LamolculadeADNylagentica

Loscidosnucleicos:Principalescaractersticasyfunciones
Es de fundamental importancia para el estudio de los seres vivos, conocer las principales caractersticas y
funciones de los componentes moleculares esenciales que los estructuran. Los cidos nucleicos son
biomolculas formadas por diferentes subunidades denominadas nucletidos, y que de acuerdo a la
condensacin de su carbono secundario se dividen en dos clases: el cido desoxiribonucleico (ADN) y el cido
ribonucleico (ARN). Dichos nucletidos se encuentran compuestos por una pentosa, un grupo fosfato y una
base nitrogenada, pero son estas ltimas las que le otorgan su carcter particular y nos permiten dividirlas en
dos familias, las purinas (heterociclo de 5 y 6 carbonos combinados) y las pirimidinas (heterociclo de 6
carbonos). Dentro de las bases pricas nos encontramos con la Adenina y la Guanina, mientras que dentro de
las pirimdicas tenemos a la Citosina, la Timina y el Uracilo. Particularmente las tres primeras son comunes
tanto para el ADN como para el ARN, no as con la Timina y el Uracilo, donde cada una completa el cuarteto
de bases del ADN y el ARN respectivamente.

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Respecto de las funciones de los cidos nucleicos, son las molculas que intervendrn en los procesos de
transferencia, replicacin, transcripcin y almacenamiento de la informacin gentica. Por otro lado, los
nucletidos que los componen tienen diversas funciones en donde nos encontramos con su utilidad como
coenzimas portadoras de energa, como coenzimas de transferencia de cido actico, azcares, aminas y otras
molculas y como coenzimas en reacciones de xido reduccin.

Elcidodesoxiribonucleico(ADN)
El ADN es una molcula que encontramos casi totalidad en los ncleos de las clulas (conforma la cromatina) y
una pequea cantidad dispersa en las mitocondrias o los cloroplastos (clulas vegetales). Al igual que el ARN,
el ADN es una cadena de polinucletidos direccionados a partir de la posicin del grupo fosfato del carbono 5 y
el grupo hidroxilo del carbono 3, y en base a la direccin de estas ltimas definen su polaridad, es decir, por
ejemplo en el ADN nos encontramos con dos cadenas dispuestas en posicin antiparalela formando una doble
hlice alrededor de un eje imaginario, lo que en este caso sera polaridad contraria. Tenemos aqu cadenas
formadas por un esqueleto de desoxirribosas unidas a grupos fosfatos mediante enlaces fosfo-dister, y
aparecen las bases nitrogenadas como protuberancias que se unen a la pentosa por enlaces glucosdicos, las
cuales se unen unas con otras de manera complementaria entre ambas cadenas constituyentes de la molcula de
ADN. Esto ltimo se corresponde a que estas bases nitrogenadas tienen la particularidad de formar slo dos
tipos de parejas: Adenina con Timina (Uracilo en el caso del ARN), y Citosina con Guanina. Se debe al hecho
de que la Guanina y la Citosina se enlazan mediante 3 uniones puente hidrgeno, y la Adenina y la Timina lo
hacen mediante 2, este hecho arroja una propiedad muy importante, la cual es son las configuraciones
tautomricas ms estables y de esta manera ocupan el mismo espacio dentro de la cadena de ADN, pudindose
intercambiar sin distorsionar la forma de la misma.

Respecto de la disposicin espacial, existen varios tipos de configuraciones posibles para la doble hlice, la ms
relevante desde el punto de vista biolgico es la desoxirribosa puesto que es la ms frecuente en condiciones
fisiolgicas. En esta configuracin la hlice es dextrgira, posee un dimetro de 2 nm, posee 10 pares de bases

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por cada vuelta separadas por unos 3,4 nm, y los grupos fosfato se encuentran por fuera de la hlice a una
distancia de 1 nm del eje. Los giros de las hebras del ADN no presentan simetra, existe una proyeccin de
giros que da origen a huecos asimtricos entre cada vuelta, uno denominado mayor (2,2 nm) y otro menor (1,2
nm). Todos estos estudios fueron llevados adelantes por los cientficos Watson y Crick, es por ello que al
modelo ms aceptado sobre la estructura del ADN lleva su nombre, sin embargo como se cit anteriormente,
existen varios tipos de configuraciones alternativas, tal es el caso de la forma alfa o las forma P y Z, las cuales
han sido el resultado de recientes investigaciones que justifican estas disposiciones segn diferentes factores
qumicos y fsicos, y dependiendo de las secuencias aleatorias de bases nitrogenadas, dndole a la molcula de
ADN un carcter dinmico.

LosGenes
El ADN contiene toda la informacin gentica de la clula, cifrada o codificada en su secuencia de bases, pero
A qu nos referimos con ello?. Esto ltimo significa que a partir de la disposicin de sus componentes, el
ADN es capaz de comandar la sntesis de protenas, principales elementos estructurales y funcionales de las

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clulas, y que lo hace por medio de lo que se denomina Gen. Puntualmente definimos como Gen a la secuencia
de ADN que contiene la informacin requerida para fabricar una molcula de ARN, y si sta corresponde a un
ARN mensajero, a partir de l construir una protena. Cada gen se localiza en un sitio particular del cromosoma
llamado locus y todos juntos en total abarcan alrededor de un 10% del ADN en s. Los genes no solo dirigen la
sntesis de las molculas de ARN, sino que adems, como el resto del ADN, posee la caracterstica de
replicarse en los procesos de divisin celular, es decir, sintetizan molculas de ADN complementarias que se
reparten en las clulas hijas con el fin de auto-perpetuarse. Complementariamente, por la forma como se
replican las molculas de ADN durante la meiosis y se distribuyen en las clulas germinativas, constituyendo
las entidades biolgicas a travs de las cuales se transmiten caracteres fsicos de padres a hijos, pues cada gen
es una regin del ADN que genera un carcter fsico susceptible de ser heredado dando lugar a una sola clase
de protena. Ms an, las mutaciones que los genes acumulan a lo largo del tiempo pueden resultar beneficiosas
para la evolucin de la especie.
Todo esto es posible gracias a una serie de pasos de decodificacin que comprenden un proceso de
transcripcin y traduccin de los genes. Este proceso arranca primero que nada por la replicacin de la hebra
de ADN y luego contina con la lectura de la informacin contenida en la secuencia de nucletidos, al
sintetizarse una cadena de ARN a partir de un segmento de ADN, paso al cual se denomina transcripcin. Este
ARN mantiene la informacin que estaba contenida en el ADN gracias a que lleva su secuencia
complementaria de nucletidos (con la excepcin del Uracilo en lugar de la Timina), y si bien es capaz de
intervenir de manera directa en algunos procesos celulares, lo ms habitual es que se encargue de justamente
transmitir esta informacin al siguiente elemento decodificador de la cadena, motivo por el cual es denominado
ARN mensajero. Este ARNm ser entonces la molcula conductora de un elemento concreto de la cadena de
ADN, es decir un gen, hasta los ribosomas, donde gracias al papel combinado con el ARN de transferencia y el
ARN ribosomal, se producir la traduccin de la informacin gentica regida segn la secuencia de
nucletidos transcripta, obtenindose as una serie de pasos que permitirn al ribosoma la sntesis de alguna
protena en particular.

Elcidoribonucleico(ARN)
Si bien en el prrafo comenzamos a nombrar a una molcula trascendental en el proceso de transcripcin de
informacin gentica para la sntesis de protena: el ARN. Este tipo de molcula es un polirribonucletido de
hebra sencilla de direccin 5-3, que presenta apareamientos entre bases nitrogenadas de manera similar a lo
que ocurre con el ADN, en este caso tendremos Guanina con Citosina y Adenina con Uracilo (a diferencia del
ADN donde esta unin ocurre con la Timina). La presencia del grupo hidroxilo en la posicin 2 le impide a la
hebra de ARN enrollarse en forma de doble hlice a diferencia de lo que sucede con el ADN. Estas molculas
de ARN se clasifican en 3 clases principales acorde a su participacin durante el proceso de sntesis de
protenas:

ARNm (mensajero)
ARNt (de transferencia)
ARNr (ribosomal)

ElARNmensajero

Ser el encargado de determinar la secuencia de aminocidos que luego compondrn a la protena, hacindose
valer de una suerte de cdigos genticos donde cada tres nucletidos de ARNm se conforma una unidad
denominada codn, la cual es la encargada de codificar un aminocido de la protena. Entre la secuencia de
aminocidos que determinan la protena nos encontramos con seales de inicio y de paro, determinadas por una
serie de codones que son los encargados de indicar el principio y el final de la protena a sintetizar. Su accin
sucede de manera directa con el ADN donde cada codn del ARNm ser conformado por bases
complementarias a las de la hebra madre de ADN.

ElARNdetransferencia

Ser el encargado de traducir la sntesis de protenas decodificando los datos que en ARNm lleva consigo,
para as proporcionar el ordenamiento de aminocidos adecuado. Poseen una estructura de hoja de trbol,

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donde a izquierda y derecha se hallan los extremos 5 y 3, mientras que en la zona central se halla la regin
anticodn. Dicha regin ser la encargada de interactuar de modo directo con el ARNm a travs de la
complementariedad de las bases. Por otro lado, en el extremo 3 que componen este trbol, se unir por un
enlace covalente el aminocido que ser transferido a la protena durante la sntesis.

ElARNribosomal

Ser el encargado de brindar el medio para la interaccin de los diferentes participantes de la sntesis proteica,
encargndose adems, de formar el enlace peptdico entre los aminocidos constituyentes de la protena. Son la
variante de mayor peso molecular de ARN, el mismo posee un tamao y conformacin constante en las clulas
de un mismo organismo, y puede componer hasta un 50% del ARN celular total en l. Su disposicin espacial
muestra una estructura secundaria de tallos y bucles originados al cerrarse la molcula debido a la existencia de
secuencias de bases nitrogenadas complementarias. Este ARNr forma complejos supramacromoleculares junto
con una serie de protenas ribosmicas que se estructuran en dos subunidades conocidas como subunidad
mayor y menor del ribosoma. El proceso de formacin de estas subunidades se inicia con la transcripcin de un
pre-ARNr que da origen a cada uno de los ARNr que posteriormente se ensamblan con las protenas
ribosmicas y conforman as estos complejos individuales que slo sern utilizados en el momento de sntesis
proteica.

ReplicacindelADN
Para comenzar hablando de la replicacin del ADN debemos ubicar el inicio de la misma. Dicha replicacin
tiene origen en sitios dentro del ADN que contienen secuencias especficas que no generan productos genticos
pero que marcan el inicio del copiado, y que funcionan como sitios de anclaje para las protenas que realizan el
proceso de replicacin. A partir de este origen de la replicacin, se generan dos sitios de copia activa de ADN,
las denominadas horquillas de replicacin. Estas presentan un movimiento bidireccional a partir de dicho
origen, donde a medida que avanza el copiado del ADN las horquillas se separan entre s de manera opuesta.
La replicacin del material gentico se ve comandada por una serie de diversas enzimas:

La ADN polimerasa, encargada catalizar la elongacin de la cadena de ADN durante la replicacin, es

decir, abrir camino dentro de la hebra del ADN garantizando la unin entre los nucletidos al incluir
aquellos complementarios y procurando eliminar cualquier insercin errnea.

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 La helicasa, protena encargada de utilizar la energa del ATP para catalizar el desenrollamiento
parcial y transitorio de la doble hebra de ADN, contando con la capacidad de identificar el sitio de
origen del gen y ensamblarse con el mismo.
Las ligasas, encargadas de catalizar la formacin de los enlaces entre los cidos nucleicos de las dos
hebras de ADN, para ello se valen tanto del NAD+ como del ATP.
Las protenas ssb, deben su nombre a las siglas en ingls protena estabilizadora de la hebra simple
(single strain binding protein), y son las encargadas de unirse a la hebra simple de ADN para impedir
que esta retome su conformacin de doble hlice.
Las primasas, encargadas de catalizar la formacin de pequeos segmentos de ARN llamados
cebadores, y que son indispensables para que la ADN polimerasa pueda comenzar su funcionamiento.
Las topoisomerasas, encargadas de cortar y ligar el ADN cambiando su topologa induciendo tanto
giros como relajamientos en los superenrollamientos dentro del mismo.

Todas estas enzimas comandan el proceso de replicacin del material gentico el cual, a grandes rasgos, puede
caracterizarse en 6 etapas:

1. El reconocimiento por parte de la helicasa del origen de la replicacin, y la apertura de la hebra.

2. El mantenimiento de la abertura de la hlice, donde las protenas ssb se asocian con los nucletidos de
cada hebra impidiendo que se forme la doble hlice.
3. El proceso de sntesis del cebador, donde la primasa sinteriza un ARN corto como cebador para la
siguiente enzima.
4. El inicio de la copia, donde el extremo 3 del cebador funciona como punto de anclaje para la ADN
polimerasa, y se inicia el proceso de insercin de nucletidos complementarios.
5. La relajacin de los superenrollamientos, los cuales deben evitarse para no impedir el avance de la
ADN polimerasa, gracias a la accin de las topoisomerasas.

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 6. La terminacin de la replicacin de la hebra de ADN, donde se identifica el sitio de terminacin del
proceso y las protenas inhibidoras del avance de las helicasas ponen fin a la replicacin.

TranscripcindelARN
Podemos decir que la iniciacin de la transcripcin del ARN determina qu genes se pueden expresar, as como
cundo y dnde. Esta transcripcin tiene lugar gracias a la deteccin de una seal promotor en el ADN, el cual
debe ser detectado y en donde mediante la accin de una serie de protenas, debe formarse un complejo de
preiniciacin, el cual facilitar la unin con la ARN polimerasa y regular la accin de la helicasa para permitir
el desdoblamiento de las dos hebras del ADN madre. Este inicio de transcripcin tambin se ve influenciado
por la accin de los llamados potenciadores y silenciadores, una serie de secuencias de ADN sobre las que
se unen factores proteicos que contribuyen a estabilizar y potenciar el complejo de preiniciacin
(potenciadores) o impedir la transcripcin (silenciadores). Luego de la iniciacin, comienza el proceso de
transcripcin donde la ARN polimerasa lee la secuencia de nucletidos de una de las cadenas de la doble hebra,
y sintetiza un polinucletido complementario reemplazando las Timinas por Uracilos conservando
perfectamente la informacin contenida en el ADN. Los polinucletidos se sintetizan en la direccin 5 a 3al
igual que el ARN mensajero, por lo tanto la hebra molde se lee en sentido 3 a 5 (antisentido) mientras que la
transcripcin es la que ocurre efectivamente en el sentido 5 a 3. De este modo se llamar hebra sentido a la
hebra de la doble cadena de ADN que contiene exactamente la misma secuencia de nucletidos del futuro
ARNm, mientras que se llamar hebra antisentido a la hebra complementaria. Luego el proceso de elongacin
del ARN transcripto estar sujeto a numerosas paradas debido a diversos obstculos que encuentre en su
camino la ARN polimerasa, estos pueden ser la concentracin de cromatina, o mismo daos internos dentro del
ADN. Como es de esperarse, la ltima fase de la transcripcin es la etapa de terminacin, donde se la misma
concluye en base a procesos madurativos del ARNm, puesto que la transcripcin suele continuar incluso
sobrepasando el extremo 3 del ARNm. Este proceso de maduracin del ARNm tiene su comienzo en la adicin
de un capuchn en el primer nucletido del mismo, el cual consiste en una Guanina modificada que establece
un enlace 5a 5 a diferencia del comn 5 a 3, y concluye con la modificacin del ltimo nucletido de la
cadena de ARNm mediante la adicin, en un corte interno previo, de una cola de poli-adeninas tras detectar una
seal de poli-adenilacin previa al nucletido final.

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Sntesisdeprotenas
La sntesis de protenas tiene lugar en los ribosomas del citoplasma celular, donde a grandes rasgos, se puede
decir que los aminocidos son transportados por el ARNt y llevados hasta el ARNm donde se aparean al codn
de este y al anticodn del ARNt por complementariedad de bases. Luego de la sntesis, el ARNm queda libre
para leerse de nuevo, y es ms, muchas veces comienza la sntesis de una nueva protena sin concluir la sntesis
de la primera, siendo este ARNm utilizado por varios ribosomas simultneamente. Este proceso de sntesis
regula la actividad enzimtica, es decir, todo lo que la clula pueda realizar.
La sntesis proteica como bien se dijo, comienza con la sntesis del ARNt, accin que ocurre gracias a la
catlisis de la ARN polimerasa y a la sntesis del complejo de iniciacin. El ARNt deber tomar los
aminocidos del ribosoma siguiendo las rdenes establecidas por el ARNm. Sabemos que el ARNt cuenta con
un brazo aceptor de aminocido (extremo 3) y otro complementario al codn del ARNm (el brazo anticodn)
en este caso el extremo 3 recibir en el proceso de sntesis proteica, la adicin del aminocido al ARNt gracias
a la accin de la enzima aminoacilsintetasa, la cual se encargar de reconocer el aminocido indicado para cada
ARNt y e interpretar el cdigo gentico para as detectar posibles errores y corregirlos. Funciona en conjunto
con una molcula de ATP, la cual activa al aminocido para poder ser unido a su ARNt especfico. As el ARNt
ir alineando los diferentes aminocidos siguiendo el orden de los codones para de este modo cumplir con sus
funciones. Al mismo tiempo que sucede la transcripcin del ARNt, la sntesis proteica cuenta con un proceso
de traduccin comandado por el ARNm. La traduccin comienza con una fase de iniciacin donde sucede la
unin de la subunidad menor del ribosoma al capuchn del ARNm maduro. Luego la subunidad menor se
desplaza por el ARNm hasta encontrar el codn de iniciacin, unindose as con el primer ARNt y la subunidad
ribosomal mayor. Este ARNt se une al sitio A del ribosoma en la etapa de iniciacin, luego sufre un
desplazamiento de tres nucletidos en la etapa de elongacin, y pasa a ocupar el sitio P. Esto permite que el
codn del ARNm quede dentro del sitio A donde acudir otro ARNt con un anticodn complementario al
nuevo codn. A continuacin, la cadena peptdica enlzada en el ARNt que ocupa el sitio P, es transferida al
aminocido del ARNt que ocupa el sitio A en la etapa de transpeptidacin, desplazando el ARNt primario del
sitio P al sitio E. Finalmente la terminacin de la traduccin tendr lugar cuando alguno de los tres codones de
parada ocupe el sitio A.

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TecnologadelosGenes
La tecnologa de los genes engloba todas aquellas tcnicas que permiten la manipulacin del gen como una
entidad bioqumica, y que dan lugar a la ingeniera gentica. Las tcnicas bsicas que la constituyen son: la
recombinacin gentica, la clonacin gentica y la posterior manipulacin de dichos genes. Al hablar de
recombinacin gentica estamos hablando de un reordenamiento de genes o fragmentos de los mismos, los
cuales sern reordenados en un nico microorganismo, para lograr as una combinacin de la informacin
gentica de dos o ms de ellos. Esta combinacin de informacin puede tener lugar gracias al intercambio de
segmentos genticos entre diferentes microorganismos (recombinacin homloga), o bien gracias a la adicin
de ADN nuevo al que el microorganismo ya posee previamente (como sucede en el caso de la transferencia de
plsmidos). Lo cierto es que este intercambio de informacin tiene como finalidad la posterior replicacin de
este nuevo ADN, para la propagacin del la modificacin gentica.
Para el aislamiento de genes puntuales, se debe trabajar con los genomas de los seres vivos, organizando cada
genoma especfico en lo que se denomina genoteca, y que contiene una mezcla de fragmentos de ADN que
representan todo el genoma de la partida. Dentro del genoma de cada organismo se debe identificar la secuencia
de aminocidos que codifica una protena especfica, y para localizarla nos podemos hacer valer de tres tcnicas
bsicas:

La clonacin, la cual consiste en inducir la formacin de cepas bacterianas que contengan una copia
del fragmento de ADN de inters, para poder seleccionarlo posteriormente.
La hibridacin, la cual consiste en la sntesis de una cadena sencilla de ADN o ARN, marcada
qumica o radiactivamente, y su posterior acoplamiento con el ADN a identificar. 3)
La reaccin en cadena de la polimerasa, que consiste en obtener mltiples copias de una regin
especfica de ADN por mtodos bioqumicos.

Estas tcnicas de obtencin de material gentico se llevan, a cabo a rasgos generales, en 3 pasos:

1. La obtencin de un pequeo nmero de copias del fragmento de ADN gracias a la digestin del ADN
por medio de una enzima que pueda cortar puntualmente al genoma en el punto deseado
2. La insercin de dichas copias en un vector, el cual es un fragmento de ADN con la capacidad de
multiplicarse dentro de un husped apropiado
3. La propagacin del nuevo fragmento recombinante dentro del husped.

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 Los elementos participantes en los procesos de recombinacin genticas son:

Los plsmidos, molculas circulares capaces de replicarse dentro de una bacteria de manera
independiente a su genoma; el inserto, o segmento de ADN de inters
Las enzimas de restriccin, endonucleasas que cortan el ADN en secuencias especficas
Las ligasas, enzimas capaces de unir por sus extremos dos fragmentos de ADN formando as el ADN
circular
La clula husped, medio donde se introduce el ADN recombinante manipulado in vitro, y se realiza su
propagacin, identificacin y aislamiento. En la gran mayora de los casos, las clulas hospedadoras
son bacterias debido a su simplicidad para producir ARNm maduro y su protena correspondiente, y la
capacidad que tienen para multiplicarse de manera exponencial en perodos cortos.

Vectores
Es fundamental para la conformacin de la genoteca, la eficiencia con la que se produce en ARNm base y con
que las molculas recombinantes puedan introducirse en un vector. Estos vectores de clonacin son diversos y
deben contar con: un origen que les permita replicarse de manera independiente del genoma celular, un
marcador que permita identificar las clulas que lo contengan, sitios de restriccin identificables por las
endonucleasas y compatibles con los que estn en el fragmento a insertar, y poseer un mecanismo de
incorporacin a la clula husped. Esto implica el desarrollo de una gran cantidad de vectores con diferentes
ventajas que se adecuan para diferentes situaciones particulares. Sin lugar a dudas los vectores ms empleados
en la ingeniera gentica son los plsmidos. Estos son una estructura adicional de ADN, que est separada del
cromosoma y est constituido por una doble cadena de ADN circular, y que se encuentran en forma natural en
una gran cantidad de bacterias y algunas levaduras.
Pueden transferirse de una cepa bacteriana a otra, introduciendo as propiedades genticas totalmente nuevas, y
la misma se da a lugar por tres caminos diferentes:

La transformacin, donde las bacterias son destruidas, el material gentico es liberado y una pequea
parte penetra en otra bacteria
La transduccin donde los virus pueden acarrear material gentico de una bacteria a otro o al suyo
propio
La conjugacin, donde el material gentico es transferido directamente de una bacteria a otra por
apareamiento y recombinacin sexual.

Los plsmidos son los encargados de codificar numerosas funciones celulares como la fertilidad, la resistencia a
metales pesados, la resistencia a la radiacin UV, entre otros, pero sin lugar a dudas una de sus funcionalidades
ms representativas es portar los genes responsables de la resistencia a los antibiticos, ya que pueden ser
transferidos de una bacteria a otra a travs de las paredes celulares, por lo que los genes incluidos en ellos se
han difundido ampliamente.
Los vectores plasmdicos no son los nicos existentes, puesto que, en contraposicin con su favorable
estabilidad, se presenta la imperiosa necesidad de necesitar de clonar fragmentos de mayor tamao.
Resumiendo, las clases ms comunes de vectores son:

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Preparacindelgenareplicar
La preparacin del segmento de ADN a adicionar es comanda por las denominadas sondas de genes, las cuales
son fragmentos cortos de ADN o ARN que han sido marcados de alguna forma y son capaces de hibridar con
la secuencia especfica del genoma. Las sondas de genes pueden ser marcadas con nuclesido trifosfato, lo que
permite que las sondas sean detectadas por autorradiografa. Un procedimiento alternativo es el uso de ADN
marcado con biotina, puesto que la presencia de la misma es detectada utilizando avidina o estreptoavidina que
ha sido marcada con un colorante fluorescente, una enzima o un anticuerpo. Para obtener la expresin del gen
clonado es necesario entender la organizacin gentica de procariotas y eucariotas. En eucariotas las regiones
codificadores de los genes (exones) estn generalmente intercaladas con regiones no codificadoras (intrones).
De un transcripto primario del gen nuclear deben eliminarse los intrones (procesamiento de ARN) antes de que
est presente el RNAm maduro traducible. Las etapas de procesamiento de ADN no pueden ser llevados a cabo
por procariotas de forma que no es posible una traduccin correcta de los genes eucariotas puesto que no
cuentan con la maquinaria enzimtica especfica para ello. Por consiguiente, cuando se utilizan bacterias como
hospedadora de clonacin, es preferible utilizar un ADN sinttico o ADN complementario (una copia del ADN
del ARNm maduro) que la bacteria pueda transcribir de manera directa. En el caso del ADN sinttico, se
deduce la secuencia del ADN por traduccin reversa a partir de la secuencia de aminocidos de una protena,
mientras que para el ADN complementario (ADNc), las molculas especficas de ARNm, aisladas de clulas o
tejidos ricos en ese ARNm se utilizan como moldes in vitro con la enzima transcriptasa inversa para producir
ADN complementario. Estos segmentos de ADN luego debern insertarse en el vector correspondiente gracias
a la ayuda de las enzimas de restriccin, la cual con sus cortes crear extremos romos (corte exacto sobre el
mismo nucletido en ambas hebras del ADN a clonar) y extremos cohesivos (corte defasado en bases respecto
de las dos hebras siendo una ms larga que la otra), debiendo ser estos cortes similares entre el segmento de
ADN inserto y el ADN a clonar para permitir el acople entre ambos.

ExpresindelADNclonadoenunsistemabacteriano
La eficiencia de la incorporacin del ADN en la clula husped es una etapa crtica en la manipulacin
gentica, siendo esencial que el hospedador sea capaz de incorporar el ADN manipulado. Los organismos
hospedadores incluyen no solo microorganismos sino tambin clulas de plantas, animales o humanas. Para la
introduccin del ADN recombinante en la clula bacteriana husped, se recurre a varios mtodos, uno de ellos
es la denominada transformacin, en la cual se produce el ingreso del ADN recombinante a la clula
bacteriana husped a travs de la pared y su eventual establecimiento dentro de ella, gracias al cultivo de
bacterias en una solucin hipotnica que conduzca a que las bacterias se hinchen haciendo la pared y la
membrana celular permeable al ADN libre. El ADN recombinante aadido a esta solucin forma un complejo
que se adhiere a la superficie bacteriana y un choque trmico induce la entrada de dicho complejo hacia el
citoplasma bacteriano. Otro mtodo para introducir el ADN recombinante en bacterias, denominado
transduccin, consiste en la infeccin natural de bacterifagos y virus, ya que estos inyectan su ADN
eficientemente a las bacterias. Esto es posible debido a la accin de vectores donde se suprimen los segmentos

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prescindibles de ADN para las funciones de infeccin y replicacin, insertando en su lugar el ADN pasajero
(gen de inters) para introducirlo en la bacteria receptora cuando esta sea infectada por el virus.
Una vez que el fragmento de ADN recombinante es ingresado en el husped se producir la clonacin, y
posterior a ella se deber seleccionar el inserto de inters, e identificar cuando el ADN insertado no codifica de
manera exitosa la protena en cuestin. Existen varios procedimientos posibles que pueden ser utilizados para
examinar las clulas transformadas y determinar que los procesos de clonacin y expresin han sido efectivos:

La identificacin de clulas hospedadoras que contengan el vector con el ADN exgeno.

La deteccin del ADN exgeno en las clulas hospedadoras.
La deteccin del ADN exgeno indirectamente ensayando la expresin del producto (protena
exgena).

En primer lugar, para seleccionar las clulas transformadas puede utilizarse la tcnica de inactivacin del
marcador. Se utilizan vectores que contienen dos marcadores selectivos (por ej. resistencia a antibiticos), uno
de los cuales contiene el sitio de reconocimiento para la enzima de restriccin utilizada en el proceso de
clonacin. Si el ADN extrao se integra en el gen de resistencia a antibiticos, la actividad de ese gen se pierde
(inactivacin insercional). Las clulas hospedadoras a las que les falta el vector son sensibles a ambos
antibiticos, aquellas otras que contienen un vector que carece de ADN extrao son resistentes a ambos
antibiticos, mientras que los vectores con el ADN extrao insertado son sensibles al antibitico en cuyo gen de
resistencia se ha insertado el ADN exgeno.
Para demostrar que el ADN clonado sintetiza la protena especfica se procede con la hibridacin de las
colonias donde mediante la tcnica de Southern se identifica la secuencia especfica, o con el mtodo de los
anticuerpos marcados.
En la hibridacin fragmento de ADN especfico debe identificarse mediante el marcado de un fragmento
complementario mediante un marcaje radiactivo empleando P32, o un marcaje qumico, mediante la
digoxigenina. Dicha hibridacin se hace utilizando la tcnica de rplica en placa para transferir alrededor de
200 colonias desde las placas de agar a filtros de nitrocelulosa, el ADN liberado se desnaturaliza con NaOH 0,5
N, se elimina el exceso de protena con la enzima proteinasa K, y el ADN se fija al filtro calentado a 80 C.
Despus de la hibridacin, con una sonda marcada con P32, el filtro se somete a autorradiografa. Las colonias
que corresponden a las manchas positivas de hibridacin pueden ser aisladas de la placa original.
Tras el aislamiento de las molculas hbridas, la secuencia especfica de ADN puede ser identificada mediante
la tcnica de adsorcin de Southern. Esta consiste en el tratamiento del ADN con una enzima de restriccin,
donde los fragmentos de ADN resultantes se separan por electroforesis en gel, y son transferidos a papel o
filtros de nylon por adsorcin. Los filtros proporcionan un portador estable para los fragmentos, y aquellos que
contienen la secuencia de ADN son identificados mediante una sonda gnica.
Por otra parte, en el mtodo de los anticuerpos marcados, estos se preparan a partir de una inyeccin en
animales de la protena que se quiere obtener, de modo que el sistema inmunitario reconocer esta protena
como extraa en l y producir los anticuerpos que la reconozcan de especficamente, anticuerpos que luego
sern aislados y marcados ya sea por radiacin o por fluorescencia.

MutacinGentica

Se llama mutacin a cualquier cambio en la secuencia de ADN. Segn la extensin, se consideran dos tipos de
mutaciones: mutaciones puntuales y mutaciones cromosmicas. Cualquiera sea el tipo de mutacin genera un
cambio en la informacin contenida en el gen y lleva a la produccin de una protena distinta de la esperada o a
la ausencia de su produccin.

a. Mutaciones puntuales:
Afecta solamente un par de bases de un gen. Son cambios pequeos a nivel de los nucletidos.

b. Mutaciones cromosmicas:
Se producen cambios estructurales de los cromosomas, que comprenden tramos extensos de la molcula de
ADN. Son cambios bruscos, ya sea en el nmero o estructura de los cromosomas.

Ing. Bernarda Mancuello - 14/27

Vamos a detener nuestra principal atencin en las mutaciones espontneas e inducidas. Estas ocurren
espontneamente o bajo la induccin con agentes mutagnicos. La frecuencia de las mutaciones espontneas
dependen de las condiciones de crecimiento del organismo y generalmente la velocidad de mutacin est entre
10-7 y 10-6 por generacin y por gen. Las causas de las mutaciones espontneas que se conocen hasta el
momento incluyen la integracin y la escisin de elementos, junto con errores en el funcionamiento de enzimas,
como la ADN polimerasa, enzimas de recombinacin y enzimas de reparacin de ADN. Debido a la baja
frecuencia de mutaciones espontneas, no es econmico aislar mutantes para el desarrollo industrial de cepas.
La frecuencia de mutacin puede aumentarse significativamente con el uso de agentes mutantes (mutgenos),
llegando a crecer hasta 10-5 o 10-3 en el caso de aislamiento de mutantes auxotrofos. Los mutantes espontneos
e inducidos se producen como resultado de cambios estructurales en el genoma, dicha mutacin en el genoma
puede causar cambios en el nmero de cromosomas y por lo tanto cambiar en estos el orden los genes,
clasificndose segn su importancia.
Dentro de las mutaciones espontaneas, nos encontramos con las transiciones o con las transversiones. Las
primeras implican el cambio de una purina por otra o una pirimidina por otra; mientras que las segundas
implican el cambio de una pirimidina por una purina o viceversa. Es caracterstico en este tipo de mutaciones,
la posibilidad de revertirlas. Las transversiones aparentemente deberan ser el doble de probables que las
transiciones por el simple hecho de que existen el doble de combinaciones probables al poder intercambiar
purinas con pirimidinas y viceversa (8 transversiones versus 4 transiciones), sin embargo el anlisis de

Ing. Bernarda Mancuello - 15/27

mutaciones presentes en enfermedades humanas arroja que las transiciones son las ms frecuentes, puesto que
ellas provocan una alteracin menos severa del producto proteico favoreciendo una menor presin selectiva.
Por el lado de las mutaciones cromosmicas, nos encontramos con fenmenos de deficiencia, delecin,
inversin o translocacin. Este tipo de mutaciones se caracterizan por el desplazamiento de lectura, resultado de
la insercin o delecin de nucletidos, alterando de esta forma el marco de lectura en el proceso siguiente de
transcripcin o traslacin, y conduciendo a una secuencia de aminocidos cambiada en la protena resultante.

1. Delecin: prdida de un segmento de ADN

2. Duplicacin: repeticin de un trozo de ADN
3. Inversin: cambio de sentido de un tramo dentro de la misma molcula
4. Translocacin: un fragmento de una molcula de ADN cambia de posicin relativa dentro del mismo
cromosoma o se incorpora a otro.
5. Intercalacin: insercin de uno o varios nucletidos en una molcula de ADN.

Los efectos generados por las mutaciones espontaneas se clasifican en:

a. Sustituciones sinnimas o silenciosas, donde no se cambia ningn aminocido en la protena codificada

debido a que la mutacin cambia un codn por otro sinnimo. Habitualmente suceden por cambios en la
tercera base del triplete del codn puesto que este ltimo nucletido es el que vara entre codones
sinnimos.
b. Sustituciones no sinnimas, donde el cambio de nucletidos origina un cambio en la capacidad
codificante del ARNm. Se distinguen mutaciones con cambio de sentido de aminocidos, ya sean
conservativas (cuando el aminocido nuevo y el original corresponden al mismo grupo bioqumico) o no
conservativas (cuando pertenecen a grupos bioqumicos diferentes); mutaciones sin sentido, cuando un
codn que codifica un aminocido se convierte en un codn de parada (los menos frecuentes pero los ms
graves); mutaciones con ganancia de sentido, cuando la mutacin transforma un codn de parada en un
codn codificante de un aminocido.
c. Eliminacin de aminocidos sin cambio de lectura, propiciadas por deleciones o inserciones de uno o
ms nucletidos, siempre y cuando se trate de cambios que involucren mltiplos de 3. Cuando el cambio no
incluye un mltiplo de 3, lo que se produce es el corrimiento de marco de lectura, llegando incluso a
introducir codones de parada prematuros que desembocan en protenas truncadas. Afortunadamente los
cambios en el marco de lectura traen consigo alteraciones importantes en el producto proteico, razn por la
cual estn sometidas a mayor presin selectiva y se hacen menos frecuentes.

El dao al ADN causado por agentes mutagnicos puede ocasionar errores en la transmisin hereditaria de
cromosomas completos y, por lo tanto, puede causar la prdida o ganancia de stos. Tambin puede suceder
que los cromosomas se rompan, y stos tengan afinidad por otros cromosomas rotos dando lugar a aberraciones
cromosmicas. Estas pueden ocasionar la transferencia de un cromosoma a otro (translocacin); prdida de
material gentico (delecin), o bien, la inversin de una porcin del cromosoma si ocurren dos rupturas en el
mismo cromosoma.

Mecanismosdereaccindelosmutgenos
1. Mutagnesismedianteradiacin

a. Luz UV de longitud de onda corta (alta frecuencia)

200 300 nm, con un ptimo a 254 nm que es la absorcin mxima del ADN
b. Radiacin de luz UV de longitud de onda larga
300 400 nm

Tiene menos efectos letales y mutagnicos que la luz UV de onda corta, sin embargo, si se lleva a cabo la
exposicin de las clulas o bacterifagos a luz UV de longitud de onda larga en presencia de distintos

Ing. Bernarda Mancuello - 16/27

colorantes que interaccionan con el ADN, se producen frecuentemente mayor frecuencia de mutacin y
mayores velocidades de muerte.

c. Radiaciones ionizantes
Incluyen a los rayos X de origen elctrico (diferencia de potencial), tanto como los rayos , y , los cuales
actan causando ionizacin del medio a travs del que pasan. Estos rayos se utilizan generalmente para
mutagnesis solamente si no pueden ser utilizados otros agentes (por ejemplo, para material celular
impenetrable a los rayos UV). Se producen rupturas simples y dobles con una probabilidad significativamente
mayor que con todos los dems mutgenos. El 90 % de los sitios de corte de la cadena, se reparan por escisin
de nucletidos.

2. Mutagnesisconagentesqumicos

Se pueden clasificar en tres grupos por su modo de accin:

Mutgenos que afectan el ADN en ausencia de replicacin

Anlogos de bases que se incorporan en el ADN que se replica debido a su similariedad estructural con
una de las bases que existen naturalmente
Mutaciones por corrimiento de lectura que entran en el ADN durante la replicacin o reparacin y
mediante esta intercalacin origina inserciones o deleciones de uno o unos pocos pares de nucletidos.

Quizs los ms representativos sean aquellos que afectan el ADN en ausencia de replicacin. Por ejemplo, el
cido nitroso (HNO2) deamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a las distintas
propiedades de apareamiento de los productos de deaminacin (Hipoxantina aparea con citosina, uracilo con
adenina) se producen transiciones AT a GC y/o GC a AT. Adems el nitrito induce entrecruzamiento entre
cadenas complementarias. La hidroxilamina (NH2OH) reacciona con las pirimidinas, pero solamente es
mutagnica la reaccin con citosina, en la que el grupo amino es reemplazado por un grupo hidroxilamino.
Adems del cido nitroso, tambin nos encontramos con los agentes alquilantes, que son los sistemas ms
potentes para aplicaciones prcticas por detrs de los rayos UV. Entre los ms empleados nos encontramos con:

EMS: Etilmetano sulfonato (CH3-CH2-O-SO2-CH3)

MMS: Metilmetano sulfonato (CH3-O-SO2-CH3)

DES: Dietilsulfonato (CH3-CH2-O-SO2-CH2-CH3)

Gas mostaza: Di-(2-cloroetil) sulfuro (Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl)

En el caso de los anlogos de bases, podemos mencionar que algunas sustancias se parecen a las bases y
provocan un emparejamiento errneo durante la replicacin al cambiar una base por otra (por ejemplo el 5-
bromouracilo puede incorporarse en vez de timina y la 2-aminopurina puede sustituir a la adenina).
Por otra parte, para el caso de las mutaciones por corrimiento de lectura, podemos decir que ciertas molculas
se intercalan en la cadena polinucleotdica del ADN y provocan mutaciones por insercin o delecin. Son por
ejemplo la acridina y la proflavina que son dos colorantes y el benzopireno, que se encuentra en el humo del
tabaco y en los alquitranes, provoca mutaciones al intercalarse entre las dos cadenas del ADN.

Desarrollodecepas
Con excepcin de la industria de los alimentos, slo algunos pocos procesos de fermentacin utilizan cepas
silvestres aisladas directamente de la naturaleza, debido a que frecuentemente producen mezclas de sustancias
qumicamente relacionadas, productos, subproductos, productos secundarios. Es por ello que se emplean
mutantes que estn adaptados especficamente a los procesos de fermentacin para la produccin de
antibiticos, enzimas, aminocidos y otras sustancias. Estos mutantes sintetizan un solo componente como
producto principal y simplifican el proceso de recuperacin.

Ing. Bernarda Mancuello - 17/27

El objetivo de un programa de mejora gentica de cepas depende del proceso, pero comnmente el motivo
principal es econmico. Como la concentracin de metabolitos producidos por cepas silvestres son muy bajas
para la economa del proceso, con el desarrollo de cepas busca obtenerse aumentos de produccin muy
importantes. Con los metabolitos secundarios, que son frecuentemente los productos finales de complejos
sistemas biosintticos altamente regulados, puede ser necesaria una variedad de cambios en el genoma para
permitir la seleccin de cepas de alta produccin.
Dejando de lado los motivos meramente econmicos, la mejora gentica de cepas con propiedades de
fermentacin mejoradas, puede tener como objetivos:

menores tiempos de fermentacin

reduccin en la produccin pigmentos indeseables
reduccin en la produccin de espuma durante la fermentacin
capacidad de metabolizar sustratos ms baratos.

Mtodosdeseleccinyconservacindecepaspuras
Adems de conseguir un proceso de mutagnesis ptima, el mtodo de seleccin es crucial para la bsqueda
selectiva de mutantes. Existen bsicamente dos formas de bsqueda: examinar la produccin de antibitico u
otra propiedad en un proceso de fermentacin que recuerde de cerca el proceso a gran escala, o seleccionando
al azar los sobrevivientes de una poblacin mutagenizada. Este ltimo es un proceso muy costoso pero
frecuentemente es la nica forma de encontrar mutantes con productividad mejorada en cepas industriales.

Bsquedaalazar
El alto rendimiento obtenido con los microorganismos industriales ha sido posible en gran medida a travs de
un proceso emprico de seleccin posterior a la mutagnesis. Despus del tratamiento con el mutgeno y de la
expresin de las mutaciones inducida, se inspecciona la habilidad de producir el producto de inters por
seleccin al azar entre los sobrevivientes. Esto se hace en fermentaciones modelo que estn cuidadosamente
adaptadas al medio y a los parmetros de fermentacin del procedimiento a gran escala, a fin de maximizar las
similitudes para que las cepas sean adecuadas en la produccin industrial. Las mejores cepas de tal ciclo de
mutacin son repetidamente mutadas y seleccionadas. Continuando con estas etapas, se logra obtener un
aumento gradual en el rendimiento. En este programa de mutacin y seleccin el estudio, no se centra
solamente sobre la cepa que presente el mejor rendimiento sino que tambin lo hace sobre aquellas que no
muestran aumento en la productividad, debido a que generalmente se producen mltiples mutaciones por la alta
dosis del mutgeno, y en el curso del desarrollo de cepas estas mutaciones no reconocidas conllevan a que
ciertas cepas no muestren aumento productivo. Por consiguiente, dependiendo de la capacidad del programa de
bsqueda, las 5 a 10 mejores cepas de un ciclo de seleccin-mutacin deberan ser utilizadas como cepas
parentales para mutagnesis futuras. Estas cepas son normalmente tratadas con mutgenos distintos de aquellos
utilizados en el tratamiento original.
La cantidad de aislados que deben ser examinados para obtener cepas con productividad superior son
determinados por diversos factores, los ms influyentes en la amplitud del programa de bsqueda son:

La frecuencia de mutacin.
La extensin de los aumentos de rendimiento.
La cantidad de tiempo requerida para un ciclo de mutacin-seleccin.
La capacidad para realizar pruebas en el programa de bsqueda y la exactitud de la prueba de anlisis
(por ejemplo ensayo de antibitico).

Aislamientoselectivodemutantes
Aislamientodemutantesresistentes

Una alta densidad de clulas de una poblacin mutagenizada puede sembrarse sobre un medio selectivo que
contiene una concentracin de una sustancia txica que impida el crecimiento de la cepa silvestre, de modo que

Ing. Bernarda Mancuello - 18/27

solamente pueden desarrollarse los clones resistentes. As entonces pueden aislarse mutantes que son resistentes
a antibiticos o antimetabolitos. El carcter de resistencia a antibiticos puede ser utilizado no slo como
marcador gentico sino que los mutantes aislados pueden tener tambin una permeabilidad celular mayor o una
sntesis de protena con un recambio ms alto, que los hace tiles para propsitos industriales.

Aislamientodeauxotrofos

Utilizando ciertos mutantes bloqueados, pueden obtenerse productos de inters como aminocidos y
nucletidos a travs de vas ramificadas. Las mutaciones auxotrficas en los organismos productores de
antibiticos originan frecuentemente una formacin reducida de productos. En algunos casos se pueden obtener
cepas mejoradas (produccin de tetraciclina) por aislamiento de revertientes prototrficos (mutantes
supresores). Adems las mutaciones auxotrficas pueden ser frecuentemente utilizadas como marcadores
genticos.
El aislamiento de auxotrofos se hace sembrando la poblacin mutagenizada sobre un medio completo con agar,
en el que los mutantes bioqumicamente deficientes pueden tambin crecer. Por la tcnica de Lederberg de
rplica en placa, los clones son transferidos a medio mnimo en el que las colonias auxotrofas no pueden crecer.
Estos mutantes son recuperados de las placas maestras y son caracterizados por su defecto. Puesto que por este
mtodo deben observarse un nmero grande de placas, han sido desarrollados varios procedimientos para
enriquecer los mutantes auxotrofos separando o matando a los organismos prototrfico.
El procedimiento conocido como enriquecimiento por filtracin permite que se desarrollen en un medio
mnimo las esporas de los microorganismos filamentosos en actinomicetos, hongos despus de haber sido
mutagenizados. Las microcolonias que se producen a partir de los prottrofos se separan por filtracin, dejando
en el filtrado las esporas de los auxotrofos que han sido incapaces de crecer. El filtrado es entonces sembrado y
se comprueban las caractersticas de auxotrofia de las colonias resultantes.
Otro procedimiento para la seleccin de auxotrofos que puede ser utilizado tambin para organismos
unicelulares, hace uso del hecho de que la penicilina mata a las clulas en crecimiento pero no a las clulas que
no crecen. En este procedimiento de seleccin por penicilina, las clulas que crecen son luego eliminadas
selectivamente por el tratamiento con antibitico, enriqueciendo de esta forma a los auxotrofos que no pueden
crecer en medio mnimo.
Como ltima alternativa cabe destacar el procedimiento de enriquecimiento con pentaclorofenolato sdico.
Aqu se hace uso de la mayor toxicidad de este compuesto contra las esporas en germinacin que contra clulas
vegetativas, logrando conseguir un enriquecimiento en auxotrofos de 10 a 100 veces, lo que aumenta de esta
forma la probabilidad de obtener mutantes

Procedimientosenzimticos

La presencia o ausencia de actividad enzimticas especficas puede observarse directamente en colonias que
crecen en placas, pulverizndose con reactivos adecuados o incorporando colorantes indicadores en el medio de
cultivo. Estas sustancias con actividad antibitica pueden ser detectadas gracias a ensayos que permitan
establecer la inhibicin de organismos sensibles. A su vez, ste mtodo puede tambin determinar el contenido
en antibitico de una solucin.

Recombinacinnaturaldecepas
La informacin gentica de dos genotipos puede ser agrupada en un nuevo genotipo mediante recombinacin
gentica, que es por tanto otra forma efectiva de aumentar la variabilidad gentica de una poblacin. En las
clulas se reconocen dos clases de recombinacin: entre homlogos y entre sitios especficos.

RecombinacinentreHomlogos

Implica el intercambio gentico entre dos regiones extensas que presenten secuencias homlogas, localizadas
en copias diferentes del mismo cromosoma. Aqu, el intercambio de segmentos grandes de ADN se realiza
mediante sinapsis, es decir, el rompimiento y entrecruzamiento de dos cadenas de ADN en un nico sitio.
Luego de establecerse la sinapsis, la regin compartida se extiende a travs de un proceso unidireccional
denominado migracin de la bifurcacin.

Ing. Bernarda Mancuello - 19/27

Recombinacinentresitiosespecficos

Se han identificado una serie de segmentos genticos mviles, los cuales contienen de 1000 a 12000 pares de
nucletidos, y presentan la particularidad de moverse por el genoma de manera aleatoria por medio de dos
mecanismos que requieren la accin de enzimas especializadas e incluyen sitios especficos de ADN: la
recombinacin transposicional y la recombinacin conservativa.

a. Recombinacin transposicional
Los elementos que se mueven (transposones) no poseen selectividad hacia los sitios de destino, de manera que
pueden insertarse casi en cualquier sitio del genoma. Poseen la informacin que codifica la enzima transposas,
la cual se encarga de cortar el transposn de las regiones de su sitio de origen y cataliza su insercin en el sitio
de destino.

b. Recombinacin conservativa
Implica la integracin temporal de dos molculas de ADN inicialmente independientes y ocurre por la
integracin de virus en bacterias. Al ingresar el virus a la clula, se sintetiza una protena vrica llamada
integrasa lamda, la cual cataliza la unin covalente del ADN vrico con el cromosoma bacteriano mediante el
reconocimiento de secuencias en especficas en ambos genomas, y las consecuentes reacciones de corte y
resellado del ADN hospedador. Al final del proceso el ADN vrico forma parte integral del genoma bacteriano,
lo que facilita su replicacin automtica.

Ciclossexualyparasexualenhongos

Los hongos tienen dos tipos distintos de procesos de recombinacin gentica que pueden ser utilizados en un
programa de mejora de cepas. Son conocidos como ciclo sexual y parasexual:

a. Recombinacin sexual
Algunos hongos utilizados industrialmente (por ejemplo gneros Aspergillus, Claviceps,) tienen un ciclo sexual
completo. En estos organismos la fusin nuclear (cariogamia) que resulta de la fusin de las hifas ha
conducido a la mezcla de ncleos en el micelio heterocaritico. Despus de la formacin de diploides tiene
lugar la recombinacin durante el proceso de meiosis. Se produce un nuevo genotipo, ya sea de los
cromosomas parentales o mediante el entrecruzamiento como resultado de intercambios de segmentos de los
pares de cromtidas homlogos.

b. Recombinacin parasexual

Ing. Bernarda Mancuello - 20/27

Algunos de los hongos econmicamente tiles, como Penicillum Crysogenum (productor de penicilina) y
Cephalosporium acremonium (cefalosporina), no tienen ciclo sexual, de modo que el descubrimiento del
proceso parasexual en hongos imperfectos ha conducido al desarrollo de tcnicas adecuadas para la mejora de
cepas. En la parasexualidad, la fusin de dos cepas de igual o de diferente polaridad resulta de un micelio con
ncleos de ambas cepas parentales. Este heterocarionte es normalmente estable con los ncleos mezclados pero
que no interaccionan, slo en casos raros (10-7 en crysogenum) se produce la fusin nuclear y se forma un
ncleo diploide. En tales ncleos diploides puede producirse el entrecruzamiento mittico entre cromtidas de
cromosomas homlogos, lo que origina la recombinacin gentica. Para obtener un recombinante debe
producirse la formacin de clulas haploide o de esporas. La haploidizacin espontnea es relativamente rara
pero puede ser inducida por p-fluorofenilalanina, y se produce, no a travs de la meiosis, sino por distribucin
al azar de los cromosomas a los ncleos de la progenie.

Recombinacingenticaenbacterias

Los mecanismos parasexuales establecidos in vivo en bacterias incluyen:

Transformacin.
Transduccin.
Conjugacin.

En cada caso se transfiere solamente un fragmento del genoma donador a la clula recipiente, la cual de esta
forma, se convierte en un diploide parcial (merozigoto). Despus del apareamiento homlogo se produce la
recombinacin, pero cada transferencia de ADN no resulta automticamente en recombinacin.
En la transformacin, las clulas competentes receptoras toman trozos pequeos de ADN.
En la transduccin generalizada, partculas de fagos temperados que han perdido una pieza de su propio
genoma, transfieren un fragmento de ADN a la bacteria husped a la velocidad ptima de 105 por fago y por
caracterstica.
En la conjugacin, la transferencia de material gentico entre la bacteria donadora y la receptora se produce a
travs del contacto directo o una conexin que las una.

Recombinacindeactinomicetos

Entre los microorganismos industriales, los actinomicetos (bacterias filamentosas Gram positivas) tienen inters
econmico como productores de antibiticos. La conjugacin es la forma ms comn de intercambio gentico
en actinomicetos in vivo, mientras que la recombinacin no ha sido de gran importancia en el desarrollo de
cepas industriales de actinomicetos.

VIRUS
Los virus son partculas formadas por cidos nucleicos rodeados por protenas, que tienen la capacidad de
reproducirse a expensas de las clulas que invaden. Son parsitos obligados de animales, plantes, hongos y
bacterias, no son organismos independientes, sino que requieren para su reproduccin clulas vivas. Para ello se
multiplican en la clula husped produciendo su muerte y atacan a continuacin a las clulas vecinas sanas,
destruyendo de este modo complejos celulares completos. Esta condicin los lleva a ser agentes de numerosas
enfermedades, tanto de animales como de vegetales, y algunos de ellos producen tumores en el organismo que
los hospeda.
Bsicamente estn constituidos por una cubierta de naturaleza protenica llamada cpsida, que contiene en su
interior cido nucleico. La cpsida se forma por asociacin de unidades polipeptdicas o capsmeros dispuestos
regularmente en forma simtrica. Por otro lado, los virus presentan por lo general conformaciones geomtricas
polidricaso cilndricas y se diferencian de los dems microorganismos por sus reducidas dimensiones 30 a 300
milimicrones. Solo presentan un tipo cido nucleico ADN o ARN y una sola clase protena, pero para su
reproduccin requieren exclusivamente ADN. No obstante, no pueden crecer ni multiplicarse por divisin.
Desde el punto de vista industrial los fagos son importantes:

Ing. Bernarda Mancuello - 21/27

 Como posibles contaminantes de fermentaciones bacterianas y de Streptomyces (un cultivo bacteriano
puede ser destruido en pocas horas por fagos (lisados).
El cultivo industrial de virus patgenos para la produccin de vacunas.
Luego de una invasin de fagos, pueden aislarse cepas resistentes a dicho fago (cepas mutadas)
mediante el cultivo de placas (ciclo de la infeccin ltica).

Tiposdevirus
Los que poseen una molcula de ARN como cromosoma (virus del tabaco).
Los que tienen una molcula de ADN como cromosoma (virus bacteriano).

BacterifagosdelaserieT2

Poseen estructuras ms complejas, las protenas de las cubiertas forman una cabeza polidrica con la
informacin gentica del virus. Tienen un tallo hueco formada por protenas con capacidad contrctil y seis
filamentos en su base que le permite fijarse a la pared de la bacteria que atacan. El cido nucleico encerrado en
la cpsida contiene la informacin necesaria para sintetizar las protenas del virus.
Se reproducen invadiendo una clula en la cual introducen su cido nucleico y la obligan a reproducir nuevas
partculas virales, comportndose como parsito perfecto, ya que utilizan la maquinaria metablica y la energa
de las clulas atacadas para la sntesis de protenas y cidos nucleicos del propio virus.

Estructura de un Bacterifago

Virusvegetales

Penetran en el interior de la clula a travs de lesiones, y por lo general son transmitidos por insectos. En
algunos casos el virus se multiplica en el tubo digestivo del insecto, de modo que la infeccin de la planta slo
se produce luego de un determinado perodo de incubacin.
El material gentico de los virus vegetales es el ARN

Losviruspatgenosanimales:

Causan enfermedades tanto al hombre y como a los animales, las ms conocidas son la viruela, la varicela, el
sarampin y la rabia. Los virus animales se caracterizan por una membrana relativamente delgada, y son
transmitidos por contacto o a travs de insectos y penetran a la clula por fagocitosis.

Ing. Bernarda Mancuello - 22/27

El material gentico del los virus animal es el ADN ARN, en el caso del ADN se presenta como doble hlice
(filamento), mientras que para el ARN presenta una cadena polinucletida monofilar.

Virusbacterianosofagos

Son el tipo de virus especficos para las bacterias. Estos bacterifagos pueden ser aislados sin dificultad, como
ocurre en el caso del colfago T 2 del E. Coli. Este est conformado por una cabeza de simetra cbica de 100
nm de largo, de la que sale una cola aproximadamente de la misma longitud. La cabeza es relativamente rgida
y est formada por una cubierta con subunidades proteicas. Esta cubierta encierra el material gentico, ADN.
La cola del T2 presenta una forma complicada y est constituida por un tubo central hueco rodeado de una
vaina contrctil en cuyo extremo se encuentra una placa terminal provista de fibras y de tentculos de absorcin
del husped.

Mecanismo de accin
1. La cola del fago, que consta de una protena, se adosa a la pared celular a la cual altera.
2. Dicha protena lisa la pared y el ADN de la cabeza del fago es inyectado al interior del citoplasma de la
bacteria. La cola puede quedar o no adosada a la pared.
3. El ADN del fago proporciona informacin para la sntesis de una serie de enzimas que, en conjuncin
con las propias de la clula, catalizan la formacin de ms ADN y ms protenas del fago.
4. Se unen el ADN y protena del fago formando viriones.
5. Se lisa la clula dejando en libertad a los viriones.

Este ciclo completo dura alrededor de 15 a 60 minutos.

Suele suceder que muchas veces el fago puede infectar la clula sin lisarla. En este caso el ADN inyectado a la
clula no inicia la sntesis de ms material del fago sino que se liga a un lugar especfico del cromosoma de la
bacteria y se replica junto con el cromosoma. A esta clase de bacterias se las denomina lisognicas, y son
inmunes al fago que contienen, siendo a no sus propiedades similares a las originales.

CULTIVODETEJIDOSVacunas

El cultivo de tejidos es el proceso mediante el cual una serie de clulas aisladas o pequeos grupos de clulas
derivadas de organismos multicelulares complejos, pueden ser desarrollados bajo condiciones relativamente
controladas. El proceso consiste en tomar un tejido de planta o animal, disgregarlo en clulas simples, tanto
mecnicamente o como por la accin de enzimas, y colocar a stas en un medio nutritivo que permita su
replicacin continua. Dado que el tejido original generalmente contiene varios tipos de clulas, se necesitan
tcnicas selectivas para aislar un solo tipo de ellas.
Las clulas aisladas retienen sus caractersticas biolgicas y qumicas as como la capacidad gentica de
producir cualquiera de los materiales que elaboraba el tejido original. Tienen tambin la capacidad de
reproducirse exactamente como en el tejido original, sin sufrir ningn tipo de variaciones.

Aplicaciones
1. En la produccin de macromolculas biolgicamente activa como:

Hormonas
cidos nucleicos
Enzimas.

Todos ellos son productos imposibles de sintetizar ni de obtener por vas de procesos fermentativos
microbiolgicos, cuya nica va de obtencin es actualmente la extraccin de tejidos.

2. En la produccin de vacunas

Ing. Bernarda Mancuello - 23/27

Hasta el presente ha sido el mayor uso de los cultivos de tejidos. Las vacunas producidas por este medio son
por ejemplo:

Polio
Rubola
Fiebre amarilla
Rabia
Vacuna de uso veterinario contra la aftosa.
Para esta ltima se usa clulas de rin de cobayo los cules han sido adaptados para crecer en suspensiones
agitadas en reactores de varios miles de litros.

Tecnologaaplicada
Hay diferencias fundamentales entre esta tecnologa y la empleada para crecimiento de hongos y bacterias.
Ellos son:

La duplicacin de clulas se realiza en 24 36 horas, contra 20 120 minutos de los microorganismos.

El medio de cultivo es mucho ms caro, normalmente deben tener nutrientes bsicos que estn en la
sangre y lo ms usual es suplementar el medio con suero hasta 20 %.

Dado que los medios con suero no pueden esterilizarse con calor, debe recurrirse la filtracin, ms
costosa.

Debido a la lentitud de crecimiento y el medio de cultivo tan rico, se deben extremar los cuidados para
mantener la esterilidad, por lo que comnmente se agregan antibiticos para evitar riesgos de
contaminacin.

Las clulas frecuentemente crecen solamente adheridas a una superficie slida (como por ejemplo en
vidrios, plsticos, esferas de sephatex, films de polister, entre otros), por lo tanto los equipos
empleados para su desarrollo deben tener una gran relacin superficie/volumen.

Todo esto hace que el proceso sea definitivamente ms costoso que los procesos fermentativos comunes.

Fabricacindevacunasantibacterianas

Es un mtodo sencillo puesto que no se requiere el cultivo previo de tejidos. Estas vacunas se pueden atenuar
replicando la bacteria en medios de cultivo de laboratorio en los cuales van perdiendo virulencia por
mutaciones en sucesivos repiques.

Produccindevacunasantivirales

Consiste en:

Una vez obtenida la densidad celular ptima, las clulas se filtran, resuspenden en medios especiales y
se inoculan con el virus deseado
Se concentran y purifican por ultracentrifugacin, eliminando as al mximo las protenas no virales
Se inactiva total o parcialmente la suspensin de virus con formol.

Suerosyvacunascomerciales
Anticuerpospreformados

Los productos de este tipo reciben el nombre de antisueros y se emplean nicamente para conferir una
proteccin temporal de unas semanas, mientras que tiene lugar la edificacin por parte del paciente de una

Ing. Bernarda Mancuello - 24/27

inmunidad activa. Su origen puede ser tanto humano o animal, y respecto de su actividad, algunos son
especficos contra un microorganismo determinado y otros poseen un carcter mixto.

a. Sueros de personas convalecientes (suero adulto mezclado o fraccionado: globulnica)

Se emplea contra determinadas enfermedades, tales como el sarampin, fiebre amarilla, poliomielitis y rubola.
La aplicacin de suero contra esta ltima enfermedad ha sido objeto de especial inters en los ltimos aos, ya
que se ha demostrado que pueden nacer ms de un 20 % de nios deformes si sus madres sufren esta leve
enfermedad durante las primeras semanas de gestacin. Otra aplicacin reciente de la sueroterapia es el
tratamiento de las quemaduras graves, puesto que en quemaduras extensas se forman anticuerpos especficos
contra los productos de degradacin, de tal modo que el suero de un caso convaleciente es til para reducir las
reacciones txicas en otros pacientes con quemaduras recientes.

b. Sueros antitxicos
Se emplean para neutralizar las toxinas producidas por microorganismos. Un ejemplo importante es la
antitoxina tetnica que es eficaz nicamente antes de que la toxina haya producido lesiones irreversibles en el
tejido nervioso. Su efecto positivo es posible porque la toxina tetnica tarda algn tiempo en formarse despus
de la infeccin y adems su trnsito a travs de los nervios es lento.

c. Sueros antibacterianos.
Los resultados no han sido completamente satisfactorios posiblemente por la variabilidad antignica de las
diversas cepas de microorganismos. Su uso no es muy amplio.

d. Sueros antivricos
Con la introduccin de agentes quimioteraputicos eficaces contra bacterias, actualmente la atencin se ha
concentrado sobre problemas de los virus. La inoculacin de un animal para produccin de un antisuero puede
llevarse a cabo, bien empleando una cepa seleccionada de un organismo, o sino con sus toxinas obtenidas por
filtracin de un medio en el que se ha cultivado el germen. Esta inoculacin provoca la formacin de
anticuerpos en el animal, pero no ocasiona necesariamente los mismos sntomas que en el paciente humano.
Adems, pueden ser necesarias varias inoculaciones para conseguir una mxima produccin de anticuerpos.

ANEXO:InstrumentacinenIngenieragentica
1. Sintetizadordegenes
Sintetizan cortas secuencias de ADN, de manera rpida y automtica, bajo el control de un microprocesador de
ADN, a razn de 30 por ADN.

Procedimiento:

La secuencia de bases deseadas se marca en un teclado. Luego el microprocesador abre las vlvulas
correspondientes para que los nucleticos, disolventes y reactivos necesarios en cada etapa se bombeen hasta la
columna de sntesis. Posee una columna que contiene diminutas esferas de slice bien compactadas (con
consistencia semejante a la arena fina), donde cada esfera sirve de soporte para que se vayan ensamblando las
molculas de ADN. Si se quiere obtener una secuencia determinada se usa una columna en la que inicialmente
a cada esfera se ha fijado el nuclesido (base ms azcar) elegido que debe constituir uno de los extremos de la
secuencia.
El microprocesador bombea a la columna al primer nucletido, por ejemplo Adenina, y posteriormente el
siguiente nucletido, Timina, con un extremo protegido de las reacciones no deseadas, de modo que se asegura
la unin de las Adenina con la Timina. Luego se elimina el agente protector, dejando ese extremo libre para
aceptar el siguiente ADN, y terminadas las cadenas, se separan de las esferas y se eluyen de las columnas hacia
el colector.

Ing. Bernarda Mancuello - 25/27

2. Analizadordeprotenas

Este sensible Analizador de Protenas, en conjunto con el Sintetizador de Protenas, nos dar una poderosa
estrategia para clonar genes extraos.
Consiste en un par de tijeras moleculares que permiten comenzar en el extremo N-terminal de la cadena
proteica y cortar un aminocido por vez. Tanto reactivos como solventes, son volcados en un orden
programado dentro de una cmara de reaccin en forma de columna, la cual contiene la protena en estudio y
donde cada aminocido separado de la cadena proteica ser volcado en tubos individuales del colector de
fracciones, de modo tal que se hace posible determinar la secuencia de aminocidos en la cadena proteica.
Por otra parte, la separacin de mezclas complejas de protenas se realiza por medio de un gel de electroforesis
bidimensional, donde la primera separacin se realiza en base al tamao de las protenas y la segunda por carga
electrofortica. De este modo, se logra que virtualmente cualquier muestra proteica pueda ser visualizada en un
gel bidimensional para luego ser analizada.

Ing. Bernarda Mancuello - 26/27

Cuestionario
1.- Qu clases de los cidos nucleicos existen? Dnde se originan?

2.- Qu funcin cumple cada uno de los cidos nucleicos en la clula?

3.- Cules son los principales componentes y cmo es la estructura de los cidos nucleicos?

4.- Qu funcin cumplen los grupos fosfatos en los procesos biosintticos? De ejemplos.

5.- Qu otros mononuclesidos importantes existen, que contienen bases que no se encuentran en los cidos
nucleicos? Qu funcin cumplen?

6.- Cmo se lleva a cabo la replicacin del ADN? Cul es la funcin que cumplen las enzimas en dicho
proceso? Explicar brevemente.

7.- Qu aplicaciones le encuentra a la sntesis de protenas? Cmo se lleva a cabo la misma?

8.- Qu es el gen? Dnde se localiza y qu funcin cumple?

9.- Explique los procesos de transmisin de los caracteres hereditarios de una clula a otra.

10.- Qu entiende como mutacin gentica? Cul es la importancia de los vectores y qu aplicacin recibe
cada uno de sus diferentes tipos?

11.- Qu tipos de mutaciones se conocen? Describa las caractersticas de los mismos.

12.- Cules son los agentes mutagnicos utilizados en la industria? Cmo y por qu se los emplea?

13.- Cmo se desarrolla el proceso de seleccionan de mutantes?

14.- Qu son los virus? Caractersticas principales. Importancia industrial.

15.- Investigar y desarrollar brevemente el ciclo de la infeccin ltica.

16.- Cmo se realiza el cultivo de tejidos? Descripcin y principales aplicaciones industriales.

17.- Cules son los factores para clasificar un microorganismo? Por qu se los emplea?

18.- Cules son los microorganismos ms importantes de uso industrial?

19.- Desarrollar brevemente los tipos de reproduccin de microorganismos: sexual asexual. Citar ejemplos.

20.- Encuentre casos en los que crea que la ingeniera gentica se relaciona de manera directa con la ingeniera
qumica y sus procesos. Fundamentar el por qu y explicar cmo.

Ing. Bernarda Mancuello - 27/27