Contenido

Preparaciones en fresco ................................................................................................................. 3

Fijacin ............................................................................................................................................... 3
Colorantes ......................................................................................................................................... 3
Tipos de colorantes ...................................................................................................................... 4
Ventajas y desventajas .................................................................................................................... 4
Pasos.................................................................................................................................................. 7
Interpretacin .................................................................................................................................... 7
Precauciones..................................................................................................................................... 8
Utilidad ............................................................................................................................................... 9
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias
funciones:........................................................................................................................................... 9
- Identificacin preliminar de la bacteria causal de una infeccin. ...................................... 9
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos
identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos
bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero de formas
bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados as
como la atmsfera de incubacin. ................................................................................................. 9
A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos
son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular
(micrococos), aparecer por pares (diplococos), formar cadenas (estreptococos), o
agruparse de manera irregular (estafilococos). ........................................................................... 9
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena
(estreptobacilos) o en empalizada. ................................................................................................ 9
Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos (si son de forma
rgida) o espiroquetas (si son blandas y onduladas). Si por el contrario, poseen forma de
coma (o curvados) entonces se los designa vibrios............................................................... 9
Introduccion
La mayora de los microscopios compuestos poseen varias lentes objetivos,
cada una con un poder de aumento diferente. Normalmente, existe una lente de
bajo poder (objetivo dbil seco) que aumenta un objeto 10 veces (l0x), una de alto
poder (objetivo fuerte seco), que aumenta 40 veces (40x) y el objetivo de
inmersin, 100 veces (l00x). Casi todas las lentes del ocular proporcionan un
aumento adicional de 10 veces (l0x). Se puede calcular el poder total de aumento
de un microscopio multiplicando el aumento que proporcionan las dos lentes,
objetivo y ocular, en uso. Si se desea observar la apariencia general de un
espcimen es recomendable usar un objetivo de bajo poder, porque su campo de
visin es grande. El objetivo de inmersin tiene un campo de visin pequeo, pero
proporciona ms detalles de la imagen.

Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en un

microscopio ptico, una preparacin especial; esto es debido a que poseen poco
contraste natural. La preparacin y la tincin (tratamiento con colorantes) de un
espcimen son fundamentales si se desea obtener buenas imgenes. Muchas
dcadas de esfuerzos y errores han conducido a mtodos generales de
preparacin que resultan idneos.
Tinciones en Microbiologa
Preparaciones en fresco
La forma ms simple de preparar un espcimen para su examen microscpico es
hacer una preparacin en fresco. Existen dos tcnicas, una preparacin en fresco
simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de lquido con los
microorganismos sobre un portaobjetos y a continuacin cubrirla con un
cubreobjetos. Una preparacin en gota pendiente se realiza colocando una gota
del material en un cubreobjetos y cubrindolo con un portaobjetos (invertido) con
una excavacin central (portaobjetos excavado). Hay que sellar la preparacin con
vaselina alrededor de la excavacin. La ventaja de esta ltima tcnica, es que la
preparacin no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo. Las
preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite

aumentar el contraste de la preparacin. Por tanto, su uso, con un microscopio
ptico de campo claro, es limitado.

Fijacin
Para la fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra
lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa la
preparacin de Forma rpida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama
mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las
protenas coaguladas unen las clulas al portaobjetos. Cuando se desea fijar
especmenes delicados se utiliza la fijacin qumica, va que es menos lesiva que
el calor. Para ello se aade una gota del fijador.

La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la

apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la identificacin; adems, no permite
la observacin del movimiento de los microorganismos. Despus de la fijacin, se
aade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el
espcimen, para que pueda ser absorbido. A continuacin, se retira el exceso de
colorante, normalmente lavando con agua.

Colorantes
El tinte es un compuesto orgnico que le da contraste a la clula. El microscopio
de campo claro es ms til para la observacin de especmenes teidos. Existen
algunos, llamados colorantes vitales, que pueden aadirse directamente a una
preparacin en fresco; por tanto, colorean clulas vivas. No obstante, la mayora
de los colorantes son solamente efectivos despus de que los microorganismos
hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. El
mordente es un compuesto qumico intensificador de color. Las tinciones existen
desde antes que los medios de cultivo.

- cromgeno (solvente orgnico que le provee las propiedades de color)

- auxcromo (grupo qumico que se ioniza con el cromgeno y forma sales
que se pegan a las fibras y tejidos).
- La adhesin del tinte va a depender de la carga que posea.

Tipos de colorantes
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.
Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion
cargado positivamente, mientras que en los cidos, el colorante es el ion cargado
negativamente. Los colorantes ms utilizados son los de tipo bsico, ya que la
mayor parte de las clulas microbianas poseen cargas dbilmente negativas en su
superficie, lo cual facilita su unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se
encuentran la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno.
Los colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas positivamente.
Se utilizan para teir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los
ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.

Ventajas y desventajas
Ventajas:

- Eficacia conocida
- Baratas
- Rpidas de llevar a cabo
- No necesitan un equipo que no exista ya en la mayora de laboratorios.

Desventajas:

- Requieren fijar la muestra con calor: (clulas mueren)

- El calor adicional sumado a los qumicos pueden distorsionar la forma original de las
clulas
 Descripcin Tincin Uso Tcnicas
Un colorante;
Utilizacin de un solo
proporciona
tinte con el cual
contraste para Se tie con un colorante
podemos evaluar
observar mejor bsico (azul de
solamente la morfologa.
un organismo metileno, cristal violeta,
Las tinciones simples es
completo. Se o fucsina bsica)
cuando toda la muestra
utiliza un solo durante unos 5 minutos.
Simple se tie del mismo color y Simple
colorante Aclarar brevemente con
se utiliza un solo
(bsicos). agua. Se tien casi
colorante. Se utiliza un
- Azul de todas las bacterias; la
solo colorante (bsicos).
metileno mayora de los tejidos
- Azul de metileno
- Safranina no se tien.
- Safranina
- Cristal violeta
- Cristal violeta
Se cubre la preparacin
de bacterias fijadas con
cristal violeta y despus
con una solucin de
iodo (mordiente). Todas
las clulas quedan
tenidas de color violeta
Dos o ms oscuro. Se decolora con
colorantes; acetona al 95%.
Tincin de
distingue entre Las clulas Gram
Gram
bacterias Gram positivas permanecen
positivas y Gram tenidas, pero las
Reaccionan de manera
negativas negativas pierden el
diferente entre las
colorante. Se tie con
distintas clases de
safranina (contraste). El
bacterias. Constituidas
color violeta de las
por 2 ms tintes o
Gram positivas se
reactivos y sirven para
vuelve ms oscuro y las
clasificar las bacterias u
Gram negativas se tien
observar sus
Tinciones de rosa.
caractersticas
diferenciales Se tien las clulas con
especiales. Se utilizan
fucsina bsica y se
dos ms colorantes.
calienta a emisin de
Pueden usar mordentes
vapores durante 5
y decolorantes.
minutos. Todas las
- Giemsa
bacterias se tien de
- Wrigth
rojo. Se decolora
- May Grnwald
Dos colorantes; brevemente con una
(Eosina -Azul de Tincin de
distingue entre mezcla de alcohol-HCl.
metileno) cido-alcohol
las micobacterias Las bacterias
resistencia
(cido-alcohol resistentes permanecen
(Ziehl-
resistentes) y el teidas de rojo; todas
Neelsen)
resto de las las dems se decoloran.
bacterias Se trata con el colorante
de contraste azul de
metileno. Las bacterias
cido-alcohol resistentes
continan tenidas de
rojo, las otras se tien
de azul.
 Se cubre la preparacin
con verde de malaquita
y se calienta a emisin
de vapores durante 60
Tincin de Tie segundos. Se lava con
esporas de selectivamente agua durante 30
Wirtz-Cortitlin las endosporas segundos y se tie con
safranina. Las
endosporas retienen el
color verde; el resto de
la clula toma el color
rosa.
A las clulas
previamente fijadas, se
Son utilizadas para dar
Tincin de le aade una mezcla de
color y aislar partes Permite observar
flagelos de cido tnico (mordiente)
Tinciones especficas de los los flagelos
Leifson y del colorante
especificas microorganismos
rosanilina. El mordiente
- Endosporas
engruesa los flagelos y
- Flagelo
el colorante los fine.
- Ncleo
Revela la
presencia de
cpsulas. El Se utiliza tinta china o
fondo se tie de nigrosina para tenir una
oscuro para preparacin en fresco
observar la clula del espcimen. Las
Tincin
o estructuras particulas de colorante
negativa
refringentes. El no pueden penetrar en
fondo se tie de la cpsula, que se
oscuro para observa como una
observar clulas regin clara alrededor
o estructuras de la clula.
refringentes.

Tincin de Gram

gram positivas y gram negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario

(cristal violeta) luego del proceso de decoloracin. Los organismos que retienen el
cristal violeta luego de la adicin del agente decolorante, el alcohol, aparecen
como azul oscuro o violeta, y se designan como gram positivos; aquellos que
pierden el cristal violeta y se tien con el colorante secundario, la safranina,
aparecen como rojos y se designan como gram negativos. Un examen minucioso
de un extendido bacteriano teido diferencialmente, provee una informacin muy
importante sobre la caracterizacin morfolgica e identificacin de la muestra. Por
ejemplo, una reaccin positiva o negativa a la Tincin de Gram es sumamente
importante como medio primario de clasificacin.

El por qu las bacterias gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo y

las gram negativas no, ha sido un tema muy controversial. Una de las
explicaciones que se dan, est relacionada con la naturaleza qumica de la pared
celular de las bacterias gram positivas que previenen la remocin del complejo con
el alcohol. Otra teora mantiene que la gruesa envoltura celular de las gram
positivas, especficamente la capa gruesa de peptidoglucano, se deshidrata y al
encogerse por el efecto del alcohol, ocasiona el cierre de los poros lo cual impide
la salida del complejo cristal violeta-lugol.

En definitiva la pared celular es la barrera para la decoloracin. Si se altera la

pared celular de las bacterias gram positivas se transforman en gram negativas.

Es un procedimiento rpido (minutos). Sin embargo plantea problemas de

sensibilidad y especificidad, sobre todo en muestras paucibacterianas. Sigue
siendo de gran utilidad en manos expertas.

Pasos
1. Colorante primario. Cristal violeta 1% en solucin de oxalato de amonio al
0.85% (1 minuto)
2. Colorante de contraste. Safranina 0.25% (1 minuto)
3. Mordente. Lugol I/KI 1g/2g en 300 mL de agua (1 minuto)
4. Decoloracin. Alcohol-Acetona 70:30. Hasta eliminar el exceso de
colorante.
5. Colorante de contraste. Safranina 0.25% (1 minuto)

Interpretacin
Membrana externa de las Gram

- es soluble en solventes orgnicos como el alcohol

- la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el
complejo cristal violeta/yodo que se form
- por lo que va perdindose el color azul-violeta.

Las Gram + no tienen su capa susceptible a la accin de solventes orgnicos

- se deshidratan los poros y se cierran

 - retenindose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color
azul-violeta.

Precauciones
Para obtener una buena lmina de Gram, es necesario tomar en cuenta ciertas
precauciones tanto en su preparacin como en su observacin bajo el microscopio
con el objetivo de inmersin.

1. Extendido: Este paso es importante ya que la preparacin debe ser fina y no

gruesa. Si se coloca demasiada muestra del cultivo bacteriano, el extendido
quedar muy grueso y una vez teido, sin la ayuda del microscopio se observar
una gran mancha coloreada, pero vista bajo el microscopio, con el objetivo de
inmersin, se observar una masa oscura de estructuras que no pueden ser
distinguidas en forma individualizada y el proceso de identificacin de la
morfologa, arreglos y estructuras tipo endosporas, etc. se dificulta.

2. Fijacin: Si el extendido bacteriano no se fija adecuadamente, las clulas

bacterianas se pierden durante el proceso de tincin que involucra varios lavados
y trae como consecuencia la ausencia de bacterias teidas. Por el contrario un
sobrecalentamiento puede ocasionar la aparicin de artefactos y la ruptura de la
morfologa de las clulas bacterianas.

3. Antes de colocar la lmina en la platina determine en cul lado de la lmina

portaobjeto est localizado el extendido.

4. Observe varios campos hasta encontrar aqul que permita una identificacin de
la morfologa, estructura y reaccin al Gram.

Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se tien como gram

negativas:

- Mycobacterias (estn encapsuladas).

- Mycoplasmas (no tienen pared).
- Formas L (prdida ocasional de la pared).
- Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared,
respectivamente).
Utilidad
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir
varias funciones:
- Identificacin preliminar de la bacteria causal de una infeccin.
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor
nmero de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los
medios de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.
A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los
cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin
celular (micrococos), aparecer por pares (diplococos), formar cadenas
(estreptococos), o agruparse de manera irregular (estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de

cadena (estreptobacilos) o en empalizada.

Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos (si son de
forma rgida) o espiroquetas (si son blandas y onduladas). Si por el contrario,
poseen forma de coma (o curvados) entonces se los designa vibrios.

Tincion de bacterias en el laboratorio

Escherichia coli (E. Bacilus Sutilis Staphylococcus

coli) aureus
Caractersticas Bacilo Gram
 negativo. No forma
esporas Mviles
(flagelos pertricos).
Miden 0.5 de
ancho por 3 de
largo. Catalasa
positivos. Oxidasa
negativos. Reducen
nitratos a nitritos.
Producen vitamina B
y K.

Bibliografa

https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf}

http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2016/11/Tincion-de-Gram.pdf

http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2016/11/Tinciones-en-Microbiolog%C3%ADa.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morfolog%C3%A
Da_y_Tinci%C3%B3n.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U2j_PreparacionesMicrobiologicas_17194.PDF

http://www.helicobacterspain.com/congresos/j-esteban.pdf

http://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap304
.htm