Professional Documents
Culture Documents
____________________________________________
Ministarstvo zdravlja
LABORATORIJSKA
DIJAGNOSTIKA U
KLINIKOJ
BAKTERIOLOGIJI
Nacionalne smjernice dobre klinike prakse
Podgorica | 2012.
Crna Gora
_____________________________________
Ministarstvo zdravlja
Laboratorijska dijagnostika u
klinikoj bakteriologiji
Nacionalne smjernice dobre klinike prakse
Autori:
Recenzenti:
Urednik:
Doc.dr Gordana Mijovi
________________________________________________________________
ISBN 0-000-00000-0
Izdava: Ministarstvo zdravlja Crne Gore 2012
Tehnika priprema i dizajn: Aleksandar Klimovi
tampa: XXXXXXXXXXXXXXX
Tira: XXX primjeraka
Predgovor
Autori
Izvod iz recenzije
1.1 Uzorkovanje
Uzorkovanje obaviti sa pojavom prvih simptoma, prije antibiotske terapije.
Pacijenta zamoliti da iroko otvori usta i izgovori a. Koristei dobro
osvjetljenje i pritiskajui patulom korijen jezika, osmotriti
unutranjost usta traei znakove upale, prisustvo bilo kakvih
membrana, eksudata ili gnoja.
Uvesti bris do zadnjeg zida drijela. Polako rotirajui u ruci bris,
energino prebrisati prostor iza uvule i izmeu tonzilarnih lukova.
Prilikom ulaska i izlaska iz drijela paziti da se bris ne kontaminira
salivom i odloiti ga u sterilan kontejner (epruvetu) ili transportnu
podlogu.
Pacijent ne smije osam asova prije uzimanja brisa koristiti bilo
kakav antibiotik, niti ispirati usta bilo kakvim dezinficijensom.
1.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
1.3 Zasijavanje
1.4 Inkubacija
1.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 3
2.1 Uzorkovanje
Uzima se brisom ispod i iznad donje nosne koljke. Prilikom uzimanja
materijala paziti da se ne dotaknu brisom otvor i zidovi atrijuma, pa je najbolje
uzeti bris kroz nosni spekulum.
2.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
2.3 Zasijavanje
2.4 Inkubacija
2.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 5
3.1 Uzorkovanje
3.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue dva asa). Ako je brz transport nemogu:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
3.3 Zasijavanje
3.4 Inkubacija
3.6 Izvjetavanje
4 Ispitivanje sputuma
4.1 Uzorkovanje
4.2 Transportovanje
4.3 Zasijavanje
4.3.1 Ispitivanje kvaliteta uzorka
Primarnu obradu uzoraka sputuma treba vriti u komori za bezbjedan rad
klase II.
Makroskopska evaluacija: opisati sputum (purulentan,
mukopurulentan, mukoidan, krvav).
Direktni mikroskopski preparat:
4.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
selektivni okoladni agar za Haemophilus
4.4 Inkubacija
4.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora usne duplje.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 9
5.1 Uzorkovanje
Uzorci koji se mogu ispitivati su:
sadraj apscesa dobijen punkcijom ili poslije incizije
bris rane
eksudat rane
Optimalno vrijeme uzimanja uzorka - prije sprovedene antimikrobne
terapije. Optimalna koliina uzorka - minimum 1 ml gnojnog sadraja, ili dobro
natopljen bris.
Optimalno je uzeti 2 brisa: jedan za kultivaciju, drugi za pravljenje
direktnog mikroskopskog preparata.
5.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue do pola sata). Ako je brz transport nemogu:
za briseve koristiti transportnu podlogu
prihvatljivo vrijeme transporta za sadraj apscesa zavisi od koliine
uzetog materijala:
5.3 Zasijavanje
5.3.1 Direktan mikroskopski preparat
Bris se priprema za direktnu mikroskopiju u vidu tankog razmaza na
istom predmetnom staklu i potom boji po Gramu.
Gnojni sadraj se sterilnom pipetom ili ezom nanese na isto predmetno
staklo u koliini od jedne kapi, razmae i boji po Gramu.
Izvjestiti o prisustvu leukocita i (opisno) mikroorganizama.
5.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
tioglikolat bujon
podloga za anaerobne bakterije sa 5 g diskom metronidazola
Dodatno, u sluaju primarnog peritonitisa kod ena i prostatinog apscesa:
okoladni agar
5.4 Inkubacija
Mogui patogeni:
Staphylococcus aureus
Streptococcus haemolyticus
Druge streptokoke
Enterococcus
Enterobakterije
Pseudomonas spp.
Anaerobi
Actinomycetes
Nocardia
Neisseria gonorrhoeae
6.1 Uzorkovanje
6.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za
briseve:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
Aspirirani sadraj iz pustula moe se transportovati u sterilnim
plastinim kontejnerima.
6.3 Zasijavanje
6.3.1 Direktan mikroskopski preparat
Radi se, ako je vidljiv gnoj na brisu.
6.3.2 Kultivacija
Svi brisevi:
krvni agar
endo agar
Dodatno, u sluaju da se radi o ujedu ivotinje ili ovjeka, celulitisu, paronihiji,
povrnoj povredi:
podloga za anaerobe sa 5g diskom metronidazola
Dodatno, u sluaju celulitisa kod djece i ljudskog ugriza:
selektivni okoladni agar za Haemophilus
Dodatno, kod sumnje na difteriju koe:
cistein telurit krvni agar (alternativa Hoyle's teluritni ag,ar)
Dodatno, kad se trai ispitivanje na gljivine infekcije:
prema posebnom protokolu
6.4 Inkubacija
Mogui patogeni:
Staphylococcus aureus
Streptococcus haemolyticus gr. A, B, C i G
Bacteroides spp.
Clostridium spp.
Anaerobne koke
Koagulaza negativni stafilokoki
Enterobakterije
Pseudomonas species
Streptococcus haemolyticus
Pseudomonas spp.
Acinetobacter spp.
Bacillus spp.
Enterobakterije
Koagulaza negativni stafilokok
Uzronici impetiga:
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Pasteurella multocida
Staphylococcus aureus
Streptococcus haemolyticus
Anaerobi
Eikenella corrodens
Haemophilus spp.
Koagulaza negativni stafilokoki
Streptobacillus moniliformis
Uzronik erythrasma-e:
Corynebacterium minutissimum
6.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora koe.
Ukoliko su izolovani u istoj kulturi ili kao dominantna flora
mikroorganizmi koji su sastavni dio mikroflore koe, u zavisnosti od uputne
dijagnoze, izvjestiti uz komentar: Izolovani soj porastao u istoj kulturi ili
Izolovani soj porastao kao dominantna flora.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 15
7.1 Uzorkovanje
Optimalno vrijeme uzimanja uzorka je prije antimikrobne terapije. Uzorak
treba da uzima ljekar ili iskusna osoba. Uzorak treba da bude u dovoljnoj
koliini da bi mogle da se odrade sve dijagnostike procedure (koliina
potrebnog uzorka zavisi od broja zahtijevanih ispitivanja).
Uzorci tkiva mogu se dobiti na tri naina:
kao zatvorena procedura perkutanom biopsijomu toku operacije
(uklanjanjem devitalizovanog ili inficiranog tkiva)
post mortem
Pri uzorkovanju bilo kojim od navedenih naina mogu se javiti problemi.
Kod perkutane biopsije
nedovoljna koliina uzorka
moe se promaiti infektivna lezija
kontaminacija florom koe
Kod uzorkovanja u toku operacije uzorkovanje se ne moe ponoviti,
stoga treba voditi rauna u toku obrade ovih materijala
Kod uzorkovanja tkiva post mortem kontaminacija enterinom
florom, treba oprezno interpretirati rezultate
Mjere bezbjednosti:
izbjegavati akcidentalne povrede prilikom korienja igle
koristiti sterilne kontejnere u zatvorenim plastinim kesama
laboratorijske procedure koje daju infektivni aerosol, sjeckanje i
homogenizacija uzoraka moraju se izvoditi u komorama za
bezbjedan rad klase II, a ukoliko su u pitanju biohazardi grupe 3
kao to su Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., ili postoji
sumnja na egzotine importovane mikoze, obrada i ispitivanje
materijala mora biti izvoena u biolokom kabinetu nivoa 3.
kad god je mogue koristiti sterilne makaze, preporuljivije u
odnosu na skalpel.
7.2 Transportovanje
7.3 Zasijavanje
7.3.1 Direktan mikroskopski preparat
Homogenizovani uzorci:
Nehomogenizovani uzorci:
7.3.2 Kultivacija
7.4 Inkubacija
Za sve uzorke:
Inkubacija
Klinika slika/ Standardni itanje Ciljni
uslovi medijum kulture organizmi
Temp. Atmosfera Vrijeme
- Gangrena krvni agar 35-37 5-10% CO2 40-48h svakodnevno bilo koji
Myonecrosis mikroorganizam
- Nekrotizirajui
fasciitis ENDO 35-37 aerobno 16-24h 16h
- Sve druge agar
udruene
infekcije
Podloga za 35-37 anaerobno 5 dana 40h i petog
anaerobe sa dana
diskom 5 g
metronidazola
Inkubacija
Klinika slika/ Standardni itanje Ciljni
uslovi medijum kulture organizmi
Temp. Atmosfera Vrijeme
Inkubacija
Klinika slika/ Standardni itanje Ciljni
uslovi medijum kulture organizmi
Temp. Atmosfera Vrijeme
* inkubacija se moe produiti do 5 dana, u tom sluaju ploe treba itati nakon 40h i produiti do 5 dana
7.6 Izvjetavanje
Opisati direktni mikroskopski preparat bojen po Gram-u: izvjetava se
nalaz upalnih celularnih elemenata i prisustvo mikroorganizama. Izvjestiti svaki
porast uz odgovarajui komentar. U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti:
Zasijane podloge ostale su sterilne.
7.7 Komentar
Vrsta infekcije
Nekrotizirajui fasciitis
Udruena gangrena
Gasna gangrena
Spontana gangrena
Javlja se nakon blagih trauma tkiva ili bez vidljive povrede kod oboljelih
od karcinoma kolona, leukemije ili neutropenije. Glavni uzronici C. perfringens
i C. septicum.
Pyomiositis
Actinomycosis
Traumatska inokulacija
Mycetoma
8.1 Uzorkovanje
Bris uva uzima se tankim brisom koji se uvlai u uni kanal kroz
sterilan uni lijevak. Una koljka se povlai nagore i unazad kod
odraslih, a kod djece dole i naprijed.
Kod sumnje na otitis media bris se uzima jedino ako postoji
supuracija t.j. perforacija bubne opne. U protivnom se moe uzeti
nazofaringealni bris. Timpanocenteza se rijetko koristi.
Materijal je najbolje uzeti prije uvoenja antibiotske terapije.
8.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
8.3 Zasijavanje
Preporuka je da se primarna obrada uzoraka vri u komori za bezbjedan
rad klase II.
8.3.2 Kultivacija
selektivni okoladni agar za Haemophilus
krvni agar
endo agar (CLED agar)
podloga za anaerobe sa neomycinom i 5 g diskom metronidazola
8.4 Inkubacija
Mogui patogeni:
Streptococcus haemolyticus gr. A, C, G
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Moraxella catarrhalis
Pseudomonas spp.
Haemophilus influenzae
Enterobakterije
Anaerobne bakterije (gram -)
Candida spp.
Aspergillus spp.
8.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora spoljnjeg unog kanala.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 25
9.1 Uzorkovanje
9.3.2 Kultivacija
krvni agar (sa stafilokoknom crtom na razrijeenom dijelu)
selektivni okoladni agar za Haemophilus
endo agar
Dodatno:
ako je u pitanju novoroene i na podlogu za izolaciju Neisseria
gonorrhoeae (VCN okoladni agar)
9.4 Inkubacija
9.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 27
Canaliculitis
Celulitis orbitae
Dacriocystitis
Dacrioadenitis
Keratitis
Endophtalmitis
Hypopyon
Infekcije poslije operacije ili traume
10.1 Uzorkovanje
10.2 Transportovanje
to prije poslati do laboratorije (anaerobi!) Ako je brz transport nemogu:
koristiti transportnu podlogu
10.3 Zasijavanje
10.4 Inkubacija
11 Ispitivanje likvora
11.1 Uzorkovanje
11.2 Transportovanje
11.3 Zasijavanje
11.3.1 Direktan mikroskopski preparat
upotrebiti nova, nekoriena stakla, koja se dre u alkoholu, a prije
upotrebe isperu destilovanom vodom, osue i provuku kroz plamen.
praviti dva preparata: jedan se boji po Gramu, a drugi metilenom
za pravljenje preparata koristiti sediment sa dna epruvete nakon
centrifugiranja (ne razvlaiti kap nanesenu na staklo)
nakon suenja na vazduhu, preparate fiksirati prelivanjem 95-100%
metil alkoholom koji se ostavi na preparatu 1 minut, odlije, a preparat
se ponovo sui na vazduhu. Alternativa je brzo provlaenje preparata
3 puta kroz plamen (nakon toga kada se dodirne rukom poleina
stakla treba da je blago zagrijana - ne vrua)
11.3.2 Kultivacija
modanosrani infuzioni krvni agar sa stafilokoknom crtom
obogaeni okoladni agar
teni Muller-Hinton sa X i V faktorima rasta ili modano-srani
infuzioni bujon sa X i V faktorima rasta - presijava se nakon
inkubacije na modano-srani infuzioni krvni agar sa stafilokoknom
crtom i obogaeni okoladni agar
Prije zasijavanja likvor i podloge se dre u termostatu na 37 C pola
sata.
Zasijavanje se obavlja tako to se sterilnom pipetom ili ezom sa dna
epruvete uzme po jedna kap taloga i nanese na svaku od podloga. Podloge staviti
u termostat da se kap osui, a potom razvui materijal ezom po podlozi.
11.4 Inkubacija
11.6 Izvjetavanje
U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su
sterilne
12.1 Uzorkovanje
12.2 Transportovanje
12.3 Zasijavanje
Krv za hemokulture se dodaje podlozi u razmjeri 1:5 ili 1:10 kako bi se
razblaili postojei antibiotici i druge antibakterijske supstance u uzorku.
Koristiti komercijalne gotove podloge za hemokulture. Mogue je
korienje i podloge za automatizovane sisteme za ispitivanje hemokultura uz
odgovarajuu aparaturu i prema uputstvu proizvoaa.
12.4 Supkultivacija
Pozitivnost hemokulture registrovati prema uputstvu proizvoaa gotove
komercijalne podloge.
Pozitivnu hemokulturu presijati na:
Krvni agar sa stafilokoknom crtom
Podloga za anaerobe sa diskom 5 g metronidazola (na ovu podlogu
presijava se pozitivna boica za anaerobnu hemokulturu)
12.5 Inkubacija
12.7 Izvjetavanje
U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su
sterilne nakon ... dana inkubacije.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 35
13.1 Uzorkovanje
13.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za
briseve:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
13.3 Zasijavanje
Tehnike koje se koriste za dijagnozu lokalne ili sistemske infekcije povezane sa
kanilom ukljuuju:
semikvantitativnu i kvantitativnu kultivaciju segmenata kanile
bujon kultivacija segmenata kanile, posebno vrha
bojenje kanile
kultura krvi aspirirana kroz i.v. kanilu
kultura vora (eng. hub) kanile
kultura mjesta insercije kanile
ultarsonikacija kanile
13.4 Inkubacija
13.6 Izvjetavanje
13.6.1 Kanila
Izvjestiti broj CFU izolovanog mikroorganizma uz napomenu: npr.
porast 15 CFU moe biti povezan sa sistemskom infekcijom u vezi
sa kanilom ili moe biti povrinska kolonizacija ili kontaminacija -
treba uzeti u obzir rezultat hemokulture.
13.6.2 Brisevi
Izvjestiti kakav je intenzitet porasta (masovan, umjeren ili oskudan)
uz napomenu koja e uzeti u obzir da li postoji ili ne lokalna
infekcija.
14.1 Uzorkovanje
14.2 Transportovanje
14.3 Zasijavanje
14.4 Inkubacija
Mogui patogeni:
Salmonella spp.
Campylobacter spp.
Shigella spp.
Yersinia enterocolitica
Escherichia coli O:157; H:7
Clostridium difficile (ispituje se po posebnom protokolu)
Vibrio cholerae (vidi protokol 13.1)
14.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Kulturom nisu izolovane Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp.,
Escherichia coli O:157; H:7, Yersinia enterocolitica.
15 Koprokultura za izolaciju
Vibrio cholerae
Ne radi se u rutinskoj dijagnostici ve prema epidemiolokim indikacijama!
15.1 Zasijavanje
15.2 Inkubacija
15.3 Izvjetavanje
16.1 Uzorkovanje
Optimalno vrijeme je prije primjene antimikrobne terapije.
16.3 Transportovanje
Vrijeme izmeu uzimanja i obrade uzorka:
do 4 h - ako je mogue
do 48 h - propadanje uzorka se izbjegava hlaenjem
do 96 h - uzorak se uzima u sterilan, zatvoren kontejner sa 1-2%
bornom kisjelinom
16.4 Zasijavanje
Preporuene podloge i vrijeme inkubacije dati su u tabeli br.5
Runi metod - kalibrisanom ezom, zasijavanje povrinskim linijama.
paljivo promukati urin da se izbjegne pjenuanje
uroniti kraj sterilne, kalibrisane eze (1l, 2l, 10l) u urin odmah
ispod povrine i izvui vertikalno vodei rauna da ne bude urina van
ome
inokulisati podlogu i razvui, najvie 2 uzorka na ploi prenika 9
cm, ezom od 10 l
Broj bakterija u 1 ml urina (cfu, engl. colonies forming units) se
odreuje prema tabeli br.3
Multipoint metod - SPA, drugi hirurki uzeti urini i urini u kojima se oekuje
manje od 100 cfu/ml
inokulisati 100 l (0.1 ml) uzorka aseptino na cijelu Endo agar
(CLED agar) plou
za izolaciju pojedinanih kolonija, razvui inokulum sterilnom ezom
ili tapiem po cijeloj povrini ploe
cfu/ml = broj poraslih kolonija x10
Broj bakterija u 1 ml urina se odreuje prema tabeli br.3
16.6 Inkubacija
Za situacije:
Susp.
Sabouraud
gljivina 35-37 aerobno 40-48 40 Gljivice
agar
infekcija
MH agar
sa Bacillus
Ispitivanje
subtilis
prisustva
(vie 35-37 aerobno 16-24 16 Antimikrobne supstance
antimikrobnih
uzoraka na
supstanci
jednoj
ploi)
Sterilna Podloga za
35-37 aerobno 40-48 40 Anaerobi
piuria anaerobe
Nema
antimikr.
sredstava okoladni 510 %
35-37 40-48 40 Osjetljivi organizmi
agar CO2
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 45
Ponoviti ako
je uzorak
star ili nema
Vjerovatna piurije.
1 Svi Nema Da
IUT Ako je iz
kese
predloiti
SPA, CCU.
- Mogua IUT
MSU,
- kolonizacija Ponoviti
CCU, Le
ako je loe Da zbog
SCU, Simptomi
uzimanje ili potvrde
Bilo koji BAG,
transport
organizam u
2 broju Ne - uvati Razmotriti
100.000 ili Stalni plou 5 ako pacijent
>10.000 kateter Vjerovatna dana ako ima stalni
>100.000 CSU
Neuroloka kolonizacija pacijent kateter ili
beika postane zahtijeva
septian terapiju
Ponoviti ako
je uzorak
1 organizam
Da, star ili nema
2 predominira u
predomin- piurije
ili broju Svi Nema Mogua IUT
antan Ako je iz
3 >100.000 ili
organizam kese
>10.000
predloiti
SPA, CCU
Mijeani rast
Nepravilno Ponoviti
nema
3 Svi Nema uzimanje ili Ne ako ima
dominantnog
transport simptome
soja
Ponoviti
1 Le Vjerovatno
Svi Da zbog
Simptomi IUT
potvrde
Vjerovatno
10.000 IUT
100.000 Da,
Le predominan-
1 predominan- predomin- Ponoviti ili
2 Svi Simptomi tnom vrstom
tan u 10.000 antni SPA / CCU
Djeca Drugi izolat
organizam
vjerovatno
kontamin-acija
Mijeana
1 u <10.000 ili
kultura,
u 10.000- Vjerovatna
Nema Ne vjerovatno
100.000 ali ne kontamin-acija
kontamin-
dominira
acija
Mijeana
Vjerovatno
Ne uvati kultura
1 predominira Le IUT
Svi ploe do 5 ponoviti ako
u 10.000 Simptomi dominantnim
dana ima
sojem
simptome
3
Stalni Razmotriti
Ne uvati
Sve kateter ako je
Kateter Kolonizacija ploe do 5
kombinacije Neuroloka potrebna
dana
beika terapija
MSU, Vjerovatna
CCU, IUT potrebna Ponoviti da
1 Da
CSU, klinika se potvrdi
ene sa
IL ispitivanja
simptom-
1.000
ima
10.000
Svaka vrsta Prostatitis
Vjerovatna
1000 Le
IUT potrebna Ponoviti da
2 ukljucujuci E. Svi Da
klinika se potvrdi
coli ili
ispitivanja
S. saproph
Vjerovatno
1 Nema Da
IUT
Svaki
SPA, Vjerovatno
100 2 organizam Le Da
CYS, IUT
10.000 100
SCU
Da,
Mijeani
1 organizam Vjerovatno predomin-
3 Le rast,
1000 IUT antan
ponoviti
organizam
Nema ili je
pacijent
Nema IUT
asimptom-
< 1000 ezom atian
Nema od 1 l Pacijent na
Svi
porasta < 100 ezom od Simptom- antibioticima ?
10 l Preporuiti
atski Mogua
dalje
perzisten- Chlamydia
ispitivanje
tna piurija Osjetljivi
organizmi
MSU Srednji mlaz, CCU clean catch, BAG urin iz kese, SPA suprapubicni aspirat, CSU kateter,
SCU jedna kateterizacija CYS cistoskopski urin, Le leukociti, IUT infekcija urinarnog trakta
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 47
17.1 Uzorkovanje
17.2 Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:
koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
17.3 Zasijavanje
17.3.1 Direktan mikroskopski preparat
dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko
od dodatnih bojenja, po potrebi
izvjestiti o postojanju blastospora, leukocita i eventualnom prisustvu
intracelularnih Gram - diplokoka
izvjestiti opisno uoene mikroorganizme
izvjestiti o postojanju clue elija
izvjestiti da li mikroskopski preparat sugerie bakterijsku vaginozu
(BV) na osnovu jedne od dvije eme:
ema po Nugentovim kriterijumima:
BROJ BROJ BROJ
LAKTOBACILA GARDNERELLA MOBILUNCUS
REZULTAT REZULTAT REZULTAT
PO VIDNOM * PO VIDNOM PO VIDNOM
POLJU POLJU POLJU
> 30 0 > 30 4 > 30 4
5 30 1 5 30 3 5 30 3
24 2 24 2 24 2
1 3 1 1 1 1
Nijedan 4 Nijedna 0 Nijedan 0
Fizioloka
I stepen preovladava Lactobacillus (Gram pozitivni tapii)
mikroflora
17.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
17.4 Inkubacija
17.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana fizioloka mikroflora.
18.1 Uzorkovanje
18.2 Transportovanje
18.3 Zasijavanje
18.3.1 Direktan mikroskopski preparat
dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko
od dodatnih bojenja, po potrebi
izvjestiti o postojanju blastospora, leukocita i eventualnom prisustvu
intraceularnih Gram - diplokoka
izvjestiti opisno uoene mikroorganizme
18.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
VCN okoladni agar
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 51
18.4 Inkubacija
Mogui patogeni:
Neiserria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis (obraeno u protokolu za virusoloke i
seroloke analize)
Mycoplasma hominis
Ureaplasma urealyticum
18.6 Izvjetavanje
Ukoliko nije uoen porast mikroorganizama izvjestiti: Zasijane podloge ostale
su sterilne.
19.1 Uzorkovanje
19.2 Transportovanje
19.3 Zasijavanje
19.3.1 Direktan mikroskopski preparat
dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko
od dodatnih bojenja, po potrebi
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 53
19.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
VCN okoladni agar
19.4 Inkubacija
Mogui patogeni:
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis obraeno u protokolu za virusoloke i
seroloke analize
Streptococcus pyogenes
Trichomonas vaginalis
Ureaplasma urealyticum
Mycoplasma hominis
Drugi mikroorganizmi koji mogu biti znaajni:
Streptococcus haemolyticus
Druge streptokoke
Enterococcus spp.
Enterobakterije
Haemophilus spp.
Listeria spp.
Pseudomonas spp.
Staphylococcus aureus, gljivice.
19.6 Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:
Izolovana samo fizioloka mikroflora.
20 Ispitivanje prisustva
genitalnih mikoplazmi
20.1 Uzorkovanje
20.2 Zasijavanje
21.1 Uvod
21.2 Izolacija
21.3 Identifikacija
21.3.1 Kulturelne osobine
Kolonije su okrugle, glatke, sjajne povrine, ravnih ivica, blago
konveksne, pigmentisane, bijele ili krem boje, ponekad ute pa i narandaste,
promjera 1-2 mm, mogu pokazivati hemolizu. Ezom se razmazuju po podlozi
(kao maslac).
SLIKA 2. Staphylococcus
aureus bojenje po Gram-u
Izvor:
http://www.geocities.com/capecana
veral/3504/gallery.htm from Neal
Chamberlain: Photo Gallery of
Bacterial Pathogens
Katalaza test
Stafilokoki su katalaza pozitivni, a streptokoke katalaza negativne. Test se
izvodi sa odabranim bakterijskim kolonijama poraslim na vrstoj podlozi. Ne
treba raditi sa kolonijama poraslim na podlogama koje sadre intaktne eritrocite
(krvni agar). Kolonije sa okoladnog agara mogu se upotrebiti za testiranje.
Reagens je 3-5% hidrogen peroksid. On je nestabilan i treba ga uvati u
friideru. Izbjegavati svako nepotrebno izlaganje svjetlosti.
Izvoenje:
staviti jednu kap hidrogen peroksida na predmetno staklo
mali dio suspektne kolonije nanijeti na centar pokrovnog stakalceta
obrnuti pokrovno stakalce i staviti na kap hidrogen peroksida na
ploici
posmatrati stvaranje mjehuria unutar 10 sek. Koristiti lupu ako je
potrebno za gledanje vrlo slabe produkcije katalaze.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 57
Koagulaza test
Vrste roda Staphylococcus se diferenciraju prema sposobnosti da
koaguliu plazmu pomou enzima koagulaze. Staphylococcus aureus je
koagulaza pozitivan.
Vezana koagulaza se odreuje testom na ploici, a slobodna testom u
epruveti.
Reagensi i oprema: test rastvor komercijalna plazma (sa EDTA) za test
na ploici, odnosno za test u epruveti, bakterioloka oma i Pasterove pipete.
Pozitivna kontrola: Staphylococcus aureus NCTC 6751
Negativna kontrola: Staphylococcus epidermidis NCTC 4276
Izvoenje koagulaza testa na ploici:
Staviti kap destilovane vode na ploicu.
Napraviti suspenziju ispitivanog soja da bude homogena i gusta.
(Lano negativna reakcija se moe dobiti ako suspenzija nije
dovoljno gusta. Pogledati da nema autoaglutinacije. Sojevi koji
pokazuju autoaglutinaciju moraju biti testirani drugim metodama.)
Uzeti ezom plazmu i izmijeati je lagano sa homogenom
suspenzijom.
Pozitivan rezultat vidljivo stvaranje grudvica unutar 10 sek.
Negativan rezultat nema vidljivog stvaranja grudvica.
Postoje komercijalni kitovi koji sadre npr. lateks estice senzibilisane sa
IgG (monoklonsko anti-Staph. aureus antitijelo) i eritrocite obloene humanim
fibrinogenom. Staphylococcus aureus u ovoj suspenziji se proteinom A vezuje
za Fc fragment IgG na povrini lateks estica, a clumping faktorom reaguje sa
fibrinogenom na povrini eritrocita. Ovo dovodi do pojave grudvica, odnosno
aglutinacije. Test je zbog navedenog osjetljiviji od klasinog koagulaza testa na
ploici.
Izvoenje koagulaza testa u epruveti:
Staviti u epruvetu oko 1 ml komercijalne plazme pogodne za ovaj
test.
Suspendovati ispitivanu koloniju u plazmi.
Inkubirati na 35-37C i oitavati nakon 4 h.
Uoiti koagulum koji zahvata itav sadraj epruvete ili formira
slobodnu opnu fibrina. Ako je negativan, inkubirati preko noi na 22-
25C.
Pozitivan rezultat: stvaranje koaguluma unutar 4h na 37C ili nakon
inkubacije preko noi na 22-25C.
Negativan rezultat: nema koaguluma nakon 4h odnosno 24h.
Kod negativnog koagulaza testa na ploici obavezno uraditi test u
epruveti!
Novobiocin test
Koristi se u diferenciranju Staphylococcus saprophyticus (novobiocin
rezistentan) od ostalih koagulaza negativnih stafilokoka (novobiocin senzitivni).
22.1 Uvod
Rod Streptococcus obuhvata heterogenu grupu Gram pozitivnih, katalaza
negativnih koka koje su odgovorne za brojne infekcije kod ovjeka, a takoe su i
dio fizioloke mikroflore.
Najznaajnije vrste izazivai oboljenja kod ovjeka:
Streptococcus haemolyticus (BHS) gr. A, B, C, G
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus anginosus grupa: Streptococcus anginosus,
Streptococcus constellatus i Streptococcus intermedius
Streptococcus bovis
Viridans streptokoki (Streptococcus mutans, Streptococcuas
sanguis, Streptococcus mitis i dr.)
Enterococcus faecalis (od 1984. izdvojen iz streptokoka u
poseban rod Enterococcus zajedno sa Enterococcus faecium)
22.2 Izolacija
22.3 Identifikacija
22.3.1 Kulturelne osobine
Kolonije su sitne, sivkaste ili prozrane, konveksne i kompaktne. Kolonije
Streptococcus pneumoniae imaju centralno udubljenje (zbog aktivacije
autolizina). Neki sojevi zahtijevaju za rast prisustvo ugljen dioksida.
Na krvnom agaru streptokoki pokazuju jedan od tri tipa hemolize:
Alfa zelenkasta zona hemolize oko kolonija zbog djelimine destrukcije
eritrocita i redukcije hemoglobina u eritrocitima (Streptococcus pneumoniae i
veina viridans streptokoka, Enterococcus spp.)
Katalaza test
Bacitracin test
Osjetljivost na trimethoprim/sulfamethoxasol
Optohin test
Hidroliza eskulina u 40 % ui
Rast u prisustvu
/ / / + - - -
6.5% NaCl
* Objanjenje tabele:
Uoiti suspektne kolonije na hranljivim podlogama i definisati tip hemolize.
Napraviti preparat sa kulture (Gram-pozitivni koki) i katalaza test (negativan).
64 Nacionalne smjernice dobre klinike prakse
22.4 Komentar
Seroloka klasifikacija streptokoka je zasnovana na antigenim razlikama
polisaharidnog antigena elijskog zida (C supstanca ili grupni karbohidratni
antigen) i dijeli streptokoke na grupe. Od medicinskog znaaja su grupe: A, B,
C, D, F i G. Streptococcus pneumoniae nema grupni antigen.
Viridans streptokoki je termin za alfa-hemolitike streptokoke koji su
takoe bez grupnih antigena.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 65
23.1 Uvod
23.2 Izolacija
23.3 Identifikacija
24 Identifikacija enterobakterija
24.1 Uvod
Familija Enterobacteriaceae ini veliku grupu razliitih mikroorganizama.
Opisano je 32 roda sa preko 130 vrsta. Glavne osobine lanova ove familije:
Gram negativni bacili, asporogeni, fakultativni anaerobi
Fermentuju glukozu,
Redukuju nitrate do nitrita
Ne produkuju citohrom oksidazu
Svi lanovi su pokretni, osim bakterija iz rodova Klebsiella i Shigella.
Yersinia spp. su pokretne na 18-25oC, ali ne i na 37oC.
24.2 Izolacija
24.3 Identifikacija
24.3.1 Kulturelne osobine
Endo agar / MacConkey agar - sadre laktozu kao izvor ugljenih hidrata,
organizmi koji fermentuju laktozu stvaraju kolonije roze do crvene boje (laktoza
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 69
Salmonella
Shigella
Yersinia enterocolitica
25.1 Uvod
Nefermentujui gram negativni bacili imaju sve vei kliniki znaaj zbog
poveanja broja imunokompromitovanih pacijenata.
Faktori rizika za infekciju ovim mikroorganizmima su: imunosupresija
(diabetes mellitus, cancer, transplantacija organa, hormonalni poremeaji),
traume, opekotine, vjetaki implantati.
Ovo je veoma heterogena grupa bacila, jedina zajednika osobina je
nereaktivnost na Kligler-ovom eeru /trostrukom eeru.
25.2 Izolacija
25.4 Komentar
Definitivna identifikacija nefermentujuih bacila zahtijeva vrijeme i
novac, a esto i ne odgovara dijagnozi bolesti. Odluka da se identifikuje
organizam do vrste, zavisi od materijala iz koga je izolovan:
a) da li je izolovan iz materijala koji je primarno sterilan,
b) ili iz primarno nesterilnog materijala, zajedno sa tri ili etiri bakterije.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 73
Nereaktivnost na
Kligler-ovom
eeru
26.1 Uvod
26.2 Izolacija
26.3 Identifikacija
26.3.1 Kulturelne osobine
26.5 Izvjetavanje
26.6 Komentar
26.6.1 HACEK grupa organizama
Za razlikovanje HACEK grupe organizama od kliniki brojnih,
morfoloki slinih, aerobnih ili fakultativno anaerobnih Gram negativnih tapia,
uglavnom udruenih sa endokarditisom i infekcijama normalno sterilnih
materijala, potreban je sistematski pristup. HACEK grupa mikroorganizama su
komensali orofaringealnog/respiratornog trakta. Identifikacija je udruena sa
klinikim detaljima i izolati se dalje identifikuju, ako je kliniki indikovano.
Izolati kliniki znaajnih HACEK organizama se alju referentnoj laboratoriji.
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Cardiobacterium hominis
Eikenella corrodens
Kingella spp.
27.1 Uzorkovanje
27.2 Transportovanje
27.3 Izolacija
27.4 Identifikacija
27.4.1 Kulturelne osobine
Kolonije sitne (oko 1,5 mm), glatke, sjajne, jako konveksne, srebrenaste
(kao kapi ive)
27.6 Izvjetavanje
28.1 Izolacija
28.2 Identifikacija
28.2.1 Kulturelne osobine
Slivene, sjajne kolonije, prozirne ili lagano bjeliasto-sive. Ivice nisu
jasne i stapaju se sa podlogom.
SLIKA 11. Tipian mikroskopski izgled Campylobacter spp. -galeb u letu ili slovoS
Izvor: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch023.htm
29 Identifikacija Corynebacterium
diphteriae, Corynebacterium ulcerans,
Corynebacterium pseudotuberculosis
29.1 Uzorkovanje
29.1.1 Uzorci za ispitivanje
bris koe
bris grla i nosa
bris nazofarinksa
ako su prisutne membrane sa ivice membrane
29.2 Transportovanje
29.3 Izolacija
Za obradu uzoraka izolaciju i identifikaciju obavezno koristiti komoru za
bezbjedan rad nivoa zatite II.
Bris koe:
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 83
29.4 Identifikacija
29.4.1 Kulturelne osobine
Corynebacterium diphteriae
Hoyles teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije
var. gravis: mat povrine, trone, suve, kidaju se u manje segmente kad se
uzimaju ezom, radijalno su izbrazdane, nepravilnih ivica (na krvnom agaru:
nehemolitine)
var. mitis: glatke, sjajne povrine, jasno oiviene (na krvnom agaru: mala
zona hemolize)
var. intermedius: sjajne, diskretno prozirne (na krvnom agaru: mala zona
hemolize)
var. belfanti: glatke, sjajne povrine (na krvnom agaru: mala zona
hemolize)
Corynebacterium ulcerans
Hoyle's teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije, veoma suve (na
krvnom agaru: mala zona hemolize)
Corynebacterium pseudotuberculosis
Hoyle's teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije, veoma suve (na
krvnom agaru: hemoliza)
30.1 Uzorkovanje
30.2 Transportovanje
30.3 Izolacija
30.3.1 Direktan mikroskopski preparat
Preparat bojen po Gram-u prikazuje tip i relativan broj
mikroorganizama i elija domaina. Takoe moe sugerisati upotrebu
odgovarajuih podloga i pomoi kliniaru u odreivanju terapije prije
zavrene kultivacije.
30.3.2 Kultivacija
Podloga za anaerobe sa 5 g diskom metronidazola - u anaerobnoj
atmosferi, 35 - 37 C, 48 h
Sve procedure zavriti za to krae vrijeme.
Preporuuje se uporedo aerobna kultivacija - krvni agar - aerobno,
35-37C, 18-24 h
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 87
30.4 Identifikacija
30.5 Komentar
Anaerobne infekcije su najee mijeane infekcije, tj. uz anaerobne
bakterije kao uzronici se javljaju fakultativno anaerobne i aerobne bakterije.
Najee izolovane anaerobne bakterije iz humanih uzoraka su: Bacteroides
fragilis, Prevotella melaninogenica, Fusobacterium, Actinomyces,
Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus,
Veillonella.
Od znaaja su i kliniki znaci koji ukazuju na moguu anaerobnu
infekciju: prisustvo gnoja neprijatnog mirisa, gas u tkivu (krepitacije), lokacija
infekcije u blizini povrine sluzokoa, prisustvo sulfatnih granula itd.
31.3 Inokulum
Izbor antibiotika
Tumaenje rezultata
Izvjetavanje
Izbor antibiotika
Tumaenje nalaza
Izvjetavanje
Izbor antibiotika
Tumaenje nalaza
Izvjetavanje
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 93
Izbor antibiotika
Tumaenje nalaza
Izvjetavanje
31.5.5 Enterobakterije
Izbor antibiotika
Tumaenje nalaza
Izvjetavanje
Izbor antibiotika
Tumaenje nalaza
Izvjetavanje
Izbor antibiotika
Tumaenje rezultata
Izbor antibiotika
Izvjetavanje
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 97
31.6 Inkubacija
Zasijane podloge sa postavljenim diskovima antibiotika se inkubiraju 18
24 h na odgovarajuoj temperaturi (uglavnom 35-37C) u aerobnim,
mikroaerofilnim ili anaerobnim uslovima, zavisno od vrste bakterija koje se
ispituju (tabela br.11). Ploe su okrenute poklopcem na gore.
32 Identifikacija -laktamaza
proirenog spektra
32.3.2 E-test
Podloga za anaerobe
34 Literatura
1. Bradbury S.M. Collection of urine specimens in general practice-to clean or
not to clean? J R Coll Gen Pract 1988; 38: 363-365.
2. Cheesbrough M. Collection and transport of specimens. Examination of
specimens. In: Medical laboratory manual for tropical countries.
Cheesbrough M. Ed. 100-199. Butterworth-Heinemann Ltd. Cambridge,
1993.
3. Health Protection Agency. National Standard Method. http://www.hpa-
standardmethods.org.uk/
4. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C.
The role of the mycrobiology laboratory in the diagnosis of infectious
diseases: guidelines to practice and management. In: Diagnostic
microbiology. Winters R. Ed. 1-15. J.B.Lippincott Company, Philadelphia,
1992.
5. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C.
Guidelines for collection, transport, processing, analiysis, and reporting of
cultures from specific specimen types. In: Diagnostic microbiology. Winters
R. Ed. 61-104. J.B.Lippincott Company, Philadelphia, 1992.
6. Kunin C.M. Detection, prevention and management of urinary tract
infections: A manual for physician, nurse and allied health worker. 2nd ed.
Lea and Febriger, Philadelphia, 1974.
7. Mahon C.R., Manuselis G. Laboratory diagnosis of gastrointestinal
pathogens. In: Diagnostic microbiology. Fabion K. Ed. 965. Saunders,
Philadelphia, 2000.
8. Pelemi M.R., Lavadinovi L. Antimikrobna terapija gram negativnih
infekcija. U: Antibiotici 2001. Prostran M. Ed. 231-275. Zavod za
udbenike i nastavna sredstva, Beograd, 2001.
9. Radna Grupa za standardizaciju metodologije i interpretacije rezultata
antibiograma, Srpsko lekarsko drutvo-Mikrobioloka sekcija. Izmene i
dopune Prirunika za izradu antibiograma, Institut za imunologiju i
virusologiju Torlak, Beograd, 2001.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI 105
www.mzd.gov.me