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Science Associated Editors L.L.C
Instituciones de Educacin Superior
La labor investigadora e innovadora en Mxico
Diciembre 2016
Science Associated Editors, L. L. C es una editorial de acceso casi libre totalmente en lnea, su
labor se desarrolla acorde a la Iniciativa Budapest sobre Acceso Abierto
(www.budapestopenaccessinitiative.org/read).
La propiedad intelectual de los artculos permanece en los autores de los mismos, as como la
responsabilidad de sus opiniones.
ISBN-10: 1-944162-16-X
ISBN-13: 978-1-944162-16-0
Diciembre - 2016
Presentacin
La investigacin que desarrollamos en todas las reas es nuestro granito de arena con
lo que buscamos mejorar un pequeo aspecto de nuestra vida. Somos conscientes que
nuestra aportacin es un pequeo paso que deber ser seguido de muchos otros que
deberemos mejorar.
Este libro de distribucin libre es un esfuerzo de todos los autores por poner al
alcance de cualquier interesado los resultados de la labor investigadora que
realizamos con el fin de compartir e incentivar este trabajo que resulta
sorprendentemente gratificante.
1. Introduccin
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Jess Muoz Rojas, joymerre@hotmail.com
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4. Goteo en placa
Quizs una de las tcnicas cuyo uso se ha intensificado en nuestros das para el
recuento bacteriano, es la tcnica de goteo en placa, debido a que sta es fcil, rpida y
econmica [Herigstad et al., 1982; Hoben & Somasegaran, 2001]. En este mtodo
tambin se realizan las diluciones 1:10 a partir de la muestra original, pero a diferencia
del mtodo de plaqueo, aqu se colocan tres gotas de 20 l de cada una de las
diluciones seriadas en las placas de medio gelificado (Figura 2) y despus del
crecimiento de colonias se elige la dilucin contable. No hay una regla para elegir la
dilucin contable, no obstante, recomendamos se cuenten entre 3 a 15 colonias en la
gota seleccionada. A partir del nmero de colonias presentes en la dilucin contable se
realizan los clculos requeridos. Por ejemplo en la figura 2, a partir de la dilucin
1:1000000 se detectaron 4 colonias en la primera gota, 4 en la segunda y 3 en la tercera,
por lo que sumando el nmero de colonias y dividiendo ese valor entre tres, obtenemos
un valor promedio de 3.6666 UFC presentes en 20 los l adicionados. Este valor es
posteriormente multiplicado por 50 dando un valor de 18.3333 que significa el nmero
de UFC en 1000 l y finalmente multiplicamos este valor por el factor de dilucin (en
este caso 106), obteniendo un valor final de 1.833X108 que significa el nmero de
UFC/ml presentes en la suspensin original.
Los medios de cultivo y las condiciones de crecimiento sern variables en funcin
del microorganismo explorado. Por ejemplo, para Pseudomonas putida KT2440 se
puede usar LB gelificado y las bacterias se crecen a 30 oC [Muoz-Rojas et al., 2006],
para Escherichia coli se puede usar medio MacConkey y su crecimiento es a 37 oC
[Jure et al., 2010] y para el hongo Penicillum sp. UAPGRC-1 el medio de cultivo
utilizado es MESMA-Cm80 a 30 oC [Morales-Garca et al., 2016]. Algunos hongos
presentan la ventaja de crecer de forma dimrfica; en medio lquido crecen como
clulas independientes (levaduriforme) y en medio gelificado crecen en forma miceliar.
La tcnica de goteo en placa es una metodologa til para cuantificar el nmero de
clulas fngicas dimrficas presentes en muestras lquidas, en distintas etapas de
crecimiento, similar a lo que se ha propuesto para bacterias en una curva de
crecimiento caracterstico [Morales-Garca et al., 2016].
Una variante del mtodo es que en lugar de poner las tres gotas de la misma
dilucin en la misma placa, se coloca una gota de cada dilucin en una placa,
realizando tres replicas en placas independientes, de esta manera las colonias son
visualizadas mejor y no hay riesgo de que se fusionen; lo cual es particularmente
importante para la cuantificacin de hongos (Figura 3). El mtodo de goteo en placa se
puede acoplar al mtodo nmero ms probable para aquellos experimentos donde las
colonias no se pudieran diferenciar, en este caso se toma el dato de los crecimientos
positivos y negativos como se explicar en la seccin 5. Esto podra ocurrir para
hongos micelares de crecimiento muy rpido.
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Dbereiner, 1988]. Bajo estas condiciones las bacterias fijadoras de nitrgeno crecen
usando nitrgeno de la atmsfera como fuente de este componente y si se usan medios
de cultivo con una seleccin adicional, es altamente probable que solo crezca la
bacteria deseada. Por ejemplo, Gluconacetobacter diazotrophicus es una bacteria
endfita de la caa de azcar que se ha cuantificado a partir de tallos de esta planta
mediante el mtodo NMP; usando el medio LGI sin nitrgeno combinado, que contiene
30% de sacarosa y es altamente selectivo para esta bacteria [Cavalcante & Dbereiner,
1988; Reis et al, 1994]. Otra bacteria cuantificada a partir de rizsfera de maz es
Azospirillum brasilense [Bashan and Levanony, 1985]. La rizsfera se define como el
suelo que est influenciado por los exudados de las races de las plantas [Molina-
Romero et al., 2015] y es un sistema complejo donde existe una diversidad enorme de
bacterias y hongos, razn por la que resulta difcil cuantificar a A. brasilense a partir de
esas muestras. Sin embargo, el medio JNFb semigelificado permite una seleccin
adecuada de esta bacteria gracias a que contiene cido mlico como fuente de carbono;
un compuesto que da preferencia al crecimiento de esta bacteria, bajo condiciones
diaztrofas [Reis et al., 2015]. Algunos hongos tambin podran cuantificarse usando el
mtodo de NMP por la aparicin del micelio caracterstico.
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debe ser multiplicado por 10 para tener el nmero de bacterias presentes en 1000 l de
la dilucin respectiva. Finalmente el valor obtenido se multiplica por el factor de
dilucin en este caso por 10000, obteniendo un valor de 9.5X105 bacterias por mililitro
de la muestra original.
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Tiempo (h)
Figura 8. Curva de crecimiento de Burkholderia tropica MTo-293
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Log UFC/ml
Tiempo (h)
Figura 9. Curva de crecimiento de Penicillum sp. UAPGRC-1.
Para la recoleccin de suelos debe considerarse .que debemos contar con contenedores
estriles, por ejemplo tubos Falcon de 50 ml, donde sern colocadas las muestras.
Primero debemos seleccionar la profundidad de la muestra. Si deseamos explorar un
suelo superficial, con un utensilio estril por ejemplo una pala pequea, se toma un
poco de suelo de la superficie, este se depositar dentro del contenedor. Si se requiere
suelo ms profundo se debe tener un mtodo para cavar sin alterar mucho el ecosistema.
En ocasiones el microbilogo tiene que ser astuto y colectar muestras aprovechando
que se est cavando a profundidades mayores con otros propsitos, por ejemplo cuando
se construyen carreteras, en minas e incluso construcciones de casas. Esos suelos
suelen contener microorganismos diferentes a los encontrados en la superficie [XXX].
En todos los casos no se requiere ms que unos cuantos gramos de suelo que deben de
ser transportados inmediatamente al laboratorio para su recuento y aislamiento [XXX].
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9. Conclusiones
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