6853CURSO22 Guia Tecnico PDF

Tcnicas Analticas
de Laboratrio
CURSOS DE FORMAO
CIIMAR UNIVERSIDADE DO PORTO
Manual do Curso
10/08/2015
Tcnicas Analticas
de Laboratrio
CURSOS DE FORMAO
Hugo Ribeiro
Julho de 2015
Tcnicas Analticas de Laboratrio
FORMADORES: ORGANIZAO DO CURSO:

Cristina Marisa Almeida Cristina Marisa Almeida
Paula Salgado Ana Paula Mucha
Joo Santos Sandra Ramos
Hugo Ribeiro Catarina Magalhes
Mafalda Batista
1
10/08/2015
FUNCIONAMENTO E LOGISTICA DO CURSO:
Cada aluno - 32 horas de formao;
Obteno de certificado participao 24 horas (75%) de formao;
Alunos divididos por quatro turnos - aulas prticas;
Cada turnos ter um dia livre.
PROGRAMA DO CURSO:
Mdulo 1 - Introduo anlise laboratorial
Modulo 2 - Tcnicas analticas para anlises de nutrientes em guas
Modulo 3 - Tcnicas laboratoriais para anlise de contaminantes.
OBJECTIVO:
Enquadramento de metodologias analticas necessrias para a avaliao do
estado ambiental dos ecossistemas marinhos no mbito da Diretiva-Quadro
Estratgia Marinha (DQEM).
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Mdulo 1
Introduo anlise laboratorial
Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

BOAS PRTICAS DE TRABALHO DE LABORATRIO:
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Etiquetar frascos com:
Nome do composto: H2SO4

Concentrao: 3M
Data: 27/07/2015
Validade: 6 meses
Responsvel: Hugo
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A ANLISE QUMICA:
Qualitativa - estudo de mtodos para determinao de propriedades que indiquem a
presena de um analito duma mistura ou soluo;
Quantitativa - estudo de mtodos para separao e determinao da quantidade de
um analito duma mistura ou soluo.

SELEO DO MTODO ANALTICO:
1. O analito a analisar
2. Quantidade de amostra disponvel
3. Concentrao do analito
4. Exatido e preciso do mtodo
5. Seletividade
6. Propriedades fsicas e qumicas da amostra
7. Nmero de amostras a analisar
8. Facilidade, rapidez e custo da analise
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OS MTODOS ANALTICOS:
CLASSICOS OU QUMICOS anlise fundamenta-se em determinados tipos de reaes qumicas:
Analise qualitativa Analise quantitativa Analise por separao
Teste Chama Ponto de ebulio Gravimetria Volumtricos Destilao Precipitao

OS MTODOS ANALTICOS: Infra Red Spectroscopy
Mass Spectroscopy
Atomic Absorption Spectroscopy

Espectroscopia Atomic Emission Spectroscopy
Ultra Violet Spectroscopy

INSTRUMENTAIS - anlises efetuadas Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
por mtodos instrumentais:
Paper Chromatography
High Performance Liquid Chromatography

Cromatografia
Gas Liquid Chromatography
Column Chromatography
Thin Layer Chromatography
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Radiao
eletromagntica
Nuclear spin Molecular rotation Molecular vibration Transition of outer most valence electrons Transition of inner electrons
Nuclear Magnetic Infra Red Visible Ultra Violet Atomic Absorption

Resonance Spectroscopy Spectroscopy Spectroscopy Spectroscopy Spectroscopy
Organic structure determination Organic structure determination Quantification of the interaction of Quantification of metal ions
MRI and body scanning Measuring bond strength visible light with a chemical compounds. Detection of metal in various samples

Espectroscopia
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Espectroscopia
Analise
qualitativa
Analise
quantitativa

Spectroscopy
Transmitncia :
T = I/I0
Absorvncia:
A = -log10 T = log10 I0/I Espao tico
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Lei de BEER
100 100
Lei Beer-Bouguer -Lambert
80 80 PO
60 60
T e cl
%T %T
PI
40 40
P
A ln O cl
20 20
PI
0 length 0 concentration
A = ebc
e a absortividade molar com unidades de L mol-1 cm-1
b o percurso tico em cm
c a concentrao do composto em soluo expresso em mol L-1

Lei de BEER
VALIDADE DA LEI
DESVIO NEGATIVO
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Lei de BEER
VALIDADE DA LEI
DESVIO POSITIVO

Cromatografia
Vrios metodos cromatogrficos :
Paper Chromatography
Thin Layer Chromatography (TLC)
Liquid Chromatography (LC)
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Ion Chromatography Gs de arraste
Gas Chromatography (GC) H2, N2, He, Ar

Funo: transporte da amostra
Propriedades: inerte, compatvel
com o detetor, puro
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Cromatografia
Flow

Cromatografia
Flow
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Cromatografia
Tempo de reteno:
Qualitative
Analysis
Depois de injetada a amostra, o tempo
necessrio para um soluto individual
atingir o detetor;
Dependendo do tempo de reteno, podemos

utilizar como analise qualitativa

Cromatografia
Dois modos de quantificar um Quantitative

composto na amostra: analysis
Determinao da altura do pico

tendo em conta a linha de base;
Determinao da rea do pico.
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Mdulo 2
Tcnicas analticas para anlises

de gua

Tcnicas laboratoriais para anlise de nutrientes inorgnicos em gua
MICRONUTRIENTES:
Ciclos
Biogeoqumicos
Elemento Respirao Respirao
Aerbia Anaerbia
C CO2 CH4
N NO3- NH3
S SO42- H2S
P PO43- PH3
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PREPARAO DE MATERIAL:
Passar o material por gua desionizada (condutividade < 0.1mS cm-1 - colocar
num recipiente com HCl a 10%, - perodo nunca inferior a 10 h.
Retirar material e lavar muito bem com gua desionizada at remover por completo
todo o cido.
Colocar o material a secar numa estufa (< 40C). Depois de

seco, empacotar o material em sacos de plstico.
Nota: No colocar no cido qualquer material de metal.

PREPARAO DAS AMOSTRAS:

filtrar amostra com filtro de acetato de celulose 0.45 m ou 0.2 m - seringa
acoplada a suporte de filtros ou - bomba de vcuo, a baixa presso
guardar amostra de gua filtrada em frasco de plstico - polietileno

de alta densidade (HDPE);
Vidro - escorrncia de silicatos do vidro para a gua; por outro lado, os

fosfatos podem adsorver s paredes de frascos de polietileno e outros
materiais;
o ideal analisar a amostra nas primeiras 8 horas aps a recolha, sem adio de fixadores ou congelao.
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EM CASO DE NECESSIDADE DE CONGELAR AS AMOSTRAS:
no adicionar fixador e congelar imediatamente a amostra (-20C);
congelao bom mtodo para preservao de amostras destinadas a anlise de

nitratos;
congelao no serve para preservao de amostras destinadas anlise de

fosfatos;
descongelao das amostras temperatura ambiente melhor para a

dissoluo dos cristais de silicatos, mas deteriora os fosfatos; pelo contrrio,
descongelao em gua quente provoca menor deteriorao dos fosfatos;

AMNIA
Para a quantificao da concentrao de amnia (NH4+ e NH3 ) nas amostras de gua usado o mtodo de Koroleff,
descrito em Grasshoff et al., 1983.
A reao demora cerca de 6 horas at se completar e

a incubao feita temperatura ambiente, no escuro.
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Tcnicas laboratoriais para anlise de gua
NITRITOS
O mtodo para a determinao dos nitritos encontra-se descrito em
Grasshoff et al. (1983).

NITRATOS
Este baseia-se na reduo de nitratos a nitritos e subsequente determinao dos nitritos formados (Jones 1984).
A reduo desencadeada com cdmio esponjoso, na presena de uma soluo tampo de cloreto de amnio.
A reduo depende:
Metal;
pH;
atividade da superfcie metlica.
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NITRATOS
Mdulo 3
Tcnicas laboratoriais para

anlise de contaminantes
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Tcnicas laboratoriais para anlise de contaminantes
Poluio Ambiental
Contaminante: qualquer substncia que ocorra no meio ambiente em nveis mais elevados que
os normais (naturais), entretanto sem ainda causar algum efeito danoso aos recursos ambientais.
Poluente: qualquer substncia que ocorra no
meio ambiente em nveis mais elevados do que
os normais (naturais), a ponto de afetar de
forma indesejvel/danosa a qualidade e a
utilidade de um ou mais recursos ambientais.

Exemplos de Poluentes
Aldrin/Dieldrin Pendimethalin
Benzo(a)pyrene Pentabromo diphenyl ether
Cadmium Pentachloronitrobenzene
Chlordane Polybrominated Hydrocarbons
DDT, DDD, DDE Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)
Dicofol Tin (organotins)
Dioxins (TCDD) & Furans Toxaphene
Endrin Trifluralin
Endosulfan Mercury
Hexachlorobenzene Methoxychlor
Heptachlor Mirex
alkyl-lead Octachlorostyrene
Lindane Polychlorinated biophenyls (PCBs)
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CONCENTRAO DE HIDROCARBONETOS DE PETRLEO
A determinao de poluentes orgnicos em gua consiste

essencialmente de trs passos: colheita, preparao e anlise da
amostra.
Alm da extraco frequentemente necessrio um processo de

limpeza, dado que alguns interferentes so coextractados com os
analitos de interesse.

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ESPECTRMETRO FTIR OBTEM UM ESPECTRO NO INFRAVERMELHO POR:

Lei de BEER
A = ebc
e a absortividade molar com unidades de L mol-1 cm-1
b o percurso tico em cm
c a concentrao do composto em soluo expresso
em mol L-1
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Symmetrical Antisymmetrical
Espectro representa os nveis de energia Scissoring
stretching stretching
quantificada associados com as vibraes
dos tomos no interior da molcula.
Aumento da amplitude da vibrao Rocking Wagging Twisting

molecular corresponde diminuio do
feixe, consequentemente, da intensidade.

Normalmente, espectro IR de solues contendo

-CH2-
hidrocarbonetos apresentam bandas caractersticas: -CH3-
Ligaes C-H : 2853 cm1
Ligaes C-H de CH2: 2926 cm1
Ligaes C-H de CH3: 2962 cm1
Ligaes C-H de aromticos: 3040 cm1
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TEOR DE METAIS
A determinao de metais em gua e sedimentos consiste

essencialmente de trs passos: colheita, preparao e
anlise da amostra.

TEOR DE METAIS
Mtodos de espectroscopia na zona do

visvel, violeta e infravermelho so muito
utilizada em espcies moleculares;
A espectroscopia de absoro atmica

muito utilizada na determinao de caties
metlicos;
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TEOR DE METAIS
Espectroscopia de
absoro atmica

TEOR DE METAIS
Espectroscopia de absoro atmica - Chama
A amostra atomizada na chama, atravs da qual passa

radiao com comprimento de onda adequado a cada
elemento a analisar (fonte - lmpada de ctodo oco).
A quantidade de radiao absorvida uma medida

quantitativa da concentrao do elemento a ser
analisado..
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TEOR DE METAIS
Espectroscopia de absoro atmica - Chama

Concentrao de um elemento presente na amostra
valido pela Lei de Beer:
A = klC
Onde A = absorbncia, C = concentrao, l = espao

tico da chama, k = coeficiente nico to cada
elemento
Tcnicas Analticas
de Laboratrio
CURSOS DE FORMAO
Obrigado pela vossa ateno
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Mtodos para Anlise de
Nutrientes Inorgnicos
(volumes pequenos)
Laboratrio ECOBIOTEC
CIIMAR Centro Interdisciplinar de Investigao Marinha e Ambiental
Julho de 2015
(actualizado)
Lavagem do Material
Todo o material usado para as anlises de nutrientes passa pelos seguintes passos de lavagem:
Limpar com lcool as marcaes ou retirar fitas autocolantes que estejam a etiquetar o
material.
Colocar o material de molho em detergente ausente de fosfatos ou amnia.
Passar o material por gua destilada (preferencialmente) e colocar num recipiente com
HCL a 10%, durante um perodo nunca inferior a 10 h.
Retirar material do cido e lavar muito bem com gua destilada at remover por completo
todo o cido (usar tiras de pH).
Pr o material a secar.
Empacotar o material em sacos de plstico.
Nota:
No colocar no cido qualquer material de metal.
Preparao das amostras de gua para anlise de nutrientes
todo o material a usar dever ser descontaminado com cido;

filtrar amostra de gua por filtro de acetato de celulose 0.45 m ou 0.2 m, com seringa
acoplada a suporte de filtros;
- a filtrao pode ser feita atravs de bomba de vcuo, a baixa presso
guardar amostra de gua filtrada em frasco de plstico; melhor polietileno de alta

densidade (HDPE);
no se deve guardar a amostra de gua em vidro, devido escorrncia de silicatos do vidro
para a gua; por outro lado, os fosfatos podem adsorver s paredes de frascos de
polietileno e outros materiais;
adicionar o fixador (cloreto de mercrio) ou congelar;
o ideal analisar a amostra nas primeiras 8 horas aps a recolha, sem adio de fixadores
ou congelao.
Congelao
no adicionar fixador e congelar imediatamente a amostra (-20C);
congelao bom mtodo para preservao de amostras destinadas a anlise de nitratos;
congelao pode ser usada para preservar amostras para anlise de silicatos, se a sua
concentrao for inferior a 30-40 M; a amostra tem que descongelar bem (mais de 24
horas) para dissolver a totalidade dos cristais de Si que se formam; concentrao de Si
diminui com o tempo de congelao;
congelao no serve para preservao de amostras destinadas anlise de fosfatos;
descongelao das amostras temperatura ambiente melhor para a dissoluo dos
cristais de silicatos, mas deteriora os fosfatos; pelo contrrio, descongelao em gua
quente provoca menor deteriorao dos fosfatos;
amostras ricas em clcio no devem ser congeladas para evitar a precipitao do fosfato.
Amnia
Para a quantificao da concentrao de amnia (NH4+ e NH3) nas amostras de

gua usado o mtodo de Koroleff (in Grasshoff et al., 1983). O presente mtodo
baseia-se no facto da amnia, em solues moderadamente alcalinas, reagir com o
hipoclorito formando o composto monocloramina. Este, por sua vez, na presena de
um catalisador (nitroprussiato), fenol e hipoclorito em excesso, d origem a um
complexo de cor azul intensa (indofenol). A reaco demora cerca de 6 horas at se
completar e a incubao feita temperatura ambiente, no escuro.
A formao de monocloramina requer um pH entre 8 - 11.5. A um pH superior
a 9.6 pode ocorrer precipitao dos ies Mg e do Ca, sendo usado citrato para os
manter em soluo.
Quando no adicionado citrato existe a precipitao de hidrxido de
magnsio presente na gua salgada. Este absorve a matria particulada e os cidos
hmicos, eliminando possveis interferncias destes ltimos, tornando-se este mtodo
conveniente na anlise de guas salobras (Grasshoff et al., 1983). Quando as amostras
apresentavam uma salinidade inferior a 5 adiciona-se uma soluo de magnsio, de
modo a haver um excesso de ies Mg e um pH constante 10. O precipitado formado
deposita-se rapidamente no fundo do tubo, ficando um sobrenadante opticamente
lmpido, cuja absorvncia lida por espectrofotometria no comprimento de onda de
630 nm.
necessrio um total de 15 ml para fazer a anlise em triplicado. Esta dever

de ser filtrada (0.2 m ou 0.45 m) e armazenada no congelador ou imediatamente
processada.
Referncia
Koroleff, 1983. Determination of ammonia. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. & Kremling, K.
(Ed.s). Methods of Seawater Analysis. 2nd ed.. Verlag Chemie, Weinheim.
Amostra
necessrio um total de 1.5 ml para fazer a anlise em triplicado. Esta dever de ser filtrada
(0.2 ou 0.45 m) e armazenada no congelador, ou imediatamente processada.
Reagentes
Reagente de Magnsio
Dissolver 45 g de Cloreto de Sdio (NaCl) e 20 g de Sulfato de Magnsio hepta-hidratado
(MgSO4.7H2O) em 200 ml de gua destilada (AD).
Adicionar umas gotas de NaOH a 1M at comear a formar um precipitado.
Adicionar um bocado de vidro e pr a soluo a ferver (para eliminar a amnia) at termos uma
quantidade inferior a 200 ml.
Deixar a soluo arrefecer e perfazer os 200 ml com AD.
armazenado num frasco de vidro ou plstico temperatura ambiente no escuro.
Reagente de Fenol e Nitroprussiato

Dissolver 3.8 g de Fenol (C6H5OH) em 100 ml de AD. Pesar o reagente no recipiente onde se vai
fazer a soluo e depois adicionar a AD.
Dissolver 0.04 g de Nitroprussiato (Na2Fe(CN)5NO.2H2O) na soluo anterior.
Este reagente deve de ser feito com cuidado visto que o fenol muito txico. armazenado num
frasco de vidro escuro no frigorfico. Estvel durante meses.
Reagente de Hipoclorito
Diluir 0.25 g de Trione (correspondente a 750 mg de Cl-) em 100 ml de NaOH a 0.5 N
armazenado num frasco de vidro escuro no frigorfico. Estvel durante algumas semanas.
Reagentes Comuns
NaOH a 1N - Dissolver 40 g de NaOH num litro de AD.
NaOH a 0.5 N - Dissolver 20 g de NaOH num litro de AD.
H2SO4 1 N- Diluir 28 ml de H2SO4 num litro de AD.
Soluo Standard Primrio (100 mM)

Secar durante a noite Cloreto de Amnia (NH4Cl) a 50 C (at peso constante).
Dissolver 0.5349 g do reagente anterior em 100 ml de AD.
Preservar adicionando umas gotas de clorofrmio.
armazenado num frasco de vidro no frigorfico sendo estvel durante alguns meses.
Soluo Standard Secundrio (250 M)

Diluir 250 l de soluo Standard Primrio em AD e ajustar at aos 100 ml.
Este reagente feito sempre de fresco.
Procedimento
Solues padro
A recta padro deve de ser feita sempre que so processadas as amostras. As concentraes dever-se-
o ajustar concentrao de nutrientes nas nossas amostras.
Para um volume total de 1 ml:

PADRES P250 M( L) H2O ( L)
0 M 0 1000
5 M 20 980
10 M 40 960
20 M 80 920
30 M 120 880
Amostras
1. Saber qual a salinidade das amostras.

2. Colocar 1 ml ou fazer diluio (ver tabela abaixo) de amostra em cada tubo, em triplicado.
Diluies (amostras):
DIL H2O (L) Amostra (L)

2X 500 500
4X 750 250
5X 800 200
10X 900 100
3. Se a salinidade for inferior a 5, adicionar 30 l do Reagente de Magnsio e agitar no

vortex.
Determinao da amnia (para padres e amostras)
1. Adicional 50 l do reagente Fenol/Nitroprussiato (REAG 1), agitar no vortex.

2. Adicionar imediatamente 50 l do reagente Hipoclorito (REAG 2), agitar no vortex e
fechar os eppendorfs.
3. Incubar temperatura ambiente no escuro durante um perodo de 6 - 30h.
4. Aps a incubao centrifugar as amostras, se necessrio (pode haver formao de
precipitado; pipetar s o sobrenadante para as cuvettes).
5. As amostras so lidas ao espectrofotmetro a = 630 nm. Retiramos a amostra com uma
pipeta para evitar a ressuspenso do precipitado.
Clculos
NH 4 NH 3 D Aa Ab
em que, NH4+ + NH3- concentrao de amnia e io amnio, na gua ( M),

D - declive da recta padro,
Aa - valor de absorvncia obtido para a amostra,
Ab - valor de absorvncia obtido para a soluo sem amnia,
Nitratos
A concentrao de nitratos nas amostras determinada a partir do mtodo

descrito por Jones (1984) e adaptado por Joye & Chambers (1993). Este baseia-se na
reduo de nitratos a nitritos e subsequente determinao dos nitritos formados, sem
recurso a uma coluna de cdmio. A reduo desencadeada agitando as amostras com
uma quantidade apropriada de cdmio esponjoso, na presena de uma soluo tampo
de cloreto de amnia. As vantagem deste mtodo, em relao coluna de cdmio,
prendem-se com a diminuio do tempo de execuo e do volume da amostra (5 ml).
Problemas com a deteriorao progressiva das colunas de cdmio na capacidade de
reduo, so tambm ultrapassados.
Aps a reduo de nitratos a nitritos, segue-se a metodologia usada para a
determinao dos nitritos.

processada.
Referncias
Jones, M. N. (1984). Nitrate reduction by shaking with cadmium: alternative to cadmium
columns. Water Research 18: 643-646.
Joye, S. B. & Chambers, R. M. (1993). Nitrogen exchange between microvegetated intertidal
sediments and the overlying water column. Estuarine Research Federation Annual Meeting.
Hilton Head, Sc., Published Abstract. 58.
Amostra
(0.2 ou 0.45 m) e armazenada no congelador ou imediatamente processada.
Reagentes
Reagente Colorido
Diluir 50 ml de cido Fosfrico concentrado (H3PO4, 80%) em 400 ml de AD (primeiro a gua
depois o cido).
Adicionar soluo anterior 5 g de Sulfanilamida (4-NH2C6H4SO2NH2) e dissolver.
Adicionar soluo anterior 0.5 g de NNED (N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride) e
dissolver.
Perfazer 500 ml com AD
Soluo Tampo de Cloreto de Amnia a 0.7 M

Dissolver 37.4 g de NH4Cl em aproximadamente 800 ml de AD.
Adicionar aproximadamente 40 ml de NaOH a 1 N at termos um pH de 8.5.
Perfazer 1 litro com AD.
Armazenado num frasco de plstico temperatura ambiente.
Soluo de Sulfato de Cdmio

Dissolver 200 g de CdSO4 ou 3CdSO4.8H2O e perfazer num litro de AD.
Armazenado num frasco de vidro temperatura ambiente.
Soluo cido Clordrico a 6 N
Diluir 492 ml de HCl concentrado (37%) num litro de AD.
Armazenado num frasco de vidro temperatura ambiente.

Secar KNO3 por vrias horas a 60C.
Dissolver 1.011 g do reagente anterior em 100 ml de AD.
Armazenado num frasco de vidro no frigorfico.

Diluir 250 l de soluo Standard Primrio em AD e ajustar at aos 100 ml.
Cdmio Esponjoso
Encher aproximadamente 6 tubos de ensaio largos (2-3 cm de dimetro) com soluo Sulfato de
Cdmio.
Mergulhar uma barra de zinco em cada um dos tubos anteriores e deixar incubar aproximadamente
8 h (pode ficar de um dia para o outro).
Aps a incubao, remove-se o cdmio que se formou superfcie das barras com a ajuda de duas
pinas e colocar num frasco de vidro.
As barras de zinco so depois lavadas com HCl 6N e AD e secas antes de se guardar.
Adicionar umas gotas de HCl 6N soluo de Sulfato de Cdmio que est no frasco onde
colocamos o cdmio esponjoso e remover a soluo.
Cobrir o cdmio com uma soluo de HCl a 6 N e agitar aproximadamente 3 minutos.
Retirar o HCl e lavar vrias vezes com AD at termos um pH de aproximadamente 5 (verificar
com as tiras de pH).
Nota: O cdmio depois de usado pode ser novamente activado com HCl e posteriormente usado.
Procedimento
1. Colocar em todos os eppendorf (incluindo o dos padres) 200 l de soluo de Cloreto de

Amnia.
2. Adicionar a cada tubo uma quantidade de cdmio esponjoso de 0.10-0.20 g (ideal ser
~0.15 g).
Solues padro
A recta padro deve de ser feita sempre que so processadas as amostras. As concentraes
dever-se-o ajustar concentrao de nutrientes nas nossas amostras.

PADRES P250 M NO3- ( L) H2O ( L)
0 M NO3- 0 1000
10 M NO3- 40 960
20 M NO3- 80 920
40 M NO3- 160 840
80 M NO3- 320 680
PADRES P250 M NO2- ( L) H2O ( L)
40 M NO2- 160 840
Amostras
Colocar 1 ml ou fazer diluio (ver tabela abaixo) de amostra em cada tubo, em triplicado.
Diluies (amostras):

2X 500 500
4X 750 250
5X 800 200
10X 900 100
Determinao dos nitratos (para padres e amostras)
1. Incubar durante 1:30 h temperatura ambiente em agitao constante (100-200 rpm).

2. Aps a reduo, retira-se 1 ml da amostra para um tubo de centrfuga.
3. Adiciona-se 50 l do reagente colorido dos nitritos. Agitar no vortex.
4. Aps 10-30 minutos de incubao as amostras so lidas ao espectrofotmetro a =
540 nm.
Clculos
NO3 D Aa Ab C NO2
em que, NO3-- concentrao de nitratos dissolvidos na gua ( ),
Ab - valor de absorvncia obtido para a soluo sem nitratos,
NO2- - concentrao de nitritos na soluo,
C 1,2 factor de diluio do reagente cloreto de amnia.
Nitritos
O mtodo para a determinao dos nitritos encontra-se descrito em Grasshoff et

al. (1983). Este mtodo baseia-se na reaco do nitrito com uma amina aromtica
(sulfanilamida) dando origem a um composto diazotado que, por sua vez, se liga a
uma segunda amina aromtica (N-(1-naftil)-etilenodiamina) formando um complexo
cor-de-rosa cuja intensidade proporcional quantidade de nitrito na soluo.
No caso deste nutriente, verificou-se que a presena de cidos hmicos na gua
estuarina do rio Douro causava interferncia na sua deteco. Deste modo, com o
objectivo de eliminar o seu efeito, as amostras so tratadas com uma soluo de
hidrxido de alumnio (American Public Health Association, 1971).
Aps o processamento das amostras, a sua densidade ptica medida por
espectrofotometria no comprimento de onda de 540 nm.

processada.
Referncia
Grasshoff, 1983. Determination of ammonia. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. & Kremling, K.
(Ed.s). Methods of Seawater Analysis. 2nd ed.. Verlag Chemie, Weinheim.
Amostra
(0.2 ou 0.45 m) e armazenada no congelador ou imediatamente processada.
Reagentes
Reagente Colorido
Diluir 25 ml de cido Fosfrico concentrado (H3PO4, 85%) em 200 ml de AD (primeiro a gua
depois o cido).
Adicionar soluo anterior 2.5 g de Sulfanilamida (4-NH2C6H4SO2NH2) e dissolver.
Adicionar soluo anterior 0.25 g de NNED (N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride) e
dissolver.
Perfazer 250 ml com AD
Armazenado num frasco de vidro escuro no frigorfico.

Secar Nitrito de Sdio (NaNO2) aproximadamente 1 h a 100 C.
Dissolver 0.345 g em 100 ml de AD.
Adicionar algumas gotas de clorofrmio para conservar o reagente (1 ml por cada litro de
soluo).
Armazenado num frasco de vidro escuro no frigorfico.

Diluir 20 l de reagente Standard Primrio em AD e perfazer at aos 100 ml.
Soluo Standard Secundrio (250 M) para os nitratos

Diluir 125 l de reagente Standard Primrio em AD e perfazer at aos 25 ml.
Procedimento
Solues padro
A recta padro deve de ser feita sempre que so processadas as amostras. As concentraes
dever-se-o ajustar concentrao de nutrientes nas nossas amostras.

PADRES P10 M ( L) H2O ( L)
0 M 0 1000
0.5 M 50 950
1 M 100 900
2 M 200 800
4 M 400 600
6 M 600 400
Amostras
Colocar 1 ml ou fazer diluio (ver tabela abaixo) de amostra em cada tubo, em triplicado.
Diluies (amostras):

2X 500 500
4X 750 250
5X 800 200
10X 900 100
Determinao dos nitritos (para padres e amostras)
1. Adicionar 50 l de reagente colorido, agitar no vortex.

2. Aps 10-30 minutos de incubao as amostras so lidas ao espectrofotmetro a = 540
nm.
Clculos
NO2 D Aa Ab
em que, NO2-- concentrao de ortofosfatos dissolvidos na gua em ( M),
Ab - valor de absorvncia obtido para a soluo sem nitritos.
Fosfatos
Referncia
Koroleff, 1983. Determination of phosphorus. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. &
Kremling, K. (Ed.s). Methods of Seawater Analysis. 2nd ed.. Verlag Chemie,
Weinheim.
Amostra
necessrio um total de 1.5 ml para fazer a anlise em triplicado. Esta dever de ser
filtrada (0.2 ou 0.45 m) e armazenada no congelador, ou imediatamente processada.
Reagentes
cido Sulfrico a 4.5 M

Adicionar, lentamente e em constante agitao 250 ml de cido sulfrico (H2SO4)
concentrado a 750 ml de AD (volume total = 1L).
Deixar arrefecer a soluo e perfazer um litro.
Este reagente deve de ser feito numa bacia de gua fria para que o balo volumtrico no
aquea muito.
cido Ascrbico
Dissolver 10 g de cido ascrbico (C6H8O6) em 50 ml de H2O.
Diluir a soluo anterior em 50 ml de cido sulfrico (H2SO4) 4.5 M.
Armazenado em pequenas quantidades no congelador em frascos de plstico. Descongelar
com um dia de antecedncia.
Reagente Misto
Dissolver 12.5 g de Heptamolybdato de Amnia tetra-hidratado ((NH4)6Mo7O24.4H2O)
em 125 ml de AD.
Dissolver 0.5 g de Potassium Antimony Tartrate (K(SbO)C4H4O6), com ou sem H2O,
em 20 ml de AD.
Adicionar a soluo de molibdato (primeira soluo) a 350 ml de H2SO4 4.5 M, agitando
cuidadosamente (nunca fazer o contrrio, ou seja, adicionar o H2SO4 soluo de
molibdato).
Juntar a segunda soluo (Potassium Antimony Tartrate) soluo anterior.
125 mL soluo antimonil + 350 mL H2SO4 4,5 M + 20 mL soluo antimonil
Armazenado em frasco de vidro no escuro

Secar durante toda a noite KH2PO4 (potassium phosphate monobasic) a 110 C.
Dissolver 0.068 g em 100 ml de AD.
Adicionar algumas gotas de clorofrmio para conservar o reagente (1 ml por cada litro de
soluo).
Armazenado num frasco de vidro no frigorfico.

Diluir 0.5 ml de reagente Standard Primrio em 99.5 ml de AD.
Procedimento
Solues padro
A recta padro deve de ser feita sempre que so processadas as amostras. As

concentraes dever-se-o ajustar concentrao de nutrientes nas nossas amostras.

PADRES P25 M ( L) H2O ( L)
0 M 0 1000
1 M 40 960
2 M 80 920
3 M 120 880
5 M 200 800
Amostras
Colocar 1 ml ou fazer diluio (ver tabela abaixo) de amostra em cada tubo, em

triplicado.
Diluies (amostras):

2X 500 500
4X 750 250
5X 800 200
10X 900 100
Determinao dos fosfatos (para padres e amostras)
1. Adicionar a cada tubo 25 l de soluo de cido Ascrbico.

2. Agitar no vortex.
3. Adicionar imediatamente 25 l de reagente misto a cada um dos tubos.
4. Agitar no vortex.
5. Pr as amostras a incubar durante 20 (10 - 30 minutos) temperatura ambiente
no escuro.
6. Ler as amostras ao espectrofotmetro a = 880 nm.
Clculos
3
PO4 D Aa Ab
em que, PO43- - concentrao de ortofosfatos dissolvidos na gua em ( M),
Ab - valor de absorvncia obtido para a soluo sem fosfatos.
Slica
Para a determinao da slica dissolvida na gua (Si(OH)4) usado o mtodo

desenvolvido por Koroleff (in Grasshoff et al., 1983). Este mtodo baseia-se na
formao do cido silicomolbdico, de cor amarela, quando uma amostra de gua
tratada com uma soluo de molibdato de amnia. Visto a cor amarela desenvolvida
ser pouco intensa, este composto deve ser reduzido, adicionando-se cido ascrbico
soluo, dando origem a uma cor azul forte. A adio de cido oxlico imediatamente
antes da soluo redutora previne a reduo de molibdato que esteja em excesso na
soluo, assim como elimina a interferncia de fosfatos presentes na amostra. Aps
aproximadamente 30 minutos de incubao, formado um composto de cor azul,
sendo este estvel durante seis horas.
A densidade ptica das amostras determinada por espectrofotometria a 810 nm.
necessrio um total de 15 ml de amostra para fazer a anlise em triplicado.

Esta dever de ser filtrada (0.2 m ou 0.45 m) e armazenada no congelador ou
imediatamente processada.
As amostras usadas na determinao da slica nunca podem estar em contacto

com vidro evitando-se, deste modo, possveis contaminaes (Grasshoff in Grasshoff
et al., 1983). Quando a amostra congelada a anlise realizada cerca de uma
semana aps o incio do processo de descongelao das amostras, ocorrido no
frigorfico. Durante o processo de congelao a slica polimeriza no ficando
dissolvida na soluo (Kobayashi, 1967), impossibilitando deste modo a sua deteco
com o mtodo anteriormente descrito. O tempo de aproximadamente uma semana
suficiente para se dar novamente a despolimerizao da slica e, deste modo, voltar a
estar dissolvida na soluo.
Reagentes
cido Sulfrico a 4.5 M
Adicionar, lentamente e em constante agitao 250 ml de H2SO4 concentrado a

750 ml de AD.
Deixar arrefecer a soluo e prefazer um litro.
Este reagente deve de ser feito numa bacia de gua fria para que o balo volumetrico
no aquea muito.
Soluo acdica de Molibdato
Medir 300 ml de H2SO4 a 4.5 M e colocar numa garrafa de plstico.

Dissolver 38 g de Molibdato de Amnia ((NH4)6Mo7O24.4H2O) em 300 ml de AD.
Adicionar a segunda soluo primeira (nunca o contrrio).
Armazenar em frasco de plstico no escuro e temperatura ambiente.
Soluo de cido Oxlico Saturado
Dissolver 80 g de (COOH)22H2O em 800 ml de AD.

O reagente no se vai dissolver completamente, logo fica sempre um precipitado no
fundo da garrafa.
Armazenar em frasco de plstico temperatura ambiente.
cido Ascrbico
Dissolver 2.8de C6H8O6 em 100 de AD.

Misturar at estar completamente dissolvido.
Armazenado em pequenas quantidades no congelador em frascos de plstico.
Descongelar com um dia de antecedncia.
Secar durante toda a noite hexaFluoroSilicato de Sdio (Na2SiF6) a 105 C.
Dissolver 0.9403 g em 100 ml de AD. Aquecer um pouco se necessrio.
Transferir para um balo volumtrico de 500 ml e perfazer o volume com gua
destilada.
Armazenado num frasco de plstico temperatura ambiente ou frigorifico.
Soluo Standard Secundrio (1mM = 1000 M)

Diluir 10 ml de reagente Standard Primrio em 90 ml de AD.
Procedimento
Solues padro
A recta padro deve de ser feita sempre que so processadas as amostras. As

concentraes dever-se-o ajustar concentrao de nutrientes nas nossas amostras.

PADRES P1mM ( L) H2O ( L)
0 M 0 1000
5 M 5 995
10 M 10 990
20 M 20 980
40 M 40 960
60 M 60 940
80 M 80 920
100 M 100 900
y = 63,237x - 1,004
Recta Padro
R2 = 0,9967
90
80
70
60
Conc
50
40
30
20
10
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Abs
Amostras
Colocar 1 ml ou fazer diluio (ver tabela abaixo) de amostra em cada tubo, em

triplicado.
Diluies (amostras):

2X 500 500
4X 750 250
5X 800 200
10X 900 100
Determinao dos silicatos (para padres e amostras)
1. Adicionar 50 l de cido Molibdato, agitar no vortex.

2. Incubar durante 20 no escuro e temperatura ambiente.
3. Adicionar 50 l de cido Oxlico, agitar no vortex.
4. Adicionar imediatamente 40 l de cido Ascrbico, agitar no vortex.
5. Incubar durante 3 horas (nunca mais do que 6 horas) no escuro e
temperatura ambiente.
6. Ler ao espectrofotmetro a = 810 nm.
Nota : necessrio ser-se preciso nos tempos de incubao. O cido Molibdato

adicionado mais lentamente para aps 20 se adicionar os dois reagentes no mesmo
perodo de tempo.
A concentrao de slica presente na amostra de gua foi calculada usando a seguinte

equao:
Si D Aa Ab Dil Fs
em que,
Si - concentrao de slica dissolvidos na gua em ( ),
Ab - valor de absorvncia obtido para a soluo sem slica,
Dil - factor de diluio,
FS - factor de salinidade segundo Koroleff (in Grasshoff et al., 1983).
Referncias Bibliogrficas
American Public Health Association. (1971). Standard methods for the examination of water
and wast water. 1th Ed. American Public Health Association, New York.
Grasshoff, K., Ehrhardt, M. & Kremling, K. (1983). Methods of Seawater Analysis. Second,
revised and extended edition. Verlag Chemie, Weinheim.
Jones, M. N. (1984). Nitrate reduction by shanking with cadmim: alternative to cadmium

columns. Water Res. 18:643-646.
Joye, S. B. & Chambers, R. M. (1993). Nitrogen exchange between microvegetated intertidal

sediments and the overlying water column. Estuarine Research Federation Annual
Meeting. Hilton Head, Sc., Published Abstract. 58.
Quantificao de Hidrocarbonetos Totais
(TPH)
Laboratrio ECOBIOTEC
CIIMAR Centro Interdisciplinar de Investigao Marinha e Ambiental

Pr-tratamento da Amostra
a) Secar temperatura ambiente at peso constante
b) Desagregar no almofariz
c) Peneirar amostra com peneiro de 2mm
Pr-tratamento da Slica
a) secar durante 5 horas a 180C, e deixar arrefecer durante a noite (excicador).
b) Depois hidratar a 2% da sua massa.
Preparar duplicado de amostras em frasquinhos rolhados (VIAL) de 18 e

22 ml
a) Adicionar 1 g de Na2SO4 (Sulfato de Sdio Anidro)
b) Adicionar 1g de amostra (sedimento)
c) Adicionar 10 ml de Tetracloroetileno (PERC)
d) Preparar Branco, s adicionar 1 g de Na2SO4 e 10 ml de Tetracloroetileno
Utilizao de Ultra-sons, 0 C durante 30 minutos

a) Adicionar gua da torneira at ao limite de submergir os vials
b) Colocar uma garra ou plataforma para os fraquinhos no se dispersarem no ultra-

sons
c) Durante os 30 minutos verificar se as tampas esto bem fechadas
d) Depois do ultra-sons, esperar 10 minutos temperatura ambiente antes da

centrifuga
Preparao da Slica
a) Em novos frasquinhos, duplicado de cada amostra, adicionar 0,3 g de Slica tratada.
Preparao de filtro de 1 ml (filtro mecnico)

a) Preparar filtro
b) Pesar > 0,15 g de L de vidro

Centrifugar as Amostras (depois dos Ultra-sons)
a) Colocar os frasquinhos a centrifugar a 1500 rpm durante 2 minutos.
b) Decantar o elutriado para os frasquinhos (etiquetar as tampas) com a Slica.
c) Colocar no agitador temperatura ambiente durante 10 m.
Filtrar
a) Preparar o filtro, e decantar o elutriado, passando pelo filtro mecnico, para outro
vial, utilizando as mesmas tampas etiquetadas.
QUANTIFICAO POR ESPECTROMETRIA DE INFRAVERMELHO POR TRANSFORMADA DE

FOURIER (FTIR)
Stock 1 e Stock 2
a) Preparar o Stock 1 num balo de 5 ml
a. Adicionar 100l de hexadecano (exsicador) e 100l de Isooctano ou

Trimetilpentano (Hotte) e perfazer com PERC.
b) Preparar o Stock 2 num balo de 5 ml
a. Adicionar 100l do Stock 1 e perfazer com PERC.
Padres de calibrao a partir do stock 2

a) Preparar padres em balo de 15ml
a. P1 volume padro: 50l
b. P3 volume padro: 150l
c. P4 volume padro: 300l
d. P5 volume padro: 450l
e. P6 volume padro: 600l
Computador e FTIR
a) Ligar o FTIR
b) No computador: User Destop Spectra Manager Measurement

a. BM Abs. ; 2700-3200; ScanTime:32
b. SM Abs. ; 2700-3200; ScanTime:32
c. View Parameters Abs. ; 2700-3200; ScanTime:32
Preparar a cuba 4cm de espao ptico
a) Lavar com PERC
b) Passar por branco (este branco vai servir apenas para lavar a cuba)
Analises dos padres e amostras
a) Fazer Background B com Branco (guardar este branco pois ser utilizado
posteriormente)
b) Fazer Amostra S com Branco que fizemos o background
a. Aceita-se o resultado se a entre o pico mais alto do sinal (2926 a 2938 cm-1)
e a linha de base (3130cm-1) for inferior a 0,015 de Abs.
c) Fazer PERC como amostra
d) Fazer padres em PERC????
Bibliografia:
Couto, M. N., et al. "An improved method for the determination of petroleum hydrocarbons from soil
using a simple ultrasonic extraction and Fourier transform infrared spectrophotometry." Petroleum
Science and Technology32.4 (2014): 426-432.

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Tcnicas Analticas

Tcnicas Analticas de Laboratrio

FORMADORES: ORGANIZAO DO CURSO:

Tcnicas Analticas de Laboratrio

FUNCIONAMENTO E LOGISTICA DO CURSO:

Cada aluno - 32 horas de formao;

Obteno de certificado participao 24 horas (75%) de formao;

Alunos divididos por quatro turnos - aulas prticas;

Cada turnos ter um dia livre.

Tcnicas Analticas de Laboratrio

Mdulo 1 - Introduo anlise laboratorial

Modulo 2 - Tcnicas analticas para anlises de nutrientes em guas

Modulo 3 - Tcnicas laboratoriais para anlise de contaminantes.

Tcnicas Analticas de Laboratrio

Introduo anlise laboratorial

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

BOAS PRTICAS DE TRABALHO DE LABORATRIO:

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

BOAS PRTICAS DE TRABALHO DE LABORATRIO:

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

BOAS PRTICAS DE TRABALHO DE LABORATRIO:

Etiquetar frascos com:

Nome do composto: H2SO4

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

Qualitativa - estudo de mtodos para determinao de propriedades que indiquem a

presena de um analito duma mistura ou soluo;

Quantitativa - estudo de mtodos para separao e determinao da quantidade de

um analito duma mistura ou soluo.

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

SELEO DO MTODO ANALTICO:

2. Quantidade de amostra disponvel

4. Exatido e preciso do mtodo

6. Propriedades fsicas e qumicas da amostra

7. Nmero de amostras a analisar

8. Facilidade, rapidez e custo da analise

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

CLASSICOS OU QUMICOS anlise fundamenta-se em determinados tipos de reaes qumicas:

Analise qualitativa Analise quantitativa Analise por separao

Teste Chama Ponto de ebulio Gravimetria Volumtricos Destilao Precipitao

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

OS MTODOS ANALTICOS: Infra Red Spectroscopy

Atomic Absorption Spectroscopy

Ultra Violet Spectroscopy

High Performance Liquid Chromatography

Thin Layer Chromatography

Tcnicas Analticas de Laboratrio

Nuclear Magnetic Infra Red Visible Ultra Violet Atomic Absorption

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

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Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

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Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

Vrios metodos cromatogrficos :

Gas Chromatography (GC) H2, N2, He, Ar

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

Dependendo do tempo de reteno, podemos

Tcnicas Analticas de Laboratrio 1

Dois modos de quantificar um Quantitative

Determinao da altura do pico