Guia Microbiologia 2015 UPSJB

2015
MICROBIOLOGA
GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

ESCUELA PROFESIONAL ING. ENOLOGIA Y VITICULTURA
E ING. AGROINDUSTRIAL
FACULTAD DE INGENIERIAS.
DOCENTE: DR. BLGO. JUAN CARLOS QUISPE MEJA
CICLO: IV
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA | SEDE ICA

INDICE
Contenido
Trabajo Prctico N 1............................................................................................................................... 5
Ttulo de la prctica: El Laboratorio de Microbiologa. Normas de Bioseguridad. ...................................... 5
Trabajo Prctico N 2............................................................................................................................. 19
Ttulo del prctico: Esterilizacin. Mtodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de esterilizacin.20
Ttulo del prctico: Preparacin de materiales de uso en el laboratorio de microbiologa. Lavado, preparacin y
esterilizacin. Medios de cultivo. Definicin, clasificacin, aplicacin y preparacin. .................................. 36
Ttulo del prctico: Microscopa. Uso del microscopio. Observacin de preparados montados ........ 47
Examen microscpico. Examen en fresco. Tcnicas de coloracin de microorganismos. Coloracin de Gram-Nicolle.
Otras coloraciones .............................................................................................................................. 47
Ttulo del prctico: Marcha microbiolgica I. Tcnicas de siembra. Siembras en medio lquido y en medio slido en
tubo (a un mismo nivel y en pico de flauta) y en placa (siembra masiva, agotamiento en superficie, agar volcado).
.......................................................................................................................................................... 54
Ttulo del prctico: Marcha microbiolgica II.Lectura e interpretacin de los cultivos. Pruebas de identificacin.
.......................................................................................................................................................... 62
Ttulo del prctico: Medicin y recuento de microorganismos. Recuento en placa y en cmaras. Tcnicas de
coloracin de microorganismos. Coloracin de Gram-Nicolle. Otras coloraciones ..................................... 72
Ttulo del prctico: Anlisis Microbiolgico de agua y bebidas. Tcnica de filtracin por membrana. Estudio de
muestra problema ............................................................................................................................... 79
Trabajo Prctico N 11 ........................................................................................................................... 85
Ttulo del prctico: Micologa. Tcnicas micolgicas. Preparacin de medios de cultivo. Repiques de hongos
levaduriformes y filamentosos para su posterior identificacin ................................................................. 86
Trabajo Prctico N 12 ........................................................................................................................... 93
Ttulo del prctico: Hongos levaduriformes. Observaciones. Tcnicas de identificacin. Auxonograma y zimograma.
Mtodos convencionales y comerciales ................................................................................................ 94
Trabajo Prctico N 13 ......................................................................................................................... 100
Ttulo del prctico: Hongos filamentosos. Observaciones. Tcnicas de identificacin. Colonia gigante. Microcultivos
........................................................................................................................................................ 100
Ttulo del prctico: Morfologa bacteriana. ......................................................................................... 114
Ttulo del prctico: Tinciones simples y compuestas para bacterias .................................................... 124
Ttulo del prctico: Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano .................................. 137
PRESENTACIN
La Microbiologa, es una ciencia que viene desarrollndose crecientemente en referencia a otras ramas de la Biologa. El
estudio de los microorganismos se inici a partir de las observaciones que en 1669 realizo Robert Hooke, seguidas de
un trabajo ms explorativo en este contexto por Antonie Van Leeuwenhoek en 1670, y que a partir de los estudios de
Luis Pasteur en 1876, se logr el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran
diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y
humanos tambin es cierto que desde la antigedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
produccin de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su
importancia en diferentes reas de investigacin bsica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacutica.
El objetivo general del curso prctico de Microbiologa General es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biologa
bsica de los microorganismos, en sus caractersticas morfolgicas, nutricionales decrecimiento, control y que adquiera
las habilidades necesarias para su manipulacin en el laboratorio.
Esta Gua Prctica est dirigido a estudiantes que iniciarn su experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo
que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las
reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deber aprender, para que manipule
en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compaeros.
Este manual contiene 14 prcticas, diseadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos
de cultivo y observacin de bacterias y hongos. El orden de presentacin, corresponde al programa del curso Terico-
Prctico de Microbiologa General, que forma parte del plan de estudio de las carreras de Ingeniera en Enologa y
Viticultura e Ingeniera Agroindustrial impartidas en la Universidad Privada San Juan Bautista.
En cada prctica se presentan los Objetivos y una breve Introduccin para facilitar la comprensin de los mismos, despus
se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se
complementan con figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada prctica se proponen formas de presentacin de los resultados en cuadros o esquemas, para
que el alumno recopile sus observaciones. Tambin se incluyen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante
deber de resolver consultando con los materiales bibliogrficos.
Dr. Blgo. Juan Carlos Quispe Meja

El Laboratorio de Microbiologa.
Normas de Bioseguridad.
Trabajo Prctico N 1
TTULO DE LA PRCTICA: El Laboratorio de Microbiologa. Normas de Bioseguridad.
TEMA: Resea histrica de la microbiologa. Definicin. Importancia de la microbiologa. Microbiologa

Industrial. Definicin. Descubrimiento del mundo de los microbios. Origen del microscopio. Generacin
espontnea. Tindall, Pasteur, Koch. Conceptos generales de bioqumica y microbiologa. Modernas industrias de
fermentacin. Los procesos en la produccin de alimentos. Tratamientos biolgicos de residuos.
OBJETIVOS A ALCANZAR:
Reconocer las normas de bioseguridad.

Identificar las sealizaciones y los Pictogramas de seguridad.
Diferenciar las Fases R y las Fases S
Conocer los aspectos bsicos de bioseguridad y reglas generales de trabajo para el desarrollo de
actividades en el laboratorio de microbiologa.
COMPETENCIAS RELACIONADAS:
Introduccin a la Microbiologa.
INTRODUCCIN
Un laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar

microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena tcnica asptica, y por tanto se
requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de
esterilidad biolgica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas). Es importante que los
estudiantes que utilizan las estas instalaciones conozcan y apliquen todos los conceptos de bioseguridad. El
Objetivo de estas normas es la Proteccin de los estudiantes en las instalaciones, reduciendo el riesgo en cada
una de las etapas del proceso, as como evitar la contaminacin de las prcticas desarrolladas, teniendo como
propsito bsico tener un ambiente de trabajo seguro y ordenado.
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patgenos, todos los cultivos de todos los
microorganismos deben ser manejados con precaucin por su potencial patogenicidad. La destruccin completa
de todos los procedimientos analticos como la preparacin de medios de cultivo y otros materiales.
Es necesario cumplir dos REQUISITOS BSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el
riesgo de contaminarse uno mismo o a un compaero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.) contaminen nuestras
muestras.
Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE SEGURIDAD.
MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.
Proyector.
Gua Prctica
Seales de Bioseguridad
PROCEDIMIENTO
Se revisaran nsitos en el Laboratorio:

Normas de ingreso y permanencia en laboratorio
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio, as como el que ingresa a las instalaciones debe
responsabilizarse del cumplimiento de las normas de bioseguridad (EPPs).
2. Al iniciar y finalizar las prcticas, el estudiante se lavar las manos con agua y jabn.
3. Al INICIO y FINAL del procedimiento realizado en el laboratorio, limpie la superficie de trabajo con una
solucin desinfectante y ubique adecuadamente las sillas y materiales/equipos utilizados.
4. Las personas con cabello largo deben recogerlo al inicio de las actividades, as como utilizar: bata,
cofia, tapabocas, guantes (si es necesario), y los equipos de proteccin segn el nivel de riesgo
biolgico.
5. Emplee los equipos segn las instrucciones disponibles en el laboratorio, as como, los protocolos o
guas correspondientes a las prcticas. No manipule equipos sin la autorizacin respectiva y menos si
no posee las destrezas para hacerlo.
6. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica es
conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales para esto son la
leja y el alcohol (etanol 96).
7. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los
desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen
contaminaciones o producir accidentes.
8. Durante las prcticas est prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay
que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
9. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica deben
estar apartados del lugar de trabajo.
10. Para deshacerse del material contaminado se utilizarn los recipientes adecuados, que sern
esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura
comn.
11. Todas las reas deben estar rotuladas con la seal de riesgo biolgico y el nivel de contencin, y bajo
ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
12. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
13. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicar
inmediatamente al Docente.
14. Los libros y dems pertenencias personales deben ser ubicados en el lugar dispuesto para ello dentro
del laboratorio. NO coloque sus pertenencias sobre las sillas o mesones de trabajo.
15. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesin de laboratorio para evitar el
ingreso de agentes contaminantes por las corrientes de aire.
16. Realice el transporte de muestras dentro o entre laboratorios en los contenedores apropiados (cajas
hermticas o neveras transportables), con los cuales se eviten salpicaduras y sean de fcil
desinfestacin.
17. Al final de cada procedimiento, disponga el material contaminado o limpio en sus respectivos lugares
pero NO sobre los mesones.
18. Evitar el contacto de la piel con materiales infecciosos o con potencialidad de serlo. El uso de guantes
es adecuado para la manipulacin de muestras o cultivos de patgenos. Si ha utilizado guantes, deber
desecharlos antes de salir del rea de trabajo y NO tocar implementos, puertas, equipos o materiales
con ellos puestos.
19. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Coordinador del laboratorio.
20. Se usarn gafas protectoras y mscaras faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. Debe
evitarse al mximo la formacin de aerosoles durante el trabajo de laboratorio.
21. Cada estudiante o unidad de trabajo dentro del laboratorio debe contar con su equipo bsico de trabajo
(lminas portaobjetos, lminas cubreobjetos, jabn, tijeras, cinta de enmascarar, lpiz o marcador de
vidrio permanente, toallas de papel, algodn, etanol, asas bacteriolgicos y/o micolgicas, guantes,
pipeteador).
Introduccin al trabajo en el laboratorio de bioqumica de productos agroindustriales: Pictogramas de

Seguridad.
La sealizacin de seguridad es una medida preventiva complementaria a otras a las que no se puede sustituir.
Ella sola no existe como tal, y es el ltimo eslabn de una cadena de actuaciones bsicas preventivas que
empiezan con la identificacin y evaluacin de riesgos. Los riesgos residuales se evalan ordenndolos segn
su importancia y planificando las correspondientes medidas preventivas
SEALES DE ADVERTENCIA
SEALES DE PROHIBICIN
SEALES DE PROTECCIN
OTRAS SEALES
FRASES R Y S.
Las frases R y S se refieren a los consejos de prudencia, relativos a la manipulacin de productos
peligrosos. La combinacin de varias frases R o S, indican la concurrencia en un mismo producto de
diversos riesgos y sus correspondientes consejos de prudencia. A continuacin presentamos las frases
mencionadas y algunas de sus combinaciones posibles
FRASES S
S26 En caso de contacto con los ojos, lvelos inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico
DESINFECCIN Y AGENTES DESINFECTANTES.
Desinfeccin, describe la destruccin de microorganismos presentes en la superficie de implementos,

equipos y manipuladores, utilizando sustancias qumicas denominadas desinfectantes (o antispticos de
acuerdo al uso). La desinfeccin no implica esterilizacin, pues no siempre se eliminan todos los
microorganismos y sus estructuras de resistencia. Los desinfectantes son sustancias qumicas aplicadas
sobre objetos y superficies; los antispticos son sustancias qumicas aplicadas sobre la piel y mucosas.
Algunos autores diferencian la desinfeccin de la desinfestacin, de acuerdo al cuerpo a tratar.
Todo buen mtodo de desinfeccin deber cumplir las siguientes condiciones: (i) Eliminar el mayor nmero
de microorganismos (al menos todos los patgenos), (ii) ser econmico (iii) no debe ser corrosivo, txico o
irritante para los tejidos y (iv) al menos ser soluble en agua.
Para el uso en laboratorios de microbiologa, existen diferentes molculas que pueden ser utilizadas con
fines de desinfeccin (Tabla 1).
Agente Mecanismo de accin Aplicaciones

- Efecto letal por la combinacin rpida con
protenas.
- Los clorados reaccionan con el agua para
formar cido hipocloroso que es bactericida.
- Purificacin del agua.
- Oxidante, corrosivo para metales, de - Sanitizacin de utensilios en
Halgenos: Industrias.
Compuestos clorados: Degradacin con el tiempo, se recomienda - Microbicida.
Hipoclorito de sodio (NaOCl) - En superficies se recomienda
almacenarlas en frascos color mbar, una
concentracin de 1%, con
guardar las soluciones en frascos variaciones entre 1g/L y 10g/L.
hermticamente cerrados, protegidos de la
luz, el calor y la humedad; preparar la
cantidad para uso.
- Altera la estructura de protenas e induce

su precipitacin. Recomendacin para la
Componentes fenlicos:
- Surfactante. Desinfeccin en solucin al
Fenol - Alteracin de la membrana celular. 5%.
- Irritante y altamente txico.
- No se tiene claro el mecanismo de

Compuestos con base en accin. - La tintura de Iodo es
Iodo: Tintura de Iodo, Se presume que ocasiona la empleada como antisptico.
- Efectivo contra esporas,
Solucin Povidona-Iodo. precipitacin de las protenas. hongos y virus.
- Agente activo de superficies.
Nota. Cmo preparar la solucin diaria de hipoclorito de sodio?
Ej.: hipoclorito comercial 5% y se desea preparar 1L (1000mL), con una concentracin de 0.5% (5000 ppm).
Aplique la frmula:
V= CdxVd
Cc
Donde,
Vd: Volumen deseado
Cd: Concentracin deseada
Cc: Concentracin conocida.
Entonces, V=0.5%x1.000c.c = 100c.c.
5%
Usted debe agregar 100mL de hipoclorito de sodio comercial 5%, a 900mL de agua, para un volumen final
de 1L (1000mL), de una dilucin al 0.5%.
Algunas dosis utilizadas para la desinfeccin de diferentes fuentes son: Agua potable (0.2 ppm);
desinfeccin de manos e instrumental de acero inoxidable (50 ppm); camillas, mesas y camas (200 ppm);
desinfeccin de pisos, mesones en baldosn, ropa, tiles de aseo, material plstico y material contaminado
(p.e., V.I.H.) (500 ppm); y para la desinfeccin de material orgnico (5000 ppm).
Para un proceso de desinfeccin correcta, tenga en cuenta las siguientes recomendaciones:
- Prepare la solucin desinfectante diariamente para su uso.

- No utilice recipientes metlicos.
- Mantenga el producto desinfectante en un lugar seco y protegido de la luz.
- Emplee la concentracin recomendada por la casa comercial.
- No mezcle el desinfectante con otras sustancias.
- Utilice guantes para su empleo.
NIVELES DE CONTENCIN O DE SEGURIDAD BIOLGICA.
El principal objetivo de la bioseguridad, es la contencin. Este trmino se refiere a los mtodos que hacen
seguro el manejo de agentes infecciosos en el laboratorio, logrndose con esta contencin, la disminucin
de los riesgos en la exposicin del personal del laboratorio, de personas externas al laboratorio y del entorno.
De acuerdo a lo anterior, se han descrito cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, los cuales
combinan tres elementos de seguridad biolgica: La tcnica microbiolgica, el equipo de seguridad y el
diseo de las instalaciones.
Nivel de contencin 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes que no producen enfermedad en
el ser humano o animales. Es el utilizado comnmente en los laboratorios de prcticas de las universidades
o donde se emplean cepas no patognicas (ej.: microorganismos utilizados en la industria alimentaria).
Nivel de contencin 2. Es de riesgo individual moderado y riesgo comunitario bajo. Agentes patgenos que
pueden causar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de entraar un riesgo
grave para el personal de laboratorio, la comunidad, los animales o el medio ambiente (ej.: Staphylococcus
sp., Salmonella sp., Toxoplasma sp., etc.).
Nivel de contencin 3. Se debe aplicar este nivel, cuando se trabaja con microorganismos que ocasionan
patologas graves, de tratamiento complicado y, que pueden ocasionar la muerte. Las principales medidas
en este caso son la manipulacin correcta dentro de cabinas de seguridad (ej.: Mycobacterium tuberculosis,
Brucella abortus, Coxiella burneti, etc.). En estos casos, los procedimientos solo pueden ser desarrollados
personal calificado.
Nivel de contencin 4. De elevado riesgo individual y comunitario. Es el nivel requerido cuando se procesa
o se sospecha de la presencia de un agente patgeno infectocontagioso, que produce alta mortalidad y para
el que no existe tratamiento (o es poco fiable); para microorganismos de dosis infectiva baja y alta
contagiosidad (ej.: patgenos humano y animales).
Estructura Lgica del Informe del Laboratorio.
Introduccin ( 1 pt )
Formulacin de la Problemtica (1 pt.)
Objetivo (s) (1 pt.)
Hiptesis (1 pt.)
Materiales y Equipos usados en la Prctica (1 pt.)
Metodologa (2 pt.)
Resultados (2 pt.)
Anlisis (mnimo de 2 o 3 trabajos o referencias cientficas citadas) (3 pt.)
Conclusiones (3 pt.)
Referencias Bibliogrficas. (1 pt.)
Cuestionario (4 pt.)
Ejemplo de un Informe de Laboratorio.

GENERALIDADES
1. Tamao de papel : A4
2. Calidad de Papel : 80 gr
3. Tipo de letra : Arial 10, para los prrafos
Arial 12, para los ttulos y subttulos.
4. Interlineado : 1.5
5. Diseo de Pgina : Mrgenes
CARATULA
El tamao y la eleccin de los formatos son a eleccin del estudiante, pero ello debe de guardar el siguiente orden.
Ao de la Promocin de la Industria Responsable y Compromiso Climtico

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA EN ENOLOGA Y
VITICULTURA O
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIA
___________________
TITULO DE LA PRCTICA
DOCENTE:
ALUMNO:
ICA PER
2 015
.EJERCICIOS DE APLICACIN. RESOLUCIN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS.
a) Porque son importantes tomar medidas de Bioseguridad en los Laboratorios?

b) Describe y cita algunos Pictogramas de Seguridad que identifiques en el Laboratorio
c) Menciona tres fases R y S que se deban usar en las Industrias Agropecuarias y/o Enolgicas.
d) Liste al menos tres microorganismos representativos para cada uno de los cuatro niveles de contingencia
en los laboratorios de microbiologa, mencionando la importancia que representa para su rea de
formacin.
BIBLIOGRAFA DE CONSULTA.
Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de tcnicas de Microbiologa Mdica. Editorial Acribia. Zaragoza,
Espaa. 676 p.
Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biologa de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall
Hispanoamericana S.A. 10 Ed. Madrid.
VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnologa, qumica y microbiologa. Editorial Acribia. 2009
PELCZAR, M. R. 2002. Microbiologa. 4ta Edicin. Editorial Castillo S.A. Madrid, Espaa.
SCHLEGEL. Microbiologa general. Editorial Acribia. 1996.
Esterilizacin. Mtodos. Controles. Uso de la autoclave
y de la estufa de esterilizacin.
Trabajo Prctico N 2
TTULO DEL PRCTICO: Esterilizacin. Mtodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de

esterilizacin.
TEMA: Principales grupos microbianos. Aspectos taxonmicos moleculares segn Carl Woose. Ubicacin
relativa de los microbios dentro de los seres vivos. Divisin de los seres vivos. Nocin de clasificacin microbiana.
Principales grupos de virus. Bacterias. Levaduras. Mohos. Importancia de los microbios en el equilibrio de la
biosfera. Ciclo del nitrgeno y del carbono
OBJETIVOS A ALCANZAR.
Reconocer las metodologas existentes para la desinfeccin de superficies e implementos del laboratorio.
Aplicar algunos de mtodos utilizados para la esterilizacin de medios de cultivo, materiales y accesorios
utilizados en el laboratorio de Microbiologa.
Que el alumno conozca los principios generales de las tcnicas de esterilizacin de materiales de vidrio y
medios de cultivo de uso comn en Microbiologa. Observar el efecto de control de la contaminacin
microbiana en el laboratorio.
INTRODUCCIN
Se denomina esterilizacin al proceso validado por medio del cual se obtiene un producto libre de
microorganismos viables. El proceso de esterilizacin debe ser diseado, validado y llevado a cabo de modo de
asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del producto o un desafo ms resistente.
Como primer medida debemos realizar siempre una descontaminacin, por la cual hacemos la remocin
mecnica de microorganismo en objetos, dejndolos seguros para su manipulacin.
Tenemos opciones por las cuales podemos elegir como erradicar en la mejor manera posible, los agentes
infecciosos o patgenos:
- En la desinfeccin reducimos 3 a 5 Log la presencia de microorganismos iniciales.
- En la esterilizacin reducimos un mnimo de 6 Log la presencia de microorganismos iniciales.
Esta ltima opcin es la ms recomendable, cuando el tipo de material lo permite, porque reducimos riesgo de
infecciones presentes en superficies, material, sustancia o ambiente.
Estos procesos inactivan o destruyen a los microorganismos por daos irreversibles causados a nivel celular.
Recordamos que este es un proceso validado para obtener un producto libre de todo microorganismo en forma
latente o activa, causante de enfermedades o infecciones.
En la prctica resulta imposible probar la absoluta condicin de esterilidad, por ello se asume que un producto
est estril cuando la probabilidad de que un solo microorganismo est presente en forma viable sea igual o
menor que 1 en 1.000.000, coeficiente de seguridad de esterilidad, utilizado a nivel mundial.
Debemos partir del conocimiento de la carga microbiana inicial para poder garantizar la eficiencia del
procedimiento. La probabilidad de vida celular est en funcin del Nmero y tipo de microorganismo y de la
letalidad del proceso de esterilizacin.
MATERIALES Y EQUIPOS
5 cajas Petri.
1 gradilla.
7 tubos de ensayo.
1 autoclave.
5 pipetas de 1mL.
1 horno de aire caliente.
2 erlenmeyer.
1 rollo de cinta de enmascarar.
1 rollo de papel kraft.
1 rollo de gasa.
1 rollo de algodn.
1 asa bacteriolgica y una micolgica.
1 mechero de Bunsen o de alcohol.
3 hisopos.
1 estufa elctrica.
3 bajalenguas.
1 Pizeta con agua destilada.
VALIDACIN DE LA ESTERILIZACIN
Existen diversos tipos de controles durante el proceso de esterilizacin.

- Control fsico: se controlan los parmetros del equipo, temperatura, humedad, presin y vaco en las distintas
etapas del proceso.
- Control qumico: se utilizan qumicos que viran de color en contacto con agente esterilizante. Pueden ser
externos, se colocan por fuera del paquete y distingue de un material procesado de uno que no. Los internos
detectan la correcta penetracin del agente esterilizante. Ej.: Prueba de Bowie Dick que visualiza la eficacia en
la penetracin de vapor en textiles.
- Control biolgico: uso de dispositivos inoculados con bacterias.
Las esporas bacterianas presentan una gran resistencia frente a los antimicrobianos fsicos y qumicos debido a
esa propiedad y a la facilidad de cultivar es que se utilizan las esporas de Bacillius, para monitorear y validar los
procesos de esterilizacin de calor seco, hmedo, radiacin y agentes qumicos.
Incubamos a 65 C y leemos a las 24 y 48 hs., se deja el material en cuarentena y se libera una vez que dichos
controles biolgicos dieron negativos en el laboratorio.
CLASIFICACIN
MTODOS ESTERILIZACIN FSICOS
CALOR HMEDO
El Autoclave es el equipo utilizado para este proceso. Funciona por vapor de agua saturado (vapor que est en
contacto con el agua que lo genero), a presin superior a la normal. Mecanismo de accin: acta por
consecuencia de la liberacin de energa calorfica 540 cal/g. El vapor acta como transportador del calor, que
produce muerte celular por coagulacin del protoplasma. La desnaturalizacin de protenas y enzimas se acelera
con presencia de H2O (como la mayora de las reacciones qumicas). Es un proceso irreversible.
Es el mtodo usado por excelencia, el ms eficaz y ms econmico. No txico. En la actualidad encontramos en
el mercado una amplia disponibilidad de equipos. Posee alto poder de penetracin; acta sobre formas
vegetativas y esporas.
Depende de dos factores:
- Temperatura
- Tiempo de exposicin
A mayor temperatura menos tiempo de exposicin necesitamos.
Hay equipos de doble puerta, o de una puerta. Verticales u horizontales, automticas o semiautomticas.
Construidas en acero inoxidable.
Formas de Uso:
T 134 C a 3 atm. x 10 minutos: Para textiles de algodn, viruta.
T 121 C a 2 atm. x 20 minutos: Instrumentos quirrgicos, acero inoxidable, aluminio.
La autoclave realiza distintos ciclos segn el material a esterilizar.
- Con vacos, como primer paso, garantizando la extraccin de aire de la cmara, alternados con ingreso de
vapor, que logre la penetracin total en el interior del envoltorio. La cantidad de vacos depende del material
cargado: para textil son tres vacos y para instrumental uno solo.
LA ESTERILIZACIN COMIENZA CUANDO LOS PARMETROS TEMPERATURA Y PRESION ALCANZAN

EL VALOR ESTABLECIDO.
- Se produce una descarga por descompresin de la cmara y secado por vaco. Finaliza con ingreso de aire
filtrado que nivela la presin interior con la exterior.
- Para lquidos se realiza un vaco inicial, controlada por una sonda testigo (termocupla), ubicada dentro de la
carga, que censa la temperatura alcanzada en el lquido en la etapa de esterilizacin y finaliza con una lenta
descarga y enfriamiento lento.
El material debe quedar seco, sin restos de humedad, que generaran la formacin de colonias microbianas.
Autoclave CHAMBERLAN: esteriliza a 120 C a 2 atm. o a 134C a 3 atm. por 20 o 30 minutos, con purga inicial
del aire. Est formada por una caldera de cobre, con una camisa metlica externa y en la parte inferior una
corona de gas que emite calor.
El ciclo comienza con ingreso de vapor de agua en la cmara, este desciende al fondo de la misma y sale
mientras ingresa ms vapor en la parte superior.
Limitaciones:
No apto para polvos, lquidos oleosos, material sensible al calor o humedad (dispositivos elctricos), ni
instrumentos cromados.
Envoltorios para el instrumental:
- Papel: resistencia mecnica e integridad al agua. Gramaje: 60 g. Con permeabilidad selectiva (resistencia a la
penetracin de microorganismos y polvo) Normas IRAM 3003 para bolsas y papel.
- Bolsas: de papel grado mdico, fuelle con apertura sptica, cara satinada hacia adentro y testigo qumico
impreso. Hay de diferentes medidas.
Validacin:
- Control qumico: Test Bowie and Dick, Hoja diseada en papel flexible y porosidad adecuada, impreso con
tintas sensibles e indelebles, permite detectar fallas en la penetracin del vapor. Norma ISO 11140:1995. Cambio
de color uniforme en toda la superficie de la hoja de prueba para aceptar la validacin.
- Control biolgico: medio de cultivo con Bacillus Sterothermophilus (esporas). Normas ISO 11138:1994
Tiras de Bacillus Stearothermophillus.
Tiras de Bacillus Stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado.
Tiras de Bacillus Stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado lectura rpida (2hs -4hs)
Ampolla de vidrio con suspensin Bacillus stearothermophillus y medio de cultivo (ciclo lquidos exclusivamente)
- Registro continuo o grfico Temperatura - Presin / Tiempo.
Se realiza una carga en la que se coloca indicadores biolgicos que sern analizados posteriormente al ciclo
para verificar la eficacia.
CALOR SECO
Utilizamos para este mtodo hornos o estufas, el agente esterilizante es el aire seco. Acta por coagulacin de
protenas y por oxidacin de componentes celulares. Es econmico, no toxico, no deja residuos.
La actividad del calor depende de dos factores:
- Temperatura
- Tiempo de exposicin
Y la efectividad depende de la difusin del calor.
Se logra a:
-140C por 3 horas.
-160C por 2 horas.
-170C por 1 hora.
-180C por 30 minutos.
La penetracin del calor es lenta por lo que se requiere mayor tiempo de exposicin. Se cuentan los minutos de
esterilizacin a partir de que se alcanza la temperatura adecuada. Para enfriar se ventila con aire filtrado.
Aplicacin
Sirve para sustancias oleosas o grasas, talco, vidrio, instrumental cromado, objetos que no pueden humedecerse.
Limitaciones: Proceso lento con poco margen de seguridad. No se usa para textiles (peligro de incendio), ni para
gomas, plsticos o agua.
Validacin:
- Control fsico: termmetro de mxima, termocuplas.
- Indicadores calorimtricos: son tiras o cintas adhesivas que viran de color a determinada temperatura.
- Control biolgico: tiras con Bacillus Subtilis (esporas). Normas ISO 11138: 1994.
Esterilizacin por calor seco
Temperatura (C) Tiempo (minutos)
121 360
140 180
150 150
160 120
170 60
180 30
Una autoclave es un aparato que cierra hermticamente y que en su interior desarrolla vapor bajo presin, el cual se
presuriza y eleva la temperatura, proporcionando que el calor hmedo destruya los microorganismos.
RADIACIONES
Se somete el material a dosis predeterminadas de radiaciones. Se utilizan dos tipos de radiaciones para
esterilizacin:
-Rayos gama
Actan lesionando los cidos nucleicos. Es una radiacin ionizante con alto poder de penetracin, emitida por
una fuente de Cobalto 60, bajo estrictas normas de seguridad. No produce radioactividad en los objetos
esterilizados. Este proceso se realiza en plantas de radioesterilizacin.
Ventaja. No requiere monitoreo de rutina con controles biolgicos.
Aplicacin: Vacunas, antibiticos.
-Rayos ultravioletas
Poseen accin germicida; no se considera esterilizante.
Interfiere en el metabolismo de los organismos induciendo ionizacin de los componentes vitales de la clula.
Escasa penetracin, absorbida a una longitud de onda 240/280 nm por los cidos nucleicos alterando las bases
genticas. Esta radiacin es producida por una lmpara de mercurio de baja presin que posee un tipo de
cristales, que permite el paso de un rayo de luz, eliminando los microorganismos expuestos al mismo.
Aplicacin: Purificacin del agua. Elimina el 99% de bacterias presente el agua
MTODOS ESTERILIZACIN QUMICOS - lquidos GLUTARALDHEIDO
Es el ms ampliamente usado. Acta por desnaturalizacin de protenas y cidos nucleicos.

Uso: Para esterilizacin acta por inmersin en una dilucin al 2% por 10 horas, con enjuague de agua destilada
estril para eliminar residuos txicos.
Amplio espectro con alta velocidad de accin: 1 minuto para bacterias, 10 minutos para virus y 3 horas para
esporas bacterianas.
El personal debe estar provisto de guantes, barbijo, delantal y protector ocular.
APLICACIN
Materiales delicados que no soportan calor, ni procedimientos energticos. Ej.: endoscopios, broncoscopios, etc.
PEROXIDO DE HIDRGENO
Acta por inmersin en concentracin del 6% por 10 minutos, descompone las catalasas de los tejidos.
No deja residuos txicos; finalizado el proceso queda H 2 y O2 .
Es un desinfectante de alto nivel y se lo considera esterilizante. En la actualidad se utiliza el Plasma de Perxido
de Hidrgenos, que desarrollamos en mtodos gaseosos.
CIDO PERACTICO
Acta por oxidacin de protenas de pared celular. Lquido incoloro, de olor penetrante. Soluble en agua.
Excelente biocida, iguala al glutaraldheido, pero es menos estable.
Posee una accin desincrustante del material orgnico. Contiene una porcin de surfactante, que remueve y
mata el microorganismo.
Esteriliza por inmersin en cubetas en concentraciones del 0.2 al 30% por 10 min. a 55C / se enchufa y se
programa los tiempos de exposicin y lavados posteriores, se eliminan los residuos de este agente con 3 lavados
posteriores (enjuagues de agua estril). Todo el ciclo se registra y emite un registro que se guarda en el libro de
proceso.
Estable 20 ciclos, se usa 24 horas despus de preparado.
Sustancia corrosiva en un ph neutro, nocivo por inhalacin, ingestin y contacto con piel. Los vapores son ms
pesados que el aire; produce explosin con calor.
Aplicacin
Limitado a endoscopios, se debe lavar posteriormente a la exposicin.
Se debe hacer uso inmediato del material. Control estricto del agua de enjuague.
No permite almacenamiento por no tener envoltorio.
Validacin
- Control Biolgico: Tiras de Bacillus stearothermophillus.
MTODOS ESTERILIZACIN QUMICOS - gaseosos -OXIDO DE ETILENO ALTO MARGEN DE

SEGURIDAD DE ESTERILIZACIN
Es un gas inflamable y explosivo en estado puro.
Se utiliza una mezcla del 12% xido de Etileno con 88% de Fren 12 o en la actualidad con 90% de Dixido de
Carbono y 10 % xido de Etileno, disminuye as la explosividad del Ox. De Etileno.
Acta por alquilacin de protenas y enzimas de virus, esporas o bacterias (sustituye los tomos de hidrgeno
lbiles por otros, grupo hidroxilo, carboxilo, etc.)
Forma de Uso:
Se utilizan cmaras que trabajan a bajas temperaturas, de 37C a 55C, con humedad de 33 -75% por 4 horas
y una concentracin de xido en la cmara de 400-600 mg/ litro cmara.
Luego de la esterilizacin se necesita un periodo de aireacin para eliminar el gas residual, ya que el material
poroso puede absorberlo.
Se espera unos 40 das para la utilizacin del material.
Posee una excelente capacidad de difusin que ampla el margen de seguridad de la esterilizacin.
Aplicacin: para materiales termo sensible, dispositivos y mquinas elctricas, envases plsticos, prtesis e
implantes. No apto para lquidos, ni textil (incluyendo gasas) por la humedad que retienen las tramas de la tela,
que en contacto con el xido de etileno reacciona formando un residuo difcil de resorber.
Como envoltorio se puede usar:
-Papel Normas IRAM 3106, papel Krafft blanco, puro monolucido peso 60gr/m2.
-Fibras de celulosa largas que le dan resistencia a la traccin.
-Doble envoltorio: la externa se quita al ingresar al rea asptica, no es lo mismo doble papel son dos envolturas
completas una en un sentido y la otra en sentido contrario.
-Tambin puede usarse polipropileno que es una excelente barrera de envoltorio.
Limitaciones
Riesgo potencial para el personal. La concentracin mxima permitida es 1 ppm, durante 8 hs. de exposicin, en
el ambiente.
En el rea de trabajo son necesarias 10 renovaciones de aire por hora.
Sntomas de toxicidad aguda: irritacin de mucosas, cefaleas, vmito, diarrea, alteraciones electrocardiogrficas.
Puede inducir aberraciones cromosmicas. Tiene poder mutagnico, teratogenico y cancergeno en humanos.
Ley 19567 modificado por Resolucin 444/91 clasifica A2 POSIBLE CANCERGENO
Disposicin 33/90 de Direccin Higiene y Seguridad: Grupo II b cancergeno en humanos
Tiene un peso especfico menor al aire por lo que estratifica en el piso.
Desventajas: Alto costo de los equipos e instalacin apartada, con construccin antiexplosiva.
Requiere tiempos prolongados para el proceso de esterilizacin y desorcin (eliminacin del gas absorbido por
el material)
El material requiere cuarentena. Se exige un control de toxicidad ambiental.
ETAPAS DEL PROCESO

Equipos hospitalarios: son de doble o simple puerta con distintas capacidades de volumen.
Equipos industriales: Hay adicionado un equipo de aireacin ms una instalacin antiexplosiva. Pre
acondicionamiento del material con humectacin y precalentamiento.
Pasos de un ciclo:
- Acondicionamiento y humidificacin, bajo vaco, ya que permite una penetracin ms profunda de la humedad,
aumentando la dinmica de la difusin.
- Ingreso del gas
- Exposicin al gas
- Evacuacin
- Aireacin en cmara separada
El equipo funciona a presin negativa (cuando es puro), por lo que el gas nunca sale de la cmara, ante una
eventual prdida de los burletes.
En caso de usar mezcla con gases inertes: fren y anhdrido carbnico su utiliza presin positiva, porque hay
que introducir ms gas, para llegar a lograr la concentracin necesaria.
Grfico de un ciclo ETO puro con inyeccin de gas inerte
Ejemplo de un ciclo ETO de mezcla

Validacin y monitoreo del proceso:
-Registro grfico o continuo Temperatura - Presin / Tiempo.
-Registro grfico o continuo Temperatura; RH % / Tiempo de cmara de Pre acondicionamiento (si es aplicable)
-Registro grfico o continuo Temperatura / Tiempo de Cmara de Aireacin.
-Clculo de concentracin de xido de etileno.
- a) Peso esterilizante empleado / volumen cmara
- b) Clculo indirecto por incremento de presin debido al ingreso de gas en la cmara.
-Leak test o prueba de fugas (frecuencia recomendada semanal)
-Controles qumicos interno y externo en cada paquete.
-Controles biolgicos en cada ciclo:
- Tiras de esporos Bacillus subtilis var. niger.
- Tiras de esporos Bacillus subtilis var. niger.+ Ampolla con medio de cultivo incorporado.
FORMALDEHDO
Acta por alquilacin de las enzimas celulares y protenas estructurales.
No es explosivo, ni inflamable en concentraciones de esterilizacin. S es irritante a bajas temperaturas.
Se utiliza en dilucin en vapor de agua al 2-3% por 2 a 4 hs.
Temperatura constante a 50 C y Humedad 100% son las condiciones necesarias para provocar una
esterilizacin.
Se usan cmaras similares a una autoclave de vapor hmedo, pero en este caso, en el vapor est disuelto el
formaldehdo.
ETAPAS DEL CICLO

- Vaco previo, con entrada y salida de vapor. Precalentamiento.
- Pulsos de formaldehdo y vapor (20 pulsos)
- Extraccin del formaldehdo, con vapor hasta eliminar el residual
- Vaco de secado
- Aireacin con aire filtrado.
Aplicacin
Se usa en material termolbil, ltex, goma, plsticos. No apto para lquidos ni polvos.
Posee una menor capacidad de difusin y penetracin.
Limitaciones
Irritante y alrgeno para el operador. Sustancia txica y posiblemente cancergena. Prohibido en Japn, Canad
y Australia. Empleo de normas de bioseguridad. Lmite de exposicin 0.75 ppm por 8 hs. de trabajo.
Validacin
-Registro continuo o grfico Temperatura-Presin / Tiempo.
-Controles qumicos internos y externos de cada paquete.
-Controles biolgicos en cada ciclo:
- Tiras de esporos Bacillus stearothermophillus.
- Tiras de esporos Bacillus stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado.
VAPOR DE PERXIDO DE HIDRGENO
Se usa como agente esterilizante a bajas temperaturas y presin subatmosfrica.

Acta por interaccin de radicales libres hidroxilo sobre componentes de membrana, enzimas y cidos nucleicos.
Recientemente se utiliza el plasma de perxido de hidrgeno (estado entre lquido y gaseoso): Nube reactiva de
electrones, radicales libres, partculas atmicas neutras y partculas cargadas positivamente generada por accin
de radio frecuencia sobre vapor de perxido de hidrgeno.
El Agente esterilizante es el PEROXIDO DE HIDROGENO, en estado de plasma. Se utiliza el equipo Sterrad,
cmara hermtica.
Este es un proceso rpido, no requiere aireacin, dura 74 minutos, los ms modernos tardan 35 minutos y no
deja residuos con una concentracin en cmara de 6 ppm de perxido de hidrogeno. Con un nivel de seguridad
(SAL) de 10 -6 (cumple nivel requerido: para esterilizacin).
Es seguro: para el paciente y para el personal que lo manipula. El lquido concentrado es irritante en piel y
mucosas.
El proceso conserva ms los materiales a esterilizar, no es agresivo, aumentando la vida media de los mismos.
Equipo esterilizador simple puerta y distintas dimensiones de volumen.
No requiere instalacin separada de otros equipos / procesos.
Tiempo total del proceso: 60 - 75 minutos aproximadamente.
Trabaja en Temperatura a 42 C y Humedad del 6 y 14%.
Etapas de un ciclo
Vaco de la cmara, aumento de la temperatura y disminucin de presin atmosfrica.
- Inyeccin de la solucin de perxido.
- Difusin del vapor generado.
- Generacin del plasma: por ondas electromagnticas producidas por un generador de radiofrecuencia. Al cesar
la emisin de radiofrecuencia, el plasma se recombina para formar agua y oxgeno, sin dejar residuos txicos en
el material.
- Aireacin con ingreso de aire filtrado.
Ciclo plasma del Perxido de Hidrgeno
LIMITACIONES
No se pueden esterilizar productos que posean celulosa, algodn, lquidos ni polvos.
Es el mtodo ms caro desarrollado actualmente.
El material debe estar perfectamente seco sino aborta el proceso y se debe envolver en material poroso, bolsas
o rollos Tyvek.
Lmite de exposicin laboral 1 ppm por 8 horas trabajo y 5 ppm por 15 minutos en caso de fuga de la cmara.
Validacin y Monitoreo
Registro continuo Presin / Tiempo.
-Cancelacin automtica del ciclo por:
Presencia de humedad / Suciedad ocluida.
Retencin de Perxido de hidrgeno por materiales retentivos.
-Controles qumicos internos y externos en cada paquete.
Controles biolgicos:
Disponible: Tiras de Bacillus Stearthermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado.
MTODOS ESTERILIZACIN QUMICOS - MECNICOS

FILTRACIN
Permite la remocin de todos los microorganismos presentes en lquidos o gases, retenindolos sobre la
superficie de un material.
Filtros de membrana:
-Acetato de celulosa con poros de determinado dimetro, por ej.: 0,22 a 0.45 m.
-Retiene bacterias. No sirve para virus por su tamao pequeo.
Actualmente se est reemplazando por una membrana hidroflica fabricada de polietersulfona (PES), que es un
polmero con una excepcional estabilidad y una mnima unin inespecfica de protenas (comparable a las
membranas de acetato de celulosa).
Estos filtros son desechables. Adems de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis
microbiolgico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volmenes de agua.
Filtros Hepa:
Los filtros H.E.P.A (High efficiency Particulate Air) son filtros descartables de medio filtrante seco y extendido que
tienen una eficiencia mnima de 99,97 % (es decir una penetracin mxima del 0,03 %) en aerosoles.
Los filtros U.L.P.A. (Ultra Low Penetration Air) son filtros con caractersticas similares a los filtros H.E.P.A. pero
tienen una eficiencia mnima de 99,999 % (penetracin mxima inferior al 0,001 %) para partculas de un tamao
entre 0,1 y 0,2 micrones. Se utilizan como filtros HEPA finales en sectores como el hospitalario, industria
farmacutica, industria alimenticia, industria qumica fina, industria veterinaria, cabinas de pintura, etc.
ALMACENAMIENTO DEL MATERIAL ESTRIL

Una vez que un material est estril puede mantener esta condicin si est protegido en la forma apropiada.
La duracin de la esterilidad de un material no est relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que
comprometen su exposicin al medio ambiente.
Los materiales estriles pierden su esterilidad:
-Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o
almacenamiento.
-Al humedecerse el material de empaque.
-No colocarlos sobre superficies mojadas.
-Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos.
-Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26 C y la humedad relativa entre 30 y 60%.
La limpieza del rea se realizar diariamente con utensilios propios, adems de la limpieza general, una vez por
semana, que debe ser estandarizada y evaluada.
El material se debe rotar, colocando en la parte posterior el de esterilizacin reciente, de manera que se utilice primero
el que est prximo a caducar.
CUESTIONARIO
1. Liste al menos tres microorganismos representativos para cada uno de los cuatro niveles de contingencia en
los laboratorios de microbiologa, mencionando la importancia que representa para su rea de formacin.
2. Qu medidas podra tomar usted para verificar la efectividad de la esterilizacin en autoclave?
3. Defina liofilizacin?
4. Defina sonicacin?
5. Qu metodologa de esterilizacin es la adecuada para cada una de las siguientes muestras? (i) Medios de
cultivo slidos contaminados con Salmonella sp., (ii) Muestras de agua residual domstica, (iii) Hisopos
utilizados en muestreo de manipuladores de alimentos, (iv) tejidos de procedencia animal y origen
desconocido, (v), suelo, (vi) suelo inoculado con patgenos de plantas y, (vii) antibiticos.
BIBLIOGRAFA
Espaa. 676 p.
Preparacin de materiales de uso en el laboratorio.
Medios de cultivo
Trabajo Prctico N 3
TTULO DEL PRCTICO: Preparacin de materiales de uso en el laboratorio de microbiologa. Lavado,

preparacin y esterilizacin. Medios de cultivo. Definicin, clasificacin, aplicacin y preparacin.
TEMA: Nutricin: Tipos de nutricin. Fisiologa bacteriana: definicin. Metabolismo microbiano, usos. Divisin
del metabolismo. Clasificacin metablica de las bacterias. Fermentacin. Respiracin. Nutricin.
Requerimientos nutricionales. Requerimientos de Nitrgeno. Requerimiento de Carbono. requerimiento del
azufre
OBJETIVOS
- Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos, aplicando los
conceptos bsicos de nutricin y preparacin de los mismos.
- Desarrollar en los estudiantes competencias en los puntos clave que deben tenerse en cuenta antes, durante
y despus de la preparacin de un medio de cultivo.
- Preparar algunos medios de cultivo, lquidos o slidos, siguiendo las instrucciones proporcionadas.
INTRODUCCIN
Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes bsicos y factores fsicos
para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varan segn el tipo de microorganismo y es necesario
conocerlas para cultivarlos en el laboratorio.
Las necesidades nutricionales bsicas pueden suministrarse en el laboratorio, mediante el uso de medios de
cultivo artificiales, los cuales se encuentran disponibles en una gran variedad y los cuales en general aportan a
los microorganismos:
1. Una fuente de carbono. El carbono es un componente esencial y central para conformar la estructura celular
y permitir a la clula realizar todas sus funciones. Segn la fuente de carbono los microorganismos se
encuentran en dos grupo: Auttrofos y hetertrofos. Los organismos auttrofos pueden cultivarse en medios
que contengan nicamente compuestos inorgnicos (utilizan principalmente dixido de carbono como
carbono inorgnico). Los organismos hetertrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono orgnico
(por ejemplo glucosa u otro carbohidrato).
2. Una fuente de Nitrgeno. Elemento esencial para que la clula construya macromolculas como: protenas y
cidos nuclicos. Algunos microorganismos usan nitrgeno atmosfrico, otros emplean sales de nitrato o de
amonio como compuestos inorgnicos, as como, otros requieren compuestos orgnicos que contengan
nitrgeno como los aminocidos.
3. Elementos no metlicos. Iones no metlicos como el azufre y el fsforo. El azufre puede encontrarse en
protenas, sulfatos o como azufre elemental; mientras el que el fsforo puede encontrarse formando sales.
4. Elementos metlicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3). Llamados tambin micronutrientes,
oligoelementos o elementos traza. Encontrados en sales inorgnicas adicionadas a los medios y los cuales
son tomados en bajas concentraciones por los microorganismos.
5. Vitaminas. Los microorganismos pueden tomarlas del medio ya elaboradas o iniciar procesos de sntesis de
las mismas. Algunos microorganismos poseen una variedad de vas para sintetizar vitaminas; mientras otros,
sintetizan un nmero muy limitado de ellas a partir de componentes del medio. Otros las requieren como
suministro.
6. Agua.
7. Energa. Existen dos tipos bioenergticos de microorganismos, los fottrofos y los quimitrofos. Los fottrofos
emplean la energa radiante (luz solar), como nica fuente de energa; y los quimitrofos que, obtienen la
energa por oxidacin de compuestos qumicos orgnicos o inorgnicos.
Las necesidades fsicas involucran factores, como: Temperatura, pH y gases, los cuales se encuentran en un
rango ptimo especfico para cada microorganismo; por lo tanto, su variacin puede acelerar o disminuir el
crecimiento.
El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un microorganismo en particular, debe
satisfacer sus necesidades nutricionales, con el objetivo de recuperarlo y hacerlo crecer adecuadamente. De
manera general, estos medios pueden ser medios artificiales o medios qumicamente definidos. Para los
qumicamente definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos qumicos puros que los conforman
ya sean de tipo orgnico como inorgnico. Los medios artificiales estn compuestos de un nmero limitado
de sustancias complejas, como extractos de plantas o de animales cuya composicin qumica exacta no se
conoce. De acuerdo a lo anterior, los microorganismos en general pueden tomar los requerimientos
nutricionales de los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para multiplicarse
MEDIOS DE CULTIVO Y CLASIFICACIN.

El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el Laboratorio. Un medio
de cultivo es una solucin acuosa (bien como tal o, bien incorporada a un coloide en estado de gel), en las que
estn presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s)
(Tabla 1).
Propiedades de los medios de cultivo.
- Humedad. Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecacin) puede llevar a la

muerte del microorganismo.
- Fertilidad. Se refieren a los elementos o compuestos bsicos que permiten el crecimiento bacteriano.
- pH. Se refiere a los pH ptimos para el desarrollo bacteriano, indispensable para su aislamiento; variaciones
cidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento.
- Transparencia. Permite la observacin bacteriolgica, evidenciar morfolgica y fsicamente su crecimiento en
medos de cultivo adecuado.
La presentacin comercial de los medios sintticos y deshidratados puede ser en polvo o granulados. En el
mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos.
Los medios de cultivo granulados, son medios de cultivo elaborados a partir de materias primas sometidas a
molienda, mezclado, pulverizacin y granulacin (aglutinacin de la mezcla pulverulenta). Este tipo de medios
tienen algunas ventajas frente a los medios tradicionales en polvo, como lo son:
- Reduce alergizacin o respiracin de sustancias txicas por produccin de polvo.
- Menor adherencia a las paredes de los recipientes.
- Mayor facilidad en el pesaje.
- Mejor humectabilidad (grumos fcilmente solubles).
- No se produce separacin de fases de los componentes del medio de cultivo en almacenamiento prolongado.
- Mejor conservacin.
Tabla 1. Clasificacin de los medios de cultivo de acuerdo a su estado fsico, composicin y su propsito
Estado/
Clasificacin composicin/ Descripcin
objetivo
- Slidos: 1.5 a 2.0 % de agar agar.
SEGN SU ESTADO - Semislidos: 0.5 % de agar agar.
FSICO - Lquidos: No contienen agar agar.
- Bifsico: Contiene fase slida y fase lquida (listos para
utilizar).
Utilizados para cultivar microorganismos tal y como se
encuentran
- Naturales: en la naturaleza. Se usan con base a la experiencia y no a su
SEGN SU Composicin. Ej.: Sangre diluida, leche, jugos vegetales, etc.
NATURALEZA O De composicin exactamente conocida. Los ms utilizados son
COMPOSICIN - Sintticos: Los medios comerciales deshidratados.
Contienen clulas u organismos vivos, como las clulas de
- Vivos: rin
de mono o huevos embrionados.
Con adicin de sangre, suero o
extractos
de tejidos de animales o plantas al caldo
Medios enriquecidos: o agar, proporcionando sustancias
complementaria
nutritivas s para el
crecimient microorganismo
o de s
exigentes.
Con adicin de algunas sustancias que
no permiten el desarrollo de un grupo de
microorganismos y sin afectar el
desarrollo de los grupos de inters. En
Medios selectivos*: principio se pueden seleccionar los
microorganismos que se desarrollan en
Aislamiento de
medios orgnicos poco comunes, caso
SEGN SU microorganismos
en el cual se omiten otros compuestos
PROPOSITO
de
carbono.
Contienen reactivos qumicos que traen
como resultado, determinado tipo de
crecimiento bacteriano despus de la
(observaci hemlisis
Medios diferenciales*: incubacin n de ,
coloraciones de las colonias y otras
reacciones
indicadoras).
Para determinar el tipo de crecimiento
Medios para producido por los microorganismos, as
identificacin: como, la capacidad para producir
cambios qumicos.
*
Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas, es decir, permiten aislar microorganismos y revelan una
reaccin o cambio qumico especfico de metabolismo como: coloraciones de colonias o cambios de color del
medio; es decir, selectivos y diferenciales al mismo tiempo.
Almacenamiento y conservacin de medios de cultivo.
Los medios de cultivo deshidratados deben ser conservados en lugares secos, protegidos de la luz, a una
temperatura entre 15 y 30C, en envases bien cerrados y dispuestos preferiblemente de forma horizontal.
Despus de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos deben cerrarse firmemente.
Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos cortos, mximo
de una semana y lo ms conveniente es almacenarlos a temperatura de refrigeracin (mximo 4C); aunque
algunos medios que contienen tioglicolato, se conservan mejor a temperatura ambiente y protegidos de la luz por
un tiempo mximo de 4 das. Bajo condiciones ptimas de almacenamiento, los medios deshidratados conservan
sus cualidades durante el tiempo indicado y hasta la caducidad impresa en la etiqueta del recipiente.
A los medio de cultivos se les realiza una prueba de esterilidad, ya sea cuando estn deshidratados (Ecomtrico),
o preparados. En el ltimo caso se toma del lote una muestra no inferior al 5%, incubndose estas muestra a
37C/24h. Finalizado el tiempo de incubacin se observa si presentan crecimiento microbiano con el fin de
descartar los lotes de medios contaminados.
PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigacin microbiolgica. Para obtener un producto final bien
terminado (medio de cultivo), deber contarse con la habilidad, destreza, conocimientos bsicos en fisicoqumica
y microbiologa. En trminos generales, un medio de cultivo puede ser preparado correctamente siguiendo las
indicaciones relacionadas a continuacin:
1. Disolucin del medio de cultivo deshidratado. Se debe emplear agua limpia, recin destilada o desmineralizada
y con pH lo ms cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para
que el medio sea agitado con facilidad. Inicialmente se aade la mitad de agua y se agita suficientemente
para conseguir una suspensin homognea; despus, se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo
de medio de cultivo es sensible al calentamiento, pero no debe calentarse ms de lo estrictamente necesario.
Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a ulterior esterilizacin en
autoclave, es imprescindible prestar atencin en su disolucin completa, esto se confirma cuando al agitar no
se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partcula de agar o de medio y la solucin fluye libremente.
Si la preparacin es de ms de 2 litros, se recomienda desler el medio de cultivo en una dcima parte de la
cantidad total de agua y dejarla remojar durante 15 min.; simultneamente, calentar a ebullicin el agua
restante y agregar sta agua con constante agitacin al medio remojado. Calentar hasta su completa
disolucin.
2. Esterilizacin. Antes de su esterilizacin y despus de su completa disolucin se debe repartir el medio en los
recipientes definitivos o en los que se lleve a cabo el trabajo de investigacin, excepto si corresponde a cajas
de Petri. La esterilizacin, si as lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en autoclave a 121C/15 libras de
presin/15min. Tras la esterilizacin y despus de haber alcanzado el equilibrio de presiones (vlvula abierta),
y para evitar la sobrecarga trmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar
los recipientes rpidamente a temperatura de vertido entre 45 y 50 C, as se evitar alterar el medio de cultivo.
3. Vertido en placa. Previamente, remover el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para
entremezclarlo de manera uniforme; verter el medio a las cajas Petri a la temperatura de vertido, evitando la
formacin de humedad en la tapa de la caja. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan
Abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de Bunsen. Recuerde que el proceso de
servido de las cajas debe realizarse en un cuarto estril o en cmara de flujo laminar.
4. Tubos de agar inclinado (bisel o pico de flauta), y sin inclinacin. Los tubos llenos de medio de cultivo
esterilizado, todava lquido, se colocan en una posicin inclinada de tal forma que se forme una placa de
aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones (Agar inclinado, pico de flauta o
bisel). En los casos en los cuales se requiere el medio sin inclinar, estos deben dejarse solidificar en posicin
vertical sobre una gradilla.
Posibles defectos en la manipulacin y preparacin de medios de cultivo.
Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservacin del medio de cultivo en
ambiente exclusivamente hmedo; puede ser la causa de envases abiertos por tiempo prolongado o dejar mal
cerrado el envase despus de su uso o por ltimo que, el medio de cultivo se encuentra vencido (ver fecha de
vencimiento). Se recomienda despus de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posicin horizontal.
Desviacin del pH. Causado por utilizacin de agua no neutra, envases mal cerrados, sobrecalentamiento del
medio de cultivo durante su preparacin o medio pasado de fecha de vencimiento.
Turbidez. Precipitacin causada por uso de recipientes sucios, sobrecalentamiento del medio, prdida de agua
por evaporacin en el medio o por no disolucin completa del agar-agar.
Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporcin inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolucin
del agar-agar e ineficiencia en la agitacin.
Medios de cultivo contaminados. Por esterilizacin deficiente o contaminacin posterior a su preparacin
(vidriera no estril y/o contaminacin en etapa de servido de los medios).
Colonias inconcretas o desledas. Causada por superficies hmedas de los medios y/o por demasiado inculo
en la siembra.
CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO.
Medios simples.
Agar Nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona y agar-agar.
Caldo Nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y Cloruro de Sodio al 0.5% (Ej.:
Caldo BHI (Brain Heart Infusion/Infusin Cerebro Corazn), Caldo TSB (Caldo de Soya Tripticasa), y Caldo
Nutritivo).
Agar Base Sangre: Medio slido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%;
usado para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemoltica.
Medios enriquecidos.
Agar Sangre: Al medio Agar Sangre se le adiciona sangre de conejo desfibrinada al 7% estril, cuando este tiene
una temperatura de 45C y luego de su esterilizacin (la fuente de sangre debe ser estril).
Agar Chocolate: Consiste en un agar sangre que antes de su solidificacin se lleva a 100 C/1min., (llevar a
ebullicin); as, se rompen los glbulos rojos y el medio toma un color caf. Se usa para el aislamiento de
Haemophilus spp., y Neisseria spp.
Medio de Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerantes y anaerobios. Debe conservarse en la

oscuridad y en tubos tapa rosca de manera que, la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la
superficie del medio.
Medios selectivos y diferenciales.

Agar MacConkey: Medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares,
lactosa y rojo neutro como indicador de pH (evidencia la fermentacin de la lactosa por el cambio de color).
Agar SS (Salmonella-Shigella): Contiene peptona, lactosa, bilis de buey desecada, citrato sdico, tiosulfato
sdico, citrato de hierro (III) y amonio, verde brillante y como indicador de pH Rojo neutro, que evidencia la
fermentacin o no de lactosa. Las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras y las de
microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. Tambin pueden determinarse microorganismos
formadores de H2S, por la formacin de un centro negro en la colonia.
Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorantes que impiden el crecimiento de bacterias Gram-
positivas. E. coli crece formando colonias con brillo metlico caracterstico, por la cristalizacin de la Eosina.
Medio de Telurito: Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus y Listeria. El Telurito de potasio al

2%, es reducido por las Corynebacterias reductoras, apareciendo colonias de color gris-negro.
Medio de Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento de mohos y levaduras. Contiene dextrosa, peptona o
maltosa y con pH entre 5,0 y 5,5, inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos por efectos de la acidez del
medio.
Medios de transporte.
Mantienen viables los microorganismos presentes en una muestra antes que esta se procese; los conserva
evitando su multiplicacin y muerte.
Medio de Stuart: Se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos muestreados con escobilln estril
(hisopos).
Medio de Buffer Glicerinado: Permite el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos. Se ha
observado que, mantiene la viabilidad de Shigella.
Medios bioqumicos diversos.

Son aquellos que revelan las caractersticas bioqumicas particulares de las bacterias, como: TSI (Agar Hierro
tres azcares), Citrato de Simmons, SIM (Agar Sulfuro Indol Motilidad), Caldo MR-VP (Rojo de Metilo-Voges
Proskauer), Caldo Malonato, Caldo Rojo de Fenol + Carbohidrato, rea, LIA (Agar Lisina Hierro), etc.
Comercialmente, pueden encontrarse sistemas multipruebas para evaluacin bioqumica de microorganismos,

con 10 o ms parmetros que permiten una rpida y precisa identificacin de los rasgos metablicos del
microorganismo y su consiguiente identificacin (Sistemas Crystal y API).
Materiales y equipos.
- 2 cajas Petri estriles.

- 2 tubos de ensayo estriles.
- 2 tubos taparosca estriles.
- 2 pipetas de 10mL estriles.
- 2 erlenmeyer de 50 y 250mL (o dos botellas para preparacin de medios de cultivo).
- 1 autoclave.
- 1 rollo de cinta de papel.
- 1 rollo de gasa.
- 1 rollo de algodn.
- 1 pote de medio de cultivo deshidratado (simple, enriquecido, selectivo y diferencial).
- 1 mechero Bunsen.
- 1 estufa elctrica.
- 1 balanza de precisin.
- 1 esptula.
- 500mL de agua destilada.
- 2 probetas de 50 y 100mL.
- 2 pesasales o recipientes para pesaje.
- Alcohol 70%.
- Tollas desechables.
Procedimiento para la preparacin de los medios de cultivo.
1. Realice los clculos correspondientes para la preparacin de los medios asignados, de acuerdo con las
indicaciones del profesor y la casa comercial del medio de cultivo (gramos de medio a pesar y mililitros de
agua destilada).
2. Recuerde que todo el procedimiento debe ser llevado en asepsia (material estril y/o desinfestado).
3. Pese la cantidad calculada de medio de cultivo, de acuerdo al volumen de agua a utilizar.
4. Mida el volumen de agua destilada con una probeta segn los clculos.
5. Mezcle el medio deshidratado con la mitad del agua, agite suficientemente y agregue el agua restante. Lleve
a ebullicin si es necesario (en el caso de agares, no a los caldos).
6. Esterilice en autoclave segn las indicaciones impresas en la etiqueta del producto.
7. Finalizada la esterilizacin, sirva aspticamente aproximadamente 15 o 20 mL de agar en las cajas Petri;
evite la condensacin de agua sobre la tapa de la caja, por el servido muy caliente del medio. Para los
medios que se dispensan en tubos, se recomienda servir la cantidad adecuada de medio de acuerdo al
tamao del mismo, previo a la esterilizacin (el volumen en los tubos puede oscilar entre 5 y 10mL).
8. Recuerde inclinar los tubos con agar que deben quedar en bisel o pico de flauta.
9. Los medio ya esterilizados, no deben ser expuestos al ambiente, para evitar su contaminacin. Estos solo
deben ser abiertos en condiciones de cmara de flujo laminar en el momento de su uso.
Tenga en cuenta que,
- Los medios sin agar se pueden disolver en agua fra y los que lo contienen, deben ser calentados para
conseguir su disolucin (la dilucin completa de un agar, se relaciona a la apariencia cristalina del medio).
- Los medios que contienen sustancias que se alteran con altas temperaturas, deben esterilizarse de forma
fraccionada (recuerde que no todos los medios se esterilizan por calor).
- Los medios con pH inferior a 5,0, se deben preparar con cuidado, pues el agar se hidroliza al ser calentado
en medio cido, disminuyendo la estabilidad del gel.
CUESTIONARIO
Complete la informacin del siguiente cuadro y anxelo al informe de la prctica.
Microorganismo
(s) Composicin Forma de Interpretacin
Medio de cultivo
objeto del medio preparacin del medio
Caldo Tetrationato.
Agar Bismuto Sulfito.
Agar Baird Parker.
Caldo LMX- Fluorocult.
Agar Chromocult.
Caldo BHI (Brain Heart
Infusion).
Agar TSI (Triple Sugar Iron).
Agar LIA (Lysine Iron Agar).
Agar Entrico HEKTOEN
Agar EMB (Eosin
Methylene-blue Lactose).
BIBLIOGRAFA.
Espaa. 676 p.
Microscopa. Uso del microscopio. Observacin de
preparados montados. Examen microscpico.
Trabajo Prctico N 4
TTULO DEL PRCTICO: Microscopa. Uso del microscopio. Observacin de preparados montados
Examen microscpico. Examen en fresco. Tcnicas de coloracin de microorganismos. Coloracin de Gram-
Nicolle. Otras coloraciones
TEMA: Enzimas; Gentica Microbiana: La estructura del ADN y ARN. Genoma procariota y genoma eucariota.
Divisin celular. Mecanismo de conservacin, transmisin y traduccin de la informacin gentica. El cdigo
gentico. La mutacin. Mitosis, meiosis.
OBJETIVOS.
Reconocer cada una de las partes que componen el microscopio ptico y la funcin que cumplen en el
equipo.
Desarrollar en los estudiantes habilidades para la utilizacin correcta del microscopio compuesto,
enfatizando en las recomendaciones necesarias para lograr un mayor tiempo de vida til del equipo.
Preparar a los estudiantes en la observacin correcta de las muestras llevadas a microscopa y el reporte
adecuado de las mismas.
Que el alumno aprenda las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms utilizadas en el
estudio microscpico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios slidos y lquidos. Que identifique las
principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterizacin morfolgica
de estos microorganismos.
INTRODUCCIN
Para todos los investigadores, estudiantes y personal interesado en las ciencias biolgicas, es fundamental el conocimiento
y manejo adecuado de equipos de magnificacin como los microscopios simples, compuestos, binoculares, electrnicos y
estereoscpicos; ya que estos equipos son parte fundamental en el trabajo de campo y laboratorio de la Microbiologa,
Biologa y ciencias afines.
Los dos principios fundamentales de la microscopa son el poder de resolucin y el aumento o magnificacin.
Resolucin. La resolucin del microscopio, es la capacidad que posee el equipo de separar dos objetos adyacentes; es
decir, es la capacidad que tiene un microscopio de poder distinguir dos objetos que se encuentran muy unidos uno al otro.
Esto depende de varios aspectos como: La longitud de onda de luz empleada, la densidad del medio circundante y las
aperturas numricas de los lentes empleados en los objetivos (Figura 1) y condensador. Esta apertura numrica, hace
referencia a la capacidad que tienen estos lentes para recibir el cono de luz que pasa a travs de la muestra y que es
proveniente de la fuente.
Tenga en cuenta que, mientras menor sea la distancia que puede medirse entre dos puntos en un campo microscpico,
mayor es el poder de resolucin.
La capacidad de aumento y resolucin del microscopio depende del tipo de luz que se emplea. Los microscopios de luz
permiten la resolucin de objetos de tamao mayor a la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada, por tanto los
microscopios pticos que utilizan luz visible (La luz visible se encuentra desde el violeta-390nm., al rojo-780nm.), de
500nm., no permiten resolver objetos separados por distancias inferiores a 0,25 (=250nm.); entre menor sea la longitud
de onda de luz empleada, mayor poder de resolucin logra un microscopio, entre mayor apertura numrica tenga este
mayor poder de resolucin tendr. El ojo humano, en comparacin, slo puede resolver puntos separados por 25-100
que en promedio dara resoluciones 250 veces menores que el microscopio de ptico.
Debido al pequeo tamao de la mayora de los microorganismos, se requiere de un microscopio ptico, ya sea
de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripcin morfolgica de stos. El microscopio de uso ms
comn es el de campo claro, en el que la observacin de clulas vivas es limitada debido a que las clulas son
incoloras y permiten el paso o de una gran cantidad de luz.
La observacin de frotis teidos es ms recomendable. El frotis se prepara I haciendo una extensin de los
microorganismos sobre una superficies transparente, en la cul se fijan y tien los microorganismos. o De
acuerdo al nmero de soluciones colorantes ya los objetivos de o estudio se pueden realizar diferentes tipos de
tinciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva.
Los frotis de cultivos lquidos se debern fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darn
interferencias en las observaciones y los de colonias de medios slidos se fijan generalmente con calor. Despus
de la fijacin, los frotis son teidos con diferentes colorantes sintticos derivados de anilina.
Los colorantes ms utilizados son sales formadas por iones coloridos car-gados conocidos como cromforos.
Por ejemplo:
Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* + ci-(Cromoforo)
Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo bsico, pero si la carga es negativa ser de tipo cido.
La mayora de las bacterias son teidas por colorantes bsicos, que permean la pared celular y se adhieren por
enlaces inicos dbiles a molculas con cargas negativas de la clula bacteriana. La tincin delas bacterias con
azul de metileno, es un ejemplo de tincin simple que facilita la observacin deforma, tamao y arreglo delas
clulas.
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 mechero
1 asa de siembra
5 Portaobjetos
Piceta con agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de metileno alcalino
Alcohol etlico al 70%
Toallas desechables
Fenol al 2%
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO.
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichla col, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. Y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparar frotis
de cada cepa obtenida de cultivo slido y otros de cultivo lquido, los cuales fijar y teir con azul de metileno.
El profesor explicar los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminacin.
Preparacin de frotis
1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despus
acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapn y flamear rpidamente la boca del mismo. Introducir
el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Para el caso de cultivos lquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente
en un rea circular de 2 cm. de dimetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el
frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces ms.
5. Si el cultivo es de medio slido, previamente se colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua
destilada en la que se mezcla una pequea muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del
paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
Fijacin del frotis

Fijar los frotis de cultivos lquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en
zonas alejadas al mechero).
Los frotis de cultivos slidos, completamente secos se fijarn con calor. Para esto se pasar el frotis rpidamente
2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo
sobrecalentamiento.
Tincin simple
Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua destilada.
Dejar secaral aire
Observacin al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observacin, siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para la observacin con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequea gota
de aceite de inmersin sobre la preparacin.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que daan estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin y tamao relativo de cada uno de los microorganismos en
el cuadro de resultados.
B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
EJERCICIOS DE APLICACIN. RESOLUCIN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS.
1. Investigue cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
2. Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor? Por qu se deben
poner varias veces muestras del cultivo lquido y slo una muestra de cultivos slidos al preparar los frotis?
3. Cules son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qu se debe utilizar el aceite de
inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias?
4. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple?
5. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin de frotis?
6. Cul es la utilidad del aceite de inmersin?
7. Qu otros tipos de microscopios (microscopa), se conocen? Mencione sus diferencias.
Bibliografa de consulta.
Espaa. 676 p.
Tcnicas de siembra. Siembras en medio lquido y
en medio slido en tubo
Trabajo Prctico N 6
TTULO: Tcnicas de siembra. Siembras en medio lquido y en medio slido en tubo (a un mismo nivel y en pico
de flauta) y en placa (siembra masiva, agotamiento en superficie, agar volcado).
TEMA: Definicin de bacteriologa. Las bacterias: Forma, tamao, metabolismo y nutricin principales especies.
Estructura de la clula microbiana. cidos nucleicos. Ncleo. Citoplasma. Ribosomas. Mitocondrias. Pared
celular. Flagelos y pilis. Esporas. Cpsula. Morfologa microbiana.
- Practicar las diferentes tcnicas de siembra para el desarrollo de cultivos y subcultivos de hongos y bacterias, en medios
de cultivo dispensados en tubos y cajas Petri, as como, en medios de diferente composicin y estado.
- Desarrollar en los estudiantes la capacidad de seleccin de una metodologa especfica, de acuerdo a los criterios
proporcionados, para la aplicacin correcta de las tcnicas de siembra de acuerdo al microorganismo y al objetivo de
la prueba.
Bacteriologa, virologa y protozoologa general
INTRODUCCIN AL TEMA:
El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre
de siembra; esta operacin la podemos realizar a partir de muestras biolgicas (orina, pus secreciones, etc.), de
anlisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosmticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras
ambientales (agua, suelo, etc.), o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de un cultivo a otro la
denominamos subcultivo o repique.
Para el estudio de las bacterias y otros microorganismos cultivables, es necesario adems, conocer y reconocer
la morfologa microscpica y macroscpica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es
posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionarles
aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo.
Existen tcnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos elementos importantes para
realizar siembras, como: El mechero (de alcohol o de Bunsen), el asa bacteriolgica (asa de argolla), o micolgica
(asa recta), cmaras de flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones aspticas y los medios de cultivo ya
preparados y atemperados a 37C; esta ltima observacin es importante tenerla en cuenta, ya que los
microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras o cultivos, deben evitar ser estresados con
cambios bruscos de temperatura o por otros factores (incluida la composicin del medio de cultivo).
Contando con estos implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de cultivar o subcultivar muestras
o aislamientos previamente obtenidos.
TCNICAS DE SIEMBRA.
La tcnica ms usada en el laboratorio de microbiologa es probablemente la transferencia de microorganismos

de un ambiente a otro con el propsito de cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias,
hongos y otros cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axnico (o cultivo puro).
Existen varios mtodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus caractersticas en estos
medios.
Se entiende por cultivo puro, una poblacin de clulas las cuales todas proceden de una misma clula. Existe
gran variedad de tcnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser
aisladas en cultivo puro.
TCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.
Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de agotamiento, aislamiento o de estra cruzada.

Es un buen mtodo para el aislamiento de colonias (obtencin de colonias aisladas); mediante esta tcnica
buscamos obtener colonias separadas a partir de un inculo. Para su realizacin: (i) se toma la caja de Petri en
la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente
esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un rea
perifrica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inculo. (ii) El asa debe ser
nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no daarlo); a continuacin se realiza una
estra partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de
la superficie del agar. Se debe procurar que en cada seccin de la caja, las estras queden trazadas con mayor
separacin. (iii) Repita el paso ii, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear y enfriar
el asa cada vez que culmine una estra y solo tocar con el asa la estra inmediatamente anterior, con el objetivo
de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla
(Figura 1).
Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la tcnica de agotamiento (y otros microorganismos emulsionables
como las levaduras)
Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de siembra en cuadrantes.
El objetivo de esta tcnica, es el de diluir el inculo a medida que se realizan estras en la superficie del agar.
Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriogrfico
por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inculo y se inicia el rayado de
la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar
nuevamente inculo). Las cajas as sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria.
Fig. 2. Tcnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estras realizadas una a continuacin
de la otra y sin cargar el asa nuevamente
Siembras en cajas de Petri por la Tcnica de siembra masiva.
Este mtodo es muy utilizado para obtener un gran nmero de microorganismos (incremento de inculo), en la
superficie de un agar. Esta tcnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa
en distintas direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en
la superficie de la placa (Figura 3).
Fig. 3. Procedimiento para la realizacin de una siembra por la tcnica masiva, utilizando hisopos estriles y
sobre la superficie de un agar en caja Petri
Siembras en cajas de Petri por la Tcnica de puncin.
Mtodo de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y as ms adelante establecer su morfologa;
as como, para la transferencia o subcultivo de cepas previamente almacenadas y /o conservadas. Consiste en
tomar parte de micelio con un asa micolgica (o asa recta), y por una puncin suave en el centro de la caja
inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo, pueden hacerse mltiples picaduras en el agar
(varios puntos de siembra) (Figura 4)
Fig. 4. Procedimiento para la realizacin de una siembra por la tcnica de puncin, utilizando asa micolgica y
sobre la superficie de un agar en caja Petri
TCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS.
La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante
del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de inters, por lo tanto se deben tener las siguientes
precauciones:
- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos
del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de este.
- Los tapones se deben mantener en la mano contrara a aquella que contiene el tubo, sostenindolos entre el
dedo meique, el anular y el dedo del corazn. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algn otro
lugar.
- Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo despus de la siembra o inoculacin.
- Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porcin que entra en contacto con el medio de cultivo).
- Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
- Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
- Despus de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.
- Siembre trabaje con material abierto, en cmara de flujo laminar o en su defecto con mecheros Bunsen.
- En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, as como, utilice asas totalmente
rectas.
Siembra en tubos por estra simple.
Se realiza en un tubo con medio slido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie
expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estras (Figura 5A).
Siembra mixta en tubos.
Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y
luego haciendo una siembra en estra sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie
en bisel marcando las estras; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin
retirarla del tubo (Figura 5B).
Siembra en tubos por picadura.
Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios slidos y semislidos
generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por
el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura 5C y 5D).
Siembra en tubo en medio lquido.
Para transferir material a partir de un medio lquido o slido a otro lquido, puede usarse el asa bacteriolgica (de
argolla), o en algunos casos, pipetas estriles o hisopos. Si Usted utiliza asas bacteriolgicas, inocule el
microorganismo en el medio lquido hacindola rotar del mango (Figura 5E).
Fig. 5. Tcnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos, donde: (A) Siembra por estra
simple, (B) siembra mixta (picadura y estra), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra
con asa bacteriolgica en medio lquido
NOTA: En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas Petri o los tubos de manera
clara, completa, legible, con la identificacin respectiva y la fecha. Para anlisis clnico, marcar siempre las cajas
en la base de la caja Petri y para anlisis de control de calidad de alimentos u otras materias primas, marcar las
cajas en la tapa de la caja Petri. Luego de realizada la siembra, usted debe proporcionar la temperatura y el
tiempo adecuado para la proliferacin o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado
caso, un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inculo
no se ha adsorbido, espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa hacia arriba
por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el agua de condensacin que
pueda formarse en la tapa de la caja, caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la
formacin clara de las colonias.
MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR
1 caja Petri con agar PDA.

4 cajas Petri con agar Nutritivo.
1 tubo con 5mL de Caldo Nutritivo.
1 tubo con agar SIM.
2 tubos con agar Nutritivo en bisel.
1 tubo con agar PDA en bisel.
2 hisopos estriles en tubo taparosca.
1 asa bacteriolgica.
1 asa micolgica.
1 mechero Bunsen.
1 cultivo bacteriano en caja Petri con agar Nutritivo de 24h.
1 cultivo fngico en caja Petri con agar PDA de 3 das.
Etanol 70%.
Toallas desechables.
1 rollo de papel para sellar cajas Petri.
1 rollo de cinta de papel.
2 incubadoras de352C y 25C.
PROCEDIMIENTO.
Procedimiento para la realizacin de las siembras.

De acuerdo a la fundamentacin terica de esta gua, a las indicaciones del docente y al material de trabajo, efecte las
siembras listadas a continuacin:
1. Siembre por picadura en tubos de agar sin inclinar (rectos) (bacteria).

2. Siembre por estra en tubos de agar inclinado (bacteria).
3. Siembre por tcnica mixta en tubos de agar inclinado (bacteria).
4. Siembre por agotamiento (aislamiento o estra cruzada), en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).
5. Siembre por la tcnica de cuadrantes, en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).
6. Siembre por la tcnica masiva y con hisopo, en la superficie de una caja Petri con agar Nutritivo (bacteria).
7. Siembre en tubos de Caldo Nutritivo, utilizando asa bacteriolgica (bacteria)
8. Siembre por puncin cajas de agar PDA (hongo).
9. Siembre por puncin tubos de agar PDA inclinado (hongo).

1. Cul es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?
2. Mencione brevemente el proceso de purificacin de un aislamiento bacteriano obtenido en agares.
3. Explique brevemente la metodologa para realizar siembras en placa profunda y placa en superficie.
Espaa. 676 p.
Lectura e interpretacin de los cultivos.
Pruebas de identificacin
Trabajo Prctico N 7
TTULO: Lectura e interpretacin de los cultivos. Pruebas de identificacin.
TEMA: Reproduccin bacteriana: Sexual y Asexual Crecimiento y multiplicacin microbiana. Curva de

crecimiento. Fases. Cintica de la reproduccin de microorganismos. Crecimiento exponencial. Tiempo de
generacin. Influencia de los factores fsicos y qumicos. Presin, temperatura, nutrientes. Variaciones.
Capacitar al estudiante en las metodologas ms utilizadas en microbiologa, para la cuantificacin directa e
indirecta de microorganismos.
Desarrollar habilidades en los estudiantes para el recuento de las poblaciones de microorganismos presentes en
muestras de diferente origen.
Metabolismo De Carbohidratos Y Lpidos
Existen diferentes tcnicas para determinar el nmero de microorganismos o el peso seco (biomasa), de las
clulas microbianas presentes en un cultivo. Los mtodos en general se agrupan en directos o indirectos.
MTODOS DIRECTOS.
Los mtodos directos, requieren de preparaciones puras sin ningn tipo de partculas que puedan interferir con
los resultados y se refieren bsicamente a la medida de la masa celular o directamente del nmero de individuos
presentes en una muestra. Estas metodologas incluyen:
Determinacin del peso hmedo. En el cual se determina el peso del sedimento (microorganismos). Con esta
metodologa se pueden presentar errores debido al lquido intercelular retenido, el cual depende de la forma y
tipo de agrupaciones del a bacteria y cuan intenso es este agrupamiento.
Determinacin de peso seco. Se basa en la misma tcnica que el anterior, solo que el sedimento se seca antes
de ser pesado. Los inconvenientes incluyen el hecho de ser una metodologa compleja en tiempo y equipos;
tambin, se presentan varios errores de clculo de cantidades de biomasa muy pequeas. Se calcula que 1mg
de peso seco es igual a 5x109 bacterias.
Determinacin de nitrgeno total. Calculada por la tcnica micro-Kjeldahl.
Determinacin de componentes caractersticos de las clulas. Como peptidoglicano, cidos nuclicos, protenas,
ATP, etc. Esta metodologa es aplicada comnmente en bacterias, cuando otros mtodos evidencian ser poco
exactos, debido a la formacin de grumos no dispersables por el crecimiento tpico del microorganismo y para
mediciones de crecimiento en muestras de ambientes naturales.
Recuento en cmara de Petroff-Hauser. Cmara de Neubauer o Hemacitmetro. La metodologa se desarrolla
sobre un portaobjetos en el cual se deposita la muestra; este portaobjetos tiene impresa una cuadrcula graduada
y con medidas exactas: Profundidad de 0.02mm, rea 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes
(cada uno de ellos subdividido en 16 cuadrados ms pequeos, en un arreglo de 4x4); entonces, cuando la
muestra a cuantificar es depositada entre el portaobjetos calibrado y el cubreobjetos, se distribuye en 400 celdas
(16 x 25 = 400) (Figura 1). Ya la muestra depositada y reposada, se procede a contar las clulas en 16 celdas
(aunque las reas contadas son variables), se registra el nmero contado en estas y se calcula la poblacin de
clulas de la siguiente forma:
Concentracin en clulas/mL = n x 25 x 50 x 1000
Donde n = nmero de clulas contadas en las 16 celdas.
La ventaja de este mtodo est dada por la rapidez para el clculo del nmero de clulas, pero solo debe ser
utilizado en muestras con poblaciones concentradas de clulas (>10 x 106 clulas/mL), pues con menores
poblaciones, la observacin al microscopio es poco significativa estadsticamente. Para obtener resultados ms
exactos, es recomendable tener un conteo entre 200 y 300 clulas por muestra.
Fig. 1. La imagen de la izquierda muestra la cmara de Neubauer y el portaobjetos para el depsito de la muestra,
as como la cuadrcula graduada para el conteo de clulas (imagen central). El crculo amarillo indica el rea de
conteo de 25 cuadrados subdivididos a su vez en 16 (imagen de la derecha)
Contadores electrnicos de partculas Coulter. El fundamento del mtodo, es la interrupcin de corriente por el
paso de una clula. Con esta metodologa se requieren muestras totalmente puras, pues cada partcula presente
que no sea una clula, es registrada por el equipo o puede ser la causante de un dao del mismo. El registro de
los individuos se realiza, haciendo pasar la suspensin microbiana a travs de un tubo capilar entre dos polos de
una corriente elctrica; cada vez que por un orificio pasa una partcula (clula), se interrumpe la corriente y esta
informacin es colectada por un dispositivo electrnico que detecta el nmero y el tamao de las partculas que
van pasando y de esta manera se determina la poblacin de clulas.
MTODOS INDIRECTOS.
Consumo de nutrientes o produccin de metabolitos / tiempo. Como por ejemplo la medicin del consumo de
oxgeno, consumo de gas carbnico, produccin de cidos y otros metabolitos, etc.
Mtodos pticos de turbidimetra. Es la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un
cultivo microbiano (efecto Tyndall). La dispersin es proporcional a la masa del cultivo y solo es vlido para
concentraciones mayores a 107 clulas/mL; donde, la proporcionalidad de la absorbancia y la masa bacteriana
se conservan. Con este fin, puede ser utilizado el espectrofotmetro, que mide la densidad ptica (D.O.), es decir,
la absorbancia. El nefelmetro, es un equipo similar al espectrofotmetro, pero la lectura registrada es de la luz
dispersada por la muestra.
Escalas o patrones de McFarland. Tcnica basada en turbidimetra; La escala se basa en la capacidad de
precipitacin del Cloruro de Bario en presencia de cido Sulfrico y su utilidad, es la poder elaborar suspensiones
bacterianas ajustadas a un patrn y valorando su concentracin; para esto, se toma una alcuota de la muestra
de bacterias y se inocula en un tubo conteniendo solucin salina fisiolgica (0,85%). El objetivo es lograr ajustar
una concentracin de bacterias a uno de los patrones sealados en la Tabla 1 o determinar la concentracin de
una muestra.
Tabla 1. Escala de McFarland, forma de preparacin de cada patrn y su correspondencia en turbidez a una
poblacin de bacterias expresada en UFC/mL.
Tubo Escala de McFarland BaCl2 1% (mL) H2SO 4 1% (mL) UFC/mL
1 4,0 0,1 9,9 3,0x10 8

2 3,7 0,2 9,8 6,0x10 8
3 3,5 0,3 9,7 9,0x10 8
4 3,4 0,4 9,6 1,2x10 9
5 3,3 0,5 9,5 1,5x10 9
6 3,2 0,6 9,4 1,8x10 9
7 3,15 0,7 9,3 2,1x10 9
8 3,10 0,8 9,2 2,4x10 9
9 3,04 0,9 9,1 2.7x10 9
10 3,00 1,0 9,0 3,0x10 9
Los patrones de McFarland, permiten establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin
de bacterias (Figura 2). Se elaboran 10 estndares (Tabla 1), y por espectrofotometra se crea una recta patrn
con la cual se va a poder determinar la concentracin de las diluciones bacterianas elaboradas. La informacin
arrojada es aproximada, ya que la lectura depende de factores como el tamao de la bacteria y la formacin de
agrupaciones.
Fig. 2. Esquematizacin de los patrones de McFarland, donde se observa la turbidez ocasionada por la
precipitacin del Cloruro de Bario en presencia de cido Sulfrico en diferentes proporciones, as como, su
correspondencia a una poblacin bacteriana expresada en UFC/mL.
Recuento en placa estndar o recuento de microorganismos viables. Con este mtodo se puede distinguir entre
clulas viables y no viables; esto se logra sembrando diluciones de las muestras que contienen los
microorganismos en medios de cultivos slidos dispensados en cajas Petri, incubando y posteriormente
realizando el conteo de las colonias visibles (la metodologa puede ser aplicada en la superficie del agar o dentro
del agar). Estas colonias a su vez, son multiplicadas por el factor inverso de la dilucin (o diluciones), utilizado
(Figura 3).
Con esta metodologa y con el objetivo de reducir el error estadstico, se recomienda realizar suficientes rplicas
de las mismas diluciones, as como, de las diferentes diluciones a utilizar. Adicionalmente, el conteo y clculo de
la poblacin de viables, se debe realizar en cajas que contengan entre 30 y 300 colonias (algunos autores
reportan el rango de 50 a 300).
En este tipo de conteo de viables, las colonias no siempre han de proceder de una sola clula, dado que algunas
bacterias pueden formar agrupaciones y estas sern las que darn origen a la colonia; por lo anterior, los reportes
de esta metodologa se refieren a corresponde como mnimo a una bacteria formando una colonia, as como,
tambin a un grupo de estas que han sido las formadoras de la misma.
Fig. 3. Cajas Petri sembradas con diluciones sucesivas, donde, la imagen de la izquierda representa la dilucin
menor (o ms concentrada), en progresin hacia la dilucin mayor o ms diluida (imagen de la derecha)
Con esta metodologa se pueden aplicar algunas modificaciones, como es el uso y conteo de viables sobre filtros
de membrana de nitrocelulosa o nylon (para muestras con bajas poblaciones de microorganismos), en los cuales
quedan atrapados los microorganismos, pues el tamao del poro no permite su paso. Para este caso, las
muestras se hacen pasar a travs del filtro y posteriormente, el filtro es depositado sobre un medio de cultivo
slido, incubado y realizado el conteo de colonias formadas sobre l.
PREPARACIN DE DILUCIONES.
La fraccin de la muestra destinada para el anlisis microbiolgico, debe ser representativa de la poblacin y
constituida normalmente por 200 gramos o mililitros (esto dependiendo del anlisis). Para la puesta en marcha,
se utilizan 100 g o mL y el resto se almacena como reserva, por si se hace necesario repetir el recuento. Si la
muestra est constituida por distintos componentes, se tomarn fracciones representativas de cada una de ellas
en la superficie y en la profundidad de la misma
Para casi todos los anlisis, se parte de una suspensin lquida de concentracin conocida, que se denomina
suspensin madre y que tiene una dilucin 1:10 (10-1). Para conseguir este factor de dilucin, se mide una
cantidad de muestra (en gramos o mililitros), y el resultante, se multiplica por 9 (nueve). Este nuevo resultado
sern los mililitros de diluyente que se debe aadir a la muestra para lograr la dilucin decimal. A partir de esta
dilucin, se preparan las siguientes (1:100 o 10-2, 1:1000 o 10-3, etc.), hasta el factor requerido y establecido
por el analista; recuerde que siempre se debe tener la precaucin de cambiar la pipeta entre la realizacin de
cada una de las diluciones y de mantener en fro, los tubos de la serie de diluciones, hasta el comienzo de los
anlisis, pero sin prolongar por ms de dos horas esta refrigeracin.
Con la finalidad de realizar las diluciones con diferentes volmenes o pesos de las muestras y obtener diferentes
factores de dilucin, se puede hacer uso de la siguiente frmula:
Factor de Dilucin = Soluto

Solvente + Soluto
Donde, el soluto es la muestra (slida o lquida), y el solvente es el diluyente utilizado. Tenga en cuenta que para
el clculo de la segunda dilucin y posteriores, debe multiplicar el resultado por el factor de dilucin, de la dilucin
inmediatamente anterior.
Para la pesada de la muestra, aplique la tcnica mencionada a continuacin:
- Tarar el recipiente estril que se vaya a utilizar para triturar la muestra.
- Introducir aspticamente, la porcin de un volumen adecuado en dicho recipiente.
- Pesar de nuevo para determinar el peso neto de la muestra.
- Con una probeta graduada estril, aadir la cantidad de diluyente estril, para obtener la dilucin deseada.
- Para el caso de muestras lquidas, utilizar pipetas de volumen adecuado y estriles.
La caracterstica principal de un buen diluyente, es que no produzca modificaciones cualitativas ni cuantitativas
en la microbiota de la muestra que van a ser analizada, sin suprimir ni favorecer su desarrollo. En microbiologa,
se utilizan varios diluyentes, pero habitualmente se usan los siguientes: Agua de Triptona con Sal, Solucin de
Ringer y/o Agua de Peptona Tamponada. El diluyente utilizado para la solucin madre se suele emplear
posteriormente, para efectuar las diluciones decimales.
La trituracin de la muestra, es una operacin muy importante, pues en esta se debe evitar la destruccin de los
grmenes presentes, ya sea por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Adems de una
trituracin perfecta de la muestra, es necesario obtener una mezcla homognea para lograr la distribucin
equilibrada de los microorganismos.
Para la homogenizacin de la muestra, existen varios tipos de trituradores, como:
- Jarra o licuadora, que consiste en un envase de vidrio o acero provisto de una hlice que funciona cuando se
adapta a un motor.
- Vstago, provisto de una hlice en su extremo que se introduce en la mezcla que se va a triturar. Funciona
elctricamente y necesita de un envase de vidrio acero estriles, que se adapten especialmente al vstago.
- Triturador de paletas o Stomacher, que acta golpeando rtmicamente la mezcla de la muestra y diluyente,
que han sido previamente introducidos en una bolsa de plstico estril; los choques producidos por las paletas
disgregan la muestra y ponen a los microorganismos en suspensin.
- Para las muestras lquidas, posterior a la realizacin de la dilucin, se debe agitar suavemente de forma
manual o en vrtex, con el objetivo de homogenizar los microorganismos en todo el diluyente.

- 1 stomacher o licuadora.
- 1 recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para stomacher).
- 1 balanza de precisin de 0.1g.
- Para preparacin de muestras: Cuchilla y tijeras esterilizadas.
- 9 pipetas de 1mL estriles.
- 1 pipeta de 10 mL estril.
- 3 tubos con Agua Peptona 0.1% estril.
- 3 cajas Petri con agar para Standard Plate Count (SPC).
- 1 pipeta Pasteur plticas estril.
- 2 tubos con 10mL de Solucin Salina 0,85%.
- 1 microscopio binocular compuesto.
- 1 espectrofotmetro.
- 45 mL de agar SPC fundido y mantenido a 45-50C.
- 1 bao de agua mantenido a 45 - 50C.
- 1 incubadora de 352C.
- 1 contador de colonias.
- 45 mL de agar OGY, Sabouraud, PDA (para conteo de Mohos y levaduras).
- 1 calculadora.
- 1 tubo con cultivo bacteriano de 24h en Caldo Nutritivo.
- 1 caja Petri con cultivo fngico de 3d en agar PDA.
- 2 asas de vidrio o de hockey estriles.
- 1 asa bacteriolgica.
- 1 cmara de Neubauer.
- 1 batera de patrones de McFarland.
- 1 mechero Bunsen.
PROCEDIMIENTO.
Recuento en placa profunda (o tcnica de Barry), y placa en superficie.
- Realice inicialmente los clculos de diluciones decimales iguales a 10-1, 10-2 y 10-3, siguiendo las
indicaciones de la gua y las indicaciones del tutor.
- Realice el proceso de dilucin utilizando la muestra problema y el diluyente apropiado, guindose por los
clculos realizados anteriormente. Recuerde utilizar solo material estril en el procedimiento.
- Con las tres diluciones preparadas, proceda a inocular diferentes cajas Petri vacas y con agar SPC (siembra
en profundidad y en superficie).
- Para la siembra en profundidad: De la dilucin 10-1, tome con una pipeta estril de 1mL de capacidad, 1mL
y colquelo en una caja de Petri estril; repita este procedimiento en otra caja (cada dilucin tendr un
duplicado), y de igual forma para las dos siguientes diluciones.
- Cuando haya sembrado todas las cajas (seis cajas en total), proceda a verter agar Standard Plate Count
SPC (Agar para conteo estndar), fundido y mantenido a 45C aproximadamente. Homogenice cada caja,
realizando movimientos circulares y en ocho, hasta que el agar inicie su polimerizacin.
- Para la siembra en superficie: De la dilucin 10-1, tome con una pipeta estril de 0,1mL de capacidad, 0,1mL
y colquelo en la superficie de una placa de agar SPC y con asa de vidrio, inmediatamente homogenice el
inculo por toda la superficie del agar; repita este procedimiento en otra caja (cada dilucin tendr un
duplicado), y de igual forma para las dos siguientes diluciones.
- Recuerde que en la tcnica en superficie, debe utilizar 0.1mL de la dilucin y en la tcnica en profundidad 1
mL.
- Incube invertidas las cajas a 372C. Revise las cajas a las 24 horas de incubacin y realice un recuento
de las colonias visibles; incube nuevamente y revise a las 48h, realice el recuento (Estas temperaturas y
tiempos se aplican para el anlisis de bacterias aerobias mesfilas). Para el recuento de Mohos y Levaduras,
aplique la misma tcnica (profundidad y superficie), e incube invertidas las cajas a 25C por 3 a 5 das (al
igual que en el recuento de bacterias aerobias mesfilas, realice conteos a los 3 y posteriormente a los 5
das de incubacin).
- Con los datos obtenidos en los recuentos, proceda a realizar los clculos, de acuerdo a los volmenes
utilizados en la siembra y al factor de dilucin de cada pareja de cajas.
- Reporte correctamente sus resultados del conteo de viables en UFC, por gramo o mililitro, de acuerdo a la
naturaleza de la muestra analizada.
Recuento en cmara de Neubauer.
- Revise los conceptos relacionados en esta prctica y siga las instrucciones proporcionadas por su tutor.
- Verifique que la muestra se encuentre diluida, para proceder a calcular la concentracin de clulas por
mililitro de muestra.
- Monte la cmara de Neubauer en el microscopio, localice la cuadrcula para conteo y lleve a aumento de
10x. En este momento, debe observarse correctamente la cuadrcula y comprender la distribucin y las
reas a contar.
- Coloque el cubreobjetos de la cmara al borde de la misma y cubriendo la cuadrcula de conteo.
- Homogenice en vrtex la muestra y con una pipeta Pasteur estril, tome una alcuota de la misma; permita
que por capilaridad, la cmara absorba la muestra.
- Verifique por observacin, que la distribucin de las clulas en la cmara sea homognea. Si no es as,
realice nuevamente el montaje de la cmara.
- Proceda a realizar el conteo, registre sus datos y calcule la concentracin de clulas/mL.
Ajuste de concentraciones bacterianas mediante Patrones de McFarland.
Mtodo A:
- Revise los conceptos relacionados en esta prctica y siga las instrucciones proporcionadas por su tutor.
- A cada patrn McFarland, determine su turbiedad mediante el uso de un espectrofotmetro. Tenga en
cuenta calibrar el equipo con un tubo que solo contenga agua destilada.
- Grafique las lecturas obtenidas de la siguiente forma: En el eje Y (ordenadas), los valores de densidad ptica
(D.O.), registrados y en el eje X (abscisa), el nmero aproximado de bacterias representado para cada
patrn McFarland.
- Concluida la calibracin de los diferentes patrones, proceda a calcular la poblacin de bacterias en la(s)
muestra problema.
- Vierta aspticamente cada muestra problema en las celdas adecuadas para el espectrofotmetro y
determine la D.O.; recuerde ajustar el 0 del equipo, con la muestra problema.
- Calcule la poblacin bacteriana en UFC/mL.
Mtodo B:
- Los patrones de McFarland para la preparacin de suspensiones bacterianas de concentracin conocida,
pueden tambin ser elaborados a partir de parmetros visuales de turbidez.
- Primero, seleccione uno de los patrones McFarland, de acuerdo a la concentracin necesaria de bacteria y
homogencelo totalmente (ya que los patrones se precipitan cuando no estn en uso).
- Para el ajuste de la concentracin por comparacin con un patrn, tome aspticamente alcuotas del
crecimiento de la bacteria en cajas Petri y con asa bacteriolgica; transfiralas a un volumen adecuado de
solucin salina fisiolgica (en porciones pequeas).
- Compare la turbidez del patrn con la turbidez de la muestra en preparacin, colocando a contra luz o en
un fondo oscuro los dos tubos, para realizar una correcta comparacin visual.
- Detenga la adicin de bacterias, cuando haya logrado la misma turbidez de la suspensin bacteriana con el
patrn McFarland seleccionado.
- Registre correctamente la informacin de cada patrn y la concentracin que corresponde a cada uno de
ellos y a la muestra bacteriana preparada.

1. Explique brevemente el proceso mediante el cual se realiza el recuento de microorganismos por la tcnica
de tubos mltiples (o tcnica del Nmero Ms Probable - NMP).
2. Defina el trmino inculo.
Espaa. 676 p.
Medicin y recuento de microorganismos.

Recuento en placa y en cmaras
Trabajo Prctico N 8
TTULO: Medicin y recuento de microorganismos. Recuento en placa y en cmaras. Tcnicas de coloracin de

microorganismos. Coloracin de Gram-Nicolle. Otras coloraciones
TEMA: Definicin de virologa. Los virus: Forma, tamao, replicacin y principales especies. Procesos
enzimticos. Las enzimas: definicin, generalidades. Caractersticas fsico-qumicas. Propiedades
fundamentales. Estudios cinticos. Variables. Produccin. Transferencia de energa
OBJETIVOS.
Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Gram positi-vas o Gram negativas de acuerdo a la
tincin de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cpsulas con tinciones
selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin de
las bacterias.
La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en1884, es una de las tinciones diferenciales ms
utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram
negativas. El mtodo se fundamenta en el hecho de que el coloran-te primario (cristal violeta) tie por igual a
todas las bacterias, pero la combinacin con el colorante es ms permanente en los gram positivos.
Para establecer la diferenciacin en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene
efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son
capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy
difcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina.
Este colorante no modifica el color de los microorganismos que haban retenido el color prima-rio, pero tie a los
microorganismos decolorados.
Estas diferencias de tincin de las bacterias se explican por cambios en la composicin qumica y estructura de
las paredes celulares, que facilitan la retencin o eliminacin del colorante primario despus del proceso de
decoloracin.
Otras tinciones que permiten obtener mayor informacin son la negativa y la selectiva. La tincin negativa facilita
las observaciones de la morfologa y tamao de las bacterias sin alteracin por efecto del calor as como de
estructuras especiales, como la cpsula de algunas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix
es una estructura externa a la clula, formada de polisacridos o polipptidos, que confiere proteccin a las
bacterias contra la desecacin y la fagocitosis.
La extensin sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o
nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cpsulas, que aparecen como
una zona clara que rodea la clula bacteriana en un fondo obscuro.
Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y
Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localizacin son importantes criterios de clasificacin
taxonmica.
Adems, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos
patgenos de gran toxicidad, su deteccin en microbiologa alimentaria y mdica adquiere gran inters.

1 Probeta de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta con agua destilada Cristal violeta (Anexo 1.3) Safranina (Anexo 1.8) Lugol (Anexo 1.5)
Solucin de alcohol-acetona (Anexo 1.6) en Verde de malaquita (Anexo 1.4)
Tinta china
Fenol 2% (Anexo 1.9) Aceite de inmersin
Microscopio compuesto de campo claro
PROCEDIMIENTO.
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichia coll, Streptococcussp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.
El estudiante preparar frotis de cultivo slido y de cultivo lquido de cada microorganismo y aplicar la tincin
de Gram.
Tambin realizar la tincin selectiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tincin
negativa en cultivos de K/ebsiel/a sp.
Tincin diferencial de Gram
a) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto
b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante
c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.
d) Lavar cuidadosamente el frotis con agua.
e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya ms
tintura.
f) Inmediatamente lavar con agua.
g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.
h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar
secar al aire.
Tincin negativa para observacin de cpsulas
a) Colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del I
cultivo lquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo slido, hacer una suspensin del micro-
organismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ngulo de 45
sobre la muestra.
c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
d) Dejar secar al aire.
Observaciones al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de
aceite de inmersin sobre la preparacin.
3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.
Cuadro 3
Descripcin microscpica de cultivos bacterianos

1. Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tincin
diferencial.
2. Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram?
3. Explique qu reaccin de Gram darn los cultivos de levaduras? Estos resultados tendrn la misma
importancia que para las bacterias? Por qu?
4. Explique el fundamento de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Qu
dificultades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin?
5. Explique el fundamento de la tincin negativa realizada en la prctica. Qu tipo de informacin se obtiene?
Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.
Espaa. 676 p.
Anlisis Microbiolgico de agua y bebidas.
Trabajo Prctico N 9
TTULO: Anlisis Microbiolgico de agua y bebidas. Tcnica de filtracin por membrana. Estudio de muestra
problema
TEMA: Definicin de protozoologa. Los protozoarios: Forma, tamao, reproduccin y principales especies.
Valorar la realizacin del anlisis microbiolgico
Conocer y llevar a cabo tcnicas de anlisis microbiolgico de estos productos.
Adquirir habilidades para la realizacin de la tcnica de filtracin por membrana.
INTRODUCCIN AL TEMA: ANLISIS MICROBIOLGICO DE VINOS Y MOSTOS

Con el objeto de detectar problemas relacionados o provocados por microorganismos durante el proceso de
elaboracin o en el producto terminado, se deben realizar de manera criteriosa estudios microbiolgicos en
momentos determinados del proceso completo. La Asamblea General de la Organizacin Internacional del vino
(O.I.V.) pblico una gua para la realizacin de los mismos.
Segn las informaciones que se deseen obtener hace referencia a tres tipos de tcnicas:
1. Ensayos de comportamiento
- Ensayo de comportamiento al aire.
- Ensayo de comportamiento en estufa.
2. Deteccin, diferenciacin de microorganismos y recuento directo de levaduras.
- Examen microscpico de los lquidos o de los depsitos.
- Coloracin vital con azul de metileno.
- Coloracin de gram.
- Determinacin de la catalasa
- Recuento directo de las levaduras en microscopio
3. Recuento de los microorganismos por cultivo.
- Cultivo en placas
- Cultivo en membrana luego de filtracin.
- Cultivo en medio lquido.
Tcnica de Filtracin por Membrana
Instalar el equipo de filtracin estril y conectada a la bomba de vaco. Enjuagar el conjunto completo del filtro
con agua estril, haciendo pasar varios enjuagues por el mismo. Esto eliminara los rastros de alcohol que
pudieren haber quedado del procedimiento de esterilizacin. Colocar una membrana filtrante estril de 0,2 um
en la frita o soporte para la misma, utilizando pinzas esterilizadas (las que deben de permanecer en un recipiente
con alcohol, que no cubra ms de la tercera parte de la misma, y prenderle fuego a las puntas antes de cada
uso).
Mojar el filtro con unos milmetros de agua estril de amortiguacin, para facilitar la distribucin de los
microorganismos sobre el mismo. Si el volumen de la muestra que se va a filtrar es inferior a 10 ml agregar al
menos 10 a 50 ml de amortiguacin.
El volumen deseado de muestra debe ser transferido rpidamente al recipiente superior del aparato, empleando
siempre tcnica asptica. Luego se debe aplicar una aspiracin moderada para filtrarla. Enjuagar el embudo dos
veces con solucin amortiguadora. Detener la aspiracin del aparato y retirar la membrana para depositarla sobre
la superficie del medio de cultivo, que se encuentra en una placa de Petri.
Si se realizan ms de una siembra por muestra no es necesario esterilizar el equipo entre cada una de ellas. En
cambio es indispensable hacerlo entre cada muestra.
Las placas deben ser incubadas a las temperaturas y tiempos indicados para cada tipo de microorganismo
buscado.
En el presente trabajo se realizaran siembra para la bsqueda de levaduras, bacterias lcticas y acticas,
consideradas importantes en el vino, tanto su presencia como su ausencia, segn los objetivos perseguidos para
el producto. Mencionaremos las diferencias ms importantes que hay entre estos dos ltimos grupos de
microorganismos, ya que el tema ser abordado en clase terica.
Principales diferencias entre bacterias lcticas y acticas

Caractersticas Bacterias Lcticas Bacterias acticas
Bacilos largos y delgados, Bacilos elipsoidales rectos o
Morfologa
cocobacilos cortos y cocos. curvos o cocobacilos.
Gram + -
Microaerfilas o aerotolerantes o
Requerimiento de oxgeno Aerobias
anaerobias facultativas
Prueba de catalasa - +
Cultivo Man Rogosa Shape Medio CAAR Agar YPD + CO3Ca
Generos, ejemplos Oenococcus Lactobacillus Acetobacter Gluconobacter
Agar YPD + CO3Ca

Estracto de levadura 5 g/L
Peptona 5 g/L
Glucosa 40 g/L
Agar 20 g/L
Pimaricina 1 g/L
CO3Ca 5 g/L
CAAR
Estracto de levadura 30 g/L
Agar 20 g/L
Verde Bromocresol 4,4 % 0,5 ml/L
Agua destilada (hasta Volumen final)
Pimaricina 1g/L
Esterilizar y atemperar.
Agregar etanol 99% 20%.

Mecheros
Equipo de filtracin por membrana
Membranas filtrantes de 0,2 um de porosidad estriles
Bomba de vaco
Placas con medios de cultivo para bacterias lcticas, acticas y para levaduras.
Alcohol etlico al 70%.
Equipos para anaerobiosis.
Algodn
Gasa
Estufa de cultivo Hipoclorito de Sodio
Encendedor
PROCEDIMIENTO.
Se realizaran siembras para la bsqueda de bacterias lcticas, acticas y levaduras, en los medios de cultivo
apropiados, de una muestra aportada por el docente, en grupos de dos o tres alumnos.
Los resultados sern evaluados en la clase siguiente.
Incubaciones
Bacterias lcticas: en anaerobiosis o microaerofilia a 28-30C hasta 10 das.
Bacterias acticas: en aerobiosis entre 28-30 C durante 3 a 5 dias
Levaduras: en aerobiosis entre 25 y 30 C durante 3 a 10 das.
LOS ALUMNOS DEBERAN DCONTROLAR SUS CULTIVOS Y EFECTUAR LAS LECTURAS E
INTERPRETACIONES EN LOS TIEMPOS INDICADOS PARA ELABORAR LOS INFORMES.
Anlisis Microbiolgico del agua
El anlisis microbiolgico del agua se realiza en funcin de los objetivos planteados para el mismo, de acuerdo
a la utilidad que se le da al objeto de estudio, no son los mismos para un agua de red para consumo, que para
una empleada para riesgo exclusivamente, por ejemplo.
Los microorganismos patognicos que pueden encontrarse en el agua, provienen generalmente de la
contaminacin con excrementos de animales y del hombre. Pueden ocasionar patologas en los mismos
huspedes, de all el inters por detectarlos y evitarlos.
Organismo patognicos entricos encontrados en el agua:

Bacterias Protozoarios Virus
Salmonella Giardia Coxsackievirus
Shigella Cryptosporidium Echovirus
Campylobacter Entamoeba histoltica Poliovirus
Escherichia coli Adenovirus
Leptospira Reovirus
Yersinia Rotavirus
Legionella Hepatitis A
Vibrio cholerae Norwalk-type
Los desafos que se plantean para poder aislarlos son los siguientes:
1. Deteccin especfica para cada microorganismo
2. No existe un nico procedimiento para todos los patognicos
3. Estn presentes en pequeas cantidades
4. Tcnica trabajosa para el aislamiento y personal altamente entrenado
5. Tiempo y costo econmico.
Obtencin de muestra de agua a partir de un grifo:

Debe flamearse convenientemente el grifo, dejar que fluya el agua sin turbulencias durante 5 minutos y luego
recogerla en frascos estriles, que se abren en el mismo momento de la toma, preferentemente de un litro de
capacidad. Si es un agua clorada el frasco debi ser esterilizado con una solucin 0,01 de tiosulfato de sodio.
Si se tratara de agua procedente de lagos, ros, estanques, pantanos se tendrn en cuenta otras premisas. En
todos los casos deben evitarse los remansos, las cercanas de las orillas y las zonas superficiales o
excesivamente profundas. Generalmente se sumerge el frasco se le destapa a 10 cm de profundidad y all se le
llena a contracorriente.
El traslado debe ser rpido y refrigerado a 4C y el anlisis debe ser efectuado lo antes posible, antes de las 48
horas.
Se debe realizar una estimacin de cantidad de microorganismos presentes en la muestra, para determinar si es
necesario o no efectuar diluciones de la misma (las que se tendrn en cuenta en el momento del clculo de los
recuentos).
Recuento de bacterias mesfilas: en agar nutritivo o PCA. Incubacin a 37C durante 24 a 48 horas.
Recuento de mohos y levaduras: en agar sabouraud (o similar). Incubacin a 20-22 C durante 5 das.
Bacterias coliformes: por el mtodo del NMP (Nmero ms probable) a 37C 48 h. (Caldo Mc Conkey o Luril
Sulfato), en 100 ml. Este mtodo se basa en una estimacin derivada de la teora de probabilidades aplicable a
la enumeracin de microorganismos bajo ciertas condiciones.
Se emplea el medio Mc Conkey (o similar) lquido con campanas de drham. Se considera positivo aquellos tubos
en los cuales se evidencia cambio de color y presencia de gas.
Presencia de Escherichia coli: todos los tubos que resulten positivo en el ensayo anterior, se repican a medio
solido (agar Mc Conckey o similar) y a partir de all a las colonias sospechosas se les efectan pruebas de
identificacin (IMVIC, urea, fermentacin de azucares, motilidad, etc.)
Presencia de Pseudomonas aeruginosa: en agar cetrimide y se incuba 48 horas a 37C.

Mecheros
Equipo de filtracin por membrana
Membranas filtrantes de 0,2 um de porosidad estriles
Bomba de vaco
Placas con medios de cultivo ( Agar Mc Conkey, Agar sabouraud, agar cetrimide, agar nutritivo)
Tubos con caldo Mc Conckey y campana de Durham.
Alcohol etlico al 70%
Equipos para anaerobiosis
Algodn
Gasa
Estufa de cultivo
Hipoclorito de Sodio
Encendedor
LOS ALUMNOS DEBERAN DCONTROLAR SUS CULTIVOS Y EFECTUAR LAS LECTURAS E

INTERPRETACIONES EN LOS TIEMPOS INDICADOS PARA ELABORAR LOS INFORMES.
Espaa. 676 p.
Micologa. Tcnicas micolgicas.
Trabajo Prctico N 11
TTULO: Micologa. Tcnicas micolgicas. Preparacin de medios de cultivo. Repiques de hongos

levaduriformes y filamentosos para su posterior identificacin
TEMA: Definicin de Micologa. Generalidades. Los hongos: Forma, tamao, reproduccin y principales
especies. Hongos filamentosos. Hongos levaduriformes. Estructura. Metabolismo. Principales especies
relacionadas con procesos agroalimentarios
- Practicar las diferentes tcnicas de siembra para el desarrollo de cultivos y subcultivos de hongos y
bacterias, en medios de cultivo dispensados en tubos y cajas Petri, as como, en medios de diferente
composicin y estado.
- Desarrollar en los estudiantes la capacidad de seleccin de una metodologa especfica, de acuerdo a los
criterios proporcionados, para la aplicacin correcta de las tcnicas de siembra de acuerdo al
microorganismo y al objetivo de la prueba.
Microbiologa y Sanidad, tcnicas de observacin.
El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre
de siembra; esta operacin la podemos realizar a partir de muestras biolgicas (orina, pus secreciones, etc.), de
anlisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosmticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras
ambientales (agua, suelo, etc.), o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de un cultivo a otro la
denominamos subcultivo o repique.
Para el estudio de las bacterias y otros microorganismos cultivables, es necesario adems, conocer y reconocer
la morfologa microscpica y macroscpica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es
posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionarles
aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo.
Existen tcnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos elementos importantes para
realizar siembras, como: El mechero (de alcohol o de Bunsen), el asa bacteriolgica (asa de argolla), o micolgica
(asa recta), cmaras de flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones aspticas y los medios de cultivo ya
preparados y atemperados a 37C; esta ltima observacin es importante tenerla en cuenta, ya que los
microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras o cultivos, deben evitar ser estresados con
cambios bruscos de temperatura o por otros factores (incluida la composicin del medio de cultivo).
Contando con estos implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de cultivar o subcultivar muestras
o aislamientos previamente obtenidos.
TCNICAS DE SIEMBRA.
La tcnica ms usada en el laboratorio de microbiologa es probablemente la transferencia de microorganismos
de un ambiente a otro con el propsito de cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias,
hongos y otros cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axnico (o cultivo puro).
Existen varios mtodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus caractersticas en estos
medios. Se entiende por cultivo puro, una poblacin de clulas las cuales todas proceden de una misma clula.
Existe gran variedad de tcnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden
ser aisladas en cultivo puro.
TCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.
Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de agotamiento, aislamiento o de estra cruzada.

Es un buen mtodo para el aislamiento de colonias (obtencin de colonias aisladas); mediante esta tcnica
buscamos obtener colonias separadas a partir de un inculo. Para su realizacin: (i) se toma la caja de Petri en
la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente
esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un rea
perifrica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inculo. (ii) El asa debe ser
nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no daarlo); a continuacin se realiza una
estra partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de
la superficie del agar. Se debe procurar que en cada seccin de la caja, las estras queden trazadas con mayor
separacin. (iii) Repita el paso ii, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear y enfriar
el asa cada vez que culmine una estra y solo tocar con el asa la estra inmediatamente anterior, con el objetivo
de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla
(Figura 1).
Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la tcnica de agotamiento (y otros microorganismos emulsionables
como las levaduras) (Fuente: Rojas, A.).
Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de siembra en cuadrantes.
El objetivo de esta tcnica, es el de diluir el inculo a medida que se realizan estras en la superficie del agar.
Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriogrfico
por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inculo y se inicia el rayado de
la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar
nuevamente inculo). Las cajas as sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria.
Con esta tcnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (ltima estra realizada), se
encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2).
Fig. 2. Tcnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estras realizadas una a continuacin
de la otra y sin cargar el asa nuevamente (Fuente: Rojas, A.).
Siembras en cajas de Petri por la Tcnica de siembra masiva.
Este mtodo es muy utilizado para obtener un gran nmero de microorganismos (incremento de inculo), en la
superficie de un agar. Esta tcnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa
en distintas direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en
la superficie de la placa (Figura 3).
Fig. 3. Procedimiento para la realizacin de una siembra por la tcnica masiva, utilizando hisopos estriles y
sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.).
Siembras en cajas de Petri por la Tcnica de puncin.
Mtodo de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y as ms adelante establecer su morfologa;
as como, para la transferencia o subcultivo de cepas previamente almacenadas y /o conservadas. Consiste en
tomar parte de micelio con un asa micolgica (o asa recta), y por una puncin suave en el centro de la caja
inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo, pueden hacerse mltiples picaduras en el agar
(varios puntos de siembra) (Figura 4).
Fig. 4. Procedimiento para la realizacin de una siembra por la tcnica de puncin, utilizando asa micolgica y
sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.).
TCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS.
La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante
del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de inters, por lo tanto se deben tener las siguientes
precauciones:
- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos
del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de este.
- Los tapones se deben mantener en la mano contrara a aquella que contiene el tubo, sostenindolos entre el
dedo meique, el anular y el dedo del corazn. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algn otro
lugar.
- Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo despus de la siembra o inoculacin.
- Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porcin que entra en contacto con el medio de cultivo).
- Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
- Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
- Despus de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.
- Siembre trabaje con material abierto, en cmara de flujo laminar o en su defecto con mecheros Bunsen.
- En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, as como, utilice asas totalmente
rectas.
Siembra en tubos por estra simple.
Se realiza en un tubo con medio slido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie
expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estras (Figura 5A).
Siembra mixta en tubos.
Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y
luego haciendo una siembra en estra sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie
en bisel marcando las estras; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin
retirarla del tubo (Figura 5B).
Siembra en tubos por picadura.
Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios slidos y semislidos
generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por
el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura 5C y 5D).
Siembra en tubo en medio lquido.
Para transferir material a partir de un medio lquido o slido a otro lquido, puede usarse el asa bacteriolgica (de
argolla), o en algunos casos, pipetas estriles o hisopos. Si Usted utiliza asas bacteriolgicas, inocule el
microorganismo en el medio lquido hacindola rotar del mango (Figura 5E).
Fig. 5. Tcnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos, donde: (A) Siembra por estra
simple, (B) siembra mixta (picadura y estra), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra
con asa bacteriolgica en medio lquido (Fuente: Rojas, A.).
NOTA: En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas Petri o los tubos de manera
clara, completa, legible, con la identificacin respectiva y la fecha. Para anlisis clnico, marcar siempre las cajas
en la base de la caja Petri y para anlisis de control de calidad de alimentos u otras materias primas, marcar las
cajas en la tapa de la caja Petri. Luego de realizada la siembra, usted debe proporcionar la temperatura y el
tiempo adecuado para la proliferacin o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado
caso, un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inculo
no se ha adsorbido, espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa hacia arriba
por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el agua de condensacin que
pueda formarse en la tapa de la caja, caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la
formacin clara de las colonias.

- 1 caja Petri con agar PDA.
- 4 cajas Petri con agar Nutritivo.
- 1 tubo con 5mL de Caldo Nutritivo.
- 1 tubo con agar SIM.
- 2 tubos con agar Nutritivo en bisel.
- 1 tubo con agar PDA en bisel.
- 2 hisopos estriles en tubo taparosca.
- 1 asa micolgica.
- 1 mechero Bunsen.
- 1 cultivo bacteriano en caja Petri con agar Nutritivo de 24h.

- 1 cultivo fngico en caja Petri con agar PDA de 3 das.
- Etanol 70%.
- Toallas desechables.
- 1 rollo de papel para sellar cajas Petri.
- 1 rollo de cinta de papel.
- 2 incubadoras de352C y 25C.
PROCEDIMIENTO.
De acuerdo a la fundamentacin terica de esta gua, a las indicaciones del Docente y al material de trabajo,
efecte las siembras listadas a continuacin:
1. Siembre por picadura en tubos de agar sin inclinar (rectos) (bacteria).

2. Siembre por estra en tubos de agar inclinado (bacteria).
3. Siembre por tcnica mixta en tubos de agar inclinado (bacteria).
4. Siembre por agotamiento (aislamiento o estra cruzada), en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).
5. Siembre por la tcnica de cuadrantes, en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).
6. Siembre por la tcnica masiva y con hisopo, en la superficie de una caja Petri con agar Nutritivo (bacteria).
7. Siembre en tubos de Caldo Nutritivo, utilizando asa bacteriolgica (bacteria)
8. Siembre por puncin cajas de agar PDA (hongo).
9. Siembre por puncin tubos de agar PDA inclinado (hongo).

1. Cul es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?
2. Mencione brevemente el proceso de purificacin de un aislamiento bacteriano obtenido en agares.
3. Explique brevemente la metodologa para realizar siembras en placa profunda y placa en superficie.
Espaa. 676 p.
Hongos levaduriformes. Observaciones

TTULO: Hongos levaduriformes. Observaciones. Tcnicas de identificacin. Auxonograma y zimograma.

Mtodos convencionales y comerciales
TEMA: Agitacin y aireacin, requerimientos de oxgeno. El fermentador como reactor biolgico. Materiales de
construccin. Instalaciones accesorias. El proceso de fermentacin. Fermentadores continuos. Aplicacin en la
industria enolgica.
Que el alumno aprenda las tcnicas de cultivo y manipulacin de diferentes tipos de hongos. Que el estudian-te
conozca las principales caractersticas morfolgicas (macroscpica y microscpicas) de los hongos.
Los hongos son organismos eucariticos y de mayor tamao que las bacterias, se distinguen de otros eucariontes
como los animales por ser inmviles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintticos.
Son de nutricin hetertrofa, es decir dependen de nutrientes orgnicos que son solubilizados por sistemas
enzimticos especficos y son 5 absorbidos a travs de su pared celular y membrana plasmtica. Estos
organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos), sin embargo, tambin existen
hongos di mrficos principalmente patgenos que se presentan en las dos formas alternativamente, dependiendo
de condiciones ambientales como la temperatura.
Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; frecuentemente
se encuentran formando una cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen
asexualmente por gemacin, un proceso por el cul brota una protuberancia o yema de la clula madre que
posteriormente se separa como clula individual.
El cuerpo o estructura vegetativa caracterstica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo,
generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan
tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se
les conoce como hifas cenocticas.
El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual, por fragmentacin de hifas vegetativas o por
la produccin de abundantes esporas en conidiforos y esporangiforos formados en hifas areas llamadas hifas
reproductivas. Sin embargo, la descripcin de las estructuras de reproduccin sexual es el principal criterio de
clasificacin, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones o phylum: Zygomycota, Ascomycota y
Basidiomycota.
Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las cules se han descrito ms de 250 000
y de stas solo se conocen 150 especies patgenas para el hombre y otras tantas para plantas y animales. Es
de gran importancia conocerlos, por los beneficios que proporcionan al hombre, ya que como se mencion la
mayora son saprobios (utilizan materia orgnica muerta), por lo que tienen una gran capacidad de reciclar
materiales orgnicos de diferentes tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de biodegradacin de
compuestos recalcitrantes en procesos de biorremediacin.
Desde la antigedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de produccin de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. Tambin se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes de control biolgico de insectos (bioinsecticidas) y que
pueden mejorar la nutricin y permanencia de la mayora de las plantas (micorrizas).
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA

4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox
3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 Probeta de 100 mL
1 Mechero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Aguja de diseccin
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio ptico de campo claro
Aceite de inmersin
Autoclave
Incubadora a 30 C
Azul de lactofenol
PROCEDIMIENTO.
El profesor proporcionar a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, Penicllum chrysogenum, Rhizopus
oligosporus, Trlchodermaviridey de la levadura Saccharomycescerevislae.
El estudiante inocular cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar,
a base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.
Har la descripcin macroscpica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observacin microscpica
la realizar aplicando la tcnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deber separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con
aguja de diseccin, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con
medio de Czapek-Dox.
3. Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la
inoculacin de bacterias.
4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plstico en forma invertida dentro de una incubadora a
28-30 C durante 3-5 das.
Descripcin macroscpica de levaduras y mohos

1. Hacer la descripcin de la forma, tamao, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces
cerevisiae.
2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamao y el tipo de colonia, as como las caractersticas del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
Descripcin microscpica de levaduras

1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de metileno.
2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.
Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva

1 Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomndola nicamente por los extremos.
2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionar como cubreobjetos por lo que se deber aplanar lo mejor
posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidiforos, conidias, esporangiforos,
esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.
A. Reportar sus observaciones. Hacer los dibujos de las observaciones morfolgicas de cada uno de los
microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.
C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la prctica.
Espaa. 676 p.
Hongos filamentosos. Observaciones
TTULO: Hongos filamentosos. Observaciones. Tcnicas de identificacin. Colonia gigante. Microcultivos
TEMA: Biosntesis y degradacin de aminocidos. El ciclo de la Urea: regulacin.
- Que el estudiante se familiarice con las morfologas macro y microscpicas tpicas de los hongos y logre
establecer comparaciones con la morfologa y estructuras bacterianas.
- Que el estudiante est en la capacidad de realizar diferentes tipos de montajes, utilizados para la identificacin
de hongos.
- Reconocer los diferentes tipos de estructuras de los hongos, de acuerdo a la Clase a la cual pertenecen.
Los hongos son organismos de organizacin Eucariota y de mayor tamao que las bacterias; estos se diferencian
de otros Eucariotas, por ser inmviles (aunque algunas clulas presentan mecanismos de locomocin), carecer
de pigmentos fotosintticos y por las variaciones en la composicin de su estructura (como paredes celulares).
Los hongos presentan una tipo de nutricin hetertrofa (quimiorgantrofos), dependiendo de nutrientes
orgnicos, solubilizados por los sistemas enzimticos de los hongos y absorbidos a travs de la pared y
membrana celulares.
Los hongos pueden ser unicelulares (como las levaduras), o multicelulares (hongos filamentosos); sin embargo,
existen hongos pleomrficos, que de acuerdo al medio en el cual se encuentren, desarrollan un crecimiento
filamentoso o un crecimiento de tipo levadura. Estos ltimos son principalmente hongos patgenos.
Las levaduras son hongos unicelulares de forma esfrica, alargada u oval y con diferentes colores (blanco,
rosado, beige o rojo). Su tamao oscila entre 2,510 x 4,5-21 m. Son anaerobios facultativos, siendo las
levaduras aerbicas productoras de CO2, agua y biomasa relativamente alta y las levaduras anaerobias,
fermentadoras de azcar en alcohol, CO2 y menos biomasa. La mayora son mesfilas, con una temperatura
mxima de crecimiento entre 24 y 48C, crecen en un rango amplio de pH entre 2,5 y 8. No presentan
mecanismos de locomocin, por lo que nicamente pueden ser transportadas a travs de corrientes de aire,
fluidos o por insectos.
Las levaduras se reproducen por gemacin, generando en este proceso la clula madre, una o varias yemas
que, crecen y se separan formando clulas independientes; otra forma de divisin de las levaduras es la divisin
transversal o escisin. En medios de cultivo forman colonias opacas, cremosas o pastosas (Figura 1).
Fig. 1. (A) Morfologa tpica de las levaduras y reproduccin por gemacin (crculo rojo), y (B) caracterstica de
las colonias sobre medio de cultivo PDA (Fuente: Rojas, A.).
En comparacin con las levaduras, los hongos filamentosos (mohos), presentan un desarrollo de estructuras
denominadas talo, que est compuesto a su vez por hifas ramificadas y que en su total, conforman el micelio del
hongo (que es macroscpicamente observable). Estas hifas, a su vez, pueden presentar septos o tabiques
transversales, conformando el micelio tabicado o septado (las hifas septadas a su vez, pueden contener un
ncleo o varios ncleos formando clulas multinucleadas). De forma contraria, en algunas Clases de hongos, las
hifas son continuas (sin ningn tipo de separaciones), denominndose hifas cenocticas, como en los hongos de
la Clase Zygomycetes y anteriormente los Oomycetes (o pseudohongos), los cuales, actualmente pertenecen a
un reino diferente a los hongos, el reino Stramenopila (junto con las diatomeas, las algas pardas, etc.).
Las hifas que conforman el talo de los hongos filamentosos, se ramifican en todas direcciones del sustrato, donde
van absorbiendo los nutrientes necesarios. La pared de las hifas es delgada, transparente, tubular que
interiormente puede tener una capa de protoplasma variable en su grosor. Las hifas presentan crecimiento apical
y en el pice de las hifas, existen un gran nmero de vesculas citoplasmticas, que tienen diferentes
disposiciones, segn el tipo de hifa (septada o cenoctica) (Figura 2).
Fig. 2. Tipos de hifas de hongos filamentosos, donde se observan (A), hifas septadas o tabicadas e, (B) hifas
cenocticas (Fuente: Rojas, A.).
Fisiologa y nutricin de los hongos.
Fisiolgicamente los hongos se adaptan a condiciones ms severas que las bacterias. Por ejemplo, los mohos
se desarrollan en sustratos con concentraciones de azcar que las bacterias no pueden tolerar ya que, los hongos
no son tan sensibles a la presin osmtica elevada. Los hongos toleran y se desarrollan en concentraciones de
acidez elevadas, soportan escalas de pH entre 2 a 9 pero el pH ptimo es 5.6. Aunque necesitan humedad para
su desarrollo y pueden obtener agua de la atmsfera y del medio, los hongos pueden vivir en ambientes
deshidratados que sern inhibitorios para la mayor parte de las bacterias.
Casi todos los hongos son estrictamente aerobios, pero su crecimiento se aumenta por la presencia de oxgeno
(las levaduras son facultativas y los mohos u hongos filamentosos son estrictamente aerobios, con algunas
excepciones); se desarrollan en condiciones de temperatura muy variadas pero entre 22-30C es la temperatura
ptima. La glucosa es una fuente de carbono muy aprovechada por muchos hongos; otros azcares como,
sacarosa y maltosa y muchos carbohidratos ms complejos como almidn y celulosa son utilizados por muchas
especies.
El Nitrgeno inorgnico es aprovechado por algunas especies en forma de amonio o nitratos; otras especies
necesitan sustratos con Nitrgeno orgnico que, frecuentemente se proporciona a los medios artificiales en forma
de peptona.
Los hongos son capaces de catabolizar y utilizar una gran variedad de sustratos. Son altamente eficientes en
transformar material nutritivo en sustancia celular. En medios en los que el material nutritivo est en cantidades
moderadas la mayor parte de los sustratos son sintetizados en sustancias celulares, pero si el alimento abunda,
se acumula como reserva en el micelio (carbohidratos y lpidos), y muchos productos del metabolismo son
excretados en el medio. En condiciones apropiadas los mohos transforman carbohidratos a alcoholes y cidos
orgnicos. Las actividades bioqumicas de los hongos modifican la fertilidad del suelo, son deteriorantes de
algunos materiales, participan en la maduracin de algunos alimentos, muchos gneros son patgenos para
plantas, humanos y animales y, son importantes en la produccin de antibiticos y otros metabolitos de
importancia comercial.
Reproduccin de los hongos.
Los hongos se pueden reproducir de forma sexual y asexualmente. En algunas especies coexisten las dos formas
de reproduccin, denominndose holomorfo. El holomorfo, tiene a la vez una forma de multiplicacin asexuada,
conocida como anamorfo (o estado imperfecto), y una sexuada, conocida como teleomorfo (o estado perfecto).
La reproduccin asexuada, puede ocurrir por propagacin vegetativa a partir de fragmentos de micelio, o por
formacin de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.). La reproduccin sexuada se caracteriza
por la unin de dos ncleos que dan lugar a esporas sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.).
Adicionalmente, los hongos pueden ser homotlicos, si poseen en el mismo micelio ncleos complementarios
que pueden conjugarse; o heterotlicos, cuando requieren ncleos provenientes de micelios diferentes. En
general la reproduccin asexuada es ms importante para la propagacin de las especies, en muchos hongos la
reproduccin sexual se da solo una vez al ao o con poca frecuencia.
En el tipo de reproduccin asexual, existe un grupo de hongos a los que no se les conoce reproduccin sexual y
por lo cual, son agrupados dentro de una Clase tentativa, la Clase Deuteromycetes o clase de hongos imperfectos
(Fungi Imperfecti); a los integrantes de esta Clase, se los reclasifica dentro de una Clase especfica, cuando es
hallado su estado perfecto (teleomorfo o sexual); principalmente, los estados sexuales de los Deuteromycetes,
son hongos de las Clases Ascomycetes y algunos Basidiomycetes. Es importante subrayar, que no todos los
hongos producen esporas, dado que, dentro de la Clase Deuteromycetes, se encuentra un Orden denominado
Mycelia Sterilia o Agonomycetales, que est conformado por hongos que no forman esporas de ningn tipo y
solo se reproducen por fragmentacin del micelio (Rhizoctonia spp., Sclerotium spp.).
Clases de hongos.
Clase Zygomycetes. Hongos filamentosos con micelio no tabicado (cenoctico). Pueden presentar rganos de
fijacin, como rizoides (tpicos de Rhizopus spp.).
Reproduccin asexuada por Clamidosporas (clulas vegetativas que se rodean de una pared gruesa
constituyendo a la vez elementos de resistencia, que posteriormente dan origen al micelio; y por
Esporangiosporas (esporas producidas endgenamente dentro de un esporangio); algunas veces en el
esporangio se presenta una columela (Mucor spp.), que es una vescula o parte central del esporangio (hifa que
genera el esporangio) (Figura 3).
Reproduccin sexual por Zigosporas (cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente
estn cubiertos por espinas, formados por la fusin de dos gametangios). Estos zigotos pueden ser heterotlicos
(Ej.: Absidia coerula), o zigotos homotlicos (Ej.: Mucor baciliformis) (Figura 3)
Fig. 3. Estructuras asexuales (esporangiosporas y clamidosporas), y sexuales (zigosporas), de Rhizopus spp.,

hongo clasificado en la Clase Zygomycetes (Fuente: Rojas, A.).
Clase Ascomycetes. Son hongos filamentosos con micelio tabicado y tambin presencia de levaduras. Los
Ascomycetes integran la clase ms numerosa de los hongos perfectos, conocindose aproximadamente unas
15.000 especies. Como es de esperar en un grupo tan grande existe una notable variedad de formas y
estructuras. En un extremo de la escala se hallan los microorganismos unicelulares que se conocen
corrientemente con el nombre de levaduras y en el otro, especies como con desarrollo de micelio y complejas
estructuras de reproduccin. El asca (Gr. Askos = piel de cabra, saco), estructura caracterstica que da nombre
a la Clase, es una estructura que contiene un nmero generalmente definido de ascosporas (esporas sexuales),
y que a su vez, pueden o no estar contenidas en una estructura denominada ascocarpo (que puede ser: apotecio,
cleistotecio y peritecio) (Figura 4).
La reproduccin asexual se lleva a cabo por gemacin o fisin en las levaduras y, en los mohos por esporas o
conidias formadas en conidiforos. Los anamorfos o estados imperfectos de estos hongos (reproduccin
asexual), se encuentran agrupados en la Clase Deuteromycetes (hongos imperfectos).
La reproduccin sexual es llevada a cabo en la formacin de ascosporas, contenidas en un asca y que se forman
frecuentemente por procesos de cariogamia de dos ncleos distintos; generalmente se forman ocho ascosporas,
aunque pueden formarse de dos o cuatro. A su vez, las ascas pueden estar incluidas o no dentro de un
ascocarpo.
De acuerdo a la forma en la cual se desarrolla el ascocarpo y el cual es utilizado como carcter taxonmico de
identificacin, se definen:
Los apotecios, son cuerpos fructferos con forma de copa, normalmente de colores marrones claros, se pueden
producir a partir de la germinacin de esclerocios o del mismo material vegetal invadido por el hongo. Algunos
alcanzan ms de un centmetro de dimetro y dentro de l, se encuentran las ascas conteniendo ascosporas
(Figura 4).
Los cleistotecios, son cuerpos fructferos con forma esfrica y que no poseen abertura para la salida de las
ascosporas, por lo tanto deben romperse para que estas se liberen. Generalmente se producen sobre el tejido
vegetal colonizado por el hongo. A simple vista pueden observarse como puntos negros (Figura 4).
Los peritecios, son cuerpos fructferos con forma de pera y con una abertura para la salida de las ascosporas.
Generalmente se producen sobre el tejido vegetal colonizado por el hongo y a simple vista pueden observarse
como puntos negros (Figura 4).
Fig. 4. Estructuras de reproduccin sexual en hongos de la Clase Ascomycetes, donde se observan las esporas
sexuales o ascosporas, el saco que las contiene (asca), el tipo de ascocarpo que contiene las ascas (cleistotecio,
peritecio y apotecio), y ascas desnudas (Fuente: Rojas, A.).
Clase Basidiomycetes. Los Basidiomycetes son caracterizados por la presencia de una clula frtil en su ciclo
de vida, llamada basidio, la cual produce exgenamente 4 basidiosporas. Estas son originadas en ttrada, desde
una estructura llamada basidio y por medio de un esterigma, que es una prolongacin del pice del basidio. Esta
Clase, se caracteriza por presentar micelio tabicado y a su vez, los basidios pueden ser septados o no (Figura
5).
En esta clase, se encuentran los hongos de sombrilla o repisa que pueden ser observados a simple vista,
creciendo sobre madera en descomposicin o residuos de animales o vegetales. Tambin, se encuentran hongos
de gran importancia econmica, por ser causantes de enfermedades en plantas (Royas, Carbones, Pudriciones
blancas, etc.), o de uso comestible-medicinal (Pleurotus spp., Ganoderma spp., Lentinula spp., etc.).
Su reproduccin asexual, est dada por el crecimiento vegetativo, gemacin, fragmentacin y produccin de
esporas (uredosporas y teliosporas); y su reproduccin sexual dada por basidiosporas formadas sobre basidios.
La reproduccin en esta Clase de hongos, reviste mayor complejidad, dado que se observan diferentes tipos de
esporas, formadas por algunos gneros, como: espermacios, aeciosporas, uredosporas y teliosporas, as como,
el cuerpo o estructura que los contiene (Figura 5)
Fig. 5. Tipos de esporas observadas en hongos de la Clase Basidiomycetes, donde se observan: (A, B y C)
esporas sexuales o basidiosporas y basidio; (D) espermacios, (E) aeciosporas, (F, G y H) uredosporas y
uredosoro y, (I, J y K) teliosporas y teliosoro (Fuente: Rojas, A.).
Clase Deuteromycetes o Fungi Imperfecti. Esta Clase incluye a los hongos con micelio tabicado que no se les
conoce reproduccin sexual. Estos hongos pueden no tener reproduccin sexual o si la tienen, esta se produce
rara vez y no se le conoce an. Estos hongos se reproducen de forma asexual formando esporas denominadas
conidios, los cuales pueden producirse en forma libre o dentro de cuerpos fructferos. De igual manera, los
conidios pueden tener diferentes formas y tamaos (Figura 6), pueden ser hialinos o pigmentados, pueden ser
unicelulares o pluricelulares, sueltos o agrupados en ramilletes o cadenas. Las anteriores caractersticas, son
utilizadas como patrones de identificacin de los gneros y especies y los cuales forman los rdenes y Familias,
por las cuales pueden ser ubicados taxonmicamente estos hongos.
De acuerdo a la pigmentacin las esporas reciben varios nombres; las esporas que presentan pigmentacin se
denominan phaeosporas y las no-pigmentadas hialosporas; dicho prefijo se antepone a la forma de la espora.
Las formas son definidas como: Las amerosporas son conidias unicelulares, las didimosporas son esporas
bicelulares, las phragmosporas son esporas con ms de dos clulas y septos transversales nicamente, las
dictyosporas o esporas muriformes son esporas con ms de dos clulas con septos transversales y
longitudinales, las scolecosporas son esporas filiformes, las helicosporas son esporas con forma de espiral y las
staurosporas son esporas con forma de estrella (Figura 6)
Fig. 6. Tipos de esporas de acuerdo a su forma, donde: (A) Amerosporas, (B) didimosporas, (C) phragmosporas,
(D) dictyosporas o esporas muriformes, (E) scolecosporas, (F) helicosporas y (G) staurosporas
De acuerdo a la forma como ellas se desarrollan, se encuentran: Blastosporas (espora producida por gemacin),
botryoblastosporas (blastosporas producidas por clulas esporgenas; pueden ser individuales o en cadena),
sympodulosporas (el conidiforo crece en forma simpodial y en cada eje se forma una espora), aleuriosporas
(las esporas son liberadas por explosin del conidiforo), annelosporas (en la media en la cual se producen
conidias, se forman anillos en el conidiforo), phialosporas (conidias producidas en un conidiforo con forma de
botella, con una abertura en el extremo), porosporas (la liberacin de la conidia deja un poro en el conidiforo),
arthrosporas (el conidiforo se forma y se fragmenta dando origen a las esporas), arthrosporas meristemticas
(la base del conidiforo se comporta como un meristemo), y blastosporas meristemticas (la base del conidiforo
se comporta como un meristemo) (Figura 7).
Fig. 7. Tipos de esporas de acuerdo a su forma de desarrollo, donde: (A) Blastosporas (Aureobasidium spp.), (B)
botryoblastosporas (Botrytis spp.), (C) sympodulosporas (Cercospora spp.), (D) aleuriosporas (Nigrospora spp.),
(E) annelosporas (Spilocaea spp.), (F) phialosporas (Chalara spp.), (G) porosporas (Drechslera spp.), (H)
arthrosporas (Geotrichum spp.), (I) arthrosporas meristemticas (Oidium spp.), y (J) blastosporas meristemticas
(Zygosporium spp.) (Fuente: Rojas, A.).
Adicionalmente, las esporas pueden ser de origen asexuado (mitosporas), o sexuado (meiosporas), y por su
ubicacin relativa se denominan esporas internas o externas. Se presume que stos hongos, son los estados no
sexuados o anamorfos de muchos Ascomycetes (eventualmente de Basidiomycetes), cuyos estados sexuados
o teleomorfos no han sido descubiertos. En el momento en el cual se conoce el estado sexual de un gnero de
Deuteromycetes, ambos estados se transfieren al grupo al que pertenece el teleomorfo (o estado perfecto).
Su reproduccin est dada por la formacin de conidias, formadas en clulas especializadas llamadas clulas
conidigenas y que se encuentran en una hifa especializada denominada conidiforo.
Los conidiforos pueden encontrarse libres, sin formar ningn tipo de agrupacin, as como, agruparse para
originar las siguientes estructuras (Figura 8):
Acrvulos. Forma de un estrato plano o con forma de plato, conformado por conidiforos cortos (generalmente),
que crecen juntos y forman una masa de hifas y conidias. Son subepidrmicos o subcuticulares y errumpentes
al madurar. Estructura caracterstica del Orden Melanconiales, hongos que atraviesan la cutcula del husped y
producen una masa blanda de conidiforos.
Picnidios. Es un cuerpo esfrico o con forma de botella, con el interior cubierto de conidiforos. Presentan una
abertura (ostiolo largo o corto), o estar cerrados completamente; pueden ser confundidos con los peritecios o
apotecios formados por los Ascomycetes, pero con la diferencia que en los picnidios no se encuentran ascas,
solo conidias libres, las cuales son observadas al estallar la estructura.
Sinema o coremio. Haz compacto y erecto de conidiforos. Estos pueden ser de longitud diferente, ms o menos
cilndricos y revestidos de esporas en casi toda su extensin; o pueden ser de longitud aproximadamente igual,
en cuyo caso el sinema tiene un tallo patente y una cabeza esporfora. El trmino sinema se emplea tambin, al
referirse a asociaciones de conidiforos de forma menos definida que un coremio verdadero.
Esporodoquio. Haz de conidiforos en forma de almohadillada y estrechamente apiados. En la realidad, es un
tipo de sinema en el cual los conidiforos son demasiado cortos para formar un tallo.
Tambin, pueden encontrarse agrupaciones denominadas Funculos, que es una cuerda de hifas de la cual
surgen a ciertos intervalos los conidiforos (Figura 8).
Fig. 8. Estructuras formadas por hongos de la Clase Deuteromycetes, donde se observa: (A) Acrvulo, (B)
esporodoquio, (C) picnidio, (D) sinema y (E) funculo (Fuente: Rojas, A.)
Caractersticas del examen microscpico.

La forma de las levaduras se determina mediante las tcnicas de tincin que ordinariamente se usan para las
bacterias, pero como muchas tinciones enmascaran el contenido celular, se emplean mtodos especiales para
demostrar las estructuras especficas. Es til cualquier colorante de anilina, pero para observar los detalles del
contenido celular, especialmente el ncleo, la hematoxilina frrica es adecuada. Sudan III, pone de manifest los
glbulos de grasa, el rojo neutro hace que los grnulos metacromticos y las vacuolas aparezcan de color rosa
dbil o rojos y los colorantes policromticos de azul de metileno, tien el material ncleo proteico.
Los hongos filamentosos, comnmente, pueden ser teidos con azul de Lactofenol e identificados por sus
caracteres morfolgicos mediante el uso de claves especficas para cada Clase de hongos (Zygomycetes,
Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes-pseudohongos).
Caractersticas de cultivo.
Para estudiar los hongos filamentosos se usan los mismos mtodos generales que para las bacterias. Casi todos
se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medio de cultivo bacteriolgicos usuales a temperaturas que
varan entre 20 y 30C. La mayor parte de ellos, lo hace ms lentamente que las bacterias y as, cuando llegan
a coexistir, el desarrollo de stas sobrepasa al de los hongos.
Las levaduras cuando se desarrollan en medios de cultivo adecuados, sus colonias varan en aspecto, textura y
margen, as, algunas son lisas, otras rugosas, algunas son aplanadas, otras elevadas; tienen bordes bien
definidos e irregulares; pueden producir pigmentos. El tipo de desarrollo en caldo de cultivo, tambin proporciona
informacin significativa. Algunas colonias se desarrollan en el fondo del lquido a manera de sediment, otras
crecen uniformemente en el caldo y otras crecen slo en la superficie.
Cultivo de hongos.
Si se requiere aislar hongos, resulta muy prctico utilizar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero
que, no sea ptimo para las bacterias. Los medios cidos con concentraciones altas de azcar, son tolerados
bien por los hongos, pero inhiben a muchas bacterias.
Existen tres tipos generales de medios de cultivo para los hongos:
- Medios Naturales: Como pedazos e infusiones de frutas, vegetales, granos de cereales o tejidos animales.
Estos medios varan mucho en su composicin y no son fcilmente reproducibles.
- Medios Semisintticos: Preparados con peptonas, extractos de plantas, agar y otros compuestos de
composicin desconocida o variable.
- Medios de cultivo sintticos: De composicin qumica definida (comercialmente disponibles).
Uno de los medios de cultivo ms conocido para cultivar hongos en la prctica es el agar Sabouraud que,
contiene maltosa y peptona como principales ingredientes. Este medio se utiliza mucho para el crecimiento
de hongos patgenos. Su accin selectiva se debe a su alta concentracin de azcar y bajo pH.
Adicionalmente, se conocen innumerables medios, como agar Papa Dextrosa- PDA, Agar Oxitetraciclina-
Glucosa-Extracto de Levadura-OGY, Agar Rosa de Bengala, etc.
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE LOS HONGOS.

Para el estudio microbiolgico de los hongos de una muestra, se debe realizar la observacin directa al
microscopio y obtener aislamiento del microorganismo en medio de cultivo.
Observacin microscpica de hongos filamentosos.
Se pueden aplicar diferentes metodologas para la observacin de las estructuras tpicas del hongo, como:
Montaje en portaobjetos o en rastrillo. Se coloca una gota del colorante Azul de Lactofenol sobre un portaobjetos,
se toma la muestra con la ayuda de un asa micolgica y se emulsiona y homogeniza la muestra con la ayuda de
otra asa; se coloca el cubreobjetos encima y se procede a observar hasta el objetivo 40x. A menudo, el rastrillado
de la colonia, rompe las delicadas estructuras de fructificacin de los hongos filamentosos, alterando la
observacin de la posicin y origen de algunas estructuras, como las esporas, dificultando as la identificacin
definitiva.
Preparacin en cinta engomada o impronta. Se coloca una gota del colorante Azul de Lactofenol sobre la
superficie de un portaobjeto. Utilizando cinta trasparente, presionar suavemente la parte adhesiva sobre la
superficie de la colonia, procurando adherir una porcin de micelio areo a esta. Pegar un extremo de la cinta
sobre la superficie del portaobjetos, a un lado de la gota del colorante y con cuidado pegar la cinta con la muestra
sobre la gota del colorante, para que el micelio areo se impregne con ste. Durante el procedimiento debe
evitarse la acumulacin de burbujas de aire, para evitar la aparicin de estructuras que dificulten la observacin.
Llevar al microscopio hasta objetivo 40x.
Tcnica de cultivo en Microplaca o Microcultivo.
En algunas ocasiones, cuando ninguna de las preparaciones anteriores permite una observacin satisfactoria de
la muestra para el diagnstico o cuando se desea el montaje sobre portaobjetos para estudios futuros, se
recomienda esta tcnica (Figura 9).
La tcnica consiste en colocar en el interior de una caja de Petri estril, unas varillas de vidrio estriles y sobre
ellas una lmina portaobjetos. Las varillas evitan que la lmina portaobjetos haga contacto con el fondo de la
caja de Petri. Luego sobre el portaobjetos se coloca un fragmento de 1cm2 del medio de cultivo slido (PDA,
Sabouraud, OGY, etc.), estril. Una vez realizado este montaje, con un asa previamente flameada se siembra el
hongo a analizar en la mitad de cultivo, se calienta rpidamente el cubreobjetos (para fijar la laminilla al agar), y
se cubre la preparacin con este. Este montaje, se dispone en una caja Petri con agua destilada humedeciendo
un papel filtro estril, el cual mantendr una atmsfera hmeda (o papel humedecido con glicerina 10%). Despus
se procede a la incubacin a la temperatura requerida y por el tiempo necesario (Figura 9).
Pasado el tiempo de incubacin, se retira con cuidado el cubreobjetos (teniendo en cuenta que en este se
encuentra adherido el hongo), se monta la laminilla con el hongo a estudiar sobre un portaobjeto con azul de
Lactofenol (o sin colorante, dependiendo del objetivo de la observacin), y se procede a su observacin en fresco.
Tambin puede removerse el segmento de agar del portaobjeto original y teirlo, procediendo a colocar un
cubreobjetos y observando las dos preparaciones. Llevar hasta objetivo 40x.
Fig. 9. Materiales requeridos para el montaje de un Microcultivo para hongos (Fuente: Rojas, A.).
- 1 asa micolgica.
- 1 bandeja para tincin.
- 2 varillas de vidrio o pitillos plsticos.
- 1 mechero Bunsen o de alcohol.
- Azul de Lactofenol.
- Solucin de Lugol.
- 3 portaobjetos estriles.
- 5mL de glicerina 10%.
- 3 cubreobjetos estriles.
- 1 set de papel para ptica.
- 1 disco de papel filtro estril (10 cm de dimetro).
- Cultivos fngicos en agar PDA con 3 - 5 das de incubacin.
- 1 rollo de cinta adhesiva transparente.
- Toallas de papel desechable.
PROCEDIMIENTO.
1. De cada uno de los hongos y levaduras suministrados por el tutor, realice la caracterizacin macroscpica
basndose en el aspecto del micelio o del crecimiento en las levaduras. Como marcadores de
caracterizacin en las levaduras, utilice los aplicados a caracterizacin macroscpica de colonias
bacterianas.
2. Para los hongos filamentosos: Micelio algodonoso, pulverulento, aterciopelado.
3. Pigmentacin del crecimiento (pigmentos confinados al hongo o difundidos al medio de cultivo).
4. Consistencia: Dura, blanda, viscosa.
5. Realice el montaje en placas portaobjetos por las metodologas de toma de muestra con asa micolgica o
impronta, descritos en esta gua y utilizando como colorante, azul de Lactofenol.
6. Para la observacin de levaduras, realice el montaje con solucin de Lugol y lleve a objetivo de inmersin.
7. Del aislamiento asignado por su tutor, realice un microcultivo siguiendo las indicaciones dadas en esta gua.
Incube a 25-28C/3-5 das. Concluido el tiempo de incubacin, realice el montaje y observacin del hongo
en el microcultivo, de la forma indicada en esta gua.
8. Realice la observacin de los montajes indicados por el tutor en los microscopios dispuestos para ello.
Grafique sus observaciones. Tenga en cuenta la bibliografa relacionada en la gua, para la utilizacin de
claves en la identificacin de los hongos observados.
Ilustre todas las observaciones y realice el flujograma de cada experiencia realizada.
Espaa. 676 p.
Morfologa bacteriana
TTULO: Morfologa bacteriana.
TEMA: Levaduras vnicas. Ecologa de las levaduras vnicas. El mosto como microecosistema. Proceso
fermentativo espontneo del mosto de uva. Microbiologa enolgica. El anlisis microbiolgico en enologa.
Tcnicas de aislamiento. Especies aisladas. Descripcin de las especies ms representativas. Criterios de
seleccin. Micotoxinas. Intoxicaciones fngicas.
- Reconocer la morfologa celular bacteriana, as como, las diferentes agrupaciones y otros aspectos
morfolgicos de las bacterias.
- El estudiante desarrollar la capacidad de caracterizar mediante marcadores morfolgicos, aislamientos
bacterianos de diferentes fuentes, como etapa inicial en la identificacin bacteriana.
Metabolismo de protenas y cidos nucleicos.
INTRODUCCIN:
Las bacterias en condiciones normales se desarrollan con formas definidas, las cuales son proporcionadas por
la rigidez de la pared celular; estas formas son esfricas, ovaladas, en forma de bastn o como espirales. De
acuerdo a lo anterior, es importante realizar una correcta observacin de estas caractersticas, dado que, dicha
forma se convierte en uno de los principales marcadores para la identificacin inicial de gneros bacterianos,
encontrndose registrado en el Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey; adicionalmente, es importante
subrayar que, cada gnero posee unas caractersticas particulares que permiten diferenciarlo de otros, esto
teniendo en cuenta que, la caracterizacin de un aislamiento debe incluir otro tipo de marcadores, como los
bioqumicos, serolgicos y moleculares, para poder concluir al respecto de un gnero y una especie.
Del mismo modo, los rasgos de las colonias y la disposicin o agrupacin bacteriana, son criterios taxonmicos
que deben ser descritos correctamente para aislamientos no identificados, como parte de la identificacin
primaria.
OBSERVACIN DE LA MORFOLOGA BACTERIANA EN MUESTRAS TEIDAS.
La morfologa de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados frescos o fijos y, teidos por
algunos de los mtodos de tincin conocidas; ya que, por su misma estructura son difciles de visualizar en su
estado natural. Las tinciones biolgicas y los procedimientos de tincin en unin con la microscopa de luz son
una herramienta bsica importante en microbiologa, permitiendo estudiar las propiedades de los
microorganismos y su divisin en grupos especficos para propsitos diagnsticos.
En algunas ocasiones, se hace necesario fijar los microorganismos y durante este proceso se produce la muerte
celular debido a la coagulacin del protoplasma, preservndose la morfologa celular, adems de, adherirlos a la
lmina. El agente ms utilizado para fijar es el calor, aunque puede tambin utilizarse alcohol y otros compuestos
qumicos que frecuentemente permiten una mejor diferenciacin de los detalles como las soluciones de etanol-
ter, alcohol sublimado (Cloruro de Mercurio II, Etanol absoluto y agua destilada), y solucin de cido smico
(vapores).
Consideraciones generales en la morfologa de las bacterias.
Tamao. Son invisibles al ojo humano, por lo tanto estas se miden en micrmetros (m), unidad que equivale a
10-3 mm. El tamao de las bacterias vara dependiendo de las especies entre menos de 1m y 250m; siendo
lo ms habitual entre 1 y 10m. Una caracterstica de las clulas bacterianas es la alta proporcin que existe
entre el rea de la superficie y el volumen de la clula. Esto significa que, poseen una gran superficie a travs
de la cual pueden entrar nutrientes para alimentar a un pequeo volumen; con lo cual, pueden realizar muchas
reacciones metablicas y crecer rpidamente. As, por ejemplo Escherichia coli, tarda 20 minutos en dividirse
mientras que, una clula de mamfero en laboratorio tarda de 13 a 24 horas.
Forma. La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared celular. Las bacterias poseen una
de las tres formas fundamentales: esfrica, cilndrica y espiral. Las clulas esfricas, se denominan cocos y
suelen ser redondeadas aunque pueden presentar formas ovoides o elpticas. A las de forma cilndrica se les
denomina bacilos; los extremos de estas clulas suelen ser redondeados, rectos, en forma de huso o cuerno. A
las de forma espiral o helicoidal, se las denomina espirilos y se caracterizan por su forma de sacacorchos. Existe
una morfologa intermedia entre los cocos y los bacilos, denominada cocobacilos; muchos de ellos parsitos del
hombre y de los animales, como Brucella spp., Bordetella spp., Francisella spp., y Pasteurella spp., las cuales
aparecen en el Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey, en la seccin de bacilos y cocos Gram-negativos
aerobios.
Existen modificaciones a estas tres formas fundamentales y aunque la mayor parte de las bacterias mantienen
su forma constante, algunas especies pueden variar la forma, por lo que se les llama pleomrficas. Arthrobacter
spp., es un ejemplo de pleomorfismo debido a que, su forma cambia en funcin de la edad del cultivo. Tambin,
exhiben pleomorfismo aquellas bacterias que no poseen pared celular, como es el caso de los micoplasmas (o
fitoplasmas, de acuerdo a su origen animal o vegetal). Otro ejemplo son las formas de L que, son bacterias que
carecen de pared celular debido a una situacin de estrs (choque trmico u osmtico, antibiticos, etc.), pero
cuando cesa el estrs sintetizan de nuevo la pared celular. Debido a que, la forma es un carcter taxonmico, el
pleomorfismo puede inducirnos a confusin ya que podemos pensar que un cultivo est contaminado con otro
tipo de bacteria. Sin embargo, el pleomorfismo no suele ser lo ms frecuente.
Disposicin: Muchas veces al mirar al microscopio se observan clulas unidas unas a otras. Mientras que, las
bacterias en forma de espiral (espirilos), suelen ser clulas separadas, otras especies suelen crecer en una
disposicin caracterstica; disposicin que, va a depender del plano en el que se realice la divisin celular y si la
clula hija permanece junto a la madre una vez realizada la divisin celular. Cada una de estas disposiciones es
tpica de una especie particular y puede usarse en la identificacin. Hay que tener en cuenta que, raramente
todas las clulas de una especie se disponen exactamente de la misma manera.
Cuando un coco se divide en un plano, forma un diplococo o dos clulas juntas (Neisseria spp.). Cuando un coco
se divide en un plano y permanece unido despus de varias divisiones, forma una cadena que se denomina
estreptococo (Streptococcus spp.). Si las clulas se dividen en ms de un plano o dimensin, la disposicin es
ms complicada. Cuando un coco se divide en ngulo recto al primer plano de divisin forma ttradas
(Pediococcus spp.). Una posterior divisin en el tercer plano puede resultar de un paquete cbico de ocho clulas
conocido como sarcinas (Sarcina spp.). Si la divisin en los dos planos es de forma irregular se forman similar a
un racimo de uva conocido como estafilococo (Staphylococcus spp.).
Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones caractersticas, aunque hay excepciones. Por ejemplo,
el bacilo de la difteria, tiende a agruparse en empalizada. Dentro del gnero Bacillus spp., algunas especies
forman cadenas llamadas estreptobacilos.
De acuerdo a la disposicin, forma y tamao, las bacterias se clasifican en (Figura 1):
Fig. 1. Formas y disposiciones representativas de las clulas bacterianas (Fuente: Rojas, A.).
- Cocos. Clulas esfricas, generalmente de 1 de tamao. La divisin celular da lugar a una distribucin
caracterstica de las clulas hijas. En el caso ms simple las clulas hijas se separan resultando clulas
aisladas.
- Diplococos: Son pares de clulas que no se separan.
- Estreptococos: Cadenas de clulas esfricas que no se separan.
- Ttradas: En las clulas aisladas se presentan divisiones en ngulo recto (como el gnero Gaffkya spp.),
formando cuadros de cuatro clulas.
- Estafilococos: Las clulas presentan un eje de divisin al azar, dando como resultado la agrupacin de las
bacterias en racimos (Staphylococcus aureus)
- Sarcina: Las clulas presentan tres planos de divisin en ngulos rectos, producindose paquetes regulares
de 8 a 16 bacterias cada uno (Sarcina spp.).
- Bacilos. Bacterias cilndricas en forma de varilla. Estas clulas presentan tamaos aproximadamente de 0,5
a 1 de ancho por 2 a 3 de largo. Se pueden encontrar aislados, en cadenas cortas y largas o, en pares
paralelos, lo que en algunos casos facilita su clasificacin.
- Bacterias en forma de coma y espiral. Se encuentran como clulas aisladas con una gran variedad de
tamaos, nmero de espiras y rigidez de la pared (Campylobacter spp., Vibrio spp., Borrelia spp., y
Treponema spp.).
- Espiroquetas: Presentan forma de sacacorchos, son flexibles y pueden llegar a medir hasta 250 de largo.
- Espirilos: Son microorganismos Gram-negativos, mviles y flagelados.
- Vibrios o vibriones: Se presentan como bacilos curvos en forma de coma.
- Bacterias filamentosas y ramificadas. Los Actinomicetes, en un principio se consideraron hongos por su tipo
de crecimiento, pero en realidad difieren en la composicin de su pared y en el ncleo. Nocardia spp. (De
importancia mdica e industrial), presenta un crecimiento de filamento compacto; Streptomyces spp. (De
importancia mdica, industrial y agrcola), forma filamentos ramificados que dan origen a un micelio, pero de
dimensiones bacterianas.
- Bacterias con yemas y/o apndices (Prostecadas). Presentan crecimiento y divisin celular caracterstica, al
darse de una manera desigual en la clula, en los cuales se origina una clula hija sin que, la clula madre
pierda su identidad (Rhodomicrobium spp., Pirella spp., y Blastobacter spp.).
- Formas de involucin. Es una morfologa anormal que se encuentra a menudo en cultivos viejos (Tpicos en
Pasteurella pestis y Neisseria spp.). Estos tipos de clulas suelen no ser viables, pero s lo son, al ser
transferidas a un medio favorable, se dividen dando origen a clulas de morfologa normal.
Dentro de la morfologa debe tenerse en cuenta la presencia de cpsula, flagelos y endospora (no todas las
bacterias forman estas estructuras). Tambin se debe tener en cuenta, la posicin de la endospora dentro de
la clula (terminal, subterminal, central), y la distribucin de los flagelos si estn presentes.
Morfologa de la colonia bacteriana.
Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben diferencias en la apariencia macroscpica
de su crecimiento, estas diferencias llamadas caractersticas culturales, son la base para la separacin de ellas
en grupos taxonmicos. Las caractersticas culturales de los microorganismos conocidos, estn consignadas en
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology y, son determinadas por el cultivo de los microorganismos en agar
Nutritivo inclinado y en placas de Petri, en caldo Nutritivo y en Gelatina Nutriente.
La morfologa colonial, es una caracterstica indispensable a tener en cuenta en el aislamiento primario de una
bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la elevacin de la misma. Adicionalmente, es importante
apreciar la consistencia y la textura de la masa celular, pues tambin son caractersticas distintivas. La
consistencia va desde la colonia seca que, tocada con una asa se desplaza en la superficie del medio, hasta las
colonias viscosas que se pegan al asa y se separan de la colonia formando un hilo (generalmente son bacterias
con cpsulas gruesas). As como, tambin la pigmentacin de la colonia, las pelculas continas de crecimiento
(bacterias mtiles), colonias lisas (generalmente virulentas), o colonias rugosas (generalmente avirulentas).
Caracterizacin del crecimiento sobre Agar Nutritivo inclinado.

Los cultivos en este medio se inoculan en una sola lnea recta (sobre la superficie del bisel), y se evalan de la
siguiente manera (Figura 2):
Fig. 2. Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en una sola lnea sobre agar Nutritivo inclinado, donde:
(A) Crecimiento filiforme, (B) equinulado, (C) barbado, (D) difuso (E), arborescente y, (F) rizoide
1. Abundancia de crecimiento. La cantidad de crecimiento es designada como ninguna, leve, moderada o

abundante.
2. Pigmentacin. Los microorganismos cromognicos, pueden producir pigmentos intracelulares que son
responsables de la coloracin de las colonias; otros microorganismos, producen pigmentos solubles
extracelulares que son excretados en el medio y tambin producen un color; sin embargo, la mayora de los
microorganismos son no cromognicos y aparecern en tonalidades que van desde el blanco al gris.
3. Las caractersticas pticas. Pueden evaluarse con base en la cantidad de luz transmitida a travs del
crecimiento; estas caractersticas son descritas como: opaca (ninguna transmisin de luz), translcida
(transmisin parcial), o transparente (transmisin total de la luz).
4. Forma. La apariencia del crecimiento de la siembra en una sola lnea sobre la superficie del agar inclinado se
designa de la siguiente forma (Figura 2):
A. Filiforme: Crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos.
B. Equinulado: Crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares continuos.
C. Barbado: Colonias semi-confluentes o no confluentes.
D. Difuso: Crecimiento difuso y reducido.
E. Arborescente: Crecimiento en forma de rbol.
F. Rizoide: Crecimiento en forma de raz.
Caracterizacin del crecimiento en Caldo Nutritivo.
Son evaluados segn la distribucin y apariencia del crecimiento como sigue (Figura 3):
A. Turbidez fina uniforme: Crecimiento fino y totalmente disperso.
B. Floculante: Crecimiento en agregados escamosos totalmente dispersos.
C. Pelcula: Crecimiento en la superficie como plataforma, grueso.
D. Sedimento: Concentracin del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser granular, escamoso o floculante
Fig. 3. Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en caldo Nutritivo, donde: (A) Crecimiento de turbidez
fina uniforme, (B) floculante, (C) pelcula y, (D) sedimento (Fuente: Rojas, A.).
Caracterizacin del crecimiento en placas de Agar Nutritivo.
La descripcin se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y
observable macroscpicamente), de forma aislada y se evala de la siguiente manera (Figura 4)
Fig. 4. Descripcin macroscpica realizada en colonias creciendo sobre agar Nutritivo, donde se aprecia la forma,
la elevacin y el borde (Fuente: Rojas, A.).
a. Tamao: Grande (dimetro mayor a 1mm), mediano (dimetro aproximado a 1mm), pequeo (dimetro
inferior a 1mm), y puntiforme.
b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.
c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado, espinoso/dentado/lacerado,
ondulado y filamentoso).
d. Elevacin: Plana o aplastada (no elevacin), elevada (convexa baja, convexa cupuliforme, mamelonada,
pulvinada y umbilicada).
e. Superficie: Lisa o rugosa.
f. Consistencia: Blanda, dura o mucoide.
g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translcido.
h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que decoloran el medio; piocianina
(azul verdosa y factor de virulencia en P. aeruginosa), pigmentos fluorescentes y pigmentos no difundibles
confinados a las colonias.
i. Hemlisis: Parcial (Alfa, parcial aclaracin de la sangre alrededor de las colonias, con decoloracin verde del
medio; borde de clulas rojas intacta), total (Beta, zona de completa aclaracin de sangre alrededor de las
colonias, debida a la lisis de las clulas rojas), y no hemlisis (Gamma, no hay cambio en el medio circundante
a la colonia; no hay lisis ni decoloracin de las clulas rojas de la sangre).
La morfologa de las colonias es un parmetro importante en el proceso de identificacin bacteriana, siendo
estas caractersticas, comunes entre cada gnero bacteriano. Sin embargo, la morfologa puede alterarse por
el tiempo de incubacin, composicin del medio de cultivo (excesiva desecacin o humedad), etc. Esta
descripcin es tambin aplicable a las levaduras, debido a que estas presentan crecimientos tpicos
bacterianos.

- 1 bandeja para tincin.
- 5 portaobjetos.
- 5 cubreobjetos.
- Colorante Azul de Metileno.
- Colorante Cristal violeta.
- Colorante Tinta china.
- Etanol 70%
- 1 microscopio compuesto binocular.
- Aceite de inmersin.
- Colorante Fucsina.
- Colorante Verde Malaquita.
- Colorante Safranina.
- 1 cultivo bacteriano en agar Nutritivo en caja Petri, sembrado por aislamiento o agotamiento.
- 1 cultivo bacteriano en Caldo Nutritivo en tubo taparosca.
- 1 cultivo bacteriano en agar Nutritivo en tubo taparosca-bisel, sembrado por estra
PROCEDIMIENTO.
1. Con los cultivos bacterianos suministrado por su tutor (agar en cajas Petri, agar en tubos y caldos en tubos),
realice la descripcin morfolgica de la colonia o tipo de crecimiento observado; para esto, defina los marcadores
relacionados en esta gua: Forma, elevacin, borde, tamao, superficie, consistencia, aspecto y presencia de
pigmentos (en el medio o en la colonia), y los marcadores para crecimiento en tubos de agar inclinado o caldos.
2. Tabule los datos recolectados. Recuerde que, las observaciones deben hacerse en colonias aisladas, no en
zonas con crecimiento abundante de la bacteria; as como, caracterice un nmero representativo de colonias y
concluya al respecto.
3. Una vez finalizada la caracterizacin de la colonia bacteriana, proceda a realizar la caracterizacin de la
morfologa y agrupacin bacteriana; para esto, elabore un frotis y sobre l realice una tincin simple. No olvide
fijar el frotis al mechero.
4. Una vez coloreada la preparacin, llvela a observacin bajo el microscopio binocular compuesto, siguiendo
las instrucciones correctas de manejo del equipo y con las indicaciones de su tutor.
5. Describa y registre sus observaciones, definiendo el tamao, la forma y la disposicin o agrupacin
bacterianas.
6. Repita los pasos de 1 a 5 con cada una de las muestras suministradas por su tutor.
Presente los resultados condensados en una Tabla, dentro del informe del Laboratorio.
Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la experiencia prctica
Espaa. 676 p.
Tinciones simples y compuestas para bacterias
TTULO: Tinciones simples y compuestas para bacterias
TEMA: Bacterias lcticas. Antecedentes histricos. Morfologa. Taxonoma. Ecologa y aislamiento.

Fermentacin lctica del cido mlico: bioqumica de la transformacin. Factores que influyen en el proceso.
Factores ampelogrficos. Factores tecnolgicos. Factores fsicos y qumicos. Requerimientos nutricios.
Bacteriocinas.
Introducir a los estudiantes en los fundamentos, utilidades y procedimientos aplicados a las tinciones bacterianas,
para la observacin de las principales estructuras.
Los estudiantes desarrollarn las metodologas de tinciones simples y compuestas aplicadas a las bacterias,
reconociendo la funcionalidad y finalidad de cada una.
Microbiologa y Sanidad, tcnicas de observacin
Los microorganismos son seres pequeos y su protoplasma posee un ndice de refraccin cercano al del agua,
por lo cual se requiere generalmente de tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente. La introduccin
de coloraciones a finales del siglo pasado, permiti demostrar el fino detalle de sus estructuras.
Las tinciones se preparan en soluciones acuosas y orgnicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren
una variedad de colores a los microorganismos. Los colorantes, no solo sirven para la tincin directa o indirecta.
La tincin simple puede ser directa cuando se tie la estructura microbiana mientras el medio permanece sin
colorear y simple indirecta en la cual se tie el entorno que rodea la estructura microbiana, mientras esta
permanece sin teir. La tincin con azul de metileno puede ser til para teir grnulos metacromticos (tincin
directa).
As mismo, los colorantes sirven como indicadores de cambio de pH o de xido-reduccin, para demostrar la
presencia o ausencia de condiciones anaerobias. Casi todos los colorantes biolgicos son derivados del alquitrn
y la estructura fundamental alrededor de la cual estn construidos qumicamente la mayora de los colorantes,
es el anillo bencnico.
En trminos generales la clasificacin de los colorantes es convencional y se basa en la presencia de grupos
cromforos. Son cidos o bsicos no necesariamente ligados con el pH, sino ms bien, si una parte de la
molcula es aninica o catinica; as los colorantes bsicos tien estructuras de naturaleza cida, como la
cromatina nuclear; los cidos por su parte reaccionan con sustancias bsicas como las estructuras del citoplasma
y poseen adems una elevada afinidad por el hidrgeno. Cuando todos los sitios moleculares aceptores de
hidrgeno estn ocupados, el colorante se halla en su estado reducido y es generalmente incoloro y se denomina
"Leucocompuesto". Teniendo en cuenta este concepto desde un criterio opuesto, un colorante retiene su color
en tanto sus afinidades por el hidrgeno no estn completamente satisfechas. Dado entonces que, el oxgeno
posee generalmente mayor afinidad por el hidrgeno que muchos colorantes, el aire retiene el color. Esta es la
razn por la cual ciertos colorantes (como el azul de metileno), se utilizan como indicador de aerobios, ya que
este es incoloro en ausencia de oxgeno.
De acuerdo a lo anterior, qumicamente un colorante se define como un compuesto orgnico que contiene un
grupo benceno ms un grupo cromforo, as como, un auxcromo. Un cromforo, es un grupo qumico que
imparte color al benceno (solvente orgnico); mientras que un auxcromo, es un grupo qumico que le confiere
la propiedad de ionizacin al cromgeno, capacitndolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos. La habilidad
de un colorante para unirse a macromolculas de componentes celulares (protenas, cidos nuclicos, etc.),
radica en la carga elctrica tanto de la porcin cromognica como del componente celular a teir (Figura 1).
Los colorantes cidos son aninicos, es decir que en forma ionizada la porcin cromognica exhibe una carga
negativa que tendr afinidad por los constituyentes de la clula cargados positivamente. Las protenas,
componentes celulares cargados positivamente, se unirn y aceptarn el color de un cromgeno aninico
cargado negativamente de una tincin cida
Fig. 1. Naturaleza de los componentes de los colorantes utilizados en tinciones de bacterias (Fuente: Rojas, A.).
Los colorantes bsicos son catinicos, es decir, la ionizacin de la porcin cromognica exhibe una carga
positiva, lo cual permite una fuerte afinidad por los constituyentes de la clula cargados negativamente. Los
cidos nuclicos, componentes celulares cargados negativamente, se unirn y aceptarn cromgenos catinicos
cargados positivamente; un ejemplo es el azul de metileno.
Los colorantes bsicos son los ms comnmente empleados para tinciones bacterianas, la presencia de carga
negativa en el exterior celular, repele los colorantes cidos y evita su penetracin en la clula. La Tabla 1, resume
algunas tcnicas de tincin y los propsitos de cada una.
Tabla 1. Tcnicas de tincin aplicadas a bacterias
Las tinciones simples, se aplican para incrementar el contraste de las clulas a observar bajo el microscopio, por
medio de un nico colorante que, tie con la misma tonalidad toda la clula; de esta forma, se hace visible la
morfologa y el arreglo de crecimiento de las mismas. Es aconsejable, utilizar colorante bsicos que contengan
un cromgeno (compuesto que da el color), con carga positiva, dado que en la pared celular de las bacterias
existen compuestos con cargas negativas que, atraen y ligan el cromgeno.
El azul de metileno es uno de los ms utilizados, actuando sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y sin
producir un color intenso que oscurezca los detalles de las clulas; tambin pueden ser utilizadas la safranina,
cristal violeta y tinta china (azul de Lactofenol para observacin de hongos). Este tipo de tincin, es especialmente
til para detectar observar bacterias en muestras naturales (no aisladas), debido a que, la mayor parte de los
artefactos o materiales no celulares, no son teidos por el colorante.
Las tinciones compuestas, son aquellas en las cuales se utiliza ms de un colorante y tienen por objetivo, la
observacin de estructuras especficas de las bacterias. Este tipo de tinciones, se caracterizan por presentar un
colorante principal o primario (bsico que tie clulas cargadas negativamente), un agente mordiente (sales
metlicas, solucin Yodada o Lugol, cido tnico o fenol que, potencia el desarrollo de color), un agente
decolorante (disolventes orgnicos), y un contractor, colorante secundario o de contraste (de distinto color al
utilizado en el primer colorante).
Las principales tinciones compuestas aplicadas a las bacterias son: Tincin de Gram, de bacterias cido-alcohol
resistentes-BAAR, endosporas, cpsulas, flagelos y grnulos.
Preparacin de frotis bacterianos para tinciones simples y compuestas.
Se denomina frotis, a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de un cultivo bacteriano, con el objetivo
de separar por extensin los microorganismos presentes. Esta etapa es importante para lograr los resultados
esperados en cada una de las tinciones (simples o compuestas). Tenga en cuenta que, para algunas tinciones
la elaboracin del frotis, puede ser diferente. Con el objetivo de lograr lo anterior, realice las siguientes
indicaciones:
1. Limpie las lminas con agua y jabn, papel y, posteriormente desengrase con alcohol, dejndolo evaporar;
este paso es esencial ya que, la grasa o aceite de los dedos no permiten una buena elaboracin de frotis e
interfieren en la tincin.
2. Identifique cada lmina con el nombre o numeracin de la muestra.
3. Si la muestra procede de un cultivo en caldo, tome una o dos alcuotas de las clulas con la ayuda de un asa
bacteriolgica y colquelas directamente sobre la lmina, extindalas de forma circular y luego extienda
longitudinalmente en la placa.
4. Si la muestra procede de un cultivo slido, coloque una gota de solucin salina fisiolgica estril (NaCl 0,85%)
sobre el portaobjetos y extienda con la ayuda del asa bacteriolgica estril, la muestra de las bacterias.
5. Permita que el extendido seque al aire, pero no flamee, ya que la morfologa celular o las estructuras pueden
denaturarse.
6. Fije al calor la preparacin para evitar la elusin del frotis durante el proceso de tincin. Esto se realiza,
pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un mechero Bunsen.
Procedimiento para la realizacin de las tinciones simples.
Siga los pasos relacionados a continuacin:
1. Realice el frotis con la tcnica mencionada previamente y con las indicaciones del tutor.
2. Coloque la lmina en los sitios dispuestos para tinciones, dentro de la bandeja de coloracin y vierta sobre el
frotis uno de los siguientes colorantes: Cristal violeta/30-60 segundos, azul de metileno/1-2 min., o Carbol-
fucsina 15-30 segundos.
3. Pasado en tiempo de tincin, lave cuidadosamente el frotis con agua corriente, para remover el exceso del
mismo.
4. Deje secar al aire, con la placa en posicin inclinada (no seque flameando la preparacin).
5. Lleve la preparacin al microscopio y observe bajo los objetivos de 4x, 10x, 40x e inmersin
Procedimientos para la realizacin de tinciones compuestas.

Tincin de Gram.
Nombrada as, en honor al bacterilogo Christian Gram. Clasifica y diferencia las bacterias en dos grupos
principales: Gram-positivas y Gram-negativas (Figura 2). La tincin emplea 4 reactivos diferentes (Anexo A):
1. Cristal Violeta. Colorante primario de color violeta, su funcin es dar color a todas las clulas.
2. Yodo de Gram (Lugol). Reactivo que acta como mordiente, formando el complejo cristal violeta-yodo (CV-I),
insoluble por unin al colorante primario. Sirve para intensificar el color en la tincin. En este punto todas las
clulas permanecern violeta oscuro. Solo en clulas Gram-positivas, el complejo se une al componente cido
ribonuclico-magnesio de la pared celular (Mg-ARN-CV-I), este complejo resultante es ms difcil de remover
que el complejo ms pequeo cristal violeta-yodo.
3. Alcohol etlico 95% o Alcohol-acetona (Etanol 95% y acetona 70:30). Agente decolorante. Un agente
decolorante, puede o no remover el colorante primario de la clula entera o solo de ciertas estructuras celulares.
Tiene doble funcin, como solvente de lpidos y como agente deshidratante de protenas. Su accin en el
procedimiento, est determinada por la cantidad de lpidos de la envoltura celular. En clulas Gram-positivas, la
baja concentracin de lpidos es importante para retener el complejo Mg-ARN-CV-I, siendo los lpidos disueltos
por el agente decolorante y formndose pequeos poros en la pared celular que, son cerrados por la accin
deshidratante del alcohol. Como consecuencia, la tincin primaria se une fuertemente y es difcil de remover,
permaneciendo las clulas de color prpura. En clulas Gram-negativas, la alta concentracin de lpidos en la
capa externa, es disuelta por el alcohol formndose grandes poros que no cierran a causa tambin de la
deshidratacin de las protenas. As, se facilita la liberacin del complejo CV-I dejando a las clulas decoloradas
o desteidas.
4. Safranina. Reactivo de contratincin. Tiene un color de contraste al colorante primario (rojo). Si despus de
la decoloracin el colorante primario ha sido lavado, los componentes decolorados de la clula tomarn el color
del colorante de contraste. Solo las clulas Gram-negativas, que se decoloran, absorben el color rojo del
colorante, mientras que, las clulas Gram-positivas retienen el color prpura del colorante primario.
Procedimiento para realizar correctamente una tincin de Gram.
1. Realice el frotis con la tcnica relacionada en esta gua y fjelo al calor.
2. Vierta sobre el frotis cristal violeta y djelo actuar por 1 minuto.
3. Lave con agua de la llave y escurra el exceso.
4. Cubra ahora el frotis con Lugol (Iodo de Gram), y deje actuar por 1 minuto.
6. Cubra ahora con solucin decolorante (alcohol-acetona), por 30 segundos.
7. Lave con agua de la llave y escurra el exceso
8. Cubra ahora con colorante de contraste (Safranina o fuschina), y deje actuar por 45 segundos.
10. Permita que la preparacin teida se seque al aire, dejando la lmina en posicin inclinada.
11. Observe al microscopio hasta objetivo de inmersin (Figura 2).
Fig. 2. Proceso de la tincin de Gram, donde se observa el color tomado por las clulas en cada etapa. (A) Cristal
violeta, (B) Adicin de Lugol, (C) Decoloracin con Alcohol-acetona y, (D) adicin de Safranina. Las bacterias
Gram-positivas mantienen su color violeta y la Gram-negativas son decoloradas por el solvente, aceptando el
color conferido por la Safranina, y por lo cual se ven rojas-rosadas
Recuerde.
- Lo ms crtico del procedimiento es el paso de decoloracin, si en este paso no se remueven completamente
los complejos CV-I, los organismos Gram-negativos aparecern falsamente como Gram-positivos.
- Es imperativo remover completamente con agua el reactivo de cada etapa de la tincin, de manera que se
preparare la lmina para el subsiguiente reactivo.
- Preparaciones teidas con Gram, se realizan con cultivos frescos, es decir hasta con 24 horas de cultivo.
Cultivos viejos y especialmente de bacterias Gram-positivas, tienden a perder la habilidad para retener el
colorante primario -variables, aparecindose Gram algunas clulas
- Un frotis grueso causa decoloracin inadecuada.
- Un tiempo excesivo de decoloracin puede llevar a la observacin errnea del color tomado por las bacterias.
- La remocin de frotis durante el secado puede eliminar la muestra de la lmina.
Tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR).
Se aplica para bacterias que no se tien fcilmente por los colorantes corrientes, debido a su alto contenido de
lpidos en la pared celular (p.e., Mycobacterium spp.). Se fundamenta en que, las bacterias cido-alcohol
resistentes, en especial las mycobacterias, por su composicin de pared difcilmente toman los colorantes, pero
una vez teidas, retienen el color y no lo pierden an por la accin energtica de los cidos. Los bacilos cido
alcohol resistentes, se tien de rojo por la Carbol-fucsina y, los microorganismos restantes se tien de azul por
el colorante de contraste (Figura 3; Anexo A).
Procedimiento para realizar correctamente una tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR).
1. Cubrir la preparacin con Carbol-fucsina y calentar hasta la emisin de vapores. Mantener as por 10 minutos,
evitando el secado del colorante sobre la preparacin (el cido carblico acta como el primer mordiente y el
calor como segundo mordiente o mordiente fsico).
2. Lavar con agua suavemente
3. Decolorar completamente con alcohol-cido (cido sulfrico al 3% en el alcohol etlico al 95%).
4. Lavar con agua.
5. Cubrir con azul de metileno por 2 minutos.
6. Lavar con agua y colocar en posicin vertical, dejar secar y observar al microscopio hasta el objetivo de
inmersin.
NOTA: La coloracin de Kenyou, es igual que la coloracin de Ziehl-Neelsen, slo difiere en que no es necesario
calentar la Fuschina y la cual es ms concentrada, los dems colorantes son idnticos.
Fig. 3. Resultados de la tincin de bacterias cido-alcohol resistentes (BAAR), donde se observa: (A) Bacilos no
cido-alcohol resistentes teidos de azul por efecto del colorante azul de metileno y, (B) bacilos cido-alcohol
resistentes, teidos de rojo por accin de la Carbol-fucsina
Tincin de esporas.
Cuando el medio ambiente de las bacterias se torna desfavorable, muchas de ellas entran en latencia; algunas
especies bacterianas forman esporas, para contrarrestar la adversidad del medio con la deshidratacin, el calor,
el fro, o la escasez de nutrientes. Si las condiciones ambientales retornan a la normalidad, la espora absorbe
agua, rompe la pared interna y la clula bacteriana vuelve a surgir por el proceso de germinacin (activacin del
crecimiento vegetativo). Las endosporas, estn formadas por una cubierta alrededor del ADN y una pequea
porcin de citoplasma dentro de ella; esta estructura, posee una mayor resistencia a los agentes fsicos y
qumicos que la clula vegetativa. El dimetro de la espora con respecto a la clula bacteriana y la posicin que
ocupa dentro de ella son caractersticas distintivas de las especies. Las endosporas no se colorean por mtodos
corrientes y por consiguiente, se recurre a mtodos de coloracin especiales para su observacin. Algunas
coloraciones para esporas son: Coloracin de Meller y de Schaeffer-Fulton.
Tincin de esporas de Schaeffer-Fulton. En este tipo de tincin se utiliza como colorante primario, el verde de
malaquita y uno de contraste (Safranina o Fucsina) (Figura 4; Anexo A). Por medio de esta tcnica se pueden
diferenciar las endosporas de la clula vegetativa. De acuerdo con ella, se aplica el colorante primario en solucin
acuosa y se le hace vaporizar para incrementar la penetracin de los recubrimientos relativamente impermeables
de las endosporas. Las endosporas sometidas correctamente al mtodo, resistirn la sustitucin por el colorante
de contraste y a menudo se podrn observar endosporas verdes dentro de clulas rojas; de esta forma, se puede
determinar la ubicacin intracelular de la misma (terminal, subterminal o central), para usarse con fines
taxonmicos
PROCEDIMIENTO para realizar correctamente una tincin por el mtodo de schaeffer-fulton.

1. Prepare el frotis y fjelo al calor.
2. Agregue unas gotas de verde de malaquita, hasta cubrir totalmente la preparacin; caliente por 5min., hasta
que se observe la emisin de vapores pero, sin dejar hervir ni secar el colorante. La placa puede ser cubierta
con papel filtro para evitar salpicaduras y siempre tenga en cuenta que el montaje debe estar lo suficientemente
hmedo.
3. Deje enfriar y lave con agua destilada.
4. Contracolorear con Safranina al 0,5% por 1 minuto.
5. Retire el exceso de colorante lavando con agua destilada.
6. Deje secar al aire.
7. Realice la observacin al microscopio hasta el objetivo de inmersin. Las esporas aparecen verdes y las
clulas vegetativas de color rosado (Figura 4A).
Procedimiento para realizar correctamente una tincin por el mtodo de Meller.
1. Realice el frotis de la muestra y djelo secar al aire; fjelo.
2. Cubra el frotis con fucsina-carblica de Ziehl-Neelsen y calintelo hasta que desprenda vapores. Tenga
cuidado de no dejar secar ni hervir el colorante. Contine este proceso por 5 min.
3. Lave con agua.
4. Decolore con cido Sulfrico 1%.
5. Lave con agua.
6. Cubra con Azul de Metileno de Leffler durante 2min.
7. Lave con agua, deje secar y observe al microscopio hasta objetivo de inmersin. Las esporas aparecen rojas
y las clulas vegetativas de color azul (Figura 4B).
Fig. 4. Resultados de las tinciones de endosporas bacterianas de (A) Schaeffer-Fulton, donde se observan las
endosporas teidas de verde y la clula vegetativa de color rosado y de (B) Meller, donde se observan las
esporas rojas y la clula vegetativa de color azul
Tincin de cpsulas bacterianas.

Tincin negativa. En esta tincin se puede identificar la estructura externa que envuelve a algunas bacterias
como Klebsiella spp., Streptococcus pneumoniae y Clostridium perfringens. Utiliza como colorante primario tinta
china o Nigrosina. La tcnica de tincin negativa incorpora materiales como la tinta china, que se compone de
partculas demasiado grandes para penetrar en la clula; despus de haber utilizado el colorante primario se
adiciona el de contraste que, penetra fcilmente a la clula bacteriana. Al examinar la preparacin, la cpsula
aparecer como una zona transparente que rodea a la pared celular (las clulas no se tien), sobre un fondo
negro. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cpsulas, debido
a que el encogimiento de las clulas o la recesin o separacin de la tinta china pueden producir resultados
anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado presenta muchas zonas transparentes con siluetas
uniformes, es posible que sean reales y no artificiales (Figura 5).
Procedimiento para realizar correctamente una tincin Negativa.
1. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado deposite en un extremo una gota de tinta china.
2. Tome una gota del cultivo y mezcle a lo largo del portaobjetos (tcnica del frotis sanguneo). Tambin,
puede mezclar en un tubo, partes iguales de cultivo y tinta china.
3. Tome la muestra, suspndala sobre la lmina y realice el extendido.
4. Deje que el extendido seque naturalmente (nunca fije al calor).
5. Cubra con Safranina por 10 segundos y luego retire el exceso de colorante con agua destilada muy
cuidadosamente para no eliminar el frotis.
6. Deje secar al ambiente.
7. Realice la observacin bajo el microscopio hasta el objetivo de inmersin (Figura 5A)
Fig. 5. Resultados de las tinciones de cpsulas bacterianas por los mtodos de (A) tincin negativa, donde se
observan las cpsulas transparentes (las clulas no se tien), y el fondo oscuro y, (B) tincin de Hiss, donde se
observan las cpsulas azul claro y la clula vegetativa de color prpura oscuro bajo un fondo claro (Fuente:
Rojas, A.).
PROCEDIMIENTO para realizar correctamente una tincin de cpsulas de Hiss.

Con esta tincin, las clulas se ven teidas intensamente y la cpsula de azul o rosado segn se use violeta o
fucsina.
1. Previamente se cultivan las bacterias para el desarrollo mximo de cpsulas.
2. Fijar los frotis con vapores de cido smico durante 10-20 segundos.
3. Dejar secar sin calentar.
4. Fijar la preparacin adicionando alcohol y flamendolo.
5. Cubrir con una solucin de fucsina bsica o cristal violeta, calentando ligeramente hasta la emisin de
vapores.
6. Retirar el colorante mediante solucin al 20% de Sulfato de Cobre en agua.
7. Secar con papel filtro y examinar al microscopio hasta objetivo de inmersin. Si emplea cristal violeta, la
cpsula aparecer azul claro en contraste con el color prpura oscuro de la clula (Figura 5B).
Tincin de flagelos.
Los flagelos son rganos de locomocin delgados, de naturaleza proteica que se originan en la regin
protoplsmica inmediatamente debajo de la pared celular. No todas las bacterias poseen estas estructuras y
En consecuencia, la presencia de flagelos, al igual que la distribucin y las cantidades en que estn presentes
en ellas, son caractersticas tiles para su clasificacin (patrones de flagelacin: Polar, pertricos, monotricos,
lofotricos, anftricos). La observacin de flagelos se realiza comnmente en microscopios electrnicos, sin
embargo, con la tcnica adecuada se pueden observar en microscopios pticos, cuando se aplican mordientes
y colorantes alrededor de ellas, ya que, estas incrementan el dimetro de los flagelos (Figura 6).
Procedimiento para realizar correctamente una tincin de flagelos modificada de Leifson.
1. Prepare una suspensin poco densa de bacterias en agua y a partir de un cultivo joven.
2. Coloque dos gotas de la suspensin en un extremo del portaobjetos, deje secar al aire y con un lpiz
vidriogrfico, dibuje una lnea perpendicular en la superficie del vidrio y en el extremo opuesto de la
suspensin.
3. Coloque el portaobjetos, en un soporte inclinado y cubra la suspensin bacteriana seca con una pelcula
fina de colorante de Leifson (Fucsina bsica 1.2% en alcohol 95%, cido Tnico 3% (mordiente), en agua y
NaCl 1.5% en agua; mezclados en iguales volmenes). La marca con el lpiz de cera, impide que el
colorante se escurra del extremo del portaobjeto.
4. Permita que el colorante acte por 5-15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que se
evapora el alcohol. El tiempo de tincin disminuye si el colorante es fresco y si la temperatura del ambiente
es alta.
5. Cuando se forme el precipitado, enjuague el portaobjetos suavemente con agua destilada, elimine el exceso
de agua y dejar secar al aire. Observe al microscopio hasta objetivo de inmersin (Figura 6).
Fig. 6. Resultados de la tincin de flagelos bacterianos por el mtodo de Leifson, donde se observan las clulas
vegetativas de color rojo y los flagelos de color rosado
Tincin de grnulos bacterianos.

Se usa para teir grnulos metacromticos de Polimeta-fosfato, los cuales se tien de color rojizo mientras el
cuerpo de la clula se tie de color azul-verdoso. Cuando se tie con azul de Toluidina y verde de metilo
acidificado en solucin alcohlica y, Lugol, se observan los grnulos de color azul oscuro y la clula de color
verde claro; es una tcnica de tincin til para observar los grnulos de las corynebacterias. El azul de toluidina
tie los grnulos principalmente y el verde de metilo el protoplasma de la bacteria.
Procedimiento para realizar correctamente una tincin de grnulos de Albert.
1. Cubra el frotis con el colorante de Albert y deje por 10 minutos.
2. Lave suavemente con agua corriente.
3. Cubra el frotis con Lugol y deje actuar por 5 minutos.
4. Deje secar la muestra a temperatura ambiente
5. Realice la observacin bajo microscopio y hasta objetivo de inmersin.
6. Las corynebacterias se observan con formas de L, V o Y de color verde claro y los grnulos metacromticos
de color azul oscuro.
Causantes de error en el proceso de tincin.
1. El cristal violeta puede precipitarse, ocasionando la observacin de estructuras falsas en el frotis. Para evitar
esto, filtre el colorante antes de su uso.
2. La evaporacin (concentracin del colorante), es causa de mal funcionamiento.
3. El uso de portaobjetos engrasados o sucios, es la causa de mala fijacin del frotis y teido de la muestra.
4. El sobrecalentamiento del frotis en el momento de la preparacin del mismo, provoca daos fsicos en la
pared celular de las bacterias, afectndose la retencin de los colorantes.
5. Lavado muy fuerte del frotis durante la tincin.
6. Aplicacin de tiempos o proporciones inadecuadas de los colorantes utilizados en el proceso de tincin.
7. Algunos tintes pueden contaminarse (safranina y fucsina bsica). Si se sospecha contaminacin, cultive
1mL del colorante en Caldo Tioglicolato y observe la reaccin o, preferiblemente descarte el colorante.
8. La tincin de Zielh-Neelsen, presenta algunas limitaciones por la no especificidad a micobacterias y la baja
sensibilidad (el nivel de deteccin 5.000-10.000 bacilos/mL). Para esta tincin, siempre debe ser teido un
aislamiento control positivo (p.e.: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177), cada vez que se cambie de
reactivos (nueva preparacin o compra)

- 1 cultivo bacteriano en agar Nutritivo de 18-24 horas, sembrado por agotamiento.
- 1 bandejas para tincin.
- 1 cultivo bacteriano en caldo Nutritivo de 18-24 horas.
- cido sulfrico 1%.
- Azul de metileno de Zeehl-Neelsen.
- 10 portaobjetos desengrasados.
- 1 pinza metlica.
- 10 cubreobjetos desengrasados.
- 1 rejilla metlica.
- 6 pipetas Pasteur plsticas.
- 1 beaker de 1000mL (o un recipiente de gran capacidad y resistente al calentamiento).
- 1 hornilla elctrica.
- Papel filtro o toalla.
- Reactivo de Hiss.
- Azul de Metileno.
- Reactivo de Albert
- Cristal violeta.
- Tinta china
- Lugol de Gram.
- Colorante de Leifson.
- Alcohol-acetona.
- Solucin de fenol 5%.
- Safranina.
- Fuschina carblica de Zeehl-Neelsen.
- Verde Malaquita.
- Aceite de inmersin.
- Fucsina (para fucsina fenicada de Ziehl).
PROCEDIMIENTO.
1. De cada uno de los cultivos bacterianos (que se encuentran en agar y caldo), proporcionados por su tutor,
prepare una lmina; realizando un frotis y fijndolo o no al mechero, esto de acuerdo a las instrucciones
mencionadas en esta gua en el apartado de elaboracin de frotis y tinciones de estructuras.
2. Coloree cada preparacin de acuerdo a las metodologas proporcionadas en esta gua, para tinciones
simples y compuestas; tenga en cuenta realizar mnimo una placa para las tinciones de Gram, endosporas,
cpsulas y flagelos y, mnimo una placa de tincin simple.
3. Una vez coloreadas las lminas, llvelas una a una a observacin bajo el microscopio compuesto, siguiendo
las instrucciones correctas de manejo del microscopio binocular compuesto y con las indicaciones del tutor.
4. Describa y grafique cada una de las observaciones realizadas, registrando: Color o colores observados,
estructuras, morfologa y agrupacin bacteriana.

Realiza la descripcin detallada de las actividades realizadas durante la experiencia prctica
Espaa. 676 p.
Efecto del pH y la temperatura en el
crecimiento microbiano
TTULO: Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
TEMA: Bacterias acticas. Generalidades. Morfologa. Ecologa. Aislamiento. Clasificacin. Transformacin

provocada en el vino por bacterias acticas. Biotecnologa de la elaboracin del vinagre. Sistemas industriales
de fabricacin de vinagre. Alteraciones y defectos del vinagre. Vinagres especiales.
Que el estudiante conozca el efecto del pH y la temperatura como parmetros de control del crecimiento
microbiano. Que el alumno comprenda la importancia de estos factores fisicoqumicos en la seleccin de
poblaciones microbianas en los diferentes ambientes en que se encuentran y los mecanismos de adaptacin a
nivel celular y metablico que han desarrollado.
Microbiologa y Sanidad, tcnicas de observacin
Los microorganismos estn continuamente afectados por su ambiente, ya que ste ejerce una influencia profunda
en su desarrollo al igual que sobre las dems formas de vida. Los factores del medio se pueden clasificar en tres
grupos:
a).- Fsicos.- temperatura, presiones externas, humedad.
b).- Qumicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de productos txicos.
c).- Biolgicos.- las interacciones microbianas entre las especies coexistentes.
Algunos microorganismos estn especialmente adaptados a los hbitats extremos, donde otros no pueden
sobrevivir y que incluso tienen propiedades fisiolgicas que restringen su crecimiento a tales sitios. En otros
hbitats menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y las interacciones entre poblaciones adquieren mayor
importancia en la seleccin de las poblaciones que se encontrarn. Los factores ambientales que se controlan
en condiciones de laboratorio con mayor frecuencia, adems de los nutrimentales son los fisicoqumicos como:
la temperatura y pH. Todos los organismos tienen una temperatura ptima de crecimiento que los caracteriza;
en la cual muestran las tasas ms elevadas de crecimiento. Tambin hay lmites de temperatura, la temperatura
mnima en las que son metablicamente inactivos y una temperatura arriba de la cul el crecimiento ya no es
posible llamada temperatura mxima. De acuerdo a su temperatura ptima de crecimiento, los microorganismos
se dividen en psicrfilos (<0C-20C), mesfilos (20-40C), termfilos
(40-80C) e hipertermfilos (80-110C). La mayora de hipertermfilos son arqueas como Methanococcus
igneos. Las diferencias entre la temperatura ptima de crecimiento y los intervalos de temperatura entre los
cuales es posible el crecimiento de bacterias y arqueas determinan la separacin espacial en la naturaleza de
Estos dominios de microorganismos. La concentracin de iones hidrgeno del medio afecta directamente a
los microorganismos y enzimas, e influye tambin en la disociacin y solubilidad de molculas que requieren. Sin
embargo, algunos microorganismos se han adaptado a diferentes condiciones de acidez o alcalinidad, como
Sulfolobusy Thiobacillus que crecen a pH tan cido como 1 - 2 oxidando minerales de sulfuro para producir cido
sulfrico y son llamado acidfilos.
Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos
donde los valores de pH 10 son comunes, estos alcalfilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas
bacterias entricas y cianobacterias. En general los hongos son ms tolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
Modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar. Ajustado a pH 7.0

2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajustado a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajustado a pH 9.0
22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin (Bioxon) ajustado a pH 7.0 sin amortiguar.
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH 5.0 sin amortiguar
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH 9.0 sin amortiguador
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH 7.0 con amortiguador
1 Asa de inoculacin
3 pipetas de 1.0 mL. estriles
1 mechero Fisher
Espectrofotmetro
Microscopio estereoscpico
Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10
PROCEDIMIENTO.
El profesor proporcionar cultivos lquidos de: Eschechia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una
suspensin de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas debern
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inocular.
Efecto de la Temperatura
1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensin de esporas de
hongos en cada seccin.
2. Incubar una caja de Petri a 15C, otra a 30C y la ltima a 45C en forma invertida durante 72 horas y hacer
las observaciones macroscpicas.
3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscpico despus de una
semana.
4. En seis tubos de caldo microinoculacin ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas.
5. Incubar dos tubos en estufa a 15C, otros dos a 30C y los dos ltimos a 45C durante 24-48 horas. Medir la
D.O.
Efecto del pH
1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculacin ajustados a 3 diferentes valores de pH
(5.0, 7.0 y 9.0) con solucin de HC11.0 M o NaOH 1.0 M.
2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando
soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10.
3. Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculacin
ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo.
4. Incubar los tubos a 35 C durante 24-48 horas y medir la D.O.
5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de
hongos.
6. Incubar las cajas de Petri a 30 C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscpicas.
7. Despus de una semana observar las cajas en microscopio estereoscpico.
EJERCICIOS DE APLICACIN . RESOLUCIN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS.

1. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento
(-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
2. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografa de cada una de las cepas.
3. Cules son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su
temperatura ptima de crecimiento?
4. Cmo influy el pH en el crecimiento de hongos y bacterias? Qu diferencias se observaron en los
medios de cultivos amortiguados y sin amortiguar?
5. Explique brevemente cules son los mecanismos celulares que los microorganismos termfilos extremos
y psicrfilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.
6. Explique cul es la relacin que existe entre condiciones ptimas de crecimiento en el laboratorio y las
condiciones del hbitat de origen de las poblaciones microbianas
Cuadro 9
Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano
Cuadro 10
Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano
Espaa. 676 p.

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GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA | SEDE ICA

Dr. Blgo. Juan Carlos Quispe Meja

TTULO DE LA PRCTICA: El Laboratorio de Microbiologa. Normas de Bioseguridad.

TEMA: Resea histrica de la microbiologa. Definicin. Importancia de la microbiologa. Microbiologa

Reconocer las normas de bioseguridad.

Un laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.

Se revisaran nsitos en el Laboratorio:

Introduccin al trabajo en el laboratorio de bioqumica de productos agroindustriales: Pictogramas de

Desinfeccin, describe la destruccin de microorganismos presentes en la superficie de implementos,

Agente Mecanismo de accin Aplicaciones

- Altera la estructura de protenas e induce

- No se tiene claro el mecanismo de

Para un proceso de desinfeccin correcta, tenga en cuenta las siguientes recomendaciones:

- Prepare la solucin desinfectante diariamente para su uso.

NIVELES DE CONTENCIN O DE SEGURIDAD BIOLGICA.

Ejemplo de un Informe de Laboratorio.

Ao de la Promocin de la Industria Responsable y Compromiso Climtico

a) Porque son importantes tomar medidas de Bioseguridad en los Laboratorios?

TTULO DEL PRCTICO: Esterilizacin. Mtodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de

Existen diversos tipos de controles durante el proceso de esterilizacin.

MTODOS ESTERILIZACIN FSICOS

LA ESTERILIZACIN COMIENZA CUANDO LOS PARMETROS TEMPERATURA Y PRESION ALCANZAN

Esterilizacin por calor seco

Temperatura (C) Tiempo (minutos)

MTODOS ESTERILIZACIN QUMICOS - lquidos GLUTARALDHEIDO

Es el ms ampliamente usado. Acta por desnaturalizacin de protenas y cidos nucleicos.

MTODOS ESTERILIZACIN QUMICOS - gaseosos -OXIDO DE ETILENO ALTO MARGEN DE

ETAPAS DEL PROCESO

Ejemplo de un ciclo ETO de mezcla

ETAPAS DEL CICLO

VAPOR DE PERXIDO DE HIDRGENO

Se usa como agente esterilizante a bajas temperaturas y presin subatmosfrica.

Ciclo plasma del Perxido de Hidrgeno

MTODOS ESTERILIZACIN QUMICOS - MECNICOS

ALMACENAMIENTO DEL MATERIAL ESTRIL

TTULO DEL PRCTICO: Preparacin de materiales de uso en el laboratorio de microbiologa. Lavado,

MEDIOS DE CULTIVO Y CLASIFICACIN.

- Humedad. Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecacin) puede llevar a la

PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Posibles defectos en la manipulacin y preparacin de medios de cultivo.

CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO.

Medio de Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerantes y anaerobios. Debe conservarse en la

Medios selectivos y diferenciales.

Medio de Telurito: Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus y Listeria. El Telurito de potasio al

Medios bioqumicos diversos.

Comercialmente, pueden encontrarse sistemas multipruebas para evaluacin bioqumica de microorganismos,

- 2 cajas Petri estriles.

Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* + ci-(Cromoforo)

Fijacin del frotis

La tcnica ms usada en el laboratorio de microbiologa es probablemente la transferencia de microorganismos

TCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.

Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de agotamiento, aislamiento o de estra cruzada.

Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de siembra en cuadrantes.

Siembras en cajas de Petri por la Tcnica de siembra masiva.

Siembras en cajas de Petri por la Tcnica de puncin.

TCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS.

Siembra en tubos por estra simple.

Siembra en tubos por picadura.

Siembra en tubo en medio lquido.

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR

1 caja Petri con agar PDA.