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OBJETIVO
HIPTESIS
MARCO TERICO
FUNDAMENTO DE LA TCNICA
La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los tomos o
molculas son excitados por absorcin de radiacin electromagntica. Las
especies excitadas se relajan posteriormente hacia el estado basal, cediendo el
exceso de energa en forma de fotones. Una de las caractersticas ms
interesantes de la fluorescencia molecular es su sensibilidad inherente, la cual es
comnmente de uno a tres rdenes de magnitud mejor que la de la espectroscopia
de absorcin. De hecho, se han detectado molculas sencillas de especies
seleccionadas por espectroscopia de fluorescencia en condiciones controladas.
Otra ventaja de los mtodos fluorescentes es su amplio intervalo de concentracin
lineal, el cual es significativamente mayor que en la espectroscopia de absorcin.
Sin embargo, los mtodos fluorescentes son mucho menos aplicables que los
mtodos de absorcin debido al bajo nmero de sistemas qumicos que muestran
fluorescencia apreciable. La fluorescencia tambin est sujeta a muchas ms
interferencias ambientales que los mtodos de absorcin.
La luz es una forma de energa radiante electromagntica, es decir, la energa se
propaga mediante la combinacin de campos elctricos y magnticos sin algn
material de soporte lo que le permite desplazarse en el vaco, es una porcin
visible de dicha energa radiante por lo que se considera un fenmeno
electromagntico, por lo tanto est constituida por partculas electromagnticas
denominadas fotones, un fotn es denominado tambin cantidad de energa que
posee una pequea cantidad de materia que no puede ser medida.
La luz se caracterstica por desplazarse en lnea recta con movimiento ondulatorio
a una velocidad constante, aunque cuando pasa de un medio menos denso
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Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza.
Anteproyecto de porcentaje de pureza de sulfato de quinina por
espectrofluorometra mediante comparacin con un estndar.
(aire, por ejemplo) a otro transparente de mayor densidad, como el agua, vidrio o
plstico, su velocidad disminuye. Estos cambios de velocidad son importantes
pues producen una de las caractersticas de la luz la refraccin. La luz que se
origina de una fuente emisora se desplaza o irradia en todas direcciones. De tal
forma que su energa se dispersa a medida que se aleja de su punto de origen;
por lo tanto, la energa luminosa que incide sobre una superficie situada a cierta
distancia ser menor que la que incide sobre la misma superficie, pero situada
ms cerca de la fuente emisora. Este hecho se percibe como un cambio en la
luminosidad.
Tambin la luz es reflejada, esto sucede en las superficies de los objetos no
transparentes reflejan o rebotan la luz. Es absorbida si el objeto es opaco (no
transparente), la luz no reflejada en su superficie es absorbida por el objeto y
desaparece y es Transmitida si el objeto es transparente, la mayor parte del haz
luminoso lo atraviesa y contina su desplazamiento a travs del mismo.
Debido a que la luz se propaga en forma de ondas presenta ciertas propiedades
como longitud de onda esta es la distancia que existe entre dos crestas o dos
valles sucesivos de la onda luminosa. Las longitudes de onda de la luz son muy
pequeas: Generalmente se miden en nanmetros (nm) o en angstroms ().
Mientras que amplitud de onda es la distancia que existe entre la parte superior e
inferior de la onda, La amplitud de onda le confiere a un rayo luminoso, la
intensidad luminosa o brillantez sin modificar el color, esto significa que si un haz
luminoso de un color determinado es ms intenso o ms brillante que otro del
mismo color es porque la amplitud de onda del primero es mayor que la del
segundo. Cada ciclo de la onda se repite en intervalos separados por una longitud
de onda, al nmero de estos ciclos que ocurren cada segundo se le llama
frecuencia Se mide en rpm (oscilaciones por minuto), rps (oscilaciones por
segundo o Hertz).
La velocidad de un rayo de luz, en un medio depende de su longitud de onda. Los
rayos luminosos de ondas cortas pierden ms velocidad que aquellos de ondas
largas; un rayo de luz azul se desplaza ms lentamente que un rayo de luz roja,
esto significa que el ndice de refraccin de un cuerpo transparente vara con la
longitud de onda del rayo luminoso que lo atraviese. Por lo tanto, segn la ley de
Snell, los diversos colores de la luz son refractados y desviados en distinto grado.
Esta propiedad por la que las ondas luminosas de diferente longitud, integrantes
de un haz de luz blanca, se desplazan a diferente velocidad en un cuerpo
transparente y experimentan desviaciones en su recorrido en diferentes grados de
desviacin se denomina dispersin o descomposicin de la luz. Dispersin de un
haz de luz blanca, al atravesar un prisma, en rayos luminosos de diferentes
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Anteproyecto de porcentaje de pureza de sulfato de quinina por
espectrofluorometra mediante comparacin con un estndar.
El estado electrnico de una molcula est referido a las propiedades de todos los
electrones en todos sus orbitales. La funcin de onda de un estado electrnico es
una combinacin de las funciones de onda de cada uno de los electrones en cada
uno de los orbitales de la molcula de la cual forman parte. La forma en que una
molcula absorbe radiacin electromagntica es por medio de un proceso
mecnico cuntico, donde una molcula es transformada de un estado basal a un
estado excitado. La energa del fotn de luz absorbido corresponde a la diferencia
de energa entre los dos estados. En la luz del ultravioleta y el espectro visible
(200-800 nm), corresponden energas de 143 a 35.8 kcal mol-1. En los tomos la
absorcin involucra la promocin de un electrn de una capa orbital externa hacia
un orbital vaco de mayor energa. En molculas, un electrn es promovido del
mayor orbital molecular ocupado (HOMO, highest occupied molecular orbital), al
menor orbital molecular desocupado (LUMO, lowest unoccupied molecular orbital).
Cuando un electrn en una molcula es movido de un orbital a otro, cambia el
estado de la molcula y entonces es importante considerar los estados de la
molcula involucrados en lugar de considerar solamente los orbitales involucrados
en la promocin del electrn. Una molcula en un estado excitado es mejor
referida como una nueva entidad, solo remotamente relacionada a la misma
molcula en estado basal. Un estado excitado tendr una distribucin electrnica
completamente diferente del estado basal, una nueva geometra, y ms que eso,
podr reaccionar qumicamente de forma diferente del estado basal, que es el
estado normal o de menor energa. Existe slo un estado basal para una molcula
dada. Sin embargo, hay diversos estados excitados posibles an para molculas
muy simples, y la naturaleza exacta de los cuales depende de los tipos de
orbitales involucrados. Los estados electrnicos de las molculas electrnicas se
pueden agrupar en dos grandes categoras: estados singlete y triplete. En los
estados excitados singlete, un electrn en un orbital excitado est apareado (spin
opuesto) a un segundo electrn en un orbital en el estado basal, dicho de otra
forma, todos los electrones en la molcula tienen sus spin apareados. En
consecuencia, el regreso al estado basal es permitido por el spin y ocurre
rpidamente por emisin de un fotn. Este es el caso de la fluorescencia, y las
velocidades de emisin de sta son tpicamente de 108 s-1, por lo que la vida
media de la fluorescencia es cercana a 10 ns. 7 Los estados excitados triplet son
aquellos en los cuales un par de electrones tienen sus spines desapareados, esto
es, el electrn en el orbital excitado tiene la misma orientacin que un electrn en
el estado basal. La fosforescencia es la emisin de luz de estados excitados
triplet. La transicin al estado basal es impedida y las velocidades de emisin son
lentas (103 100 s-1), tal que la vida media de la fosforescencia es tpicamente de
milisegundos a segundos. Aunque la naturaleza exacta de los estados excitados
Fluorescencia y estructura
La mayora de los compuestos que contienen anillos aromticos proporcionan
emisin fluorescente. Ciertos compuestos carbonlicos alifticos y alicclicos y
estructuras de dobles enlaces tambin lo hacen. Sin embargo, su nmero es
pequeo en comparacin con el nmero de compuestos fluorescentes que
contienen anillos aromticos.
La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos fluorescen con una
emisin fluorescente creciente con el nmero de anillos y con su grado de
condensacin. Los anillos heterocclicos ms sencillos (piridina, furano, pirrol,...)
no fluorescen (imagen 3) pero las estructuras de anillos fusionados con ms de
dos anillos (quinolina, isoquinolina, indol) lo hacen con frecuencia
Fluorforos
Los fluorforos son molculas fluorescentes que tienen un espectro de absorcin
y emisin bien definidos; existe una diferencia entre los picos de absorcin y
emisin de un fluorforo (Stokes shift); la intensidad de su fluorescencia emitida
vara con la longitud de excitacin, pero no vara la distribucin de su espectro.
Entre los ms utilizados se pueden encontrar molculas orgnicas simples y
protenas fluorescentes.
CARACTERSTICAS INSTRUMENTALES
Fluormetro
Un fluormetro ideal debera de cumplir con las siguientes caractersticas:
1. La fuente de la luz debe de producir una salida de fotones constantes a todas
las longitudes de onda.
2. El monocromador debe de pasar fotones de todas las longitudes de onda con
la misma eficiencia.
3. La eficiencia del monocromador debe de ser independiente de la polarizacin.
4. El detector (tubo fotomultiplicador) debe de detectar los fotones de todas las
longitudes de onda con la misma eficiencia.
Desafortunadamente estos elementos ideales no existen, por lo cual se debe de
realizar una seleccin adecuada y hacer las correcciones pertinentes de la
respuesta no ideal.
Los componentes principales de cualquier fluormetro son: la fuente de luz, el
selector de onda, la celda para la muestra, un segundo selector de onda para
aislar la fluorescencia emitida y el detector. En la imagen 4 se muestra un
esquema general de un fluormetro.
Caractersticas:
La fuente de luz
Los fotones correspondientes a la fluorescencia que pasan a travs del
monocromador de emisin son slo una pequea fraccin del total de la
intensidad. Por lo tanto es necesario el uso de una fuente que tenga una salida
relativamente alta. La mayora de los fluormetros tienen una lmpara de arco de
xenn de alta presin como fuente de excitacin ya que produce un espectro
continuo de alta intensidad que va de 200-1000 nm. Estas lmparas emiten luz
como resultado de la recombinacin de electrones con tomos ionizados de
xenn. Estos iones son generados por la colisin de los tomos de xenn con los
electrones que fluyen a travs del arco. La salida, que dependiente de la longitud
de onda de las lmparas de xenn, es la mayor razn para la distorsin del
espectro de excitacin de los componentes los cuales absorben en el ultravioleta.
El gas en las lmparas de xenn se encuentra bajo alta presin (aproximadamente
10 atm) por lo que siempre, al manejar este tipo de lmparas, se deben de usarse
lentes de seguridad. La envoltura de cuarzo no debe de ser tocada, si lo es, debe
de limpiarse con algn solvente como etanol ya que los residuos de las huellas
digitales se quemarn, quedando una mancha en la cobertura de cuarzo
provocando un posible fallo de la lmpara. Por supuesto la lmpara nunca debe de
ser observada directamente cuando est encendida, ya que puede daar la retina
o la crnea. Las lmparas de xenn tienen una vida til aproximada de 2000
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Anteproyecto de porcentaje de pureza de sulfato de quinina por
espectrofluorometra mediante comparacin con un estndar.
horas. Otras lmparas que tambin se pueden utilizar son las de mercurio de alta
presin, las de arco de xenn-mercurio, las de mercurio de baja presin y otra
fuente de luz como el lser. Las lmparas de mercurio de alta presin tienen
intensidades mayores que las de xenn pero la intensidad est concentrada en
lneas. Estas lmparas son tiles si las lneas de mercurio son aptas para las
longitudes de onda de excitacin del fluorforo. Las lmparas de arco de xenn-
mercurio tienen mayores intensidades que las de xenn en el ultravioleta y la
presencia de xenn ayuda a ensanchar el espectro de salida. Las lmparas de
mercurio de baja presin producen una lnea de mercurio muy afilada la cual es
til para calibrar. Las fuentes de luz antes mencionadas se usan para estados
estables o iluminacin continua, lo cual implica que no pueden ser usadas en
pulsos o amplitud modulada para mediciones resueltas en tiempo. Las lmparas
de arco usadas para mediciones de tiempos de vida de fase modulada usan
moduladores de luz externos. Finalmente, los laser (Ligth Amplification by
Stimulated Emission of Radiation) se utilizan desde los aos 70 como fuentes de
excitacin para medidas de fotoluminiscencia. Los laser sintonizables de
colorante, tienen un inters particular, ya que utilizan como sistema de bombeo, un
lser de nitrgeno pulsante o un lser de Nd: YAG. La mayora de los fluormetros
comerciales utilizan lmparas (ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y
menos complicadas en su uso. Sin embargo, las fuentes de laser ofrecen
importantes ventajas en determinados casos, por ejemplo, cuando las muestras
son muy pequeas como en cromatografa con microcolumnas y en electroforesis
capilar donde la cantidad de muestra es de uno o menor; en los sensores de
control remoto, como en la deteccin fluorimtrica de radicales hidroxilo en la
atmsfera o de clorofila en seres vivos acuticos, donde la naturaleza colimada de
los haces de laser es vital; o cuando se requiere una radiacin de excitacin
altamente monocromtica para minimizar los efectos de las interferencias
fluorescentes
pulsos llegan muy cercanos en tiempo al nodo, sern contados como un solo
pulso. Para eventos aleatorios, el conteo necesita ser aproximadamente 100
veces menor para evitar la llegada simultnea de dos fotones. Adems, la razn
entre la seal y el ruido se vuelve poco satisfactoria a conteos inferiores a 10,000
fotones por segundo. Este rango de intensidad limitada es una desventaja de la
deteccin por contador de fotones para mediciones en estado estable de
fluorescencia. En el modo anlogo los pulsos individuales son promediados La
corriente de cada pulso contribuye al promedio de la corriente en el nodo, y la
llegada simultnea de los pulsos no es un problema. Cuando se usa deteccin
anloga la ganancia del sistema de deteccin puede ser variada cambiando ya
sea la ganancia del amplificador o el voltaje en el TFM, como resultado un rango
ms amplio de los niveles de la seal pueden ser detectados sin preocupacin
sobre una respuesta no linear. La alta precisin de las mediciones anlogas
requiere amplificadores estables y fuentes de alto voltaje, lo cual actualmente no
es un gran problema. Las mediciones en contadores de fotones son menos
sensibles a estos factores.
Desviaciones de la ley de Lambert-Beer
La ley de Beer dice que la densidad ptica es directamente proporcional a la
concentracin de las especies que absorben. Sin embargo se dan desviaciones de
esta ley tanto por causas instrumentales como intrnsecas.
Dispersin de la luz
Existen dos fenmenos de dispersin, uno depende del tamao de la partcula de
soluto o cualquier material suspendido. Las muestras biolgicas son usualmente
turbias ya que las macromolculas u otros grandes agregados dispersan la luz.
Las densidades pticas resultantes de la dispersin de la luz son proporcionales a
1/4 (dispersin de Rayleigh), y puede por lo tanto ser reconocida fcilmente como
un fondo de absorcin el cual se incrementa rpidamente con la disminucin de la
longitud de onda. El segundo tipo de dispersin se conoce como la dispersin de
Raman. En este fenmeno, parte de la energa de excitacin de la luz es abstraida
por modos vibracionales de las molculas del solvente. En el caso del agua o
solventes hidroxlicos, las vibraciones ms dominantes que absorben esta energa
son los grupos OH, cuya energa de vibracin es observada a una longitud de
onda de 3300 cm-1. La seal de Raman de los solventes ser observada a una
longitud de onda que es 3300 cm-1 menor en energa que la longitud de onda de
excitacin. La longitud de onda de la dispersin de Raman (RA) puede ser
calculada como: RA-1= ex-1 - 0.00033.
Fluorescencia
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Fotlisis
Debido a las longitudes de onda utilizadas para la excitacin de los fluorforos, se
relacionan complicaciones relacionadas a la fotodescomposicin. Ciertos pasos en
el diseo de los instrumentos puede limitar la fuente de error: un obturador, para
que la muestra solamente sea irradiada cuando las mediciones son hechas, una
fuente de baja intensidad acoplada con un mejor sistema de deteccin. Existen
algunos casos en los que la fotodescomposicin puede ser utilizada como una
ventaja.
Efecto de la temperatura
La intensidad de la fluorescencia usualmente caer con el aumento de la
temperatura ya que existen altas probabilidades de que la molcula excitada sea
desactivada. Los coeficientes de temperatura se encuentran usualmente en el
rango de 1 a 1.2 unidades relativas de fluorescencia por grado centgrado. Aunque
la instrumentacin de fluorescencia hace uso de fuentes de alta intensidad, el
calentamiento de la cmara de la muestra o de la muestra misma puede ocurrir.
La mayora de los instrumentos minimizan los efectos de la temperatura aislando
el contenedor de la muestra y utilizando un mecanismo obturador.
Adsorcin
SULFATO DE QUININA
La exitacion maxima del sulfato de quinina es a 350nm y la maxima
fluorescencia es cerca de los 450nm. Por lo que este compuesto absorbe luz
ultravioleta y emite luz visible, La solucin fluorescente parece ser azul
Mtodo terico
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espectrofluorometra mediante comparacin con un estndar.
Mtodo propuesto
Preparacin muestra sulfato de quinina 0.5
Clculos:
Donde:
Volumen: 0.4L
Densidad: 1.84g/mL
=
= (0.1 ) (0.4) (49 ) = 1.96 2 4
=
1.96
= = 1.06526 1.1 2 4
1.84
10 1 1 1000
( )( )( )( ) = 0.4
50 10 50 1
10 50 1
(0.5 )( )( )( ) = 12.5
1 1 1000
Preparacin de estndar 0.5 partiendo de una masa de 12.5mg de
sulfato de quinina.
12.5 1 1 1000
( )( )( )( ) = 0.5
50 10 50 1
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Anteproyecto de porcentaje de pureza de sulfato de quinina por
espectrofluorometra mediante comparacin con un estndar.
Preparacin de muestra 0.5 partiendo de una masa de 12.5mg de sulfato
de quinina.
12.5 1 1 1000
( )( )( )( ) = 0.5
50 10 50 1
MATERIAL Y REACTIVOS
- Balanza analtica.
- 1/4 pliego de Papel glassine.
- Una Esptula.
- Un Vidrio de reloj
- 1 Pipeta graduada 10mL.
- 1 Pipeta de transferencia.
- 4 Pipetas volumtricas 1mL.
- 1 Pipetas volumtricas 2mL.
- 2 Matraces volumtricos 10mL.
- 3 Matraces volumtricos 50mL.
- 2 Vasos de precipitado 50mL.
- 4 Vasos de precipitados 100mL
- 1 Vaso de precipitados 600mL
- Un espectrofotmetro.
- 2 Celdas de cuarzo.
- Envase de desechos.
- Sulfato de quinina (materia prima)
- Agua
cido sulfrico 2 4
Punto de fusin():10
Punto de ebullicin(): 340
Densidad (g/mL): 1.8
Solubilidad: miscible en agua
Identificacin de riesgos
La sustancia es un oxidante fuerte y reacciona violentamente con
Materiales combustibles y reductores
Inhalacin: Corrosivo, sensacin de quemazn, dolor de garganta y tos.
Dificultad respiratoria. Jadeo.
Ingestin: Corrosivo, dolor abdominal, sensacin de quemazn, shock o
colapso.
Ojos: Corrosivo. Enrojecimiento, dolor y quemaduras profundas graves.
Piel: Corrosivo. Enrojecimiento, dolor, ampollas y quemaduras cutneas
graves.
Primeros auxilios
Inhalacin: Aire limpio, reposo. Posicin de semi-incorporado. Respiracin
artificial si estuviera indicada. Proporcionar asistencia mdica.
Ingestin: Enjuagar la boca. NO provocar el vmito. Proporcionar asistencia
mdica.
Ojos: Enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las
lentes de contacto si puede hacerse con facilidad), despus proporcionar
asistencia mdica.
Piel: Quitar las ropa contaminada, aclarar la piel con agua abundante o
ducharse. Proporcionar asistencia mdica.
Proteccin personal
Punto de fusin(): -
Punto de ebullicin(): -
Identificacin de riesgos
Primeros auxilios
En caso de contacto con los ojos aclarar inmediatamente los ojos abiertos
bajo agua corriente durante 10 o 15 minutos y consultar al oftalmlogo.
Proteger el ojo ileso. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fcil.
Seguir aclarando.
Proteccin personal
Es necesaria ropa de proteccin para evitar el contacto directo con la piel
(adems de la ropa de trabajo normal).
Proteccin de ojos y cara: Gafas d seguridad
Proteccin de piel: Para la manipulacin de productos qumicos slo se
pueden utilizar guantes de proteccin identificados con el marcado CE y
el cdigo de cuatro dgitos relacionado.
Trabajar en una zona a ventilada
Diagrama de flujo
Encender el
fluormetro
REFERENCIAS
- USP 36 Vol. 2 36. Revv. (USP36) 31. Ed. (NF31). Rockville, Md.: United States
Pharmacopeia Convention, c2013.
-The Merck Index. Laboratorios de investigacin Merck (Merck & CO., INC). 12
ed. U.S.A:1990.