UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO.

FACULTAD DE MEDICINA.
PORTADA

VALIDACIN DEL NIVEL DE EXPRESIN DE UN GEN REGULADO

NEGATIVAMENTE EN LINFOCITOS T AL SER EXPUESTOS AL VIRUS
DEL DENGUE

Equipo de investigacin:

Miguel ngel Lpez Ponce.

Antonio Surez Rangel.
Antonio Surez Rangel
Miguel ngel Lpez Ponce

Docente responsable:
D. en C. Ricardo Francisco Mercado Curiel.

1
2
INDICE (Se definirn las pginas al acabar el protocolo)
1. TTULOtulo.

2. MARCO TERICOMarco Terico.

2.1 DEFINICIN DEL PROBLEMAefinicin del problema.
2.2 ANTECEDENTESntecedentes.
2.2.1 El virus del dengue.
2.2.2 La enfermedad del dengue.
2.2.3 Participacin de los leucocitos en el dengue.
2.2.4 Niveles de expresin gnica y funcionamiento celular.
2.2.5 Regulacin de la expresin gnica en el dengue.
2.2.6 Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).
2.2.7 Reaccin en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa (qPCR).
2.3 JUSTIFICACINustificacin.
2.4 HIPTESISiptesis.
2.5 Objetivo BJETIVO GENERALGeneral.
2.6 OBJETIVOS ESPECFICOSbjetivo Especfico.
2.7 Materiales y mtodos.

3. MATERIALES Y MTODOSaterial y Mtodos.

3.1 DEFINICIN DE TCNICAS EXPERIMENTALESefinicin de tcnicas
experimentales.

3.1.1 -Extraccin de RNA.

3.1.2 Sntesis de cDNA.
3.1.3 qPCR
-Sntesis de cDNA.
-qPCR.

4. ORGANIZACIN DE LA INVESTIGACIN.rganizacin de la investigacin

4.1 PROGRAMA DE TRABAJOrograma de Trabajo.
4.2 RECURSOS HUMANOSecursos Humanos.
4.3 MATERIALESateriales.
4.4 PRESUPUESTOresupuesto.

3
 4.5 DIFUSINifusin.

5. DATOS DE LOS INVESTIGADORESatos de los investigadores.

6. FIRMA DE LOS INVESTIGADORESirma de los investigadores.

7. REFERENCIASeferencias.

NOTA. INTERLINEADO 1.5 EN TODO EL DOCUMENTO, LETRA ARIAL.

4
1. TITULO
Validacin del nivel de expresin de un gen regulado negativamente en linfocitos
T al ser expuestos al Virus del Dengue

2. MARCO TERICO.
2.1 DEFINICIN DEL PROBLEMA.EFINICIN DEL PROBLEMA
El virus del dengue, miembro del gnero Flavivirus, es la principal causa de
enfermedades arbovirales en las regiones tropicales y subtropicales regiones,
afectando a 70 a 100 millones de personas cada ao. (Henrique) Ys es probablemente

5
la enfermedad viral ms importante transmitida por artrpodos en trminos de
morbilidad y mortalidad humana (13). (1)
Ms de cincuenta millones de casos de infeccin por dengue ocurren cada ao,
resultando en aproximadamente 24,000 muertes debido a sndrome de shock del
Dengue. En Mxico, 45.748 casos de fiebre del Dengue y 10.501 de fiebre hemorrgica
del Dengue fueron reportados entre 2004 y 2006. (219) NOTA. LAS ABREVIATURAS
NO LAS HABAN EMPLEADO EN NINGN MOMENTO ANTERIOR PARA
DESCRIBIR LO QUE SIGNIFICA CADA UNA DE ELLAS.
En la actualidad, Mxico podra ser considerado como una regin endmica para el
dengue ya que el mosquito vector Aedes aegypti est presente en ms del 85% del
territorio del pas. (32)
El dengue es una enfermedad viral generalizada por la que ms de 3 mil millones de
personas estn en riesgo.
Las primeras epidemias registradas de la enfermedad denguelike ("fiebre comn")
ocurrieron en 1779 en brotes simultneos en Batavia (Yakarta) y El Cairo,
pPosteriormente, se registraron brotes de dengue en Filadelfia (1780), Zanzbar (1823
y 1870), Calcuta (1824, 1853, 1871, 1905), Llas Antillas (1827) y Hong Kong (1901).
(13)
No hay tratamientos farmacolgicos o vacunas disponibles para esta enfermedad.
Tambin es difcil para los mdicos predecir qu pacientes estn en mayor riesgo de
las manifestaciones severas conocidas como fiebre hemorrgica del dengue y
sndrome de choque del dengue. (418) ABREVIATURAS. VER NOTA ANTERIOR.
Y la tasa de mortalidad de fiebre hemorrgica del Dengue / sndrome de shock del
Dengue puede ser tan alta como 20% si no son tratados. Por lo tanto, una mejor
comprensin del mecanismo por el Dengue es necesario para desarrollar un sistema
de eficaz y especfica contra el desarrollo de fiebre hemorrgica del dengue / sndrome
de shock del Dengue. (53)
Aunque las clulas T especficas de virus pueden ser esenciales para la de muchas de
las infecciones virales, tambin pueden contribuir a la progresin de la enfermedad.
Durante la infeccin del dengue, el papel de los linfocitos T no est del todo clara, pero
desempean un papel tanto en la eliminacin del virus como en patognesis.

6
En el desarrollo de fiebre hemorrgica del Dengue / sndrome de shock del Dengue. En
particular, se han asociado linfocitos T de memoria reactiva cruzada con cambios en la
vasculatura, lo que conduce a edad , y la activacin de linfocitos T durante la viremia,
que es ms evidente en la FHD, se refleja en la sobreproduccin de citocinas. Adems,
CD4 + y clones de linfocitos T CD8 + que proliferan en respuesta a los antgenos
Dengue en un serotipo reactivo cruzado que han sido aislados de los pacientes con
dengue, lo que sugiere que el serotipo dengue reactivo cruzado los linfocitos T pueden
contribuir a la patognesis del dengue. (69)
Por lo anterior es importante conocer la respuesta de los linfocitos T a la exposicin con
el virus del dengue ya que no se cuenta con informacin clara y algunos estudios han
arrojado resultados contradictorios. Se han identificado genes regulados y es deseable
validar dicho nivel de la expresin de un gen cuando los linfocitos T son infectados con
DENV,. para as poder como este tipo de clulas participan en la patogenicidad, ya que
ha habido muchas contradiccines sobre si participa en la enfermedad o no.
As al validar la expresin de alguno de esos geneseste gen, se puede corroborar su
importancia y probable participacin en el desarrollo de , uno puede idear nuevas
formas de contrarrestar la enfermedad d ocasionada por el dengueDENV.
LE PUEDES AGREGAR ALGO AQU, YA NO SE ME OCURRIO NADA MAS.

NOTA. SU TRABAJO NO VERSA EN HACER UN MICROARREGLO DE EXPRESIN.

VEAN EL TTULO DE SU TRABAJO Y TRATEN DE ENFOCARSE EN EL TEMA.
PUEDEN COMENZAR HABLANDO BREVEMENTE DE LA ALTA INCIDENCIA DE LA
ENFERMEDAD, QUE NO SE TIENE UNA FORMA DE CONTROL EFICAZ
ACTUALMENTE, QUE LA DETERMINACIN DE LOS NIVELES DE EXPRESIN EN
CLULAS COMO LOS LINFOCITOS T, QUE PARTICIPAN EN LA PATOGNESIS DE

7
LA ENFERMEDAD, ES IMPORTANTE. POR LO QUE SE VALIDAR EN GEN QUE.
ETC ETC ETC.

2.2 ANTECEDENTES.
2.2.1 El virus del dengue.
El dengue es un arbovirus del gnero de los Flavivirus en donde se han
identificado ms de 500 integrantes. Llega a infectar a los humanos usando a los
mosquitos como vectores, tpicamente Aedes aegypti, siendo ms susceptibles
las localidades situadas en climas clidos y hmedos.
El ARN genmico viral se traduce en un solo precursor de poliprotena (711) que
consta de tres fragmentos estructurales (C [cpside], prM [membrana] y E
[envolturavente]) y siete NOTA: FALTA UNA protenas no estructurales (NS1, NS2a,
NS2b, NS3, NS4a, Y NS5). Las protenas estructurales son esenciales para el virin y
tiene ntima relacin con la entrada, fusin y ensamblaje del mismo. En cambio, las
protenas no estructurales, no se conoce realmente su funcin pero se ha descubierto
que tienen un papel en la replicacin del virus y juegan importantes y numerosos roles
en la evasin del sistema inmune del husped. En particular, NS3 y NS5 son protenas
multifuncionales y son el mayor componente enzimtico para la replicacin viral. La
protena NS3 especficamente contiene una proteasa de serina en su N-terminal y un
dominio de helicasa en su C-terminal. (81)

8
FIG. 1. (Assenberg) NOTA. PIE DE FIGURA.
NOTA. INCLUIR ALGUNA FIGURA/ILUSTRACIN

2.2.2 La enfermedad del dengue.

Ms de 50 millones de casos se reportan anualmente, teniendo sntomas simples
como una simple gripa o llegando a cobrar vidas, donde se estima que son
alrededor de 24,000 personas en las diferentes modalidades del virus. Al contraer
el virus, la infeccin vara desde una fase asintomtica o leve (fiebre del dengue que
presenta dolor de cabeza, artralgia, mialgia, nusea, vmito y prurito) hasta una severa
enfermedad hemorrgica (fiebre hemorrgica que presenta sangrados, trombocitopenia
y fuga de plasma que se le atribuye al aumento de la permeabilidad vascular ) o en
casos extremos que progrese la enfermedad, un shock, caracterizado por falla en el
sistema circulatorio. (6)(fiebre hemorrgica, Etc.)

9
Cabe destacar que Mxico puede considerarse una regin endmica de dengue desde
que el mosquito vector, Aedes aegypti, est presente en mas del 85% del pas y
teniendo presente los cuatro serotipos del dengue, teniendo la necesidad de
implementar mtodos eficientes de diagnstico para mejorar el manejo de los casos en
todo Mxico. (3)

(Centro Nacional de Medicina Tropical-Consejos generales sobre como viajar)

NOTA. INCLUIR
ALGUNA

FIGURA/ILUSTRACIN DE LA DISTRIBUCIN DEL DENGUE. HABLAR DE LOS

NIVELES O GRADOS DE LA ENFERMEDAD (DF, DHF, DSS)

2.2.3. PParticipacin de los leucocitosglbulos blancos de los

linfocitos T en el dengue.sarrollo de la enfermedad

En la infeccin por dengue, el principal objetivo son las clulas dendrticas que son las
responsables de la exposicin del antgeno en las infecciones, siendo las que dan paso
de la inmunidad innata a la inmunidad adquirida. Utilizando los receptores tipo Toll
presentes en la membrana celular y un grupo de reacciones en cascada, culminan en

10
la produccin de de Interfern de tipo 1 (IFN-a and IFN-b) que induce un estado de
anti-virus y que hace que se expresen genes estimulados por interferon que van a
prevenir la replicacin viral. Sin embargo, se ha visto que las protenas no estructurales
predentes en el virus del dengue pueden ser capaces de desarrollar mecanismos en
donde se evade a la inmunidad innata mediada por interfern de tipo 1. (8)
Estudios han demostrado que los linfocitos T estn en el desarrollo de fiebre
hemorrgica del DengueDFH por lo cambios en la vasculatura. En la infeccin
aguda del dengue se observa la disminucin de linfocitos T CD3 +, CD4 + y CD8
+. Pero durante la viremia que es ms evidente en fiebre hemorrgica del
dengueFHD se observa un aumento en CD4 +, y CD8 + en respuesta a los
antgenos del dengue. (69)
Un nmero creciente de estudios han demostrado que las clulas T CD8 + especficas
de DENV estn implicadas en la lisis de clulas infectadas con dengue y el control de la
replicacin del dengue. (Chen).
Adems, el interfern gamma demostr ser importante en la eliminacin de infeccin
por dengue. Estudios recientes dicen que T CD8 + que secretan IFN-g estn
involucrados en el control de la replicacin y la infeccin del dengue. Dado que el
eptopo CD8 de clulas T es un aminocido mnimo, el cido es necesario para la
activacin de clulas T CD8 +, as la identificacin del eptopo de clulas T CD8 +
puede ayudarnos explorar el papel de las clulas T CD8 + en la infeccin por dengue.
(Duan).
La activacin de linfocitos T especficos del virus del dengue durante interacciones con
monocitos infectados por el virus del dengue puede dar lugar a un aumento de la
permeabilidad capilar por varios mecanismos. Se ha demostrado que los linfocitos T
producen altos niveles de interfern (IFN) g, (IL) -2, Factor de necrosis (TNF) a, y
linfotoxina (TNFb) Estas citocinas pueden inducir una fuga capilar a travs de mltiples
efectos directos e indirectos sobre el endotelio. Se ha demostrado que TNFa induce
filtraciones de fuga y shock en modelos animales. (Rothman)

11
NOTA Tratar de enfocarse ms en los linfocitos T y ampliar la informacin para
que podamos llamar a esta seccin Participacin de los linfocitos T en el
dengue.

2.2.4 NImportancia de los niveles de expresin gnica y en el

funcionamiento celular
.

El enlace de conjunto de genes de importacin puede usarse para cargar un conjunto

de genes o identificadores de transcripcin. De manera similar, los conjuntos de genes
tambin se pueden exportar desde la interfaz de minera de datos utilizando el men de
anlisis, facilitando la transferencia genes o secuencias seleccionados para su anlisis
mediante mtodos. Despus de identificar los conjuntos de genes que muestran
patrones similares de expresin, los usuarios pueden utilizar el men para ejecutar
directamente anlisis para identificar secuencias que codifican protenas. (96)
Tomando como ejemplo la va de activacin NF-B, desempea una funcin esencial
en los procesos de inflamacin, activacin de los linfocitos, la supervivencia celular y la
formacin de rganos linfoides secundarios. El NF-B es un factor de transcripcin que
al momento de ser activado por los receptors TLR (receptor tipo toll) y las citocinas,
viaja desde el citoplasma celular hasta el ncleo, interaccionando con el ADN y gracias
a que contiene un dominio de activacin, puede facilitar el inicio de la transcripcin para
obtener los efector ya mencionados con anterioridad. La fase de NF-B inactiva que
cuenta con la union de las protenas p65/RelA, RelB y c-Rel; algunas de las formas
convinadas de stas protenas, se les considera heterodmeros NF-B cannicos. Los
heterodmeros NF-B cannicos residen en el citoplasta unidos a un inhibidor llamado
IB, para que el NF-B quede de manera activa, debe de ser fosforilado y
ubiquitinizado en la regin del inhibidor IB por una serie de complejos pasos que se
omitirn. Al ubiquitinizar la region inhibidora y ser degradada por el proteosoma, el NF-
B puede llevar acabo sus funciones celulares normales. (Abbas) 10

12
 Abul K. Abbas, et.al.

NOTA. Algunas secciones como esta por ejemplo parece sacada del traductor.
Esta seccin debe contener ms informacin general acorde con su ttulo, no tanto de
los mtodos para su determinacin.

2.2.5 Regulacin de la expresin gnica en el dengue.

NOTA: Mencionar aqu los diferentes estudios que haya del dengue en diferentes
tipos celulares.

Por ejemplo numerosos estudios han indicado que la concentracin de citocinas,

mediadores y receptores solubles puede aumentar significativamente durante la
infeccin del dengue comoIL-10 [56], TNF- [57], IL-8 [58], IL-12 [59], IFN- [19], IFN-,
elastasa, y TNF soluble y los receptores de IL-2 son aumentados durante DF y / o
DHF.(108)

13
Recientemente, ha habido varios informes de estudios de perfiles de expresin en
pacientes infectados con DENV y otros grupos han monitoreado expresin gnica en
lneas celulares y clulas primarias infectadas con DENV in vitro. Por lo que al integrar
estos resultados puede ser posible reunir un cuadro completo de DENV-host
interacciones que conducen a diferentes resultados de la enfermedad.(418)El material
encargado de guardar la informacin gentica, debe tener la posibilidad de guardar
nueva informacin, replicar su genoma fielmente y permitir cierto grado de cambio en
l. En este caso ARN es el encargo de guardar la informacin gentica del DENV. Esta
informacin est organizada en genes, los cuales son informacin e instruccin para
generar unas protenas, las cuales generan cierta funcin en el organismo. Este es el
camino que conecta el genotipo con el fenotipo. En el genoma de un organismo, solo
se expresan algunos genes de todo el genoma completo que contiene, unos son
silenciados y nunca llegan expresarse, mientras que otros son activados. Esto puede ir
cambiando con el tiempo. Esta diferenciacin entre que genes son silenciados y
activados es lo que le da una funcionalidad especfica, correcta y necesaria para que
un organismo haga su funcin encargada. Cualquier mutacin, activacin o
silenciamiento de genes generara un cambio en la funcionalidad del organismo ya sea
para bien o para mal. Ya que tendr una expresin gentica diferente y por lo tanto
diferente protenas con funciones diferentes que anteriormente no tena. Las causas de
esto pueden ser muchas, evolucin, funcionalidad del organismo, proteccin o inducido
por un agente externo. Un agente externo puede ser un virus, los cuales han
evolucionado codificando protenas capaces de generar un silenciamiento o regulacin
negativa de la expresin gentica, generando que su husped tenga una fisiologa
diferente y que no cumpla fielmente su funcin encargada. Esto altera la homeostasis
del organismo y por lo tanto generando problemas en su equilibrio.

NOTA. INCLUIR OTRAS SECCIONES:

14
 mRNA y PROTENA. NIVELES A LOS QUE PUEDE DETERMINARSE LA
EXPRESIN GNICA

2.2.6. Reaccin en Cadena de la Polimerasa ( HERRAMIENTAS

MOLECULARES PARA DETERMINAR LOS NIVELES DE mRNA EN LA
CLULA.

qPCR.PCR (punto final)).

El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma:
partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucletidos
complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unin de los
cebadores al molde. Ahora bien, cmo tiene lugar esta reaccin? Como veremos, los
cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos
necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalizacin, hibridacin y
elongacin.

En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos
cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalizacin y se
lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94C.

15
El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los
cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Esta segunda fase se
conoce como hibridacin. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y
60C.

Por ltimo, en la fase de elongacin o extensin, la enzima polimerasa incorpora

nucletidos complementarios a partir del extremo 3 libre de la regin en que han
hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de
la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de
elongacin suele ser de 72C.

16
Estas tres fases constituyen un ciclo de la PCR. Qu se ha obtenido tras un ciclo de
PCR? Unicamente una copia de un pequeo fragmento del DNA molde. En este primer
ciclo, los fragmentos generados no tienen el mismo tamao: la copia de cada una de
las cadenas se inicia, a partir del extremo 3, en el punto en el que el cebador hibrida
con el DNA molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es
capaz de aadir ms nucletidos (es decir, que la nueva cadena formada no tiene un
tamao definido). (11)

Actualmente sabemos que la misin de la PCR es copiar millones de veces una

secuencia especfica de ADN blanco mediante una poderosa catlisis llevada a cabo
por una enzima conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades
pequeas de ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con
diferentes fines. (13)

NOTA. DESCRIBEN EN QU CONSISTE Y CMO SE LLEVA A CABO A TRAVS

DE LAS ETAPAS DE CADA CICLO, PERO NO MENCIONAN NADA DE SU USO O
APLICACIN, UTILIDAD, VENTAJAS, ETC.

2.2.7. Reaccin en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa (qPCR).

Los primeros en desarrollar las bases de la PCR tiempo real fueron Higuchi y
colaboradores, al videograbar en tiempo real la incorporacin de bromuro de etidio al
ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV.
El trmino en tiempo real se refiere a que la deteccin de los productos amplificados
que suceden en cada ciclo de la reaccin, adems, es posible cuantificar la cantidad de
ADN de la muestra inicial, a diferencia de la PCR convencional donde no es posible
detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia blanco.

17
Una de sus aplicaciones ms usadas es para cuantificar cambios muy pequeos en la
expresin gnica mediante la deteccin de los niveles del ARNm procedente de clulas
o tejidos.
Los ingredientes qumicos en la PCR en tiempo real, son los mismos utilizados en la
PCR punto final (PCR convencional), slo que generalmente la enzima, dNTPs, Mg +, el
buffer y el sistema reportero de fluorescencia se venden juntos en una solucin
conocida como Master mix. Cabe mencionar que los primers deben ser diseados
especialmente para garantizar una alta especificidad y evitar errores.
SBYR Green es uno de los reporteros fluorescentes ms utilizados por los
investigadores debido a su bajo costo, ste solo en el momento en que interacta con
la la doble cadena de ADN, emitir fluorescencia, lo que ser detectado por el equipo.
Cabe destacar que las sondas SBYR Green pueden unirse con los dmeros de primer,
de esta manera, alterando los resultados. Actualmente algunos software y
termocicladores utilizan una curva de disociacin o curva melting para evaluar si se
form producto nico o si hay presencia de dmeros de primer. (13)
Existen otro tipo de sodas, por ejemplo, la sonda TaqMan formada por un fluorforo en
su extremo 5' en donde se une covalentemente y un quencher en el extremo 3'. Resulta
que la cercana entre el quencher y el fluorforo imposibilita que se produzca la emisin
de luz por tanto, cuando hibrida en la doble cadena de ADN, la actividad exonucleasa
5-3 de la Taq polimerasa rompe esta unin, logrando que la fluoroforo sea liberado y
detectado por el equipo. (14)

18
 Manit Arya, et.al

Por tanto, en la PCR tiempo real se recurre a un software que genera una serie de
grficas en donde se muestran todos los datos necesarios para conocer si la reaccin
fue exitosa o no, de otro modo, muestra los datos expresados del gen de referencia
obteniendo el nmero de veces en el que aumentaron o decrementaron los niveles de
ARNm o en su caso, si no hubo cambios. (13)

19
 Tamay de Dios, et.al

Es por ello que una de las formas recientes para detectar y cuantificar a los cidos nu-
cleicos es a travs de la PCR en tiempo real, la cual es una modalidad de la PCR
considerada como una tcnica cuantitativa.
Los primeros en desarrollar las bases de la PCR tiempo real fueron Higuchi y
colaboradores, al videograbar en tiempo real la incorporacin de bromuro de etidio al
ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV.
El trmino en tiempo real se refiere a que la deteccin de los productos amplificados
que suceden en cada ciclo de la reaccin, adems, es posible cuantificar la cantidad de
ADN de la muestra, a diferencia de la PCR convencional.
Una de sus aplicaciones ms usadas es para cuantificar cambios muy pequeos en la
expresin gnica mediante la deteccin de los niveles del ARNm procedente de clulas
o tejidos.
Los ingredientes qumicos en la PCR en tiempo real, son los mismos utilizados en la
PCR punto final (PCR convencional), slo que generalmente la enzima, dNTPs, Mg +,
el buffer y el sistema reportero de fluorescencia se venden juntos en una solucin
conocida como Master mix. A diferencia de la PCR tiempo final, los primers deben
ser diseados especialmente para garantizar una alta especificidad EN AMBAS
SBYR Green es uno de los reporteros fluorescentes ms utilizados por los
investigadores, ste, se le une a un quencher, donde ambos se encuentran en
estrecha union mientras la sonda no hibride a la secuencia blanco. NOTA. LA
INFORMACIN ES INCORRECTA PARA SYBR GREEN. Cuando hibrida, ocurren
cambios conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite que la
actividad exonucleasa 5-3 de la Taq polimerasa rompa esta unin, logrando que la
fluorescencia emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo.
El equipo tiene un software que genera una serie de grficas en donde se muestran
todos los datos necesarios para conocer si la reaccin fue exitosa o no, de otro modo,
muestra los datos expresados del gen de referencia obteniendo el nmero de veces en
el que aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm o en su caso, si no hubo
cambios. (12)

20
NOTA. LA SECCIN EN
GENERAL REQUIERE DE MS
INFORMACIN.
UTILIDAD DEL MONITOREO EN TIEMPO REAL, NO ES PARA CONOCER EL
NUMERO DE CADENAS QUE VAN APARECIENDO, SINO PARA CALCULAR EL
NUMERO DE CADENAS MOLDE INICIALES.
SYBR GREEN
TAQMAN
CUANTIFICACIN RELATIVA.

2.3 JUSTIFICACIN.
Actualmente vemos que el DENV es una infeccin muy comn en todo el mundo
incluso aqu en Mxico y lamentablemente no se ha logrado creaer una cura o vacuna
eficiente para proteger a las personas. Mientras que actualmente no se ha encontrado
una forma de controlar la picadura por Aedes aegypti principal vector del DENV es
mejor enfocarse en detener la infeccin cuando el DENV ya est en el cuerpo. Se ha
encontrado que los linfocitos T estn implicados en la patogenicidad del DENV, ya que
no ayudan a detener la enfermedad si no de progresarla. Por eso es necesario hacer la
validacin del nivel de expresin de un gen en estas clulas, para encontrar de que
forma es que DENV afecta a linfocitos T y como estos ayudan a la progresin de la
enfermedad.Nos encontramos en la situacin actual no saber cuales son los genes
implicados dentro de nuestras clulas blancas, especficamente los linfocitos T al
momento de que son infectados con el virus del Dengue. De ste modo, se opt por
desarrollar un Microarreglo de expresin con stas clulas, con el objetivo de poder

21
tener un listado de posibles genes estn implicados en el proceso de infeccin del
virus.
Al tener esta lista de genes, podemos ver si hay una protena la cual es suprimida por
DENV y as ver como los linfocitos T pueden estar involucrados en la generacin de
Fiebre del dengue, fiebre hemorrgica del dengue y shock del dengue.
As se sabra ms sobre el mecanismo de accin del DENV, y poder ver como inhibir
este mecanismo para dar alguna solucin al problema.

NOTA. VER LAS SUGERENCIAS PARA LA DEFINICIN DEL PROBLEMA Y

CENTRARSE EN LA IDEA DEL PRESENTE TRABAJO, O SEA, LA VALIDACIN DEL
NIVEL DE ETC ETC ETC.

2.4 HIPTESIS.
Se lograr validar mediante RT-qPCR el nivel de expresin de un gen regulado
negativamente en linfocitos T al ser expuestos al virus del dengue.
con xito la validacin del Microarreglo, tendiendo una lista de genes implicados en la
infeccin del virus del Dengue.

2.5 OBJETIVO GENERAL.

Determinar la expresin gentica de linfocitos T infectados con DENV a partir de
un microarreglo de expresion.

2.6 OBJETIVOS ESPECFICOS.

Realizar una extraccin de sangre perifrica de personas infectadas con DENV,
para subsecuentemente la purificacin de linfocitos T.
Comparar elExtraccin de RNA obtenido a partir de los linfocitos T expuestos al
DENV y no expuestos.
Utilizar el RT-PCR para la formacinObtencin de cDNA de buena calidad a
partir de RNAm extrado anteriormente.
Diseo de primers/cebadores para Cuantificar el cDNA por PCR tiempo real del
gen seleccionado..

22
 Fabricacin de un microarreglo de expresin de acuerdo a los genes de
linfocitos TDeterminacin de los niveles de expresin del gen seleccionado.

3. MATERIAL Y MTODOS.
3.1 DEFINICIN DE TCNICAS EXPERIMENTALES

3.1.1 Extraccin de RNA.:

La solubilizacin y extraccin de TRIzol es un mtodo para desproteinizar ARN. Este
mtodo es particularmente ventajoso en situaciones en las que las clulas o tejidos se
enriquecen de RNasas endgenas o cuando la separacin del ARN citoplsmico del
ARN nuclear es impracticable.
TRIzol (O Reactivo TRI) es una solucin monofsica de fenol y isotiocianato de
guanidinio que simultneamente solubiliza el material biolgico y desnaturaliza la
protena. Por lo tanto, el ARN, el ADN y la protena se pueden purificar a partir de una
sola muestra (de ah el nombre TRIzol). (Rio2010)
a) Mtodo
Aadiremos 0,5 ml de isopropanol a la fase acuosa por 1 ml de reactivo TRIzol.
Posteriormente se encuba por 10 minutos para as despus centrifugar durante 10
minutos a 12.000 g a 4 C. Descartaremos el sobrenadante con una micropipeta. Y
nos quedaremos con el precipitado que es un granulo blanco. Resuspenderemos el
granulo en 1 mL de etanol al 75% por 1 mL de TRIzol donde agitaremos la muestra
para despus centrifugarla durante 5 minutos a 7500 g a 4 C. Descartaremos de
nuevo el sobrenadante con una micropipeta y secaremos la pastilla de RNA obtenida
durante 5-10 minutos. Resuspenderemos el sedimento en 20-50 uL de agua libre de
RNasa 0.1 mM EDTA, or 0.5% solucin de SDS. Incubaremos en un bao de agua o
bloque de calor fijado a 55-60 C durante 10-15 minutos. (Trizol reagent)

3.1.2 Sntesis de Cdna.

Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario
hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La

23
transcripcin reversa genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN
complementario (DNAc) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR.
(Luque, Jose)
a) Metodo
Colocaremos tubos de dilucin estriles y tubos de reaccin sobre hielo.
Posteriormente descongelaremos el RNA extrado anteriormente. Despus en hielo
combinaremos 1ug RNA y el cebador de DNAc en agua libre de nucleasas para tener
un volumen final de 5ul los cuales los acomodaremos en mltiples reacciones.
Cerraremos cada tubo de RNA y los colocaremos en bloque de calor a 70 C durante 5
minutos. Despus colocaremos los tubos en una minicentrifugadora durante 10
segundos y recogeremos el condensado. Mantendremos los tubos encerrados en hielo
hasta aadir la transcriptasa inversa. Procederemos en hacer la solucin de
transcriptasa inversa. La cual la haremos al combinar sistema de transcriptasa inversa
en un tubo de 1.5 ml sobre hielo y la agitaremos antes de ponerlo en el tubo de
reaccin. Aadiremos 15 ul de transcriptasa inversa en cada tubo de reaccin sobre
hielo. Aadiremos Aadir 5 l de ARN y mezcla de cebadores a cada reaccin para un
volumen de reaccin final de 20 l por tubo. Colocaremos los tubos en un bloque de
calor a 25 C, e incubaremos durante 5 minutos para el recocido. Incubaremos los
tubos en un bloque de calor a temperatura controlada a 42 C durante una hora para la
extensin. Incubaremos los tubos de reaccin en una temperatura de 70 C durante 15
minutos para inactivar la transcriptasa inversa para despus cuantificarla. Haremos la
mezcla de PCR con concentraciones de transferencia de magnesio cloruro, dNTP,
buffer y cebadores. Adicionaremos de 20 l o 1 l de la reaccin de transcripcin
inversa en 100 l de PCR. Despues agregaremos 8 ul de acido termofilico.

3.1.3 qPCR
a) Mtodo.
El cDNA sintetizado usando la Transcriptasa Inversa puede amplificarse y cuantificarse
usando El sistema qPCR.
Prepararemos la mezcla de reaccin en un microtubo para PCR mediante la
combinacin de los siguientes: 5 ul de PCR buffer, 4ul dNTP mixto, 0.5 ul de control

24
primer 1, 0.5 ul de control primer 2 y 3, 0.25 takara taq, 0.5 ul de control templado y
39.25 ul de dH2O. Colocaremos los tubos en el termociclador y haremos la reaccin
bajo las siguientes condiciones: 94C durante 1 minuto, 68C 4 minutos para el
recocido y la extencion y por ultimo 5 minutos a 72 C.
Extraccin de RNA:

Sntesis de cDNA
qPCR
4. ORGANIZACIN DE LA INVESTIGACIN
4.1 PROGRAMA DE TRABAJO
4.2 RECURSOS HUMANOS
4.3 MATERIALES
4.3.1 Universo de trabajo:
Linfocitos T expuestos al virus del dengue.
4.3.2 Tamao de muestra.
No aplica.
4.3.3 Definicin de unidades de observacin.
Linfocitos T expuestos al virus del dengue.
4.3.4 Definicin de grupos de control.
Linfocitos T sanos.
4.3.5 Criterios de inclusin.
No aplica.
4.3.6 Criterios de exclusin.
No aplica.
4.3.7 Criterios de eliminacin.
No aplica.

4.4 PRESUPUESTO
4.5 DIFUSIN
5. DATOS DE LOS INVESTIGADORES

25
6. FIRMA DE LOS INVESTIGADORES

7. REFERENCIAS

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MICROBIOLOGY REVIEWS, 3(4), pp.376-396.
2.- Mercado Curiel, R., Black IV, W. and Muoz, M. (2008). A dengue receptor as
possible genetic marker of vector competence in Aedes aegypti. BMC Microbiology,
8(118), p.15.
3.- Alvarez Rodriguez, L., Ramos Ligonio, A., Rosales Encina, J., Martnez Cazares, M.,
Parissi-Crivelli, A. and Lopez Monteon, A. (2012). Expression,Purication,and
Evaluation of Diagnostic Potential and Immunogenicity of a Recombinant NS3 Protein
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Patterns of Dengue Virus-Infected Children from Nicaragua Reveal a Distinct Signature
of Increased. Metabolism. PLoS Negl Trop Dis 4(6) e710
5.- Yung Chun, C., Huan Yao, L., Hsiao Sheng, L., Yee Shin, L., Tzu Fun, F. and Trai
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infection increases vascular permeability. Cytokine, 54(2011), p.10.
6.- Fuentes Miranda, C., Snchez Garca, F., Coker, A., Rojas Espinosa, O., Salinas
Tobn, R. and Moreno Altamirano, M. (2014). Dengue Virus Serotype-2 Impairs
Proliferation of Healthy Donors T Lymphocytes. Intervirology, p.10.
7.- Halstead SB. Pathogenesis of Dengue: Dawn of a New Era [version 1; referees: 3
approved] F1000Research 2015, 4(F1000 Faculty Rev):1353
8.- Silveria G, Strottmann D, T. Zanchin N, Bordignon J, Duarte dos Santos C. Single
point mutations in the helicase domain of the NS3 protein enhance dengue virus
replicative capacity in human monocyte-derived dendritic cells and circumvent the type I

26
interferon response. 1st ed. The Journal of Translational Immunology. Curitiba, Brasil;
2005.
9.- Dissanayake, S., Ribeiro, J., Wang, M., Dunn, W., Yan, G., James, A. and Marinotti,
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Aedes aegypti. BMC Research Notes, 3(248), p.7.
10.- Fink, J., Gu, F. and Vasudevan, S. (2006). Role of T cells, cytokines and antibody in
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11.- Prez de Castro A. Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain
Reaction, PCR). Universidad Politecnica de Valencia. 2011;.
12.- Tamay de Dios L, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigacin en Discapacidad.
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multiepitope DNA vaccine against dengue virus serotype 1. Microbiol Immunol, 60,
pp.835845.
14.- Duan, Z., Guo, J., Huang, X., Liu, H., Chen, X., Jiang, M. and Wen, J. (2015).
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Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harb Protoc, 10, p.3.

Faltan por agregar..

27
NOTAS.
FALTA Portada, Indice, Definicin del problema.
Cada una de las secciones debe de desarrollarse de forma ms extensa, como si fueran temas
que les dejaron investigar y desarrollar. Incluir imgenes, figuras, tablas, etc.
La seccin de Importancia de los niveles de expresin gnica no tiene referencias.

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