos 129,

sendo 79 de origem endoftica e 50 oriundos do solo. Esses isolados bacterianos foram isolados

dos cinco diferentes meios de cultivo, de acordo com a seguinte distribuio: 15% foram

isolados a partir do meio FAM, 20% do meio JMV, 21% do meio LGI, 21% do meio NFb e

23% do meio JNFb.

Estes meios semisslidos e semisseletivos so amplamente utilizados em estudos

visando capturar populaes de bactrias diazotrficas que colonizam o solo e espcies de

gramneas, como a Brachiaria sp., (DBEREINER, 1988; REIS JNIOR et al., 2004; BRASIL

et al., 2005). A tabela 3 apresenta o nmero e diversidade desses isolados de acordo com o

perodo de coleta e os municpios estudados.

Tabela 3. Nmero e diversidade de bactrias fixadoras de N2 isoladas de amostras de solo

cultivado sob Brachiaria brizantha e de tecidos vegetais (endofticas) desta gramnea, nos

municpios de Alfenas e Machado, nos perodos seco e chuvoso.

Solo Endoftica

Local/ Perodo Perodo

Ponto de amostragem Seco Chuvoso Seco Chuvoso

NI1 IS2 NI1 IS2 NI1 IS2 NI1 IS2

Alfenas

P01 9 1,89 13 2,20 18 2,03 32 2,56

P02 4 1,39 23 2,48 17 1,93 34 2,57

P03 1 - 18 2,18 7 1,95 27 2,64

 39

Machado

P01 6 1,56 13 2,25 8 1,26 15 1,95

P02 2 0,69 16 1,93 9 1,58 29 2,66

P03 - - 13 1,94 1 - 17 2,20

1
Nmero de isolados; 2ndice de Shannon-Weaver

De acordo com os dados da tabela 3, o maior nmero de isolados foi oriundo do

municpio de Alfenas. Esse resultado pode estar relacionado s melhores condies qumicas

apresentadas pelos solos coletados no municpio de Alfenas (tabela 2). Segundo KENNEDY et

al. (2004), a disponibilidade de nutrientes um dos fatores que influencia positivamente a

comunidade bacteriana do solo.

No entanto, em ambos os municpios, a maior disponibilidade de gua no solo foi fator

determinante para a presena do maior nmero de isolados no perodo chuvoso quando

comparado ao perodo da seca. Resultados semelhantes foram encontrados por REIS JR et al.

(2004), estudando a densidade de Azospirillum amazonense em Brachiaria humidicola, B.

decumbens cv. Basilisk e B. brizantha cv. Marandu em solos do Cerrado e da Mata Atlntica.

A diversidade observada pelo ndice de Shannon apresentou a mesma tendncia dos

dados referentes ao nmero de isolados, ou seja, a maior diversidade foi obtida no municpio

de Alfenas, sendo que no perodo chuvoso foi observada maior diversidade de isolados de

ambos os municpios, quando comparado ao perodo da seca. A influncia da gua na maior

diversidade de bactrias diazotrficas endofticas da cultura do milho tambm foi observada

por ROESCH et al. (2007). Alm disso, a melhoria das condies qumicas dos solos coletados

no municpio de Alfenas pode ter contribudo para o aumento da diversidade das bactrias

diazotrficas.
 40

Considerando o potencial de contribuio das bactrias fixadoras de N2 nas reas de

pastagens, a avaliao da ocorrncia destas em diferentes perodos do ano de extrema

relevncia para o manejo das reas de pastagens, justificando a realizao de estudos

semelhantes em diferentes regies do Brasil (REIS JNIOR et al., 2004; BRASIL et al., 2005).

Quanto solubilizao de fosfatos inorgnicos, nenhum foi capaz de solubilizar o

fsforo ligado ao alumnio (AlPO4.2H2O), o que pode ser devido toxidez deste elemento

clula bacteriana (MADIGAN et al., 2004). J em relao ao fosfato de ferro (FePO4.2H2O),

35 isolados bacterianos foram capazes de solubilizar o fsforo (tabela 4).

Tabela 4. ndice de solubilizao (IS) de fosfato de ferro (FePO4.2H2O) em meio slido GELP

por bactrias diazotrficas de Brachiaria brizantha.

Estirpes IS (mm)

100-40 10,34 a

100-05 8,27 b

100-01; 100-02; 100-59 7,12 0,25 c

100-23; 100-116 6,14 0,19 d

100-08; 100-15 5,42 0,01 e

100-35; 100-14; 100-16; 100-70; 100-71; 100-78; 100-82; 100-32 4,35 0,48 f

100-09; 100-44; 100-69 3,50 0,13 g

100-12; 100-43; 100-49; 100-51; 100-67; 100-17; 100-33; 100-34;

2,81 0,29 h
100-265

100-07; 100-28; 100-30; 100-31; 100-42; 100-280 2,09 0,28 i

De acordo com os valores apresentados na tabela 4, observa-se uma grande

variabilidade entre os isolados em solubilizar fosfato de ferro, sendo que cerca de 50% dos
 41

isolados apresentaram IS > 4 mm, sendo considerados, segundo BERRAQUERO et al. (1976),

como alta solubilizao de P. SILVA FILHO & VIDOR (2000), relatam que a capacidade de

solubilizar fosfato varia de acordo com o tipo de micro-organismo, a presena de fontes de

carbono e a disponibilidade de nutrientes no solo

A maioria dos isolados que solubilizaram fosfato de ferro foi obtida no perodo da

seca, sendo somente os isolados 100-116, 100-265 e 100-280 capturados no perodo chuvoso.

Esses resultados apresentam grande relevncia para o fornecimento de fsforo para as plantas,

uma vez que no perodo da seca a disponibilidade de fsforo reduz devido sua baixa

mobilidade no solo (NOVAIS et al., 2007). Nesse sentido, verifica-se que apesar da reduo no

nmero e diversidade de isolados neste perodo do ano (tabela 3), a comunidade de

diazotrficos presente continua atuando na promoo do crescimento vegetal.

Quanto produo de AIA, dos 332 isolados analisados, 78 (100-03; 17; 19; 21; 26;

34; 38; 40; 47 e 48; 50; 52 a 55; 61 a 63; 72; 73; 78; 85; 88; 105; 125; 129; 130; 137; 138; 142

a 145; 147; 150 a 153; 159; 163; 167; 170 a 173; 178; 181; 184; 185; 198; 212; 223; 227; 228;

230; 238 a 240; 263; 274; 281; 282; 303; 307; 308; 310; 311; 313 a 315; 317; 318; 321 a 323;

325; 330; 331) produziram AIA quando cultivados no meio contendo triptofano.

Diferentemente do observado para os solubilizadores de P, os produtores de AIA

foram obtidos, preferencialmente, na poca chuvosa. Destes, 49 foram isolados de tecidos de

B. brizantha (endofticos), sendo 17 oriundos do perodo da seca e 32 do perodo chuvoso. Os

demais isolados, 29, foram oriundos das amostras de solos, sendo que seis do perodo da seca

e os demais do perodo chuvoso. Em relao aos processos de solubilizao de P e produo de

AIA, destacam-se os isolados 100-17, 21, 40 e 78, capazes de desempenhar ambas as funes.

Segundo CROZIER et al. (1988), o AIA esto entre os fitormnios de crescimento

vegetal produzidos por Azospirillum e outros gneros de bactrias diazotrficas, sendo este o

mais ativo e de melhor caracterizao.

 42

SARWAR e KREMER (1995) avaliaram alguns isolados de origem rizosfrica de

diferentes plantas, e verificaram que isolados associados raiz so mais eficientes na sntese de

AIA do que os no associados s plantas. A auxina, sintetizada por organismos rizosfricos

pode produzir repostas rpidas como o aumento da elongao celular, como respostas lentas no

que diz respeito diviso e diferenciao celular (DOBBELAERE et al., 2003). So vrias as

vias de sntese da auxina, sendo que o Triptofano um precursor deste hormnio, pois a sua

adio nos meios de cultura (Salkowski) promove o aumento da sntese. O gnero Azospirillum

amplamente estudado em funo da sua interao com gramneas e por produzir auxina por

diferentes vias.

CONCLUSES

A diversidade de bactrias diazotrficas em pastagens de Brachiaria brizantha est

relacionada disponibilidade de gua, no entanto, verifica-se o potencial destas em atuar como

promotoras do crescimento vegetal, independente do perodo do ano.

AGRADECIMENTOS

A CAPES/PROSUP, pela bolsa de mestrado, e ao CNPq, pela bolsa de Iniciao

Cientfica.

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ARTIGO 2
(Artigo formatado de acordo com as normas da Revista Cincia Rural- ISSN 0103-8478 B1- a ser submetido)

Bactrias diazotrficas e as caractersticas morfolgicas e bromatolgicas de Brachiaria

brizantha cv MG 05 Vitria

(Diazotrophic and the morphological and qualitative characteristics of Brachiaria

brizantha cv MG 05 Victory)

Mrcio de Souza Dias1; Ligiane Aparecida Florentino2*; Adauton Vilela de Rezende 3.

Resumo - Objetivou-se com esse trabalho avaliar o efeito da inoculao de diferentes isolados

diazotrficos sobre caractersticas morfolgicas e bromatolgicas de Brachiaria brizantha cv

MG05 Vitria. O experimento foi conduzido em vasos contendo 20 dm3 de solo durante 83

dias, com dois cortes, cujos tratamentos foram constitudos por: inoculao com 22 estirpes

bacterianas isoladas de B.brizantha e com a estirpe Azospirillum brasilense, e dois controles:

sem inoculao sendo o primeiro apenas com N-plantio e o segundo com N-plantio e N-

cobertura. Foi utilizado o delineamento em blocos casualizados com quatro repeties. Foram

analisados os seguintes parmetros anatmicos: altura, largura e comprimento da folha, nmero

de perfilhos, peso seco da raiz e comprimento da raiz, matria seca, produtividade de matria

seca, fibra em detergente neutro e cido, e a protena bruta na matria seca. A inoculao de

estirpes diazotrficas endofticas e rizosfricas influenciaram no desenvolvimento do capim B.

brizantha cv MG05 Vitria, contribuindo positivamente com a produo de matria seca,

produtividade de matria seca e protena bruta na matria seca, destacando-se os isolados

UNIFENAS-100-16, 21, 78, cujo teor de protena bruta na matria seca foi superior a 7%.

Palavras-chave: FBN, matria seca, forrageiras

_______________________
1
Universidade Jos do Rosrio Velano UNIFENAS. 2*Faculdade de Agronomia UNIFENAS. E-mail:
ligianeflorentino@gmail.com (Autor para correspondncia). 3Faculdade de Agronomia UNIFENAS, Alfenas,
MG.
 50

Abstract - The objective of this study was to evaluate the effect of inoculation of different

diazotrophics isolated on morphological and qualitative characteristics of B.brizantha cv MG05

Victoria. The experiment was conducted in pots containing soil 20 dm3 for 83 days, two courts,

whose treatments were: inoculation with 22 isolated bacterial strains B.brizantha and with

Azospirillum brasilense strain, and two controls: without inoculation with the first only with N-

planting and the second N-planting and N-coverage. The design was used in a randomized block

design with four replications. The following anatomic parameters were analyzed: height, width

and length of the sheet, number of tillers, dry root weight and root length, dry weight, dry matter

yield, neutral and acid detergent fiber, and crude protein in dry matter. Inoculation of

endophytic strains and rhizospheric influenced the development of the grass B. brizantha cv

MG05 Victoria, positively contributing to the production of dry matter, dry matter yield and

crude protein in dry matter, highlighting the UNIFENAS-100- isolated 16, 21, 78, which crude

protein content in the dry matter was in excess of 7%.

Key words:. FBN, dry matter, forage.

INTRODUO

O Brasil considerado um dos maiores produtores e exportadores mundiais de carne

bovina, em que predomina o sistema de criao extensiva, caracterizado pela necessidade de

extensas reas de cultivo de forrageiras (FONSECA et al., 2006), destacando-se o gnero

Brachiaria (AMBIEL et al., 2008).

Estima-se que cerca de 70% das pastagens brasileiras encontram-se degradadas ou em

vias de degradao, devido, principalmente, ao excesso de pastejo, baixa fertilidade natural dos

solos brasileiros e pela falta de reposio de nutrientes, em especial o nitrognio (MACEDO,

2005), indicando a necessidade de medidas de manejo visando recuperar estas reas e garantir
 51

a produtividade. VASCONCELOS (2006) destaca a importncia do nitrognio como sendo um

dos elementos mais limitantes produtividade de Brachiaria spp.

A utilizao da fixao biolgica de nitrognio (FBN) tem sido mais difundida no

cultivo de leguminosas, formando uma interao simbitica, evidenciada pela formao de

ndulos radiculares e/ou caulinares (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). No entanto, diversos

estudos indicam o benefcio da inoculao com as bactrias fixadoras de N2 em diferentes

gramneas forrageiras (DIDONET et al., 1996; CAVALLET et al., 2000; OLIVEIRA et al.,

2007a). Nesse caso no ocorre a formao de ndulos e essas bactrias podem se estabelecer

na rizosfera dessas plantas, formando uma associao, ou serem encontradas no interior dos

tecidos (endofticas).

A inoculao de estirpes bacterianas fixadoras de N2 em Brachiaria spp. indicam que

estas podem fornecer parte do N necessrio ao desenvolvimento vegetal, suprindo at 40 kg N

ha-1 (BODDEY & VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013). No entanto, embora se considerem

os benefcios apresentados, observa-se que os estudos de FBN ainda so incipientes para as

gramneas do gnero Brachiaria spp, uma vez que ainda no se encontra disponvel no mercado

estirpe aprovada como inoculante para este gnero pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e

Abastecimento (MAPA, 2011).

Desta forma, objetivou-se com esta pesquisa avaliar o efeito da inoculao de

diferentes isolados diazotrficos sobre caractersticas morfolgicas e bromatolgicas de

Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria.

MATERIAL E MTODOS

Foi conduzido experimento em vasos no viveiro de mudas florestais da Faculdade de

Agronomia da Universidade Jos do Rosrio Vellano (UNIFENAS), em Alfenas (MG), cujo

perodo de conduo foi de agosto a novembro de 2014, perodo em que a temperatura mdia
 52

registrada foi de 17,3 a 27,6C, pluviosidade de 382 mm e altitude de 860 metros (latitude 21

27, longitude 45 56). A tabela 1 apresenta as caractersticas qumicas do solo utilizado no

experimento.

Tabela 1. Resultado da anlise qumica do solo utilizado no experimento em vasos.

pH P K Ca+ Mg+ Al+ H + Al SB t T V M MO
-3 -3
(H2O) mg dm cmolc dm % dag Kg-1
5,2 0,5 21 0,3 0,2 0,2 2,6 0,6 0,8 3,2 18 26 6

Antes da instalao do experimento foi feita a correo do solo, visando elevar a

saturao por bases a 70% e a adubao de implantao foi constituda por 500 kg ha-1 de P2O5

na forma de superfosfato simples e 120 kg ha-1 de K na forma de cloreto de potssio, quando

cada vaso recebeu respectivamente 5g e 1,2 g.

Para o plantio, utilizaram-se mudas de B. brizantha que foram cultivadas por 21 dias

em bandejas de isopor contendo substrato orgnico. Aps, estas foram transferidas para vasos

contendo 20 dm3 de solo (latossolo vermelho escuro com textura argilosa), sendo cultivadas

seis plantas por vaso, Durante o perodo do experimento, o solo foi mantido irrigado de acordo

com sua capacidade de campo. Foram utilizados 2,28 g vaso-1 de uria (N plantio) cinco dias

aps o transplantio em todos os vasos.

Os tratamentos utilizados constaram da inoculao com 22 estirpes bacterianas

pertencentes coleo da UNIFENAS (UNIFENAS-100-02, 06, 16, 17, 21, 28, 30, 31, 33, 34,

35, 40, 42, 43, 49, 51, 67, 69, 71, 78, 82 e 280) isoladas de B. brizantha e de comprovada

capacidade de solubilizar fosfato e produzir o fitormnio cido-3- indolactico (AIA) in vitro.

Alm disso, foram utilizados mais trs tratamentos: um inoculado com a estirpe Azospirillum

brasilense, aprovada como inoculante para as culturas do milho, trigo e arroz (MAPA, 2011) e

outros dois controles sem inoculao, o primeiro contendo somente N plantio (2,28g vaso-1

/controle negativo) e o segundo contendo N plantio (2,28 g vaso-1) e N cobertura (2,28g vaso-1
 53

/controle positivo), sendo a cobertura realizada em dois momentos 20 e 58 dia. Foi utilizado

o delineamento em blocos ao acaso, com quatro repeties por tratamento, onde os dados

obtidos foram comparados pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade, com o programa

Sisvar (FERREIRA, 2011).

Os isolados diazotrficos selecionados foram cultivados em meio lquido BDA e

incubados por trs dias, sob agitao, a 28C, tempo suficiente para que as culturas atingissem

a fase log de crescimento, contendo, aproximadamente 108 clulas mL-1. Uma alquota de 5 mL

desta suspenso de clulas foi inoculada nas plantas sete dias aps serem transplantadas. Vinte

dias aps o transplantio, foi realizada a adubao de cobertura (2,28 g vaso-1) no tratamento

contendo N plantio + N cobertura.

Aps 58 dias de cultivo, quando as plantas atingiram 40 cm de altura, foi realizado um

corte a 10 cm acima da superfcie do solo para uniformizao dos tratamentos. Nesse perodo,

as plantas foram novamente inoculadas, conforme descrito anteriormente e realizou-se

novamente a adubao de cobertura no tratamento contendo N plantio + N cobertura.

No 26 dia aps o corte de uniformizao, as plantas atingiram novamente a altura de

40 cm e foram analisados os seguintes parmetros anatmicos: altura, largura e comprimento

da folha, nmero de perfilhos e comprimento e peso seco das razes. A porcentagem de matria

seca total (MS), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente cido (FDA) e teor da

protena bruta na matria seca (%PBMS) foram realizadas segundo metodologia descrita por

SILVA & QUEIRZ (2002).

Os dados foram submetidos anlise estatstica, e as mdias das quatro repeties

foram comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa

Sisvar (FERREIRA, 2011).

 54

RESULTADOS E DISCUSSO

Efeitos significativos da inoculao de isolados diazotrficos sobre as plantas de

Brachiaria foram observados, no primeiro e no segundo corte, em relao aos parmetros altura

da planta, largura da folha, comprimento da folha e nmero de perfilhos, onde os parmetros,

peso da matria seca e comprimento da raiz, foram observados apenas no segundo corte,

conforme dados apresentados na tabela 2.

Tabela 2. Altura (Al), Largura (LF) e comprimento da folha (CF), nmero de perfilhos (NP) e

matria seca (MS) de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria cultivada sob diferentes

tratamentos no primeiro corte e segundo corte. Massa seca radicular (MSR) e crescimento

radicular (CR) segundo corte.

1 Corte 2 Corte
1
Al LF1 CF1 Al1
LF1
CF 1
MSR1 CR1
Tratamentos NP1 NP1
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (g) (cm)
No
inoculados
N plantio +
41,75a 1,77a 32,30a 37,0a 43,80a 1,76a 54,27a 57,5a 16,42a 61,82a
N cobertura
N plantio 29,68a 1,20c 19,05i 15,3b 42,12a 1,41b 35,82g 25,5b 9,42b 35,57c
Inoculados
Azospirillum 39,45a 1,18c 15,78j 18,5b 29,82b 1,30b 26,50k 31,0b 11,27b 45,15b
100-02 44,23a 1,46b 23,93e 18,8b 42,37a 1,60a 40,20e 31,2b 10,12b 40,95b
100-06 34,78a 1,33c 21,75g 16,5b 43,65a 1,45b 36,55g 27,5b 13,80a 48,62a
100-16 43,25a 1,14c 11,05l 16,5b 42,15a 1,24b 18,55l 27,5b 8,25b 41,35b
100-17 44,38a 1,23c 26,38c 14,8b 42,12a 1,35b 44,32c 24,5b 14,57a 48,92a
100-21 41,98a 1,45b 25,00d 17,3b 38,22a 1,59a 42,02d 29,0b 13,35a 49,70a
100-28 45,08a 1,39b 15,15k 14,3b 44,05a 1,53a 25,45k 23,5b 9,87b 50,32a
100-30 43,65a 1,25c 21,55g 17,8b 41,82a 1,33b 36,25g 29,2b 10,8b 50,50a
100-31 43,40a 1,41b 21,95f 18,0b 44,52a 1,54a 36,85f 30,0b 11,10b 42,90b
100-33 45,78a 1,43b 16,88j 16,5b 43,95a 1,57a 28,37j 27,5b 8,97b 42,70b
100-34 40,93a 1,28c 19,23i 18,3b 45,05a 1,41b 32,32i 30,5b 8,72b 31,25c
100-35 40,55a 1,40b 20,98g 19,3b 43,90a 1,53a 35,27g 32,0b 11,12b 51,10a
100-40 45,13a 1,50b 20,33h 18,5b 41,30a 1,65a 34,12h 30,7b 13,30a 44,40b
100-42 43,88a 1,43b 30,00b 17,8b 42,67a 1,55a 50,42b 29,5b 11,07b 24,60c
100-43 44,43a 1,30c 19,23i 17,0b 44,50a 1,44b 32,27i 28,2b 9,92b 42,70b
 55

100-49 43,10a 1,29c 22,93f 16,3b 42,27a 1,41b 38,55f 27,2b 8,75b 51,92a
100-51 44,50a 1,40b 18,93i 17,3b 43,67a 1,52a 31,80i 28,7b 9,05b 44,82b
100-67 45,95a 1,34c 18,58i 18,0b 43,17a 1,46b 31,20i 29,7b 12,25a 43,35b
100-69 43,00a 1,23c 21,30g 16,8b 43,22a 1,34b 35,80g 27,7b 6,80b 34,45c
100-71 42,80a 1,38b 19,03i 19,3b 43,60a 1,52a 31,97i 32,0b 11,02b 33,97c
100-78 43,50a 1,34c 21,95f 20,3b 43,35a 1,47b 36,85f 33,7b 14,20a 45,65b
100-82 44,28a 1,32c 22,40f 17,8b 42,22a 1,46b 37,65f 29,5b 11,85a 52,65a
100-280 41,78a 1,22c 22,10f 21,3b 40,67a 1,34b 37,12f 35,5b 8,55b 41,62b
CV(%) 17,72 9,85 2,78 17,58 6,97 9,62 2,83 17,98 29,81 15,27
1
Mdias seguidas da mesma letra, na coluna, no diferem entre s pelo teste de Scott-Knott,

considerando o valor nominal de 5% de significncia.

Em relao ao parmetro altura, os resultados experimentais nos permitiram concluir

que no houve efeito significativo em ambos os cortes, pois todas as plantas inoculadas

apresentaram altura semelhante aos observados em relao ao controle positivo e negativo,

entretanto, no segundo corte, o tratamento inoculado com A. brasilense apresentou altura

inferior aos demais tratamentos. GUIMARES et al. (2011) relata que, em se tratando de

pastagens constitudas por Brachiaria, o parmetro altura, em especfico altura elevada, facilita

o pastejo e em contrapartida o desempenho do animal, estabelecendo assim, a relao entre

maior altura do pasto e a maior produo de massa seca, entretanto, BONFIM-SILVA et

al.(2010) destaca que o parmetro altura deve estar relacionado idade da planta e qualidade

desta quanto disponibilidade ao animal.

Houve efeito significativo dos diferentes tratamentos sobre a largura das folhas em

ambos os cortes, onde os tratamentos inoculados com as estirpes bacterianas UNIFENAS-100-

02, 21, 28, 31, 33, 35, 40, 42, 51 e 71 foram semelhantes entre si e superiores ao controle

negativo, destacando-se a contribuio da FBN no que se refere ao aumento da largura da folha,

o que colaboraria com a eficincia fotossinttica, o que de acordo com TAIZ & ZEIGER

(2004), as folhas apresentam a capacidade de se adaptarem aos fatores ambientais e que o

 56

aumento em sua largura permitiria a proteo de mecanismo que atua na fotossntese em relao

ao excesso de radiao.

Quanto ao comprimento da folha, houve efeito significativo no primeiro e segundo

corte, onde os tratamentos UNIFENAS-100-02, 17, 21 e 42 apresentaram mdias superiores a

alcanada pelos demais tratamentos e pelo controle negativo onde pode ser observada a

contribuio destes isolados ao longo do experimento. Ressalta-se ainda que a contribuio

destes isolados foi superior ao tratamento Azospirillum.

Em relao ao nmero de perfilhos, observou-se, em ambos os cortes, que a

contribuio dos isolados em relao a este parmetro foi significativa, sendo observado um

aumento em torno de 60% no nmero de perfilhos do segundo corte em relao ao primeiro.

Estudos realizados por ALEXANDRINO et al. (2005) corroboram com os resultados

alcanados, onde plantas submetidas a diferentes doses de nitrognio apresentaram diferenas

significantes quanto ao perfilhamento ao longo do tempo, o que evidenciaria o efeito positivo

da inoculao micro-organismos diazotrficos, e que de acordo com MARTHA JNIOR et al.

(2004), esta disponibilidade de nitrognio no solo contribuiria positivamente no aumento da

fotossntese, o que consequentemente contribuiria com o maior estmulo ao perfilhamento.

Apenas os isolados UNIFENAS-100-17 e 28 apresentaram mdias inferiores ao controle

negativo.

Quanto ao parmetro massa seca radicular os resultados obtidos pelos tratamentos

UNIFENAS-100-06, 17, 21, 40, 67, 78, 82 e o controle positivo foram idnticos entre si e

superiores aos valores encontrados pelos tratamentos Azospirillum, UNIFENAS-100-02, 16,

28, 30, 31, 33, 34, 35, 42, 43, 49, 51, 69, 71 e 280, estes semelhantes entre si e o controle

negativo.

J em relao ao crescimento radicular, observa-se que os tratamentos inoculados com

as estirpes bacterianas UNIFENAS 100-06, 17, 21, 28, 30, 31, 35, 49 e 82 foram semelhantes
 57

ao controle positivo, e superior aos resultados obtidos pela A. brasilense indicando o potencial

destes isolados em contribuir para o crescimento radicular, o que pode ser atribudo produo

de AIA e capacidade de solubilizar fosfato inorgnico de ferro (FePO4.2H2O) por estas

bactrias, e que consequentemente, de acordo com AGUILAR-PIEDRAS et al. (2008),

proporcionaria maior desenvolvimento vegetal devido maior aquisio de gua e nutrientes

do solo.

Situao semelhante foi observada para os dados de MSR, em que a inoculao

proporcionou resultados semelhantes ao controle positivo, exceto os tratamentos UNIFENAS-

100-34, 42, 69, 71 e controle negativo que foram semelhantes entre si e inferiores aos demais

tratamentos. OLIVEIRA et al. (2007a) constataram em seus estudos com B. brizantha cv.

Marandu, que esta gramnea, em especfico, apresentava uma maior produo de forragem

quando comparadas a testemunha (sem inoculao de diazotrficos e sem aplicao de N),

demonstrando assim, a importncia da inoculao como uma alternativa sustentvel, e ao

mesmo tempo, um contribuinte para o aumento da produo de forragem.

A tabela 3 apresenta os parmetros bromatolgicos referentes a matria seca total (MS)

e produtividade de matria seca (PMS), referentes ao primeiro e segundo corte e os valores

obtidos para fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente cido (FDA) e protena

bruta da matria seca (PBMS).

 58

Tabela 3. Porcentagem de matria seca total (MS), produtividade de matria seca g/vaso (PMS)

de B. brizantha cv MG05 Vitria cultivada sob diferentes tratamentos no primeiro corte e

segundo corte. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente cido(FDA) e protena bruta na

matria seca (PBMS) segundo corte.

1 Corte 2 Corte
MS1 PMS1 MS1 PMS1 FDN1 FDA1 PBMS1
Tratamentos
(%) (g) (%) (g) (%) (%) (%)

No
inoculados

N plantio +
18,92 b 8,15 a 15,06 b 25,62 a 65,37 b 45,10 a 14,01a
N cobertura
N plantio 20,00 b 5,22 b 15,69 b 8,34 b 61,87 b 48,85 a 4,50 e

Inoculados
Azospirillum 25,94 a 0,91 c 17,61 a 5,15 c 64,05 b 42,53 a 7,23 c
100-02 21,38 b 6,05 b 16,52 b 8,65 b 66,02 b 44,64 a 5,68 d
100-06 20,69 b 5,32 b 16,13 b 6,82 c 68,28 a 44,81 a 4,95 e
100-16 22,38 b 1,90 c 15,89 b 4,95 c 63,82 b 44,99 a 9,24 b
100-17 26,20 a 2,86 c 16,55 b 6,19 c 65,64 b 52,04 a 7,12 c
100-21 23,49 b 4,10 b 16,72 b 10,74 b 65,29 b 50,23 a 7,42 c
100-28 24,17 a 3,83 b 17,77 a 4,10 c 70,13 a 42,51 a 4,66 e
100-30 22,17 b 5,41 b 18,05 a 8,26 b 69,85 a 49,23 a 5,69 d
100-31 23,17 b 5,30 b 17,06 b 6,40 c 65,65 b 43,55 a 6,36 d
100-33 21,72 b 3,60 b 15,97 b 6,00 c 66,73 b 45,95 a 7,17 c
100-34 21,52 b 4,80 b 17,47 a 7,00 c 66,73 b 48,03 a 5,99 d
100-35 20,36 b 4,78 b 16,61 b 8,20 b 67,95 a 44,57 a 6,03 d
100-40 20,33 b 4,89 b 16,82 b 8,47 b 63,68 b 51,78 a 6,44 d
100-42 23,09 b 4,67 b 17,42 a 6,41 c 65,14 b 43,23 a 5,07 e
100-43 25,95 a 4,53 b 17,99 a 6,04 c 71,75 a 47,60 a 5,95 d
100-49 22,44 b 5,07 b 16,66 b 7,01 c 66,21 b 48,81 a 7,05 c
100-51 23,06 b 4,90 b 16,70 b 6,90 c 67,99 a 54,49 a 5,78 d
100-67 25,95 b 5,91 b 18,77 a 7,34 c 72,06 a 45,69 a 5,10 e
100-69 20,78 b 5,11 b 19,29 a 7,56 b 69,21 a 47,81 a 5,64 d
100-71 20,94 b 4,52 b 16,58 b 7,09 c 69,11 a 43,38 a 5,32 e
100-78 22,62 b 4,44 b 17,52 a 6,63 c 63,92 b 44,87 a 7,48 c
100-82 22,30 b 4,54 b 17,12 b 6,13 c 69,16 a 46,93 a 5,11 e
 59

100-280 22,88 b 4,55 b 17,77 a 5,66 c 65,90 b 44,87 a 5,55 d

CV(%) 10,58 25,52 7,86 20,60 5,58 89,28 9,82
1
Mdias seguidas da mesma letra, na coluna, no diferem entre s pelo teste de Scott-Knott,

considerando o valor nominal de 5% de significncia.

Em relao porcentagem de matria seca (MS), observou-se que em ambos os cortes

houve efeito significativo, pois as mdias observadas foram superiores ao controle positivo e

negativo, destacando-se os tratamentos inoculados com A. brasilense e as estirpes UNIFENAS-

100-17, 28, 30, 34, 42, 43, 67, 69, 78 e 280. SILVA et al. (2004) destaca que pastagens

formadas com Brachiaria apresentam uma relao entre altura da gramnea e produo de MS,

ou seja, quanto maior for a altura da planta maior ser a produo de MS. Segundo BORGES

et al. (2002), o intervalo existente entre os cortes influencia diretamente na porcentagem de MS,

onde, quanto maior for o intervalo entre os respectivos cortes, maior ser a produo de MS.

Estudos realizados por OKON e VANDERLEYDEN (1997) apontam que os organismos

fixadores de N2 participam no s da fixao de nitrognio como tambm dos processos

fisiolgicos e morfolgicos das plantas inoculadas.

Quanto produtividade mdia de matria seca (PMS), observou-se que os tratamentos

contendo os isolados UNIFENAS-100-02, 21, 30, 35, 40, 69 foram semelhantes ao controle

positivo e superiores aos tratamentos Azospirillum e UNIFENAS-100-06, 16, 17, 28, 31, 33,

34, 42, 43, 49, 51, 67, 71, 78, 82 e 280, estes semelhantes entre si e inferiores ao controle

negativo.

Os resultados alcanados nos tratamentos contendo Azospirillum, UNIFENAS-100-

16, 17, 21, 33, 49 e 78, no que se refere protena bruta na matria seca, apresentaram mdias

superiores s alcanadas pelos demais tratamentos, inclusive ao controle negativo, onde o

percentual alcanado foi superior 7%; tais resultados so expressivos, e de acordo com VAN

SOEST (1994), plantas forrageiras com teores de protena bruta abaixo deste percentual podem
 60

contribuir com a diminuio da digestibilidade dos animais devido inadequada

disponibilidade de nitrognio para os micro-organismos que atuam no rmen, o que

consequentemente diminuiria sua populao, o que reduziria o processo de digesto e ingesto

de matria seca. Dessa forma, valores acima de 7%, alcanados pelos tratamentos estariam

dentro dos valores necessrios para se atender s exigncias proteicas do animal, destacando-

se o tratamento UNIFENAS-100-16, o qual alcanou a mdia de 9,24% de PBMS, ressaltando-

se os isolados UNIFENAS-100-21 e 78, os quais demonstraram, simultaneamente, a capacidade

de solubilizar fosfato de ferro e produzir AIA, fatos estes que podem ter contribudo

positivamente com o teor de PBMS, entretanto, este pode variar em relao ao vegetal, sua

respectiva idade, a parte do vegetal que ser avaliada e at mesmo a adubao utilizada

(BUTOLO, 2002).

Os tratamentos UNIFENAS-100-06, 28, 30, 35, 43, 51, 67, 69, 71 e 82, no que diz

respeito ao teor de FDN, os tratamentos apresentaram valores superiores ao controle positivo,

negativo e demais tratamentos. Quanto ao FDA, os resultados experimentais nos permitiram

concluir que no houve efeito significativo e que todos os tratamentos apresentaram mdias

semelhantes, inclusive em relao ao controle positivo e negativo, entretanto, deve-se ressaltar

que valores mdios de FDN acima de 72% e FDA em torno de 40 % esto de acordo com os

encontrados por outros autores (OLIVEIRA et al., 2007b); em B. brizantha constatou-se FDN

78,6% e FDA de 49,6% (GOMES, 2003). Quanto maior for o valor do FDA encontrado na

forrageira, menor ser a digestibilidade do alimento, pois a fibra indigestvel contm uma

proporo de FDA, e o valor nutritivo de uma forrageira determinado pela composio

qumica da mesma (QUEIROZ, 2011). Desta forma os tratamentos Azospirillum, UNIFENAS-

100-28, 42 e 71 apresentaram o menor teor de FDA, o que representaria maior digestibilidade.

 61

O uso de bactrias diazotrficas, o manejo de forma adequado das pastagens e do solo

no apresentam pontos negativos, muito pelo contrrio, apresentam-se como alternativas

vantajosas sob os aspectos econmico e ambiental (ITZIGSOHN et al.,2000).

CONCLUSES

A inoculao de estirpes diazotrficas endofticas e rizosfricas influenciaram no

desenvolvimento do capim B. brizantha cv MG 05 Vitria, contribuindo positivamente com a

produo de MS, PMS e PBMS nas duas idades de corte destacando-se os isolados

UNIFENAS-100-16, 21, 78, cujo teor de PBMS foi superior a 7%.

AGRADECIMENTOS

A CAPES/PROSUP, por ter me concedido bolsa de mestrado. Universidade Jos do

Rosrio Vellano (UNIFENAS), por ter me apoiado e auxiliado no desenvolvimento desta

pesquisa, cedendo os equipamentos do Laboratrio de Anlise de Alimentos e Bromatologia.

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