Introduo PCR

(Reao em cadeia da polimerase)

carolina@iftm.edu.br
 Breve histrico
Tcnica inventada em 1985 por Kary B.
Mullis
Antes, utilizava-se uma polimerase termossensvel
Antes, a replicao de DNA s podia ser feita in vivo
Descoberta da bactria Thermo aqcuaticus em 1969
Utilizao da Taq DNA polimerase em 1976
Brigas por patentes e autoria da descoberta

A tcnica baseada na amplificao

exponencial de pequenas quantidades de DNA
in vitro, empregando elementos do processo
natural de replicao do DNA
Estrutura da clula bacteriana
DNA = uma nica
molcula compactada
numa regio definida
do citoplasma
(nucleide)

Plasmdeo = pequenas
molculas circulares de
DNA adicional,
transferncia de
material gentico para
outras bactrias
 Estrutura do DNA

cido desoxirribonucleico

ADENINA TIMINA
GUANINA CITOSINA

LIGAO ENTRE AS DUAS CADEIAS COMPLEMENTARES = HIBRIDIZAO

Sequncia 5 3
Uma fita 5 3
Uma fita 3 5
Relao com a
posio dos
tomos de C da
pentose

O DNA UM CIDO NUCLEICO

FORMADO POR DUAS CADEIAS
ANTIPARALELAS E
COMPLEMENTARES
 Genoma
Sequenciamento do
material gentico do
organismo

Bancos genticos de
biologia molecular
GenBank e outros

DNA bactriano =
mdia de 3 a 4
milhes de pares de
Estudos da gentica e da base
bioinformtica
PCR
uma tcnica que amplifica uma sequncia
especfica de DNA (alvo), com o objetivo de
torn-la abundante e disponvel para
diversas tcnicas de biologia molecular

O alvo (target) pode ser um gene inteiro ou

somente uma regio pequena do gene

GCAGTATTAAATTGGGCTA . . . AATTGGTTCGTACCTGAA
COMO SE FAZ UMA ANLISE
DE PCR
Algumas consideraes

PCR de micro-organismos isolados ou de

amostras de alimentos (exige pr-preparo
das amostras)

Tcnica com utilizao de quantidades

mnimas de reagentes (nanogramas)

Qualquer sequncia de DNA externo pode

ser contaminante (poeira, DNA humano)
 Mistura de PCR (PCR Mix)

Soluo tampo
MgCl2
dNTPs
Taq polimerase
Primers
Molde de DNA
gua ultra-pura
Reagentes para PCR Mix
Soluo tampo Cloreto de magnsio

Funo: manter pH Funes

Cofator enzimtico da
da soluo (mix) Taq DNA polimerase
constante Facilitar o anelamento
Tris-HCl dos primers
pH= 8.3 - 8.8 Concentrao: 0,5 a
2,5 mM
20C.
Sal de cloreto: em
soluo ocorre
dissociao Cl- e Mg++
Reagentes para PCR Mix
Taq polimerase

Enzima termoestvel recombinante extrada

da bactria Termus aquacticus.

Funo Sntese de molculas de DNA de

cadeia dupla idntica original, na regio do
DNA-alvo, a partir da unio dos nucleotdeos
complementares.

Quantidade na reao: 1 a 2,5 U

 Reagentes para PCR Mix
Desoxirribonucleot[ideos fosfatados (dNTPs)
Matria-prima para formar Concentrao: 20 a 200
os nucleotdeos M
amplificados
dATP adenina Diluio em quantidades
dTTP timina equivalentes para cada
dGTP guanina nucleotdeo evitar
dCTP citosina erros de incorporao,
seno os nucleotdeos
livres na soluo
Funo Gerar uma fita
agregam-se no sentido 3
dupla complementar para do primer
cada uma das fitas simples
dNTPs mix prontos
de DNA-alvo
 Reagentes para PCR Mix
Primers ou iniciadores
Sequncia de 15 a 30 oligonucleotdeos sintetizada a partir
de fita simples complementar ao DNA-alvo
Funo
Ligar-se (hibridizar) no DNA-alvo a partir da
complementaridade de seqncia
Flanquear as extremidades da regio a ser amplificada,
marcando o incio e o fim da sequncia-alvo
Sempre usados aos pares, um para cada fita de DNA
Forward primer 5-GTATGGTGGTGTAACTGAGC-3
Reverse primer 5-CCAAATAGTGACGAGTTAGG-3
Concentrao na reao: 0,1 a 0,5 M
excesso para que as duas fitas no se liguem de novo uma a
outra
Reagentes para a PCR mix
Template ou Molde de DNA
Extrao do DNA da clula
Culturas com 18h (fase exponencial do
crescimento)
Centrifugao
Descarte do lquido
Lavagem
Centrifugao
Ressuspenso
Fervura por 20 min/adio de
enzimas/etanol

Quantidade necessria para a reao: < 1 g

 Purificao do DNA
Possveis interferentes depois da extrao
Ribossomos
Restos de membrana
Parede celular
Kits de purificao comerciais (cromatografia de
afinidade)
A realizao da purificao depende do tipo de
anlise que pretende-se fazer
 FASES DE UMA ANLISE DE PCR

PCR (reao)
Desnaturao
Anelamento
Extenso
Eletroforese
Fotodocumentao
Edio, anlises e
interpretao da
imagem
Desnaturao
As fitas de DNA so separadas atravs de
aquecimento a 95C
Anelamento
Ligao dos primers (pontes de hidrognio) com o DNA-
alvo a 55C.
 Extenso
A Taq polimerase utiliza os dNTPs adicionando-os a nova
fita de acordo com a regra de pareamentopolimerizao,
a 72 oC
Repeties do ciclo
Amplificao exponencial, at ter
quantidade suficiente do DNA-alvo
Produto de PCR = amplicon n. de n. de cpias
ciclos do amplicon
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
20 1.048.576
30 1.073.741.824
Protocolo de PCR

-------------repete por 35 a 40 ciclos------------

Eletroforese
Separao dos amplicons atravs de corrente eltrica

Eletroforese em gel
de agarose: fragmentos longos de DNA
de policrilamida: fragmentos pequenos de DNA

Eletroforese capilar: utilizada no sequenciamento de DNA

Migrao ocorre no sentido negativo positivo

Molculas mais leves migram mais rapidamente (poro

mais inferior do gel) que as mais pesadas (poro
superior do gel)

Comparao do peso molecular do amplicon com o do

biomarcador
Amplicons x Biomarcadores
Cada amplicon tem um peso molecular
diferente
Gel de agarose
Estrutura delicada influenciada por:
Temperatura
pH
Concentrao do meio
Fora do campo eltrico

Uso de soluo-tampo pH 8,3 tanto no

preparo do gel quanto para a corrida da
eletroforese
TBE (Tris-HCl, cido brico, EDTA)
TAE (Tris, acetato, EDTA)
 Sequncia no gel de agarose

Exemplo:
A = biomarcador
B = controle-positivo
C = controle-negativo
D, E = amostras
F = biomarcador

NUNCA ESQUECER A LOADING DYE

(corante para a eletroforese)
 FOTODOCUMENTAO
No possvel visualizar os
amplicons logo aps a
eletroforese

necessrio corar o gel com

corantes fluorescentes
Brometo de etdio (txico e
cancergeno)
Nitrato de prata (mais
usado em gel de
poliacrilamida)
Gel Red (atxico, mais caro)

Fotografia tirada em uma

cmara com luz UV
 Imagem
Identificao de Bacillus cereus isolados de
leite de cabra em p (deteco do gene
GroEl)
L + ___________AMOSTRAS________ L
- _

400 bp
Outros mtodos que usam PCR
Multiplex-PCR
RAPD Random amplified polymorphic
DNA
RT-PCR (Real Time) - quantitativo
AFLP Amplified fragment length
polymorphism
Long-PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase)
 Multiplex PCR
Mais de um DNA-alvo na mesma reao

Zocche et al. (2009)

1 e 5: ladder 100 pb
2: amplificacoes obtidas com os primers ESA, ESB, femA e DNA de S.
aureus FRI S6
3: amplificacoes obtidas com os primers SEC, SED, femA e DNA de S.
aureus FRI 361
4: controle negativo.
Zocche et al. (2009)
RAPD-PCR
Amplificao randmica (aleatria) de
vrios segmentos do DNA, utilizando
conjuntos de primers universais
Primers ERIC (Enterobacteria Repetitive
Intergenic Consensus)
Primers REP (Repetitive Extragenic
Palindromic Sequence)

til na anlise de diferenciao gentica

(genotipagem)
 ERIC-PCR
ERIC1R: 5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC GGGGATTCAC-3
ERIC2: 5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3

Wieser e Busse (2000)

Real Time - PCR
Resultados quantitativos
Uso de compostos fluorescentes na PCR

FASES
1) Basal: no h
amplicons suficientes
para a deteco da
fluorescncia
2) Log: a quantidade de
aplicons duplica a
cada ciclo
3) Plat: no h mais
aumento do nmero
de amplicons