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ndice
1. INTRODUCCIN 1
1.1. LICOPENO EN TOMATE 1
1.2. CIDO ASCRBICO EN FRESA 3
2. MATERIALES Y MTODOS 6
2.1. LICOPENO 6
2.1.1. REACTIVOS 6
2.1.2. MUESTRAS 6
2.1.3. PREPARACIN DE MUESTRAS Y ESTNDARES DE CAROTENOIDES 7
2.1.4. CONDICIONES CROMATOGRFICAS (HPLC-MS/MS-APCI) 7
2.1.5. ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS 10
2.1.6. CONDICIONES DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR, 1H-RMN 10
2.2. CIDO ASCRBICO EN FRESA 11
2.2.1. REACTIVOS 11
2.2.2. MUESTRAS 11
2.2.3. PREPARACIN DE MUESTRAS Y ESTNDARES DE CIDO ASCRBICO 12
2.2.4. CONDICIONES CROMATOGRFICAS 12
3. RESULTADOS 14
3.1. LICOPENO 14
3.1.1. EVALUACIN DE LA EXTRACCIN DE CAROTENOIDES 14
3.1.2. EVALUACIN DEL MTODO DE HPLC/MS-MS 14
3.1.3. ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS. 20
3.1.4. EVALUACIN DEL MTODO DE RMN 21
3.2. CIDO L-ASCRBICO 24
3.2.1. EVALUACIN DE LA EXTRACCIN DE ANTIOXIDANTES 24
3.2.2. EVALUACIN DEL MTODO DE HPLC-PDA 24
4. CONCLUSIONES 30
5. BIBLIOGRAFA 32
Abreviaturas
ii
1. INTRODUCCIN
Este trabajo forma parte del proyecto Microorganismos endofticos como inductores de
molculas naturales de inters agronmico (referencia IPT-2011-0989-060000) cuyo objetivo
general es caracterizar y utilizar microorganismos endfitos (bacterias, hongos y endo-
micorrizas) aislados de cultivos de inters agronmico o industrial (frutos rojos, tomate, soja y
plantas usadas para la produccin de bioinsecticidas) y usarlos como inoculantes de segunda
generacin con el fin de inducir modificaciones metablicas secundarias que permitan la
adquisicin de propiedades competitivas y generar mayor valor industrial en las plantas
inoculadas, gracias al incremento en la produccin de molculas bioactivas como son, por
ejemplo, licopeno o cido ascrbico.
Licopeno (60-64%)
Neurosporina (7-9%)
Fitoeno (10-12%)
Fitoflueno (4-5%)
-caroteno (1-2%)
-caroteno (10-12%)
-caroteno (1-2)%
El cido L-ascrbico (AA) representa el 90% del contenido total en vitamina C y es la forma
predominantemente activa. Se oxida reversiblemente a la forma L-deshidroascrbico (DHA),
que tambin presenta actividad biolgica2 (Figura 4).
Muchos son los mtodos descritos para el anlisis del AA: espectrofotometra,
fluorimetra, fluorimetra indirecta, electroforesis capilar, quimioluminiscencia, voltametra y,
por ltimo, cromatografa lquida de alta resolucin acoplada a un detector UV-Vis, siendo este
ltimo el que proporciona resultados ms limpios y fiables al incrementar la sensibilidad y
especificidad.21
reajustar el pH a la neutralidad para que el DTT sea efectivo. Para ello, segn describen
Milagres Campos y Rocha Ribeiro,19 es necesario utilizar un buffer hasta alcanzar un pH de
entre 5,5-6,0 realizar la reduccin en esas condiciones y, antes de inyectar, ajustar de nuevo el
pH con cido sulfrico hasta 2,0. El considerable aumento en el tiempo de extraccin resulta
ser una gran desventaja, teniendo en cuenta que cuanto mayor sea, ms posibilidades de
degradacin del AA existen. Por esta razn, el mtodo de extraccin que se presenta en este
trabajo resulta mucho ms sencillo y rpido, con la nica exigencia de preparar las muestras el
mismo da en que vayan a ser analizadas por HPLC, preservarlas de la luz y de posibles
aumentos de temperatura y mantenerlas en fro justo antes de inyectar. Procediendo de esta
manera los resultados que se obtienen son de una calidad considerable y para hacer estudios
comparativos resultan ms que aceptables.
2. MATERIALES Y MTODOS
2.1. Licopeno
Todas las manipulaciones se llevaron a cabo con el mayor cuidado posible en cuanto a
proteccin de la luz solar y artificial directa y evitando en todo momento posibles aumentos de
temperatura. Cuando fue necesario el transporte de las muestras, se envolvieron en papel de
aluminio y /o se emplearon viales mbar.
2.1.1. Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analtico: TEA y cloroformo procedentes de
Sigma-Aldrich (Alemania), hexano procedente de Panreac Qumica SLU (Espaa). Los
disolventes orgnicos para HPLC fueron de grado HPLC: MeOH procedente de Alfa-Aesar
(Alemania), y MTBE y ACN procedentes de Sigma-Aldrich (Alemania). El agua fue obtenida a
partir de un sistema Milli-Q.
2.1.2. Muestras
La variedad de tomates empleada en este trabajo fue Marmande (Figura 5), una variedad
de crecimiento indeterminado y ciclo precoz. El tamao medio del fruto ronda los 70 g y su
morfologa es aplanada y acostillada, con cuello verde de 5-7 lbulos. La siembra se realiz en
maceta a mediados del mes de julio y a mediados del mes de agosto se trataron con 3 cepas
bacterianas (NTAB-T27, NTAB-T43 y RBA-OR133) a una dilucin 1/100, excepto en los
controles (plantas sin inocular y plantas tratadas con el medio de cultivo de las bacterias, TSB),
tal como se recoge en la Tabla 1. Todo el cultivo se llev a cabo en maceta y en invernadero.
Los tomates empezaron a aparecer a principios del mes de septiembre, pero no fue hasta
finales de noviembre cuando se realiz la cosecha.
HPLC
40 30 0 100
20
35 0 100
35 70 30
0
0 10 20 30 40 40 70 30
Figura 6: Perfil de elucin
El estudio realizado por Fang et al.10 muestra que estos ismeros producen iones
moleculares de relacin m/z 536 empleando APCI en modo negativo22 como fuente de
ionizacin. Sin embargo, durante el proceso CID, slo el in molecular del licopeno formaba
dos iones fragmento. Un primer fragmento [M69]- muy abundante con relacin m/z 467, que
se corresponde con la prdida de un fragmento de isopreno terminal, y un segundo in
fragmento menos abundante, resultado de la prdida de los dos isoprenos terminales de la
molcula con una relacin m/z 398.13 En este trabajo se ha empleado slo la transicin
536 467 para distinguir al licopeno de sus ismeros estructurales.
1. Mediante un alto voltaje se ioniza el gas nebulizante (nitrgeno) formando los primeros
iones.
2. Estos primeros iones reaccionan inmediatamente con las molculas de disolvente
formando iones reactivos.
3. Los iones reactivos reaccionan, por transferencia de un protn, con las molculas del
analito formando [M+H]+ en modo positivo o [M-H]- en modo negativo.
Experimento MRM
Para confirmar la cuantificacin del licopeno mediante el mtodo de HPLC, se llev a cabo
un ensayo espectrofotomtrico en el rango ultravioleta-visible para registrar las absorbancias
mximas tanto del licopeno, como de los otros carotenoides mayoritarios (principalmente -
caroteno). La tesis empleada como confirmacin fue la tesis control y su preparacin se limit
a disolver el extracto ya seco en 5 ml de acetona, empleado como blanco dicho disolvente.
Una vez realizada las medidas, se procesaron los datos empleando para ello el coeficiente de
extincin molar correspondiente (ver apartado 3.1.3).
Para comprobar que efectivamente lo que se estaba extrayendo en las primeras pruebas
era licopeno, se realizaron dos experimentos de Resonancia Magntica Nuclear (RMN): un
experimento monodimensional de 1H y un experimento bidimensional de correlacin
homonuclear 1H-1H: 2D-COSY con el fin de identificar y corroborar la presencia del licopeno y
sus ismeros estructurales. Para ello, se disolvi el extracto seco de tomate comercial en unos
2 ml de cloroformo deuterado (CDCl3, 99,8%) y se llev a un tubo de RMN. El equipamiento
10
empleado para el anlisis fue un Espectrmetro Bruker Advance AVIII500 de 500,40 MHz
equipado con una criosonda TXI de 5 mm para 1H, de elevada sensibilidad para muestras de
RMN en disolucin. El espectro fue registrado a temperatura ambiente. El espectro de
protones para el anlisis de los carotenoides se referenci usando la seal residual de CHCl3
(=7,26 ppm). Las condiciones para cada uno de los experimentos mencionados arriba fueron:
Los datos obtenidos fueron procesados con los programas TopSpin 3.0 y Sparky.
2.2.1. Reactivos
Todos los reactivos empleados fueron de grado analtico y grado HPLC: AcOH y H3PO4
procedentes de Panreac Qumica SLU (Espaa), MeOH de Sigma-Aldrich (Alemania), el agua
fue obtenida a partir de un sistema Milli-Q y el H2SO4 de Panreac Qumica SLU (Espaa).
2.2.2. Muestras
Una de las tareas del proyecto de investigacin en el que este trabajo participa consiste
en el seguimiento de las hormonas vegetales de fresas a distintos tiempos de maduracin: 30,
60 y 90 das. Las plantas de 90 das presentaban frutos maduros, que fueron recogidos,
triturados y congelados.
Las plantas se trataron con diferentes bacterias promotoras del crecimiento vegetal
(PGPs), dando lugar a 11 tesis que se especifican en la Tabla 2:
11
Para la preparacin de los patrones se ha empleado una disolucin madre de 1000 ppm
de cido L-ascrbico en H2SO4 0,01%.
12
Debido a la inestabilidad trmica observada en las muestras y en los patrones, hubo que
tener especial precaucin a este respecto, preparndolos frescos para cada anlisis y
manteniendo en hielo los viales justo antes de introducirlos en el carrusel del equipo.
13
3. RESULTADOS
3.1. Licopeno
Control ENT27
ENT43 RBA-OR133
La mezcla MeOH/MTBE con 0,1% TEA14,1 empleada como fase mvil proporcion una
buena resolucin de picos, como se puede apreciar en la Figura 11. El empleo de TEA mejor la
respuesta de los carotenoides y redujo la degradacin en columna. En cuanto a los tiempos de
retencin, se hicieron varios ensayos para intentar acortarlos modificando los gradientes: los
primeros ensayos se hicieron con un gradiente de 95-5% y finalmente se pas a 70-30%, lo que
redujo considerablemente (aproximadamente 10 min) el tiempo de anlisis. Por otro lado,
antes de utilizar la columna C30, se hicieron ensayos con la C18 para ver las diferencias en
resolucin y separacin de los carotenoides y tras ver los resultados se constat la capacidad
de la C30 para resolver entre ismeros estructurales como son el -caroteno y licopeno.
14
Para la cuantificacin del licopeno, se utiliz el mtodo de calibrado externo que consiste
en comparar la respuesta instrumental de diferentes concentraciones de un estndar o patrn,
mediante la construccin de una recta. Se mide a continuacin la respuesta del analito en la
muestra problema y mediante extrapolacin, haciendo uso de la ecuacin de regresin lineal
de la recta anterior, se determina la concentracin del analito. Para ello, se prepararon
disoluciones del estndar, tanto de licopeno como de -caroteno, en n-hexano, con las
concentraciones: 100, 200, 300, 500, 700, 800 y 1000 ppb. Todos los ensayos se hicieron por
triplicado para asegurar la reproducibilidad.
(5Z)
trans-licopeno
(13Z)
(9Z)
Figura 11: Perfiles cromatogrficos de los estndares de licopeno y -caroteno (izquierda), donde aparecen a 11,90 min el ismero
cis (13Z) y a 17,17 min el todo-trans-licopeno, y a 7,30 min el pico mayoritario del -caroteno. A la derecha, el perfil
cromatogrfico del extracto de Lyc-O-mato, donde adems aparecen picos correspondientes a otros carotenoides.
15
8,00E+04
rea
6,00E+04
4,00E+04
2,00E+04
0,00E+00
0 200 400 600 800 1000 1200
1,40E+05
1,20E+05
rea
1,00E+05
8,00E+04
6,00E+04
4,00E+04
2,00E+04
0,00E+00
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
ppb
Figura 12: Rectas de calibrado (calibracin externa) correspondientes a los estndares de todo-trans-licopeno y -caroteno.
Licopeno caroteno
HPLC (n = 12) HPLC (n = 15)
Ecuacin de regresin lineal Area= 1412,6 + 112,38x Area= 8159,4 + 171,33x
2 2
Coeficiente de correlacin R = 0,9968 R = 0,9931
Lmite de deteccin (LD) 52,10 ppb 85,59 ppb
Lmite de cuantificacin (LQ) 173,66 ppb 285,29 ppb
Tabla 3: Parmetros de linealidad, lmite de deteccin y cuantificacin del licopeno y -caroteno mediante HPLC.
16
Linealidad
El licopeno puro es un reactivo caro (unos 180 /mg en Sigma-Aldrich), por lo que para los
primeros estudios sobre linealidad y estimaciones cuantitativas se han utilizado extractos
comerciales procedentes de complementos dietticos; en el estudio por HPLC-MS/MS se
observa una buena linealidad entre 100 y 1000 ppb. En el caso del -caroteno, este
procedimiento no ha sido necesario. Una vez estudiado el comportamiento cromatogrfico de
los analitos, se obtuvieron las rectas de calibrado de los estndares de licopeno y -caroteno.
Se prepararon en las mismas condiciones que los extractos (n-hexano) y se inyectaron en un
rango de concentraciones de entre 100 ppb-1 ppm, repitiendose tres veces cada elucin.
La linealidad del mtodo fue confirmada mediante los estudios de regresin estadstica
detallados anteriormente. Como puede deducirse de los parmetros de linealidad mostrados
en la Tabla 3, los coeficientes de correlacin estn por encima de 0,990.
Con estos datos, se deduce que el mtodo de HPLC utilizado fue lo suficientemente
sensible para analizar este tipo de muestras biolgicas.
Reproducibilidad
17
El mtodo de HPLC se aplic a las muestras obtenidas a partir de las tesis (ver apartado
2.1.2); 4 tesis de las cuales 3 fueron tratadas con microorganismos endfitos promotores del
crecimiento, ms el control, sin tratar, y 3 variedades distintas de tomate: cherry, rama y
pintn. Los resultados se presentan en la Tabla 4. Se realiz una primera estimacin de las
cantidades presentes en cada muestra y, posteriormente, se ajust la concentracin de cada
una para que estuviese incluida en el rango de concentraciones utilizado en la curva de
calibracin.
Figura 13: Cromatogramas XIC de MRM correspondientes a las cuatro variedades de tomates: Marmande, cherry, rama y pintn.
Se observan los picos de: -caroteno a aproximadamente 7,35 min, (9Z)- cis-licopeno a aproximadamente 11,85 min y todo-trans-
licopeno a aproximadamente 17,10 min,.
18
Figura 14: Cromatogramas XIC de MRM correspondientes a las cuatro tesis analizadas: control, T43 T27 y OR133. Se observan los
picos de: -caroteno a 7,40 min aproximadamente.; (9Z)- cis-licopeno a 11,85 min y trans-licopeno a 17,10 min.
aproximadamente.
19
0,6
0,4
0,2
En todos los extractos se detectaron -caroteno y trans-licopeno con sus ismeros cis (5Z,
9Z, 13Z), aunque el 5Z es apenas detectable en los extractos, s que est presente en el
extracto comercial Lyc-O-Mato.
Para comprobar que los resultados obtenidos no fueron consecuencia de un efecto matriz
acusado, se realiz un ensayo de espectrometra UV-vis con la tesis control. Como disolvente
se emple acetona, que le fue adicionada al extracto previamente secado y se registr el
espectro de absorbancia en la regin que abarca desde 329 a 550 nm a temperatura ambiente.
El espectro obtenido (Figura 16) presenta 3 mximos de absorbancia: 503, 475 y 446 nm. Los
dos primeros son los de inters y se corresponden con los picos de absorcin del licopeno y del
-caroteno respectivamente.
20
Figura 16: Espectro de absorcin del UV-vis de la tesis control donde aparecen los mximos mencionados en el texto: 503, 473,
446 nm.
3,12
Caracterizacin de carotenoides
21
1 1
H H (ppm) H H (ppm)
Figura 17: Espectro 1H-RMN (500,40 MHz) del extracto de licopeno y ampliacin de la regin entre 6 y 7 ppm, que se corresponde
con los dobles enlaces conjugados del licopeno. Se indica tambin su asignacin.
22
Figura 18: Espectro 2D-COSY del extracto de tomate, con ampliacin de la regin olefnica y su asignacin.
23
Como se mencion en el apartado 2.2.3, las fresas se cosecharon de 3 plantas por cada
tesis, tras un cultivo de 90 das y un proceso de trituracin y congelacin previo.
Control Tesis 5
Tesis 6 Tesis 9
Para la extraccin de los antioxidantes hubo que tener especial cuidado para evitar la
degradacin del cido L-ascrbico. El procedimiento se bas en el propuesto por Palauff et
al.,27 con algunas modificaciones para acortar an ms el tiempo del proceso y adecuarlo a las
condiciones de las que se dispona.
Una de las modificaciones que dio muy buen resultado, fue el tratamiento con
ultrasonidos durante 20 min, previa a la centrifugacin. Con este paso se consigui obtener
una separacin de fases realmente buena ayudando a que, tras el proceso de centrifugacin, la
interfase apareciese perfectamente definida.
El uso de una disolucin de cido sulfrico en la fase mvil, adems de preservar el cido
ascrbico de la accin enzimtica degradativa, ha proporcionado una buena resolucin de
24
3,50E+07
y = 219376x - 505576
3,00E+07 R = 0,999
CE
2,50E+07
AP
rea
2,00E+07
1,50E+07
0,00E+00
0 50 100 150 200
Figura 20: Estimacin del efecto matriz. En naranja, curva obtenida en ausencia de extracto de fresas. En verde, curva obtenida
aadiendo 850 l de extracto de fresas a cada disolucin de estndar.
25
El cido L-ascrbico aparece aproximadamente a 4,10 min por lo que, en un principio, los
tiempos de anlisis fueron cortos (6 min). Sin embargo, a medida que se iban realizando ms
anlisis se observaron cambios significativos en los tiempos de retencin, por lo que se decidi
incluir un ciclo de lavado de la columna con metanol para descartar posibles interferencias
(Figura 21) (apartado 2.2.4). Este hecho trajo como consecuencia un tiempo de anlisis mayor
(30 min), pero preserv la columna de posibles atascos y fallos por sobrepresin.
Figura 21: Cromatograma registrado a 245 y 210 nm. Se pueden apreciar las interferencias que aparecen alrededor del minuto 15
y que se consiguieron eliminar introduciendo el ciclo de lavado con MeOH.
26
AA
DHA
Figura 22: Cromatogramas correspondientes a la tesis 6 (NTABE-P310+Micorriza) a 150 ppm, registrado a 245 y 210 nm. Puede
apreciarse la presencia del DHA (210 nm) a un tiempo de retencin muy similar al del AA.
27
2,50E+07
2,00E+07
1,50E+07
rea
y = 67789x + 1E+07
1,00E+07
R = 0,9829
5,00E+06
0,00E+00
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00
ppm
Figura 21: Superposicin de los cromatogramas correspondientes a la tesis 6 de 10, 50, 100 y 150 ppm, a una longitud de onda de
245 nm y recta de adicin patrn.
28
120
100
80
60
mg AA/100g
40
20
Figura 23: mg de cido ascrbico por cada 100 g de pulpa de fresa en cada tesis analizada.
29
4. CONCLUSIONES
Tanto para el anlisis del cico L-ascrbico como para el licopeno, se ha desarrollado
un mtodo en el que la cromatografa lquida de alta resolucin resulta ser una tcnica
eficaz para la determinacin de una amplia variedad de compuestos, tras un
tratamiento previo de extraccin simple.
En el caso del licopeno, la cantidad que se ha conseguido extraer ha sido inferior al
contenido descrito en bibliografa. Sin embargo, para el estudio comparativo que se
pretenda hacer en este trabajo, resulta vlido. Se podra pensar en un efecto matriz
como el causante de la baja cuantificacin, sin embargo, los datos obtenidos para la
tesis control mediante la espectrofotometra UV-vis, confirman que el problema ha
estado en el proceso de extraccin. ste no ha sido todo lo eficiente que se esperaba y
para una cuantificacin ms precisa, habra que optimizar el mtodo an ms,
empleando quizs disolventes ms eficaces (probablemente una mezcla de acetona,
hexano y etanol) y una purificacin ms exhaustiva.
30
31
5. BIBLIOGRAFA
1. Rivera, S. M.; Canela-Garayoa, R., Analytical tools for the analysis of carotenoids in
diverse materials. Journal of chromatography. A 2012, 1224, 1-10.
2. Pennathur, S.; Maitra, D.; Byun, J.; Sliskovic, I.; Abdulhamid, I.; Saed, G. M.; Diamond,
M. P.; Abu-Soud, H. M., Potent antioxidative activity of lycopene: A potential role in scavenging
hypochlorous acid. Free radical biology & medicine 2010, 49 (2), 205-13.
3. Giovannucci, E.; Clinton, S. K., Tomatoes, lycopene, and prostate cancer. Proc Soc Exp
Biol Med 1998, 218 (2), 129-39.
4. Clinton, S. K., Lycopene: chemistry, biology, and implications for human health and
disease. Nutrition reviews 1998, 56 (2 Pt 1), 35-51.
5. Olives, B. A. I.; Camara, H. M.; Sanchez, M. M. C.; Fernandez, R. V.; Saenz, d. T. M. L.,
Application of a UV-vis detection-HPLC method for a rapid determination of lycopene and -
carotene in vegetables. Food Chem. 2005, 95 (Copyright (C) 2012 American Chemical Society
(ACS). All Rights Reserved.), 328-336.
6. Mitrowska, K.; Vincent, U.; von Holst, C., Separation and quantification of 15
carotenoids by reversed phase high performance liquid chromatography coupled to diode
array detection with isosbestic wavelength approach. Journal of chromatography. A 2012,
1233, 44-53.
8. (a) Vertzoni, M. V.; Reppas, C.; Archontaki, H. A., Optimized determination of lycopene
in canine plasma using reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of
chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2005, 819 (1),
149-54;
(b) Xu, F.; Yuan, Q. P.; Dong, H. R., Determination of lycopene and beta-carotene by high-
performance liquid chromatography using sudan I as internal standard. Journal of
chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2006, 838 (1),
44-9.
9. Dias, M. G.; Oliveira, L.; Camoes, M. F.; Nunes, B.; Versloot, P.; Hulshof, P. J., Critical
assessment of three high performance liquid chromatography analytical methods for food
carotenoid quantification. Journal of chromatography. A 2010, 1217 (21), 3494-502.
10. Fang, L.; Pajkovic, N.; Wang, Y.; Gu, C.; van Breemen, R. B., Quantitative analysis of
lycopene isomers in human plasma using high-performance liquid chromatography-tandem
mass spectrometry. Analytical chemistry 2003, 75 (4), 812-7.
32
11. Kauppila, T. J.; Kostiainen, R.; Bruins, A. P., Anisole, a new dopant for atmospheric
pressure photoionization mass spectrometry of low proton affinity, low ionization energy
compounds. Rapid communications in mass spectrometry : RCM 2004, 18 (7), 808-15.
12. Burns, J.; Fraser, P. D.; Bramley, P. M., Identification and quantification of carotenoids,
tocopherols and chlorophylls in commonly consumed fruits and vegetables. Phytochemistry
2003, 62 (6), 939-47.
13. van Breemen, R. B.; Dong, L.; Pajkovic, N. D., Atmospheric Pressure Chemical Ionization
Tandem Mass Spectrometry of Carotenoids. International journal of mass spectrometry 2012,
312, 163-172.
14. Tiziani, S.; Schwartz, S. J.; Vodovotz, Y., Profiling of carotenoids in tomato juice by one-
and two-dimensional NMR. Journal of agricultural and food chemistry 2006, 54 (16), 6094-100.
15. Rozzi, N. L.; Singh, R. K.; Vierling, R. A.; Watkins, B. A., Supercritical fluid extraction of
lycopene from tomato processing byproducts. Journal of agricultural and food chemistry 2002,
50 (9), 2638-43.
16. Tiziani, S.; Schwartz, S. J.; Vodovotz, Y., Profiling of Carotenoids in Tomato Juice by
One- and Two-Dimensional NMR. J. Agric. Food Chem. 2006, 54 (Copyright (C) 2012 American
Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.), 6094-6100.
17. Lin, C. H.; Chen, B. H., Determination of carotenoids in tomato juice by liquid
chromatography. Journal of chromatography. A 2003, 1012 (1), 103-9.
18. Rozzi, N. L.; Singh, R. K.; Vierling, R. A.; Watkins, B. A., Supercritical Fluid Extraction of
Lycopene from Tomato Processing Byproducts. J. Agric. Food Chem. 2002, 50 (Copyright (C)
2012 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.), 2638-2643.
19. Campos, F. M.; Ribeiro, S. M. R.; Della, L. C. M.; Pinheiro-Sant'Ana, H. M.; Stringheta, P.
C., Optimization of methodology to analyze ascorbic and dehydroascorbic acid in vegetables.
Quim. Nova 2009, 32 (Copyright (C) 2012 American Chemical Society (ACS). All Rights
Reserved.), 87-91.
20. Frenich, A. G.; Torres, M. E.; Vega, A. B.; Vidal, J. L.; Bolanos, P. P., Determination of
ascorbic acid and carotenoids in food commodities by liquid chromatography with mass
spectrometry detection. Journal of agricultural and food chemistry 2005, 53 (19), 7371-6.
21. Burini, G., Development of a quantitative method for the analysis of total L-ascorbic
acid in foods by HPLC. J. Chromatogr., A 2007, 1154 (Copyright (C) 2012 American Chemical
Society (ACS). All Rights Reserved.), 97-102.
22. Kauppila, T. J.; Kotiaho, T.; Kostiainen, R.; Bruins, A. P., Negative ion-atmospheric
pressure photoionization-mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass
Spectrometry 2004, 15 (2), 203-11.
33
23. Parella, T., Pulse Program Catalogue. NMR Guide v4.0. Bruker Biospin: 2004.
24. Miller, J., Estadstica y Quimiometra para Qumica Analtica. 2002; p 296.
26. Torres, A. M. R., L.F., Estudio de Medios de Cultivo para la sntesis de licopeno a partir
de Clavibacter michiganensis sub. michiganensis. VITAE, Revista de la facultad de qumica
farmacutica 2003, 10 (2), 37-45.
27. Pallauf, K.; Rivas-Gonzalo, J. C.; del, C. M. D.; Cano, M. P.; de, P.-T. S., Characterization
of the antioxidant composition of strawberry tree (Arbutus unedo L.) fruits. J. Food Compos.
Anal. 2008, 21 (Copyright (C) 2012 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.), 273-
281.
34