Eficcia de agentes
antimicrobianos em
biofilmes para o controle de
contaminao na indstria
de domissanitrios
Autores: Eliane Gama Lucchesi1, Slvia Yuko Eguchi2
e ngela Maria Moraes1
1
Departamento de Processos Biotecnolgicos,
Faculdade de Engenharia Qumica,
Universidade Estadual de Campinas
2
Dosage Pesquisas Laboratoriais, Investiga Institutos
de Pesquisa
Contato: ammoraes@feq.unicamp.br
1. Introduo
Biofilmes microbianos tm sido estudados nos mais
diferentes segmentos industriais, onde so os principais
causadores de contaminaes de difcil controle.
O histrico de problemas com biofilmes est invaria-
velmente presente em todos os segmentos industriais
que possuem gua em seu sistema, tais como: torres de
resfriamento, sistemas de tratamento de gua (resinas
de troca inica, osmose reversa) e em todos os demais
sistemas que tenham quaisquer fluidos em circulao.
Biofilmes microbianos so definidos como associa-
es de clulas bacterianas e de fungos [1], inclusas em
uma complexa matriz polimrica extracelular (MPE). A
MPE possui variada composio qumica, e no somen-
te prov a estrutura orgnica do biofilme, como tambm
facilita o arranjo espacial das diferentes espcies que o
compem. Dentre os principais componentes da MPE
Set/Out - 2012 - SBCC
Eliane Gama Lucchesi
Slvia Yuko Eguchi
ngela Maria Moraes
podem-se citar polissacardeos, protenas, cidos nu-
clicos e fosfolipdios [2]. Assim, esta matriz extracelular
formada em parte pelas prprias clulas, podendo tam-
bm incluir componentes do ambiente, como detritos,
materiais inorgnicos e at mesmo outros organismos.
Os biofilmes asssociados a doenas tm sido deta-
lhadamente estudados nas reas de medicina e odonto-
logia, nas quais os problemas gerados so mais crticos
por envolver diretamente vidas humanas. Nestes casos,
ocorrem principalmente porque os fluidos corpreos so
excelentes meios de cultivos, provendo nutrientes varia-
dos para os micro-organismos. Estima-se que os biofil-
mes estejam envolvidos em 65% dos casos de infeces
humanas de origem bacteriana [3]. Dispositivos mdicos
propcios colonizao por biofilmes, como catteres,
so responsveis diretos pelo fracasso de muitos trata-
mentos tradicionais [4], pois permitem a instalao de
micro-organismos de difcil controle e que apresentam
maior resistncia erradicao por agentes antimicro-
41
artigo tcnico
bianos como antibiticos, biocidas e desinfetantes [5] do
que as clulas planctnicas, pioneiras na formao de
biofilmes.
Supe-se que menos de 10% dos micro-organismos
presentes num sistema sejam, de fato, clulas planct-
nicas, estando mais de 90% na forma de biofilmes [6].
Nas comunidades microbianas possvel observar in-
teraes de mutualismo, comensalismo, antagonismo e
saprofismo, responsveis pela estabilizao do sistema,
podendo ocorrer entre micro-organismomicro-organis-
mo ou micro-organismoorganismo multicelular [2].
A formao do biofilme est diretamente relacionada
adeso celular. Dentre os fatores que do incio ao pro-
cesso de adeso esto as cargas superficiais da parede
celular das bactrias. A presena de fmbrias e pilis e
fatores genticos inerentes possibilitam sua interao
com variados tipos de superfcies [7], [8].
Segundo a American Society for Microbiology [9], a
formao do biofilme divide-se em cinco etapas conse-
cutivas. A etapa inicial, de adsoro reversvel, ocorre
em segundos, e nela predominam as foras fracas de
atrao. Em seguida, ocorre uma etapa de adeso ir-
reversvel, na qual predominam foras fsicas e qumi-
cas, que duram de segundos a horas. Aps esta etapa,
por perodos de horas a dias, ocorrem o crescimento e
a diviso celular, seguidos da formao da MPE [10].
Finalmente, na quinta e ltima etapa, ocorre a adeso
de outros organismos e a liberao de micro-colnias
microbianas, que prolongam por perodos de dias as
meses [10].
Durante a adeso, as clulas modificam seu fenti-
po em funo da proximidade do suporte, respondendo
s condies ambientais com padres de crescimento
diferentes dos observados em clulas livres [8]. Alm
da maior resistncia a agentes antimicrobianos, outros
problemas esto associados presena dos biofilmes,
dentre estes, maior populao em comparao de
clulas planctnicas (podendo chegar a valores de at
10 a 10 UCF/mL), maior dificuldade de remoo das
11 12
clulas do sistema, limpeza, manuteno de equipamen-
tos, chegando at os efeitos deletrios sobre o produto
final [10].
A anlise da concentrao inibitria mnima (CIM) e
da concentrao de morte mnima (CMM) muito utiliza-
da na rea mdica e veterinria com intuito de se verifi-
car a dosagem mnima de antimicrobianos necessrios
42
para inibir ou erradicar cepas causadoras de infeces.
Os testes da CIM e da CMM so ensaios padres para
verificar a susceptibilidade de clulas planctnicas a an-
tibiticos. Devido reprodutibilidade, os testes de CIM
e CMM passaram a ser utilizados para auxiliar na de-
finio de dosagem mnima de outros antimicrobianos,
tais como conservantes necessrios para preservao
de produtos com gua em sua composio.
Entretanto, em se tratando de biofilmes, este mtodo
no deve ser aplicado, pois os ensaios de susceptibilida-
de mostram que a concentrao de agente ativo para a
erradicao do biofilme de 100 a 1.000 vezes maior do
que a determinada para clulas planctnicas [6]. Esta re-
sistncia d-se principalmente pela MPE e pela compo-
sio da membrana externa e da parede celular, e ocor-
re predominantemente com bactrias Gram-negativas
[10]. Degradao e inativao dos biocidas por enzimas
e metablitos das clulas do biofilme podem ocorrer [11],
diminuindo drasticamente a sua eficcia na erradicao
das clulas.
Variados sistemas vm sendo utilizados para o de-
senvolvimento controlado de biofilmes in vitro para que
se possa testar, de forma mais precisa e reprodutvel,
sua susceptibilidade aos antimicrobianos, determinando
a concentrao inibitria mnima para clulas ssseis
e da concentrao inibitria mnima de erradicao de
biofilmes (CIMEB) [12]. Sistemas como a imobilizao
de clulas em hidrogis, o cultivo celular em quimios-
tatos, o uso de fermentador de filme com espessura
constante, reatores de fluxo simples, o dispositivo de
Robbin modificado e o cultivo de clulas em placas
com micro-poos como o dispositivo MBEC podem
ser empregados [1]. Entretanto, questes frequentes
como a dificuldade de operao e os custos elevados
limitam seu emprego como mtodos de uso rpido para
o diagnstico de problemas e a proposio de possveis
solues.
Como alternativa aos sistemas citados anteriormen-
te, foi desenvolvida uma estratgia baseada no uso
de esferas de vidro como suporte para a formao de
biofilmes sob condies cisalhantes e em sua utilizao
para a determinao da CIM e da CIMEB em processos
contaminados com micro-organismos ssseis [13]. Tal
estratgia permite gerar biofilmes in vitro de foram rpi-
da e simultnea, de forma a possibilitar a realizao de
testes com variados tipos de agentes antimicrobianos,
SBCC - Set/Out - 2012
de forma simples, rpida, verstil, reprodutiva e menos
dispendiosa em comparao aos dispositivos encon-
trados no mercado. Esta abordagem j foi testada com
sucesso na determinao da CIM e da CIMEB em amos-
tras de fluido de corte provenientes de processos de usi-
nagem de metais contaminados por micro-organismos Solues integradas
formadores de biofilmes [13]. Alm do vidro, outros tipos
de materiais podem ser utilizados como suporte para para seu projeto de
o desenvolvimento de biofilmes, como ao inoxidvel e
PVC, de uso comum em processos industriais.
sala limpa
Um dos setores industriais que apresenta proble-
mas com contaminao microbiana disseminada por
biofilmes o da produo de domissanitrios. Este seg-
mento passou por grandes mudanas em 2009, quando
a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA),
atravs da RDC 035/2008, proibiu a utilizao de formal-
dedo como conservante nestas formulaes.
Devido ao microbicida e microbiosttica do for- Produtos Swell:
maldedo, a maior parte das ocorrncias de contamina-
Divisrias / Portas / Visores / Pass-trough
o no processo fabril de domissanitrios era, de certa
Acessrios / Sistema de ar condicionado para reas
forma, corrigida com suplementao do conservante,
uma vez que o baixo custo do formaldedo permitia o
classificadas / Controles de temperatura
aumento na dosagem usada. Com a proibio do uso Umidade / Pureza do ar / Gradiente de presso
de formol, buscar alternativas de preservao passou a
ser premente.
Devido intensa contaminao por biofilmes nos
processos de fabricao, proveniente de vrios fatores,
a simples troca do formaldedo por outros agentes anti-
microbianos foi, num primeiro momento ineficaz, criando
a necessidade de repensar todos os conceitos no que
se refere contaminao microbiana neste segmento.
No presente estudo, o uso da tcnica de esferas de
vidro foi avaliada para o estabelecimento da dosagem
de erradicao de biofilmes e da estratgia de tratamen-
to para o controle da contaminao em duas indstrias
do setor domissanitrio, que apresentavam graves
problemas de contaminao microbiana. A eficcia dos
antimicrobianos em clulas ssseis, pela abordagem de
desenvolvimento dos biofilmes em de esferas de vidro,
foi comparada com a erradicao das clulas planctni-
cas pela anlise da CIM tanto em detergentes quanto em
amaciantes de roupas, que apresentaram problemas de
contaminao. Testes comparativos, empregando a me- Rua Caravelas, 225 Jd. Vale do Sol
todologia j estabelecida baseada no sistema MBEC, So Jos dos Campos SP CEP 12238-170
foram realizados, assim como ensaios empregando es-
Tel.: (12) 3939.5854 comercial@swell.eng.br
feras de ao inoxidvel em substituio s de vidro.

43
artigo tcnico
2. Material e mtodos
2.1. Material
No caso de detergentes, para efetuar os ensaios de
formao de biofilme e anlise de sua susceptibilidade
a biocidas foi utilizado como inculo uma alquota de
detergente contaminado misturada a micro-organismos
coletados na superfcie dos tanques, na forma de pool,
tendo-se por objetivo obter um consrcio microbiano em
que foram preservadas as interaes entre os micro-
-organismos e o meio ao qual estavam adaptados. Os
micro-organismos foram coletados, com o auxlio de uma
haste flexvel com ponta de algodo estril (Swab), nas
superfcies dos tanques de ao inoxidvel utilizados na
fabricao de detergente e transferidos para meio de cul-
tura para crescimento de bactrias. Aps a proliferao
celular, a cultura foi dividida em cinco partes iguais, em
frascos de vidro para reagentes (tipo Schott) contendo
meio de cultura lquido e estril. Este inculo foi mantido
refrigerado. Nos estudos enfocando o amaciante, o incu-
lo consistiu do prprio amaciante de roupas contaminado.
No foi possvel efetuar a proliferao e a manuteno do
inculo em meios de cultura, pois os micro-organismos
contaminantes deste produto no se multiplicavam na au-
sncia do amaciante. Foram estudadas duas empresas
situadas no Estado de So Paulo (Brasil).
Para a propagao celular, a anlise de bactrias
heterotrficas totais, a formao de biofilmes e para os
ensaios de susceptibilidade microbiana aos biocidas
foram utilizados os meios de cultivos Tryptic Soy Agar
(TSA) e Tryptic Soy Broth (TSB), ambos da Difco. Para
o desenvolvimento dos biofilmes foram utilizados tubos
de ensaio com tampa de rosquevel de 16mm x 100mm
contendo esferas de vidro de 0,85mm de dimetro m-
dio (modelo U 20, S Esferas, So Paulo, SP, Brasil) ou
esferas de ao inoxidvel de 1,0mm de dimetro mdio
(AISI 304L - Nacional Esferas Ltda.).
Para o estudo foram utilizados biocidas comercial-
mente disponveis: BHD-208 (soluo aquosa de 2-bro-
mo-2nitropropano-1,3-diol, 5-cloro-2-metil-4isotiazolin-
-3ona e 2-metil-4-isotiazolin-3-ona), BP-600 (soluo
aquosa de 1,5-pentanodial), BP-610 (soluo aquosa
de cloreto de alquildimetil benzil amnio, polihexameti-
lenoguanidina hidroclorada e 1,5-pentanodial) e BHD-
44
235 (soluo aquosa de cloreto de alquil dimetil benzil
amnio), gentilmente cedidos pela empresa IPEL Itibanyl
Produtos Especiais Ltda. (Jarinu, SP, Brasil). O produto
BHD-208 empregado como agente preservante de
formulaes, enquanto o BP-600 e o BP-610 so utili-
zados como sanitizantes industriais e o BHD-235, como
desinfetante domstico.
Como diluente e soluo de lavagem foram utilizadas
gua destilada estril e/ou soluo de NaCl a 0,9% (m/v),
conforme sugerido por Capelletti et al. (2005)[14].
2.2. Determinao da concentrao inibitria
mnima (CIM) e da concentrao mnima de morte
(CMM) para clulas planctnicas
Todos os ensaios de anlise de eficcia de agentes
para o controle de biofilmes e clulas planctnicas con-
taminantes foram realizados nos Laboratrios da IPEL
Itibanyl Produtos Especiais Ltda. Os testes foram exe-
cutados em cabine de segurana biolgica (VLFS-12,
Veco), em sala controlada com presso positiva.
Para a determinao da CIM, foi utilizado como in-
culo, em ambos os casos, suspenses microbianas com
concentraes ajustadas em 1,0x108 UFC/mL com TSB.
Foram preparadas, isoladamente, solues dos qua-
tro antimicrobianos com concentraes iniciais ao dobro
das concentraes normalmente utilizadas. Estas solu-
es foram diludas de forma seriada, na proporo de
1:1 (v/v), com meio TSB previamente contaminado com
1% (v/v) de cada inculo, at que se atingisse 1,56%
da concentrao inicial de cada biocida. Para tal, foram
empregados 3mL de soluo de biocida e 3mL do meio
de cultura TSB em cada etapa da diluio, totalizando
sete transferncias. Os tubos controle continham: meio
de cultura TSB como controle negativo, meio de cultura
com o inculo como controle positivo, e meio de cultura
contendo biocida para o controle da turbidez. O cresci-
mento bacteriano foi evidenciado pela turbidez do meio
de cultura. A menor concentrao na qual no houve
crescimento foi assumida como a concentrao inibit-
ria mnima.
Aps a leitura dos resultados da CIM, de cada um
dos tubos que no apresentaram crescimento microbia-
no visvel a olho nu, foi retirada uma alquota de 10L
com uma ala de inoculao calibrada, que foi estriada
na superfcie do meio de cultivo TSA solidificado em pla-
cas de Petri, para a verificao de crescimento celular. A
SBCC - Set/Out - 2012
 menor concentrao de cada agente antimicrobiano na
qual no se verificou crescimento celular foi assumida
como a CMM.
2.3. Formao de biofilme na superfcie de
esferas de vidro ou ao inoxidvel e anlise de sua
susceptibilidade aos antimicrobianos
Os ensaios foram realizados com base na metodolo-
gia descrita por Lucchesi [15]. Para cada tipo de contami-
nante os ensaios foram efetuados em triplicata, empre-
gando os quatro biocidas em diferentes concentraes.
Alquotas de 0,3g de esferas de vidro ou ao inoxidvel
previamente lavadas foram acondicionadas em tubos de
ensaio com tampa de rosca (16mm x 100mm) e a cada
um dos tubos foram adicionados 4,5mL de cada suspen-
so microbiana contaminante (contendo 1,0 x 108 UFC/
mL), alm de 0,5mL de meio de cultivo TSB. Os tubos fo-
ram colocados em um homogeneizador (modelo AP-22,
Phoenix) e foram agitados por movimentos rotacionais
(4 a 5 rpm) em estufa (modelo 320 L, Tecnal) ajustada
temperatura de 361C por 48 horas para a gerao dos
biofilmes em condies cisalhantes.
Aps a incubao, as esferas de vidro ou ao ino-
xidvel foram removidas com o auxlio de uma cureta,
transferidas para novos tubos de ensaios estreis, e la-
vadas por duas vezes com gua destilada estril para a
remoo das clulas no aderidas e dos nutrientes em
contato com as partculas. Aps a lavagem foram adicio-
nados 2,5mL do meio de cultura TSB e 2,5mL de soluo
aquosa dos quatro biocidas testados nas concentraes
de 1%, 5%, 10%, 15% e 20% (em massa) de cada produ-
to. Os tubos foram ento incubados em estufa a 361C
por mais 24 horas, no caso das amostras provenientes
do processo de produo de detergente, e por 3 horas
no caso da amostra de amaciante contaminado. Aps
o perodo de incubao, as solues de biocidas foram
drenadas e as esferas lavadas com gua destilada estril
por duas vezes. Em cada tubo foi adicionado 5mL de meio
de cultivo TSB, que foram sonicados (modelo USC1450,
25 khz, Thornton) por 30 minutos para a desagregao
dos biofilmes e, aps 24 horas de incubao, a turvao
ou no dos meios de cultivo foi analisada visando deter-
minar a menor concentrao de cada microbicida capaz
de inibir o crescimento das clulas ssseis, ou seja, a
concentrao inibitria mnima de biofilme (CIMB). Para
os tubos sem turvao, as suspenses celulares resul-
Set/Out - 2012 - SBCC
tantes foram semeadas (por estrias) em meio de cultivo
TSA devidamente distribudo e solidificado em placas
de Petri. A menor concentrao na qual no se verificou
crescimento de clulas foi denominada concentrao
mnima de erradicao de biofilme (CMEB).
2.4. Formao de biofilmes no dispositivo
MBECHTP e anlise de sua susceptibilidade aos
antimicrobianos
Assim como no procedimento envolvendo esferas de
vidro, o ensaio com o dispositivo MBEC-HTP, produzido
em poliestireno, foi realizado em duas etapas, onde numa
se inocula o contaminante formador de biofilme e nou-
tra onde se avalia seu comportamento frente a agentes
antimicrobianos. A primeira etapa envolve um dispositivo
formado por uma base retangular escavada provida de
8 canais, onde colocada a populao contaminante, e
uma tampa com 96 pinos onde as clulas se fixam, for-
mando o biofilme. Na segunda etapa, a tampa contendo
os pinos transferida para uma nova base onde se en-
contram 96 poos preenchidos com solues de biocidas
e de amostras para a realizao de ensaios controle.
Assim, para a primeira etapa, em bases distintas
foram adicionados 22 mL de cada um dos inculos pa-
dronizados (1,0x108 UFC/mL), e 2 mL de meio de cultura
TSB. Os dispositivos foram tampados e transferidos para
uma mesa agitadora com movimentos oscilatrios (4 a 5
oscilaes por minuto e inclinao de 5), posicionando-
-os de forma que o fluxo do meio de cultura na base do
dispositivo ficasse direcionado no sentido dos canais. O
crescimento microbiano foi efetuado em estufa (modelo
320 L, Tecnal) a 361C, por 48 horas para permitir a for-
mao dos filmes em cada um dos pinos com populao
microbiana superior a 1,0x10 6 UFC/pino.
Aps a incubao, a tampa do dispositivo MBEC
foi retirada e lavada por duas vezes com soluo salina,
para remoo das clulas planctnicas. Esta lavagem foi
efetuada colocando-se a tampa do dispositivo em uma
placa do tipo ELISA com 96 poos, contendo 0,2mL de
soluo salina estril por poo. Aps a lavagem, a tampa
do dispositivo foi encaixada em outra microplaca do tipo
ELISA com 96 orifcios, cada um contendo 0,1mL das di-
ferentes concentraes dos biocidas e 0,1mL do meio de
cultura TSB, de modo a encaixar um pino em cada poo.
As placas foram incubadas a 361C por 24 horas. Aps
o perodo de incubao, a tampa foi novamente lavada
45
artigo tcnico

com soluo salina e colocada em uma nova microplaca
contendo 200L de meio TSB fresco por poo. Aps 30
minutos de sonicao, a placa foi incubada por mais 24
horas, quando, ento, foi analisado o crescimento celu-
lar por turbidez ou por estrias em meio TSA. A menor
concentrao na qual no foi verificado o crescimento de
clulas foi denominada concentrao mnima de erradi-
cao do biofilme (CMEB).
2.5. Caracterizao das clulas contaminantes do
amaciante
A identificao dos micro-organismos contaminan-
tes do amaciante foi efetuada pela equipe do Prof. Dr.
Welington Luiz de Arajo, da Universidade de Mogi das
Cruzes (So Paulo). Uma amostra representativa do
amaciante contaminado foi inoculada em meio de cultura
TSB a 10% e aps 72 h, foi realizada a extrao de DNA
total. O gene 16S rRNA foi parcialmente amplificado por
PCR e os fragmentos amplificados foram clonados em
E. coli. A biblioteca de clones resultante foi caracteriza-
da por ARDRA, utilizando-se as enzimas de restrio
HaeIII e HhaI. Clones divergentes foram identificados
por sequenciamento. A anlise fentica foi realizada
com o programa MEGA 4.0 e a rvore de similaridade foi
construda pelo mtodo de neighbour-joining.
3. Resultados e discusso
recomendadas pelo fabricante [18] (estabelecidas com
base em valores superiores CIM e CMM, na tentativa
de antever e prevenir contaminaes em produtos aca-
bados e que variam de acordo com o tipo de aplicao)
so de 1.000 a 2.000 ppm para o produto BHD-208, de
10.000 a 50.000 ppm para o BP-600 e o BP-610, e de
5.000 a 10.500 ppm para o BHD-235.
Os resultados apresentados nas Tabelas 1 e 2 cor-
roboram as afirmaes anteriores para as amostras de
detergente contaminado tratadas com os antimicrobia-
nos testados. Enquanto os dados coletados para micro-
-organismos planctnicos (Tabela 1) apontam eficcia
dos quatro microbicidas utilizados em concentraes
muito abaixo das indicadas pelo fabricante, os resulta-
dos obtidos para clulas em biofilmes mostram que as
concentraes requeridas para o controle da contamina-
o so, de fato, muito superiores.
Quando comparados os resultados das duas tabelas
pode-se verificar o aumento significativo das dosagens
para erradicao dos biofilmes formados em relao aos
Tabela 1
CIM (ppm de CMM (ppm de
Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
BHD-208 13,5 13,5
BP-600 10,5 10,5
BP-610 10,0 10,0
BHD-235 9,0 9,0

Resistncia dos micro-organismos oriundos do

Agentes microbicidas com ao preservante (ou processo de produo de detergente aos agentes
conservante) so aqueles que impedem ou retardam a antimicrobianos testados, para clulas planctnicas,
deteriorao de um produto acabado [16], normalmente em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)
e concentrao mnima de morte (CMM).
possuindo como caractersticas a dupla ao de redu-
zir a contaminao inicial e de preservar o material de
interesse por longos perodos. Os agentes sanitizantes, Tabela 2
por outro lado, reduzem o nmero de contaminantes CIMB (ppm de CMEB (ppm de
Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
bacterianos a nveis relativamente seguros [17], geral-
BHD-208 16.200 40.250
mente apresentando ao de morte microbiana rpida
(da ordem de horas). A clara diferenciao entre estes BP-600 10.005 10.005

dois tipos de produtos de relevncia na discusso de BP-610 10.000 10.000

resultados como os apresentados a seguir. BHD-235 10.800 10.800

Resistncia de biofilmes formados na superfcie de

3.1. Formao e teste de susceptibilidade do
biofilme desenvolvido na superfcie das esferas de
vidro a partir de detergente contaminado
No caso dos produtos testados, as concentraes
esferas de vidro a partir de micro-organismos oriundos
do processo de produo de detergente aos agentes
antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima
de erradicao de biofilmes (CMEB).

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SBCC - Set/Out - 2012
 resultados obtidos para as clulas planctnicas. Varia- formados nos dois tipos de materiais (Tabela 5). Pos-
es de 953 a 1200 vezes foram notadas na CIMB em sivelmente, os biofilmes formados em vidro e em ao
relao CIM, e de 953 a 2981 para a CMEB em com- inoxidvel possuem caractersticas similares.
parao CMM para os variados agentes microbicidas Variaes idnticas, de 1009 a 1020 para a CIMB em
avaliados. As menores concentraes requeridas para relao CIM, e de 1009 a 2032 para a CMEB em com-
o controle dos biofilmes foram obtidas com os produtos parao CMM foram obtidos tanto para o vidro quanto
BP-600 e BP-610. A maior discrepncia foi observada para o ao inoxidvel. Para todos os agentes microbicidas
para o microbicida BHD-208, que atua como um exce-
lente preservante, porm apresentou-se pouco eficaz
Tabela 3
como agente sanitizante.
CIMB (ppm de CMEB (ppm de
A Tabela 3 mostra os resultados do teste de erra- Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
dicao de biofilmes efetuados empregando o sistema BHD-208 13,5 13,5
MBEC. A total correlao nos dados obtidos no sistema BP-600 10,5 10,5
MBEC em relao aos biofilmes produzidos na super-
BP-610 10,0 10,0
fcie das esferas de vidro confirma e valida de uso da
BHD-235 9,0 9,0
tcnica de esferas para este tipo de aplicao.
Resistncia de biofilmes formados, no dispositivo
MBEC, a partir de micro-organismos oriundos do
3.2. Formao e susceptibilidade do biofilme
processo de produo de detergente aos agentes
desenvolvido na superfcie das esferas de antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
vidro ou ao de inoxidvel a partir de amaciante mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima
de erradicao de biofilmes (CMEB).
contaminado
Os resultados da CIM e da CMM obtidos para as
amostras de amaciante contaminado esto apresenta-
Tabela 4
dos na Tabela 4, enquanto que o comportamento quanto
CIM (ppm de CMM (ppm de
CIMB e CMEB verificado em esferas de vidro e de Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
ao inoxidvel apresentados na Tabela 5. BHD-208 25,8 51,6
Assim como verificado para as amostras de deter-
BP-600 12,2 24,4
gente, os testes da CIM e da CMM com o amaciante
BP-610 10,05 10,05
de roupas contaminado mostraram a eficcia dos an-
BHD-235 12,2 12,2
timicrobianos para o controle dos micro-organismos
planctnicos, foram em concentraes muito inferio- Resistncia dos micro-organismos oriundos do
processo de produo de amaciante aos agentes
res s indicadas pelo fabricante.
antimicrobianos testados, para clulas planctnicas,
No foram observadas diferenas quanto s concen- em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)
traes necessrias para a erradicao dos biofilmes e concentrao mnima de morte (CMM).

Tabela 5
CIMB (ppm de agente ativo) CMEB (ppm de agente ativo)
Agente antimicrobiano
Vidro Ao Inoxidvel Vidro Ao Inoxidvel
BHD-208 26.300 26.300 52.600 52.600
BP-600 12.322 12.322 24.644 24.644
BP-610 10.150 10.150 10.150 10.150
BHD-235 12.440 12.440 24.800 24.800

Resistncia de biofilmes formados na superfcie de esferas de vidro e de ao inoxidvel a partir de micro-organismos

oriundos do processo de produo de amaciante aos agentes antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima de erradicao de biofilmes (CMEB).

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Set/Out - 2012 - SBCC
artigo tcnico
observa-se que as concentraes requeridas para o con-
trole dos biofilmes foram maiores no caso das amostras
de amaciante que das de detergente contaminado, o que
indica que a microbiota do amaciante contaminado mais
resistente, possivelmente por resultar de uma populao
pr-existente que j havia sido exposta, por prolongado
perodo, a microbicidas com baixa ao residual, como
o formol.
Durante os testes com amaciante de roupas
contaminado, verificou-se que os micro-organismos
possuam um comportamento peculiar. Mesmo utili-
zando-se diversas tcnicas de manuteno e recupe-
rao de micro-organismos, no foi possvel efetuar
a propagao deste consrcio microbiano em meios
de cultivo tradicionais. Observou-se que estes micro-
-organismos somente se multiplicavam na presena
do amaciante de roupas, e que quando se retirava o
produto, no havia crescimento de colnias em meio
slido distribudo nas placas de Petri ou no meio de
cultivo lquido. Este comportamento levou ao inte-
resse de identificar a populao microbiana presente
nesta amostra, atravs da caracterizao molecular
destes contaminantes. Os resultados obtidos so
apresentados na Figura 1.
A comunidade bacteriana encontrada neste ama-
ciante de roupas foi composta por organismos do com-
Figura 1 Padro de bandas dos isolados da amostra de amaciante, obtida por meio da tcnica de ARDRA. A:
resultados obtidos com a enzima HaeIII; B: resultados obtidos com a enzima Enzima HhaI; M: marcador molecular de
100pb; A01 a A18: isolados.
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plexo Burkholderia cepacia, Buttiauxella sp., Acidobac-
teriaceae e Gemmatimonadaceae, sendo que nestes
dois ltimos no foi possvel avanar na identificao,
o que sugere que estas possam ser espcies ainda no
descritas na literatura.
4. Concluses
Os resultados deste estudo mostram que caso o
tratamento para eliminar a contaminao dos sistemas
de fabricao do detergente e do amaciante de roupas
fosse baseado somente nos testes de CIM utilizando
clulas planctnicas, a eficincia seria comprometida
necessitando rever toda a sistemtica de sanitizao e
preservao.
Na prtica, definir o preservante mais eficaz, recupe-
rar os produtos devolvidos e aumentar a dosagem de mi-
crobicida no foram aes que solucionaram o problema
de contaminao. Foi necessrio, concomitantemente,
efetuar um procedimento de limpeza mecnica com pos-
terior sanitizao, para que as empresas erradicassem
a contaminao.
O sistema de esferas mostrou-se simples, eficiente,
com a vantagem de permitir a medida CIMB, alm de
representar um custo 40% inferior ao MBEC.
SBCC - Set/Out - 2012
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