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SEMINARIO 2. Diagnstico de mutaciones y deteccin de polimorfismos.

Eleccin del mtodo diagnstico

Una vez que llegamos a la conclusin de que una enfermedad est producida por una causa gentica hay que
demostrarla eligiendo para ello un mtodo adecuado. A la hora de seleccionar un mtodo diagnstico
debemos considerar varias caractersticas para seleccionar el ms adecuado:

- Validez: es la capacidad de una prueba para diferenciar a los individuos con la enfermedad de los que
no la tienen.
- Sensibilidad: capacidad para identificar correctamente a los afectados por la enfermedad (verdaderos
positivos)
- Especificidad: capacidad para identificar correctamente a los individuos sin la enfermedad
(verdaderos negativos)

Pruebas genticas posnatales

Actualmente se realizan una serie de pruebas de screening, como la prueba del taln en los recin nacidos,
mediante la cual se les pincha y se hace un cribado de enfermedades ya tipificadas en las que se buscan
mutaciones reconocidas. Suelen ser enfermedades metablicas cuyo diagnstico temprano cambia el
pronstico al tomar medidas a tiempo. Se incluyen dentro de este cribado en recin nacidos enfermedades
como:
Hipotiroidismo Galactosemia
Fenilcetonuria
Hemoglobinopatas
Hiperplasia suprarrenal
Auditivo

Adems, en funcin de la raza de los progenitores se proceder al cribado de determinadas enfermedades


por la alta prevalencia de heterocigotos para los genes responsables en estas poblaciones:
Tay-Sachs en judos asquenazes (judos que vivan en Rusia y Polonia), donde haba gran
consanguinidad. Es una enfermedad consistente en el acmulo de ganglisidos en las neuronas.
Talasemias en todos los grupos tnicos
Drepanocitosis en poblacin afroamericana
Fibrosis qustica en individuos con ascendencia europea, como sabemos es la enferemedad
gentica con mayor nmero de portadores en Europa.

Por ltimo, hay pruebas presintomticas que se realizan en familias con historia de una determinada
patologa.

Para determinar una mutacin conocida debemos conocer la secuencia o parte de la secuencia del

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Diagnstico directo de mutaciones

Mtodos de barrido: Informan de si el paciente padece o no la una mutacin. Estos mtodos son capaces
de diagnosticar anormalidades en los genes, pero no nos informan sobre el tipo de anormalidad concreto,
por lo que no podremos valorar la gravedad de la mutacin.
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
DHPLC (Denaturing HPLC: Cromatografa Lquida Desnaturalizante de Alto Rendimiento)
Rotura de desemparejamientos
PTT (Protein Truncation Test)
Secuenciacin

SSCP Y SECUENCIACIN son las tcnicas ms utilizadas

Mtodos de comprobacin: a diferencia de las anteriores, estas tcnicas indican el problema exacto que
provoca esa mutacin: falta un exn, fallo en la lectura, etc. Se emplean cuando ya sabemos que hay una
mutacin en un gen conocido.
- PCR- digestin
- ASO (Allele Specific Oligonucleotide)
- ARMS ( Amplification Refractory Mutation System)
- OLA (Oligonucleotide ligation Assay)
- MLPA (Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification)
- FISH (Fluorescence In Situ Hybridation). Para el estudio de cromosomas

Mtodos de deteccin indirecta. Mediante anlisis de ligamiento.

Estudio de marcadores especficos que nos permitan identificar cul cromosoma de los progenitores es el
que lleva la mutacin
Determinar qu cromosomas han heredado los hijos, para predecir la probabilidad de que tambin hayan
heredado la mutacin

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MTODOS DE BARRIDO
1) Tcnica SSCP (Anlisis de conformacin de cadena sencilla)

La tcnica de SSCP diferencia alelos de igual tamao que se diferencian en un nmero pequeo de nucletidos,
incluso aunque sea una nica pareja de nucletidos. Se fundamenta en los cambios de conformacin que
presentan dos cadenas sencillas de ADN que difieren entre s en un nico nucletido. El mtodo es muy
resolutivo y su aplicacin es tcnicamente simple. Este anlisis no nos dice de qu tipo de mutacin se trata,
pero nos permite descartar la presencia de mutaciones rpidamente, lo que ahorra tiempo y recursos.

Un cambio en la secuencia provoca cambios conformacionales cuando el ADN se desnaturaliza (se separan las dos
cadenas) y se deja que cada cadena se repliegue por separado. Estos cambios conformacionales se detectan porque
alteran la migracin electrofortica en geles de poliacrilamida no-desnaturalizantes. En el ejemplo tpico, se amplifica un
exn mediante PCR, se desnaturaliza el producto de PCR por calor, se cargan los productos desnaturalizados en un gel de
acrilamida, se realiza la electroforesis y se tie el gel mediante una tincin especfica para el ADN (tincin de plata, por
ejemplo). Si no hay mutaciones, se detectarn nicamente las bandas correspondientes al homodplex (resultado de la
reasociacin parcial de las dos cadenas complementarias durante la electroforesis) y las bandas correspondientes a cada
una de las cadenas sencillas que se han replegado adoptando una conformacin determinada. En cambio, la presencia
de una mutacin dar lugar a nuevas bandas debidas al patrn de plegamiento de las cadenas sencillas mutantes, que
ser diferente al de las cadenas nativas INTERNET

Bajo ciertas condiciones, los cidos nucleicos monocatenarios adoptan estructuras tridimensionales secundarias en
solucin. Estas estructuras varan dependiendo de la composicin de las bases y pueden resultar alteradas por el cambio
de una nica base. Esto hace que, si existe mutacin en el ADN estudiado, la estructura tridimensional que adopta ste
sea diferente de la que adopta el ADN normal de control, por lo que las bandas obtenidas en la electroforesis de ambos
productos sern diferentes NTERNET

En la figura se representa, un ejemplo de aplicacin de esta


tcnica en la deteccin de una variacin polimrfica del
recepto de la vitamina D.

Dicho polimorfismo, altera la diana de restriccin del enzima


Bsml, al cambiar la secuencia ACATTC (alelo B), por GCATTC(
alelo b).

Mediante oligonucletidos sintticos que limitan el locus


polimrfico, se obtienen fragmentos de ADN. Los productos
de amplificacin, se desnaturalizan para obtener cadenas
sencillas de ADN.

El patrn de bandas obtenido ser distinto en funcin del


genotipo del paciente:

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Homocigoto para la secuencia correspondiente a la diana (BB): se obtienen dos bandas de cadena
sencilla correspondientes a cada una de las cadenas sencillas complementarias, y una banda localizada
en la parte inferior correspondiente a la cadena doble no desnaturalizada.
Homocigoto para el alelo b (bb): aparece el mismo nmero de bandas pero en distinta posicin por
diferir en un nucletido.
Heterocigoto (Bb) : presentar una banda procedente de la cadena doble no desnaturalizada, y cuatro
bandas correspondientes a las cuatro cadenas sencillas.

En muchas ocasiones, hay ms de una mutacin, un conjunto de stas son las que causan la enfermedad.
Cuando estudiamos un conjunto de mutaciones decimos que hacemos un screening de mutaciones de dicho
gen. As, tenemos una serie de paneles para cada tipo de enfermedad (panel de retraso mental, panel de
hemoglobinopatas...). Para ello tambin se usa el SSCP.

Hay distintas formas de abordar el screening, en funcin del tamao y nmero de mutaciones descritas. En
ocasiones, es muy laborioso por lo que se estudiaran solamente las mutaciones ms frecuentes.

2) Secuenciacin

Consiste en secuenciar los genes letra a letra. Hoy en da con la aparicin de equipos fluorescentes
automatizados y con bajo coste por reaccin la secuenciacin directa de productos de PCR, es un mtodo cada
vez ms popular para la deteccin de mutaciones.

Con este mtodo obtenemos una lectura de la secuencia real y eliminamos artefactos debido a digestiones
parciales.1

1 Cuando realizamos una digestin parcial con una determinada endonucleasa de restriccin, la reaccin se lleva a cabo en unas
condiciones tales que el enzima corta en uno de cada 50 sitios de reconocimiento. De esta forma, simplemente por azar, si tenemos
una molcula de ADN con 50 sitios de corte, cada vez la endonucleasa cortar por un punto diferente. Una vez marcado nuestro ADN
en el extremo 5 con P32, realizamos una digestin parcial con una endonucleasa, de esta forma se generan fragmentos de ADN de
longitudes diferentes que tienen en un extremo la secuencia de corte de la endonucleasas. Estos fragmentos se pueden separar
mediante electroforesis en geles de agarosa por sus tamaos, de forma que los segmentos pequeos migran ms rpidamente que
los grandes.
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En la figura superior, podemos ver una mutacin detectada mediante secuenciacin en el nuclotido 97 del
fragmento, cuya secuencia normal, se representa en el electroferograma superior. Debajo de l, vemos la
secuenciacin de una muestra de un paciente con dos picos (timina y citosina), en esa posicin.

La herramienta informtica detecta automticamente este tipo de alteraciones y nos alerta sobre la presencia
de una posible mutacin (figura inferior)

Dentro de la secuenciacin del ADN, hoy en da la tcnica ms destacada es:

SECUENCIACIN MASIVA O NGS (NEXT GENERATION SECUENCY): El lanzamiento en 2005 de la primera


plataforma de secuenciacin masiva marc el comienzo de una nueva era de anlisis genmico de alto
rendimiento, transformando la investigacin biomdica tanto en tiempo como en resultados.

Esta sofisticada tecnologa permite secuencia regiones codificantes del genoma (exoma), metiilomas o
genomas completos en plazos inalcanzables hace unos aos con las tcnicas convencionales.

Su objetivo es aumentar la deteccin de las causas genticas de las enfermedades, identificando nuevos
mecanismos patognicos y contribuyendo al desarrollo de nuevas alternativas diagnsticas y teraputicas. Es
la tcnica que ms se est utilizando para secuenciar genes involucrados en cnceres, diagnstico neonatal

Es un aparato capaz de secuenciar un exoma o introma completo con paneles de 300/400 genes en unos das
o una semana.

Tradicionalmente, la secuenciacin del genoma se ha realizado mediante el mtodo Sanger, donde se realizan
reacciones de PCR en presencia de un dideoxinucletido. ste es como cualquier ADN, pero no tiene el grupo
hidroxil 3', por lo que una vez que se aade al final de una cadena de ADN no tiene forma de continuar su
crecimiento. Los dideoxinucletidos son molculas similares a los nucletidos, pero les falta el grupo - OH, lo
que impide que otros nucletidos se unan a l, deteniendo la replicacin del ADN.

Para secuenciar el ADN, se hace la reaccin en presencia de pequeas cantidades de los 4 terminadores
dideoxi. Luego, se usa un gel para separar los resultados y a partir de l se lee la secuencia, usando el cdigo
de colores. Con la aparicin de la NSG todo este proceso se ve enormemente simplificado.

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MTODOS DE COMPROBACIN

1) PCR-Digestin
La PCR es una tcnica mediante la que obtenemos copias de una secuencia especfica de ADN mediante una
reaccin en cadena de la ADN polimerasa.
Las ADN polimerasas son las enzimas que llevan cabo la replicacin del ADN. Para ello, precisa de una molcula
de ADN de cadena sencilla que acte como molde y un cebador (de 15-20 aa) de secuencia complementaria a
la cadena a sintetizar.
En primer lugar, tendremos que incrementar la temperatura por encima de los 90 para obtener cadenas
sencillas de ADN, que actuarn como molde en la reaccin de amplificacin. Para favorecer el apareamiento
del cebador con su secuencia, bajaremos la temperatura, a la cual el cebador se aparear con su secuencia
complementaria. As, usando como anclaje al cebador apareado, la ADN polimerasa iniciar la extensin de la
cadena. El ciclo se reiniciar nuevamente con la desnaturalizacin por calor de la molcula recin sintetizada.

La variante PCR-digestin tiene su fundamento en el hecho de que la mutacin crea o destruye una diana de
restriccin. No es ms que una PCR normal, con la digestin de uno de sus productos mediante enzimas de

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restriccin. Presenta la limitacin, de que lgicamente no todas las mutaciones alteran una diana de
restriccin.
Para aplicar la tcnica se obtienen oligonucletidos que limitan la mutacin y mediante PCR se obtienen
millones de copias de dicha regin.
Posteriormente, los fragmentos
amplificados, se ponen en presencia de la
enzima de restriccin.
Si el ADN proviene de un individuo
afectado, todos los fragmentos tendrn la
secuencia que no es reconocida por la
enzima de restriccin, y por lo tanto la
digestin no altera su tamao.
En los heterocigotos, los fragmentos
amplificados sern de dos clases: con la
secuencia diana (ms pequeos) o sin ella
(ms grandes)
Enzimas de restriccin: las enzimas de
restriccin con protenas que reconocen secuencias concretas del ADN denominadas dianas de restriccin y
tienen actividad endonucleasa( cortan la doble hlice del ADN). Este tipo de enzimas tienen una marcada
especificidad, de modo que el cambio de un solo nucletido en la secuencia diana, produce la prdida de
reconocimiento.

Ejemplo : deteccin de una mutacin que altera una diana de restriccin ( sin usar PCR)
La anemia falciforme es una enfermedad autosmica recesiva, con una alta prevalencia en determinadas
regiones, que cursa con hemates muy frgiles, de modo que requieren frecuente transfusiones.
Los pacientes afectados presentan en homocigosis la sustitucin de una glutamina por una valina en el tercer
aa de la -globina. Dicha mutacin, se corresponde con una cambio de una adenina por una timina en el codon
6, que a su vez altera la diana de restriccin para la enzima Mstll.

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Tal y como se ve en la figura adjunta, la secuencia normal del gen de la -globina, en los codones 5,6 y 7 es
CCT- GAG- GAG. e incluye la diana para la enzima de restriccin CCTGAGG. Dicha diana se pierde con la
mutacin comentada anteriormente al pasar a ser CCTGTGG.
Vemos en la representacin que existen dos diana para la misma enzima una a 1.2 kb y otra a 0.2 kb. Para
estudiar la mutacin, podemos separar los fragmentos en un gel de agarosa, y usar una sonda complementaria
al fragmento de 1.2 kb, de modo que podremos detectar los fragmentos, que tengan secuencia
complementaria a la sonda.
Homocigoto sano ( Wild type): el nico fragmento que ser detectado por la sonda ser el de 1.2 kb.
Heterocigoto ( portador) : detectaremos dos fragmentos , el de 1.2 kb y el de 1.4 kb.
Homocigoto enfermo : solo detectaremos el fragmento de 1.4 kb, ya que no hay diana de restriccin
y el fragmento es ms grande.

2) ASO (oligonucletido especfico de alelo)

Se basa en la tcnica anterior, pero en vez de secuencias de corte, se diagnostican los cambios de nucletidos.
Hoy en da se usa poco. Se emplea cuando la mutacin que produce la enfermedad no altera los lugares de
corte de ninguna enzima de restriccin conocida.

Se basa en el diseo de sondas especficas para el alelo mutado y para el alelo nativo, utilizando
oligonucletidos . El ADN de los pacientes puede ser tanto ADN genmico como un exn amplificado mediante
PCR.

Posteriormente se colocan en unas membranas donde el ADN hibridar con su sonda 2 complementaria
correspondiente. El anlisis de esta hibridacin, permite identificar si la muestra contiene un solo alelo mutado
(heterocigoto), dos alelos mutados (homocigoto enfermo) o dos alelos normales (homocigoto sano).

Ejemplo

La fibrosis qustica (CF) es una grave enfermedad hereditaria con un alta incidencia. Se han descrito numerosas
mutaciones del locus CF, siendo la ms frecuente la deleccin de tres nucletidos (CTT), que supone la prdida
del aminocido 508 de la protena CFTR ( mutacin A508). Esta mutacin es muy frecuente, por lo que se han
puesto en marcha mtodos de deteccin directa de la misma.

El mtodo consiste en el diseo de oligonuclotidos con la secuencia correspondiente a cada uno de los alelos
descritos para la fibrosis qustica, incluyendo como control la secuencia normal.

De cada mutacin, se dispone de la secuencia de cebadores que permite amplificar el exn correspondiente.
Seguidamente, se hibridan con el ASO correspondiente a cada mutacin y a su control normal, marcados
previamente con fluorescencia o radioactividad.

2Fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeo tamao (normalmente entre 100 y 1000 bases) usado en biologa molecular
como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual.
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El paciente 1 es heterocigoto para la mutacin
A508, pues da positivo para el ASO del alelo
normal de todas las mutaciones y tambin para el
ASO del alelo A508.

El paciente 2 es homocigoto para la mutacin


A508, pues solo obtenemos seal positiva para el
ASO del alelo A508.

Los pacientes 3.4 y 5


son heterocigotos compuestos para las
mutaciones A508- W1282X ; A508- R177H y A508
- R543X respectivamente.

El paciente 6, da negativo para las cuatro


mutaciones estudiadas ya que la enfermedad
puede deberse a una mutacin distinta a las
estudiadas.

3) FISH

Esta tcnica consiste en colocar unas sondas sintticas fluorescentes en una muestra de ADN desnaturalizado
que consisten en secuencias complementarias a zonas especficas de determinados cromosomas a las cuales
se unirn y permitirn su bsqueda por microscopio de fluorescencia. Esto permite detectar rpidamente
aneuploidas, duplicaciones, inversiones, microdelecciones o utilizar las sondas como marcador de un
cromosoma.

Ejemplo: Sndrome de Prader- Willi Vemos como la sonda falta en los cromosomas 15

El sndrome de Prader-Willi es causado por la carencia de un gen en parte del cromosoma 15. Se sabe que hay
ms de un gen comprometido, que se sitan en el rea del brazo largo del cromosoma 15, en un rea llamada
15q11-13. Este sndrome tiene una gentica muy complicada

Deleccin paterna: es la forma ms comn, en la que parte del cromosoma del nio heredado del
padre est ausente.
Cuando una deleccin de la regin 15q11-q13 se encuentra en el cromosoma 15 de la madre, el
resultado es un sndrome totalmente diferente llamado sndrome de Angelman (AS). Esto es as
porque tambin hay un gen en la regin de Prader-Willi, que est impronta, o apagado, en el
cromosoma 15 de la madre; personas que carecen de este gen de su madre tienen AS lugar de PWS.
Este descubrimiento explica los misteriosos casos de personas que tenan una deleccin del
cromosoma 15, pero que no tienen las caractersticas de PWS.

Disoma uniparenteral materna (DUP): en esta forma menos comn, el beb hereda ambas copias
del cromosoma 15 de unos de los progenitores, la madre. En estos casos, el beb comienza el
desarrollo con 3 copias del cromosoma 15, pero a lo largo del desarrollo uno de esos cromosomas se
pierde (el del padre). El resultado tiene el mismo efecto que en el caso anterior, ya que el nio no
tiene los dos o ms genes imprentados que deben provenir del padre para que se expresen. Aunque

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existen dos copias del cromosoma 15 de la madre, los genes de la regin SPW estn programados
para no actuar o expresarse cuando provienen de la madre.

Mediante la tcnica de FISH se puede diagnosticar este sndrome. Para ello se usan 3 sondas, un control
(PML), otra para el centrmero del cromosoma 15 y por ltimo otra con para la regin 15q11-13

Imagen FISH (hibridacin fluorescente "in situ") para el cromosoma 15 con el marcador del locus SNRPN en la
regin 15q11-q13. Se identifican asimismo otros dos puntos fluorescentes: D15Z1 para 15p y pml para la zona
distal de 15q. No se detectan dficits de fluorescencia en SNRPN y por tanto se excluye un S. de PraderWilli
por deleccin.

Esta tcnica se usa mucho para detectar cnceres slidos y dermatolgicos, ya que permite aclarar
reordenamientos cromosmicos no claros.

CASOS CLNICOS

Caso 1:
Orla OReilly, que est casada con Raymond, ha llevado gafas por miopa severa desde que era nia. Slo mide
150 cm de estatura. Su hermano Oliver es tambin bajo y miope, y naci con paladar hendido. l tambin
lleva audfonos. Ambos se parecen a su padre, que es bajo y fornido, y ha necesitado recientemente una
prtesis bilateral de caderas. Cuando tena 35 aos fue sometido a ciruga por un desprendimiento de retina
en un ojo y un tratamiento con lser para prevenir un desprendimiento en el otro ojo.

Orla fue a un chequeo mdico por un seguro y mencion que haba padecido algn dolor de caderas. El mdico
que le hizo la revisin haba estado en un curso de gentica y, antes de hacer la historia familiar, pens que
podra haber una conexin entre los problemas mdicos de Orla y los de Oliver y los de su padre. Por ello la
remiti a una clnica gentica.

All a Orla le hicieron un detallado examen que inclua un test de ojos en el cual, adems de la miopa, mostr
que ella tena una retinopata con entramado paravascular. El mdico tambin observ que tena la nariz
corta con un puente nasal plano y articulaciones nudosas.

El mdico dijo a Orla que sospechaba que pudiera tener una enfermedad llamada sndrome de Stickler. Esta
enfermedad es debida a una mutacin en los genes que codifican componentes del tipo II o del tipo IV del
colgeno.

Miopa severa, problemas de cadera y baja estatura.

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Hermano y padre con sntomas similares
Tras anlisis mdico se detectan problemas en la retina tambin presentes en el padre y una
fisionoma caracterstica (nariz y articulaciones)

Cuando sospechemos de una enfermedad de posible causa gentica, no debemos remitirlo al genetista sin
ms, sino que debemos orientarlo sobre nuestras sospechas para saber qu buscar. En este caso el mdico
sospechaba que pudiese tratarse de un sndrome de Stickler.

El sndrome de Stickler, se hereda de forma autosmica dominante y es caracterstico de personas que tienen una
mutacin en el colgeno tipo II y a veces tipo IX. El colgeno es la mayor protena estructural del cuerpo humano,
de modo que tiene una gran variedad de funciones, principalmente en el tejido conectivo. Hay al menos 19
colgenos humanos distintos, codificados por al menos 30 genes. El nmero de genes es mayor que el nmero de
colgenos porque cada colgeno es un trmero de tres cadena polipeptdicas ovilladas en una triple hlice. Las
fibras que forman el colgeno tipo II, son la estructura principal de las protenas del cartlago, y tambin son
importantes en el vtreo del ojo y en el interior del odo. Adems, puede causar condrodisplasia.

El colgeno II es un homotrmero de polipptidos codificados por el gen COL2A1 (tambin es el gen que da la
osteognesis imperfecta) el cromosoma 12q13. Este gen tiene 53 exones, de los cuales los exones 8-49 codifican
la regin triple helicoidal. La mutacin de Orla podra estar en cualquiera de estos lugares. Los cambios fuera de
esta regin no estn asociados con su fenotipo. Dado que los genes del colgeno tienen muchos exones, el cribado
de mutaciones es muy laborioso y est disponible solo en laboratorios especializados.
En este caso, la secuenciacin de la PCR- amplificado del exn 40 revel un nico nucletido deleccionado.

Lo importante de este texto es que en un exn se detecta que falta un nucletido gracias a la PCR.
Qu consecuencia molecular puede tener la deleccin de un nucletido?
En primer lugar, debemos comprobar si la mutacin encontrada (en este caso deleccin) es la responsable de
la enfermedad (por ejemplo si modifica un intrn sin alterar las secuencias de splicing no acarreara problema
que se sepa). Esta deleccin puede ser responsable de:

Cambio en el orden de lectura (FRAMESHIP MUTATION) o Dado que la lectura es por tripletes, si
eliminamos un nucletido los nucletidos que van juntos en cada triplete cambian por completo. En
una secuencia 123-456-789-0.. si eliminamos el 3 cambiara el orden de lectura quedando 124-567-
890- Lo cual dara lugar a una protena totalmente distinta desde el punto de la mutacin
Codn stop (mutacin sin sentido o non-sense) o El cambio en el orden de lectura puede provocar
que aparezca un triplete que indique final de transcripcin, y por lo tanto la protena se cortara en
ese punto. Estos codones de STOP son TAG, TGA y TAA UAG, UGA y UAA (segn si nos encontramos
en ADN o ARN). Imaginemos una secuencia CGC-TTA-ATG-AAC-GTG-CCG- en la que perdemos
cualquier nucletido de los primeros dos tripletes (vamos a quitar el primero): nos encontraramos
con una secuencia GCT-TAA-TGA-ACG-TGC-CG.- El problema consistira en que al transcribirse y
traducirse la primera protena poseera todos sus aminocidos pero la segunda, al aparecer un codn
stop en el tercer triplete estara compuesta por tan slo 2 a.a. y, obviamente, no sera funcional.

Estas mutaciones dan lugar a fenotipos autosmicos dominantes de gravedad variable. Estas mutaciones
poseern distinta gravedad fenotpica segn los aminocidos que afecten. Por ejemplo, las mutaciones que
modifican glicinas por otros aa son mucho ms graves normalmente porque este aa es el ms pequeo y es
por donde se suele dar la torsin en la configuracin tridimensional de las protenas, por lo que al cambiarla

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por un aa ms grande la configuracin tridimensional y funcional cambia por completo. Por el contrario si se
sustituye un aa por otro similar (en tamao, cido o bsico, etc.) podra incluso pasar inadvertida.

Las delecciones de exones completos darn lugar a fenotipos graves. Sin embargo, en lneas generales las
delecciones no son una de las mutaciones ms graves pues, aunque en principio parece que alteran todo, en
la prctica existen ciertos mecanismos de reparacin especficos que se activan al aparecer un codn stop.

- Cabra la posibilidad de que no se generase un codn stop, aunque es muy improbable, en cuyo caso la
protena sera inviable y en consecuencia la vida. Las probabilidades aumentaran cuando la mutacin
se da al final de la secuencia que codifica la protena.
- El ltimo exn es muy largo, lo cual facilita que mutaciones previas generen codones stop y as se active
el mecanismo de reparacin
- Normalmente hay secuencias de repeticin largas al final del gen que suelen provocar la degeneracin
del ARN en caso de no encontrarse correctas. Recordemos que tenemos dos alelos: en estos casos en
los que se degrada el ARN errneo como mecanismo defensivo (de reparacin) mantendramos la
protena bien sintetizada del otro alelo, lo cual suele ser suficiente para la vida (aunque pueda
apreciarse el defecto).

Las mutaciones que cursan con un codon de STOP prematuro o una mutacin sin sentido, dan fenotipos
relativamente leves, ya que la clula reconoce este error y se promueve su degradacin por medios del ARN.
Dependiendo de la mutacin, la enfermedad va a ser ms o menos grave, y toda esta gravedad puede valorarla
la bioinformtica.

Mutaciones COL2a1
RESUMEN: Aunque genticamente sin sentido y cambio de lectura son las MS GRAVES, gracias a que la clula
reconoce este error y las degrada todo lo que la paciente traduce es el gen sano. En el caso hablado de la
glycina, como no se repara, tendra colgenos sanos y errneos, por lo que funcionalmente sera ms grave.
Utilizando como ejemplo este caso clnico, cabran dos opciones:

- Que se genere codn stop: la clula reconoce las secuencias de ARN errneas y las degrada antes de
traducirse. Todas las fibras de colgenos sintetizadas funcionaran correctamente.
o Tendramos un 100% de colgeno funcional, aunque tan slo se produjese la mitad
(matemticamente, supongo que entrarn ms factores en juego que puedan, por ejemplo,
activar una mayor expresin)
- Que no se genere codn stop: En este caso parte del colgeno sera funcional y parte mutado y
disfuncional.
o Podramos pensar que el 50% sera funcional y el otro 50% podra simplemente no funcionar
y obstruir la funcin del sano o tender a acumularse. El problema es que si recordamos el
colgeno est compuesto por el entrelazado de tres fibras, que podrn ser la sana o la
anmala, por lo que para que un colgeno sea bueno deber estar compuesto por las tres
fibras del alelo sano. Por estadstica slo el 12.5%* del colgeno total sera bueno, quedando
casi la totalidad del colgeno inservible.

*Probabilidad de que la primera fibra sea del alelo sano es de , as mismo para la segunda y tercera. Por lo
tanto, la probabilidad de que las tres fibras sean del alelo sano es x x = 1/8 = 12.5%.

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Caso 2:
Paciente con distrofia muscular de la cintura (LGMD2A). Se identifica una mutacin en el gen 3 de calpana,
un locus conocido por esta forma de DM, pero ocurri en la posicin de la tercera base de un codn y al parecer
era una mutacin silenciosa (GGC>GGT), ambos codifican para glicina. Sin embargo, se piensa que la
mutacin es patgena. Cmo se podra explicar?

Nos encontramos ante una mutacin en el ltimo nucletido de un triplete cuyo resultado es que el aa
expresado es el mismo, por lo que lo lgico es pensar que es una mutacin silenciosa y no es responsable de
la enfermedad. Sin embargo el genetista nos dice que s.

El problema es que aunque el cambio de nucletido codifica la misma protena se puede afectar en el splicing.
Para el proceso de corte y empalme (splicing) la clula reconoce unas secuencias al empezar el intrn (GU/
AC) y otras al terminar (AG/AU). Si stas se ven alteradas no se produce el splicing, ya sea el comienzo del
intrn o el final de ste. Adems existe una secuencia en medio del intrn que tambin interviene en el proceso
de splicing y cuya alteracin puede impedir el mismo (se denomina secuencia de ramificacin: participa tras
cortar el extremo inicial pues la Guanina interacciona con una Adenina de la secuencia de ramificacin
formando un lazo).

Toda esta informacin adicional es para ver el por qu un cambio de nucletido que en principio dara lugar a
la misma protena, o incluso que estuviese en un intrn, podra dar lugar a una mutacin con manifestaciones
fenotpicas.

La sustitucin de AGGGCAAAAG POR AGGGTAAAAG, causa la activacin de una secuencia donadora de


empalme (splicing) crptico dentro del exn 16 que origina un empalme aberrante con prdida de la secuencia
de codificacin del exn 16 y la introduccin de un cambio de marco (fase) de lectura)

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Caso 3
Nio 24 meses (Martn)
Torpe y lento al caminar
Historia familiar de distrofia muscular

Martn tiene dos hermanas que caminaron antes de su primer cumpleaos. Los primeros pasos de Martn
fueron a los 20 meses. Seis meses despus estaba torpe y necesitaba una silla para levantarse o impulsarse
poniendo sus manos sobre sus piernas. Los padres de Martn conocan la historia familiar de distrofia
muscular.

Realizado el test diagnstico de ADN se detecta en Martn una deleccin de los exones 44-48 del gen de la
distrofina. Las distrofias musculares, se producen en gran parte por mutaciones en el gen de la distrofina,
pero dependiendo del exn en el que aparece la delecin, las distrofias son distintas.

Debido a la historia familiar de distrofia muscular (2 primos por parte del madre) , lo primero y evidente es
hacer un test de distrofia muscular, lo cual es bastante complejo pues es una protena muy larga (en torno a
79 exones).

Cuando se estudia se observa deleccin del exn 44 al 48. Est estudiado qu delecciones son ms graves pues
afectan o no al orden de lectura: aqu se diferencian la distrofia muscular de Becker y de Duchenne(Duchenne
ms grave)

A su vez, cuando se afectan varios exones hay que comprobar cmo alteran el orden de lectura, pues algunos
aumentan en 1 nucletido y otros lo reducen en 1, por lo que podran contrarrestarse y no alterar el orden
de lectura. Por ejemplo, si se producen en 4 exones que cambian +1 -1 -1 +1 el resultado sera el
mantenimiento del mismo marco de lectura.

Si hubiese un cambio de lectura se generar el codn de stop probablemente y por lo tanto se activar el
proceso de reparacin.

Uno puede plantearse que se haya generado un stop en entre un +1 y un -1, pues en medio el orden de lectura
s est alterado, pero no es el caso pues si se hubiese dado un stop a partir de aqu no se habra continuado la
expresin y por lo tanto no encontraramos los exones del 49 en adelante (en el texto se indica deleccin del
44 al 48, por lo que del 1 al 43 y del 49 al 79 estn intactos. (Si se hubiese producido stop en la franja 44-48 los
exones del 49-79 no se habran expresado).

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Como se contina deducimos que no se produce ningn stop, por lo que la clula es incapaz de reconocer el
error y por lo tanto de corregirlo, por lo que se generarn protenas anmalas sin ser reconocidas como tales
por la clula. Sin embargo, nos encontramos con una diferencia importante respecto al caso anterior (Caso 1:
el del colgeno):
- En el caso del Sndrome de Stickler, las mutaciones que generaban alteraciones en el orden de lectura
y daban codn stop eran positivas frente a las que generaban una fibra de colgeno anmalo, pues
el otro alelo segua produciendo fibras normales (es una enfermedad autosmica dominante, posee
un alelo mutado y uno normal)
- En la distrofia muscular la mutacin se encuentra en el cromosoma X, y acta de forma recesiva. Esto
significa que no existe un alelo sano que produzca la protena en caso de que el mecanismo de
reparacin bloquee la expresin del alelo enfermo, por lo que aqu ser mejor tener una protena
anmala (no hay alteracin en la pauta de lectura) que no tener ninguna protena (alteracin en el
orden de lectura) o La DM de Becker es menos grave porque se produce protena anmala, no hay
cambio en el orden de lectura
o La DM de Duchenne es ms grave porque no se produce protena alguna (prdida total del
producto gnico, es decir de la distrofina) debido a la alteracin en el orden de lectura y
aparicin del codn stop.

Para saber realmente si es Becker o Duchen hay que acudir a bases de datos, buscar tu mutacin y con la suerte
de que est tipificado aparece tu mutacin en la base de datos y te dice qu enfermedad tiene (Esto es lo que
dijo la profesora, aunque lo que se entiende por lgica y por lo que he buscado es que la de Becker se produce
cuando no hay alteracin en el orden de lectura y la de Duchen cuando s, echando la cuenta de la vieja que
dijimos antes de +1 -1 -1 +1).

En este caso, y con la tabla adjunta, tendramos +1-1+1+0+0=+1, por lo que se alterara el marco de lectura y
por lo tanto sera DM de Duchen (adems cuadra con la clnica pues aparece en edades ms tempranas que la
de Becker)

El alelo i solo presente en el grupo 0

Los cambios sin sentido o de patrn de lectura son convincentemente patognicos, pero si
encontramos uno de estos cambios, es siempre causa de enfermedad?

No, ejemplo de ello son los grupos sanguneos.


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El alelo i, presente solamente en el grupo O, tiene una mutacin sin sentido, pero no produce enfermedad.
Esta mutacin provoca un dficit de una enzima glicosil-transferasa, que causa que no se produzca el antgeno
de superficie de membrana.

Los pacientes con grupo sanguneo 0 tienen dos alelos i, por lo que no tienen antgeno A, ni antgeno B en su
superficie de membrana.

Conclusiones

Por ltimo, debemos ser conscientes de que no todos los polimorfismos son causantes de enfermedad y
hacerse siempre estas preguntas respecto a una mutacin, para correlacionar genotipo-fenotipo
(mutacinsindrome)

Ha sido previamente relacionada con la enfermedad?


Est en personas no afectas?
Est en todas las personas afectas de una misma familia?
Afecta a la estructura y/o funcin de la protena?

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