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c a P t u l o
Enzimas: cintica
Peter J. Kennelly, PhD y Victor W. Rodwell, PhD
IMPORTANCIA BIOMDICA
La cintica enzimtica es el campo de la bioqumica que se encarga
de la medicin cuantitativa de los ndices de reacciones catalizadas
por enzimas, y del estudio sistemtico de factores que afectan estos
ndices. Un conjunto completo y balanceado de actividades enzi-
mticas tiene importancia fundamental para el mantenimiento de
la homeostasis. De este modo, una comprensin de la cintica enzi-
mtica es importante para entender de qu modo los estados de
estrs fisiolgico, como la anoxia, la acidosis o alcalosis metablica,
las toxinas y los agentes farmacolgicos afectan ese equilibrio. El
anlisis cintico puede revelar el nmero y orden de los pasos indi-
viduales mediante los cuales las enzimas transforman sustratos en
productos. Junto con la mutagnesis dirigida hacia sitio y otras tc-
nicas que sondean la estructura de protenas, los anlisis cinticos
revelan detalles del mecanismo cataltico de una enzima dada. La
participacin de las enzimas en casi todos los procesos fisiolgicos
hace de ellas los mejores objetivos para frmacos que curan o ami-
noran la enfermedad en seres humanos. La cintica enzimtica
aplicada representa el principal recurso mediante el cual los cient-
ficos identifican y caracterizan agentes teraputicos que inhiben de
manera selectiva los ndices de procesos catalizados por enzima
especficos. De este modo, la cintica enzimtica desempea una
funcin crucial en el descubrimiento de frmacos y en la farmaco-
dinmica comparativa, as como en la dilucidacin del modo de
accin de los frmacos.
LAS REACCIONES QUMICAS SE
DESCRIBEN USANDO ECUACIONES
BALANCEADAS
Una ecuacin qumica balanceada lista las especies qumicas ini-
ciales (sustratos) presentes y las nuevas especies qumicas (produc-
tos) formadas para una reaccin qumica particular, todas en sus
proporciones o estequiometra correctas. Por ejemplo, en la ecua-
cin balanceada (1) que aparece a continuacin se describe la
reaccin de una molcula, cada una, de sustratos A y B, para formar
una molcula, cada una, de productos P y Q.
A+B P+Q (1)
Las dobles flechas indican reversibilidad, propiedad intrnseca de
todas las reacciones qumicas. De este modo, para la reaccin (1), si
A y B pueden formar P y Q, estos ltimos tambin pueden formar A
62
08 Bender.indd 62
y B. Por ende, la designacin de un reactivo particular como sustra-
to o producto es un poco arbitraria porque los productos para
una reaccin descrita en una direccin son los sustratos para la re-
accin inversa. Sin embargo, el trmino producto a menudo se usa
para designar los reactivos cuya formacin es favorecida desde el
punto de vista termodinmico. Las reacciones para las cuales los
factores termodinmicos favorecen de manera significativa la for-
macin de los productos hacia los cuales apunta la flecha, a menudo
se representan con una flecha nica como si fueran irreversibles:
A+B P+Q (2)
Tambin se usan flechas unidireccionales para describir reacciones
en clulas vivas en las cuales los productos de la reaccin (2) son
consumidos de inmediato por una reaccin subsiguiente catalizada
por enzima. Por ende, la eliminacin rpida del producto P o Q im-
pide de manera efectiva la reaccin inversa, lo que hace a la ecua-
cin (2) irreversible desde el punto de vista funcional en condi-
ciones fisiolgicas.
LOS CAMBIOS DE LA ENERGA LIBRE
DETERMINAN LA DIRECCIN
Y EL ESTADO DE EQUILIBRIO
DE REACCIONES QUMICAS
El cambio de energa libre de Gibbs G (tambin llamado la energa
libre o energa de Gibbs) describe tanto la direccin en la cual tende-
r a proceder una reaccin qumica, como las concentraciones de
reactivos y productos que estarn presentes en equilibrio. La G
para una reaccin qumica es igual a la suma de las energas libres de
la formacin de los productos de la reaccin GP menos la suma
de las energas libres de formacin de los sustratos Gs. G0 denota
el cambio de energa libre que acompaa a la transicin desde el
estado estndar, concentraciones uno molar de sustratos y produc-
tos, hasta el equilibrio. Un trmino bioqumico ms til es G0 , que
define el G0 a un estado estndar de 107 M protones, pH de 7.0
(cap. 11). Si la energa libre de formacin de los productos es ms
baja que la de los sustratos, los signos de G0 y G0 sern negativos,
lo que indica que la reaccin como est escrita se favorece en la
direccin de izquierda a derecha. Esas reacciones se denominan es-
pontneas. El signo y la magnitud del cambio de energa libre de-
terminan qu tan lejos proceder la reaccin. En la ecuacin (3) se
ilustra la relacin entre la constante de equilibrio Keq y G0,
27/11/09 13:51:19
 captulo 8 Enzimas: cintica 63

G0 = RT ln K eq (3) A + B

O +
donde R es la constante gaseosa (1.98 cal/molK u 8.31 J/molK) y E O -o P O
T es la temperatura absoluta en grados Kelvin. Keq es igual al pro-
HO
ducto de las concentraciones de los productos de la reaccin, cada
uno elevado a la potencia de su estequiometra, dividido por el pro- O
ducto de los sustratos, cada uno elevado a la potencia de su este- E O P O
quiometra.
-o
Para la reaccin A + B P+Q OH

[P][Q]
K eq = (4)
[A ][B]
y para la reaccin (5)
A+A P (5)
[P]
K eq = (6)
[A ]2
G0 puede calcularse a partir de la ecuacin (3) si se conocen las
concentraciones molares de sustratos y productos presentes en
equilibrio. Si G0 es un nmero negativo, Keq ser mayor que la uni-
dad, y la concentracin de productos en equilibrio exceder la de los
sustratos. Si G0 es positiva, Keq ser menor que la unidad, y se fa-
vorecer la formacin de sustratos.
Note que, dado que G0 est en funcin exclusivamente de los
estados inicial y final de las especies que estn reaccionando, slo
puede proporcionar informacin acerca de la direccin y el estado de
equilibrio de la reaccin. G0 es independiente del mecanismo de la
reaccin y, por ende, no proporciona informacin acerca de ndices
de reacciones. En consecuencia y como se explica ms adelante,
aunque una reaccin puede tener una G0 o G0 negativa grande,
puede, sin embargo, tener lugar a un ndice insignificante.
O
E
O P O
o
OH
P + Q
FIGURA 8-1 Formacin de un intermediario de estado de
transicin durante una reaccin qumica simple, A + B P + Q. Se
muestran tres etapas de una reaccin qumica en la cual un grupo
fosforilo se transfiere desde el grupo L que sale hacia el grupo E que
entra. Arriba: el grupo E de que entra (A) se acerca al otro reactivo,
L-fosfato (B). Note cmo los tres tomos de oxgeno enlazados por las
lneas triangulares y el tomo de fsforo del grupo fosforilo forman una
pirmide. Centro: a medida que E se aproxima al L-fosfato, empieza a
formarse el nuevo enlace entre E y el grupo fosfato (lnea punteada)
a medida que el que enlaza L al grupo fosfato se debilita. Estos enlaces
parcialmente formados estn indicados por lneas punteadas. Abajo: la
formacin del nuevo producto, E-fosfato (P), ahora est completa a
medida que el grupo L (Q) que sale, egresa. Note cmo la forma del
grupo fosforilo difiere entre el estado de transicin y el sustrato o
producto. Vea la manera en que el fsforo y tres tomos de oxgeno que
ocupan los cuatro ngulos de una pirmide en el sustrato y el producto
se hacen coplanares, como se recalca por el tringulo, en el estado de
transicin.

ilustracin ms detallada del estado de transicin intermedio for-

LOS NDICES DE REACCIONES ESTN mado durante la transferencia de un grupo fosforilo.
DETERMINADOS POR SU ENERGA Cabe considerar que la reaccin (7) consta de dos reacciones
DE ACTIVACIN parciales; la primera corresponde a la formacin (F) y la segunda a
la descomposicin (D) subsiguiente del intermediario de estado de
Las reacciones proceden por estados transicin. Al igual que para todas las reacciones, los cambios carac-
tersticos de la energa libre, GF y GD se relacionan con cada re-
de transicin accin parcial.
El concepto de estado de transicin es fundamental para entender
las bases qumica y termodinmica de la catlisis. En la ecuacin (7) E+RL E R L GF (8)
se describe una reaccin de transferencia de grupo en la cual un
grupo E que est entrando desplaza a un grupo L que est saliendo,
ERL E R + L GD (9)
en un inicio fijo a R.

E+RL ER+L (7) E+RL E R + L G = GF + GD (10)

El resultado neto de este proceso es transferir el grupo R desde L Para la reaccin general (10), G es la suma de GF y GD. Al igual
hacia E. A la mitad del desplazamiento, el enlace entre R y L se ha que para cualquier ecuacin de dos trminos, es imposible inferir a
debilitado pero todava no se ha roto por completo, y el nuevo enla- partir de G el signo o la magnitud de GF o GD.
ce entre E y R hasta ahora est formado de manera incompleta. Di- Muchas reacciones comprenden mltiples estados de transi-
cho intermediario transitorio en el cual no existe sustrato ni pro- cin, cada uno con un cambio relacionado de energa libre. Para
ducto libre se denomina el estado de transicin, ERl. Las estas reacciones, la G general representa la suma de todos los cam-
lneas punteadas representan los enlaces parciales que estn pa- bios de energa libre relacionados con la formacin y la descompo-
sando por formacin y rotura. En la figura 8-1 se proporciona una sicin de todos los estados de transicin. por ende, a partir de la

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 64 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

G general es imposible inferir el nmero o el tipo de estados de ende, la frecuencia con la cual chocan. Esta combinacin de cho-
transicin a travs de los cuales procede la reaccin. Dicho ques ms frecuentes y ms energticos y productivos, aumenta el
de otra manera, la termodinmica general no dice nada acerca de la ndice de reaccin.
cintica.

La GF define la energa de activacin
Al margen del signo o la magnitud de G, la GF para la mayora de
reacciones qumicas tiene un signo positivo, de modo que la forma-
cin de intermediarios de estado de transicin requiere superar ba-
rreras de energa. Por esta razn, la GF para llegar a un estado de
transicin a menudo se denomina la energa de activacin, Eact. La
facilidad y por ende, la frecuencia con la cual esta barrera se
supera se relaciona de manera inversa con Eact. De este modo, los
parmetros termodinmicos que determinan la rapidez con la cual
procede una reaccin, son los valores GF para la formacin de los
estados de transicin a travs de los cuales procede la reaccin. Para
una reaccin simple, donde significa proporcional a,
ndice e Eact / RT
La energa de activacin para la reaccin que est procediendo en la
direccin opuesta a la trazada es igual a GD.
Concentracin de reactivo
La frecuencia con la cual las molculas chocan es directamente
proporcional a sus concentraciones. Para dos molculas diferen-
tes, A y B, la frecuencia con la cual chocan se duplicar si se dupli-
ca la concentracin de A o de B. Si las concentraciones tanto de A
como de B se duplican, la probabilidad de choque aumentar cua-
tro veces.
Para una reaccin qumica que procede a una temperatura cons-
tante que comprende una molcula, cada una, de A y B,
A+B P (12)
el nmero de molculas que poseen energa cintica suficiente para
superar la barrera de energa de activacin ser una constante. Por
(11) ende, el nmero de choques con suficiente energa para producir el
producto P ser directamente proporcional al nmero de choques
entre A y B y, as, y a sus concentraciones molares, denotadas por
corchetes.

ndice [A ][B] (13)

MUCHOS FACTORES AFECTAN
EL NDICE DE REACCIN De modo similar, para la reaccin representada por

La teora cintica tambin llamada la teora de la coalicin de A + 2B P (14)

cintica qumica declara que para que dos molculas reaccionen,
deben: 1) aproximarse dentro de la distancia formadora de enlace de que tambin puede escribirse como
la otra, o chocar, y 2) poseer suficiente energa cintica para ven-
cer la barrera de energa para alcanzar el estado de transicin. Por A+B+B P (15)
ende, resulta que cualquier cosa que aumente la frecuencia o energa
el ndice de expresin correspondiente es
de colisin entre sustratos aumentar el ndice de la reaccin en la
cual participan. ndice [A ][B][B] (16)

o
Temperatura
Aumentar la temperatura incrementa la energa cintica de las mo- ndice [A ][B]
2
(17)
lculas. El nmero total de molculas cuya energa cintica excede
la barrera de energa Eact (barra vertical) para la formacin de pro- Para el caso general, cuando n molculas de A reaccionan con m
ductos aumenta desde temperaturas bajas (A), pasando por inter- molculas de B,
medias (B) hasta altas (C) (fig. 8-2). El aumento de la energa cin-
tica de molculas tambin aumenta su rapidez de movimiento y, por nA + mB P (18)

el ndice de expresin es

ndice [A ] [B] (19)

n m
Barrera de energa

Remplazar el signo de proporcionalidad con signos de igual al in-
A B C troducir una constante de ndice k caracterstica de la reaccin en
Nmero de
molculas

estudio da las ecuaciones (20) y (21), en las cuales los nmeros 1 y

1 se refieren a las reacciones hacia adelante e inversa, respectiva-
mente.
0
ndice1 = k1 [A ] [B]
n m
(20)
Energa cintica

FIGURA 8-2 La barrera de energa para reacciones qumicas.

(Vase la exposicin en el texto.) ndice 1 = k 1 [P ] (21)

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La suma de las proporciones molares de los reactivos define el or-
den cintico de la reaccin. Considere la reaccin (5). El coeficiente
estequiomtrico para el reactivo nico, A, es dos. Por ende, el ndice
de produccin de P es proporcional al cuadrado de [A], y se dice que
la reaccin es de segundo orden respecto del reactivo A. En este caso,
la reaccin general tambin es de segundo orden. Por ende, k1 se
denomina una constante de ndice de segundo orden.
En la reaccin (12) se describe una reaccin de segundo orden
simple entre dos reactivos diferentes, A y B. El coeficiente estequio-
mtrico para cada reactivo es uno. Por ende, mientras que el orden
general de la reaccin es dos, se dice que es de primer orden respecto
de A, y de primer orden respecto de B. En el laboratorio, el orden
cintico de una reaccin respecto de un reactivo particular, al cual
se hace referencia como el reactivo variable o sustrato, puede deter-
minarse al mantener la concentracin de los otros reactivos a una
concentracin constante, o fija, en un gran exceso sobre el reactivo
variable. En estas condiciones de seudoprimer orden, la concentra-
cin del (o los) reactivo(s) fijo(s) permanece casi constante. De este
modo, el ndice de reaccin depender de manera exclusiva de la
concentracin del reactivo variable, a veces tambin llamado el
reactivo limitante. Los conceptos de orden de reaccin y condicio-
nes de seudoprimer orden no slo se aplican a reacciones qumicas
simples, sino tambin a reacciones catalizadas por enzimas.
Keq es una proporcin de constantes
de ndice
Si bien todas las reacciones qumicas son hasta cierto grado reversi-
bles, en condiciones de equilibrio las concentraciones generales de
reactivos y productos permanecen constantes. Por ende, en equili-
brio, el ndice de conversin de sustratos en productos, es igual al
ndice al cual los productos se convierten en sustratos.
ndice1 = ndice 1 (22)
Por ende,
k1 [A ] [B] = k 1[P ] (23)
n m
k1 [P]
= (24)
k 1 [A ]n [B]m
La proporcin de k1 a k1 se denomina la constante de equilibrio Keq.
Es necesario tener en mente las propiedades importantes que siguen
de un sistema en equilibrio:
1. La constante de equilibrio es una proporcin de las
constantes de ndice de reaccin (no los ndices de
reaccin).
2. En equilibrio, los ndices de reaccin (no las constantes de
ndice) de las reacciones hacia adelante y hacia atrs son
iguales.
3. El equilibrio es un estado dinmico. Aunque no hay cambio
neto de la concentracin de sustratos o productos,
molculas individuales de sustrato y producto
continuamente se estn interconvirtiendo.
08 Bender.indd 65
captulo 8 Enzimas: cintica 65
4. El valor numrico de la constante de equilibrio Keq puede
calcularse a partir de las concentraciones de sustratos y
productos en equilibrio o a partir de la proporcin k1/k1.
LA CINTICA DE LA CATLISIS
ENZIMTICA
Las enzimas disminuyen la barrera de
energa de activacin para una reaccin
Todas las enzimas aceleran los ndices de reaccin al disminuir la
GF para la formacin de estados de transicin. Sin embargo,
pueden diferir en la manera en que esto se logra. Cuando el meca-
nismo o la secuencia de pasos qumicos en el sitio activo es, en
esencia, equivalente al que ocurre para la misma reaccin que est
procediendo en ausencia de un catalizador, el ambiente del sitio
activo disminuye la GF al estabilizar los intermediarios de esta-
do de transicin. En otras palabras, la enzima puede imaginarse
como unida al intermediario de estado de transicin (fig. 8-1) de
manera ms estrecha que a sustratos o productos. La estabiliza-
cin puede comprender: 1) grupos acidobsicos colocados de ma-
nera idnea para transferir protones hacia o desde el intermedia-
rio de estado de transicin, 2) grupos cargados o iones metlicos
colocados de manera idnea, que estabilizan cargas que se estn
formando, o 3) la imposicin de tensin estrica sobre sustratos
de modo que su forma se aproxima a la del estado de transicin
(cap. 7). La proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) (fig. 7-6) ilustra la catlisis por una enzima que disminuye
la barrera de activacin al estabilizar un intermediario de estado
de transicin.
La catlisis por enzimas que procede por medio de un meca-
nismo de reaccin singular tpicamente ocurre cuando el interme-
diario del estado de transicin forma un enlace covalente con la
enzima (catlisis covalente). El mecanismo cataltico de la serina
proteasa quimotripsina (fig. 7-7) ilustra la manera en la cual una
enzima utiliza catlisis covalente para proporcionar una va de
reaccin nica.
LAS ENZIMAS NO AFECTAN LA Keq
Si bien las enzimas pueden pasar por modificaciones transitorias
durante el proceso de catlisis, siempre salen sin cambios cuando
se completa la reaccin. por ende, la presencia de una enzima no
tiene efecto sobre la G0 para la reaccin general, que est en
funcin slo de los estados inicial y final de los reactivos. En la
ecuacin 25 se muestra la relacin entre la constante de equilibrio
para una reaccin y el cambio de energa libre estndar para esa
reaccin:
G0 = RT ln K eq (25)
Este principio quiz se ilustra con mayor facilidad al incluir la pre-
sencia de la enzima (Enz) en el clculo de la constante de equilibrio
para una reaccin catalizada por enzima:
A + B + Enz P + Q + Enz (26)
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 66 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas
Dado que la enzima a ambos lados de las dobles flechas est presen-
te en igual cantidad y forma idntica, la expresin para la constante
de equilibrio
[P][Q][Enz ]
K eq =
[A ][B][Enz ]
reduce a una a idntica a la que procede para la reaccin en ausencia
de la enzima:
[P][Q]
K eq =
[A ][B]
Por ende, las enzimas carecen de efecto sobre Keq.
MLTIPLES FACTORES INFLUYEN
SOBRE LOS NDICES DE REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMA
Temperatura
El aumento de la temperatura incrementa el ndice de reacciones
tanto no catalizadas como catalizadas por enzima al aumentar la
energa y la frecuencia de choque de las molculas que estn reac-
cionando. Sin embargo, la energa calorfica tambin aumenta la
energa cintica de la enzima hasta un punto que excede la barrera
de energa para alterar las interacciones no covalentes que mantie-
nen su estructura tridimensional. La cadena polipeptdica empieza
entonces a desdoblarse, o desnaturalizarse, con una prdida acom-
paante de la actividad cataltica. El rango de temperatura en el cual
una enzima mantiene una conformacin estable, competente desde
el punto de vista cataltico, depende de y, por lo general, excede de
manera moderada la temperatura normal de las clulas en las
cuales reside. Las enzimas de seres humanos, por lo comn, mues-
tran estabilidad a temperaturas de hasta 40 a 55C. En contraste, las
enzimas de los microorganismos termoflicos que residen en ma-
nantiales calientes volcnicos u orificios hidrotrmicos submarinos,
pueden ser estables hasta 100C o incluso ms.
El Q10, o coeficiente de temperatura, es el factor por el cual el
ndice de un proceso biolgico aumenta para un incremento de
10C de temperatura. Para las temperaturas en las cuales las enzi-
mas son estables, los ndices de casi todos los procesos biolgicos
tpicamente se duplican para un aumento de temperatura de 10C
(Q10 = 2). Los cambios de los ndices de reacciones catalizadas por
enzima que acompaan a un aumento o disminucin de la tempera-
tura corporal constituyen una caracterstica de supervivencia pro-
minente para formas de vida de sangre fra como lagartos o peces,
cuya temperatura corporal est dictada por el ambiente externo. Sin
embargo, para mamferos y otros organismos homeotrmicos, los
cambios de los ndices de reaccin de enzimas con la temperatura
slo asumen importancia fisiolgica en circunstancias como fiebre
o hipotermia.
Concentracin de ion hidrgeno
El ndice de casi todas las reacciones catalizadas por enzima mues-
tra una dependencia importante de la concentracin de ion hidr-
08 Bender.indd 66
X
100
SH+ E
(27) %
0
Bajo Alto
(28) pH
FIGURA 8-3 Efecto del pH sobre la actividad de enzima. Considere,
por ejemplo, una enzima con carga negativa (E) que se une a un
sustrato que tiene carga positiva (SH+). Se muestra la proporcin (%) de
SH+ [\\\] y de E [///]como una funcin del pH. Slo en el rea
cuadriculada tanto la enzima como el sustrato portan una carga
apropiada.
geno. Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad p-
tima a valores de pH entre 5 y 9. La relacin entre actividad y
concentracin de ion hidrgeno (fig. 8-3) refleja el equilibrio entre
la desnaturalizacin de enzima a pH alto o bajo, y los efectos sobre
el estado cargado de la enzima, los sustratos o ambos. Para enzimas
cuyo mecanismo comprende catlisis acidobsica, los residuos com-
prendidos deben estar en el estado de protonacin apropiado para
que la reaccin proceda. La unin y el reconocimiento de molculas
de sustrato con grupos disociables tpicamente tambin compren-
den la formacin de puentes salinos con la enzima. Los grupos car-
gados ms frecuentes son grupos carboxilato (negativos) y aminas
protonadas (positivos). La ganancia o prdida de grupos cargados
cruciales afecta de manera adversa la unin a sustrato y, as, retrasa-
r o suprimir la catlisis.
LAS VALORACIONES DE REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMA POR LO
GENERAL MIDEN LA VELOCIDAD INICIAL
En casi todas las mediciones de los ndices de reacciones catalizadas
por enzima se emplean periodos hasta cierto punto breves, condicio-
nes que se aproximan a las condiciones de velocidad inicial. En estas
condiciones, slo se acumulan trazas de producto, lo que hace insig-
nificante al ndice de la reaccin inversa. De este modo, la velocidad
inicial (vi) de la reaccin es en esencia la del ndice de reaccin hacia
adelante. En las valoraciones de actividad enzimtica casi siempre se
emplea un exceso molar grande (103 a 107) de sustrato sobre enzima.
En estas condiciones, vi es proporcional a la concentracin de enzi-
ma. Por ende, la medicin de la velocidad inicial permite estimar la
cantidad de enzima presente en una muestra biolgica.
LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO
AFECTA EL NDICE DE REACCIN
En lo que sigue, las reacciones enzimticas se tratan como si slo
tuvieran un sustrato nico y un producto nico. Para enzimas con
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 captulo 8 Enzimas: cintica 67

mltiples sustratos, los principios que se comentan a continuacin los aumentos adicionales de [S] no pueden aumentar el ndice de la
se aplican con igual validez. Ms an, al emplear condiciones de reaccin. En estas condiciones de saturacin, la vi depende slo de
seudoprimer orden (vase antes), los cientficos pueden estudiar la y, de este modo, est limitada por la rapidez con la cual el pro-
dependencia del ndice de reaccin en un reactivo individual por ducto se disocia de la enzima de modo que logre combinarse con
medio de la seleccin apropiada de sustratos fijos y variables. En ms sustrato.
otras palabras, en condiciones de seudoprimer orden, la conducta
de una enzima con mltiples sustratos imitar a la de otra que cuen-
ta con un solo sustrato. Sin embargo, en estas circunstancias, la LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-
constante de ndice observada estar en funcin de la constante de MENTEN Y DE HILL MODELAN
ndice de k1 para la reaccin, as como la concentracin del (o los)
sustrato(s) fijo(s).
LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACIN
Para una enzima tpica, a medida que la concentracin de sus- DE SUSTRATO
trato aumenta, vi se incrementa hasta que alcanza un valor mximo
Vmx (fig. 8-4). Cuando los aumentos adicionales de la concentra- La ecuacin de Michaelis-Menten
cin de sustrato no aumentan ms la vi, se dice que la enzima est La ecuacin de Michaelis-Menten (29) ilustra en trminos matem-
saturada con sustrato. Note que la forma de la curva que relaciona ticos la relacin entre la velocidad de reaccin inicial vi y la concen-
la actividad con la concentracin de sustrato (fig. 8-4) es hiperbli- tracin de sustrato [S], que se muestra de manera grfica en la figu-
ca. A cualquier constante dada, slo las molculas de sustrato que se ra 8-4.
combinan con la enzima como un complejo ES pueden transfor-
marse en producto. En segundo lugar, la constante de equilibrio Vmx [S]
vi = (29)
para la formacin del complejo de enzima-sustrato no es infinita- K m + [S ]
mente grande. Por ende, aun cuando el sustrato est presente en
exceso (puntos A y B de la fig. 8-5), slo una fraccin de la enzima la constante Km de Michaelis es la concentracin de sustrato a la
puede estar presente como un complejo ES. Por tanto, de los puntos cual vi es la mitad de la velocidad mxima (Vmx/2) alcanzable a
A o B, aumentar o disminuir [S] aumentar o disminuir el nmero una concentracin particular de enzima. De este modo, Km tiene
de complejos ES con un cambio correspondiente de vi. En el punto las dimensiones de la concentracin de sustrato. La dependencia
C (fig. 8-5), en esencia toda la enzima est presente como el comple- de la velocidad de reaccin inicial de [S] y Km puede ilustrarse al
jo ES. Dado que no queda enzima libre disponible para formar ES, evaluar la ecuacin de Michaelis-Menten en tres condiciones.
1. Cuando [S] es mucho menor que Km (punto A en las figs. 8-4
y 8-5), el trmino Km + [S] es en esencia igual a la Km. El remplazo
mx
de Km + [S] con Km reduce la ecuacin (29) a
mx
Vmx [S] Vmx [S] Vmx
vi = vi [S ] (30)
K m + [S ] Km Km
mx
donde significa aproximadamente igual a. Dado que tanto Vmx
como Km son constantes, su proporcin es una constante. En otras
palabras, cuando [S] est muy por debajo de Km, vi es proporcional
FIGURA 8-4 Efecto de la concentracin de sustrato sobre a k[S]. Por ende, la velocidad de reaccin inicial es directamente
la velocidad inicial de una reaccin catalizada por enzima. proporcional a [S].

=S

=E

A B C

FIGURA 8-5 Representacin de una enzima en presencia de una concentracin de sustrato que est por
debajo de Km (A), a una concentracin igual a Km (B), y a una concentracin bastante por arriba de Km (C). Los
puntos A, B y C corresponden a esos puntos en la figura 8-4.

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 68 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

2. Cuando [S] es mucho mayor que Km (punto C en las figs. 8-4

y 8-5), el trmino Km + [S] es en esencia igual a [S]. Remplazar Km +
[S] por [S] reduce la ecuacin (29) a

Vmx [S] Vmx [S]

vi = vi Vmx (31)
K m + [S ] [S ]
De este modo, cuando [S] excede con mucho a Km, la velocidad
de reaccin es mxima (Vmx) y no est afectada por aumentos adi-
cionales de la concentracin de sustrato. FIGURA 8-6 Grfico del doble recproco o de Lineweaver-Burk de
3. Cuando [S] = Km (punto B en las figs. 8-4 y 8-5). 1/vi en contraposicin con 1/[S] usado para evaluar la Km y Vmx.

Vmx [S] Vmx [S] Vmx

vi = = = (32)
K m + [S ] 2 [S ] 2
b 1
La ecuacin (32) declara que cuando [S] es igual a Km, la velo- 0 = ax + b; por tanto, x = = (36)
cidad inicial es de la mitad del mximo. La ecuacin (32) tambin a Km
revela que Km es y puede determinarse la manera experimental a
partir de la concentracin de sustrato a la cual la velocidad inicial De este modo, Km se calcula con mayor facilidad a partir de la inter-
es la mitad del mximo. seccin x negativa.
La mayor virtud del grfico de Lineweaver-Burk reside en la
facilidad con la cual puede usarse para determinar los mecanismos
Una forma lineal de la ecuacin cinticos de inhibidores de enzima (vase ms adelante). Sin embar-
de Michaelis-Menten se usa go, al usar un grfico del doble recproco para determinar constan-
para determinar Km y Vmx tes cinticas, es importante evitar la introduccin de sesgo por la
agrupacin de datos a valores bajos de 1/[S]. Para lograr esto, se
La medicin directa del valor numrico de Vmx, y, por consiguiente, prepara una solucin de sustrato cuya dilucin hacia una valoracin
el clculo de Km, a menudo requiere concentraciones altas poco producir la concentracin deseada mxima de sustrato. Ahora se
prcticas de sustrato para alcanzar condiciones de saturacin. Una utiliza el mismo volumen de soluciones preparadas al diluir la solu-
forma lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten evita esta dificul- cin madre por factores de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, etc. Los datos entonces
tad y permite extrapolar Vmx y Km desde de datos de velocidad ini- caern en el eje 1/[S] a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, etc. De manera al-
cial obtenidos a concentraciones de sustrato menores que las que ternativa, para minimizar la agrupacin puede usarse un grfico del
producen saturacin. Se empieza con la ecuacin (29), recproco nico, como el de Eadie-Hofstee (vi contra vi/[S]) o de
Vmx [S] Hanes-Woolf ([S]/vi contra [S]).
vi = (29)
K m + [S ]
La constante cataltica, kcat
se invierte
Es factible usar varios parmetros para comparar la actividad relati-
1 K m + [S ] va de diferentes enzimas o de diferentes preparaciones de la misma
= (33) enzima. La actividad de preparaciones de enzima impuras por lo
vi Vmx [S]
general se expresa como actividad especfica (Vmx dividida entre la
se factoriza concentracin de protena). Para una enzima homognea es posible
calcular su nmero de recambio (Vmx dividida entre los mol de en-
1 Km [S ] zima presentes). Sin embargo, si se conoce el nmero de sitios acti-
= + (34)
vi Vmx [S] Vmx [S] vos presentes, la actividad cataltica de una enzima homognea se
expresa mejor como su constante cataltica, kcat (Vmx dividida entre
y se simplifica el nmero de sitios activos, St).
1 Km 1 1 Vmx
= + (35) kcat = (37)
vi Vmx [S] Vmx St

La ecuacin (35) es la ecuacin para una lnea recta y = ax + b,
donde y = 1/vi y x = 1/[S]. Un grfico de 1/vi en el eje y, expresado
como una funcin de 1/[S] en el eje x, da una lnea recta cuya inter-
seccin en el eje y se define como 1/Vmx y la pendiente se define
como Km/Vmx. Ese grfico se conoce como grfico del doble rec-
proco o de lineweaver-Burk (fig. 8-6). Establecer el trmino y de la
ecuacin (36) igual a cero y resolver para x, revela que la intersec-
cin x es 1/Km.
Dado que las unidades de concentracin se anulan, las unidades de
kcat son tiempo recproco.
Eficiencia cataltica, kcat/Km
Mediante qu medida se deben cuantificar y comparar la eficiencia
de enzimas diferentes, sustratos diferentes para una enzima dada,
y la eficiencia con la cual una enzima cataliza una reaccin en las

08 Bender.indd 68 27/11/09 13:52:20


direcciones hacia adelante y hacia atrs? Si bien la capacidad mxi-
ma de una enzima dada para convertir sustrato en producto es im-
portante, los beneficios de una kcat alta slo pueden obtenerse si la
Km es suficientemente baja. De este modo, la eficiencia cataltica de
enzimas se expresa mejor en trminos de la proporcin de estas dos
constantes cinticas, kcat/Km.
Para ciertas enzimas, una vez que el sustrato se une al sitio ac-
tivo, se convierte en producto y se libera con tanta rapidez como
para hacer a tales eventos efectivamente instantneos. Para estos ca-
talticos tan eficientes, el paso limitante es la formacin del comple-
jo ES. Se dice que esas enzimas estn limitadas por difusin, o que
son perfectas desde el punto de vista cataltico, puesto que el ndice
de catlisis ms rpido posible est determinado por el ndice al cual
las molculas se mueven o difunden a travs de la solucin. Los
ejemplos de enzimas para las cuales kcat/Km se aproxima al lmite de
difusin de 108109 M1s1 incluyen la triosafosfato isomerasa, anhi-
drasa carbnica, acetilcolinesterasa y adenosina desaminasa.
La naturaleza a menudo sortea las limitaciones sobre kcat/Km
impuestas por la difusin al montar grupos de enzimas relacionadas
para formar complejos de mltiples enzimas. Las relaciones geom-
tricas de las enzimas en estos complejos son tales que no se permite
que los sustratos y productos se difundan hacia la solucin de volu-
men sino hasta que el ltimo paso en la secuencia de pasos catalti-
cos est completo. La cido graso sintetasa extiende este concepto
un paso ms all al fijar de manera covalente el sustrato a una cade-
na de biotina que rota un sitio activo a otro dentro del complejo
hasta que se completa la sntesis de una molcula de cido palmtico
(cap. 23).
La Km puede aproximar una constante
de unin
La afinidad de una enzima por su sustrato es la inversa de la cons-
tante de disociacin Kd para la disociacin del complejo de enzima-
sustrato ES.
k
E+S 1
ES (38)
k 1
k 1
Kd = (39)
k1
Dicho de otra manera, mientras menor es la tendencia a disociarse
de la enzima y su sustrato, mayor es la afinidad de la enzima por su
sustrato. Si bien la constante de Michaelis Km a menudo aproxima la
constante de disociacin Kd, esto de ningn modo siempre es as.
Para una reaccin catalizada por enzima tpica,
k
E+S 1
ES k
2
E+P (40)
k 1
el valor de [S] que da vi = Vmx/2 es
k 1 + k 2
[S ] = = Km (41)
k1
Cuando k1 >> k2, entonces
k 1 + k 2 k 1 (42)
08 Bender.indd 69
captulo 8 Enzimas: cintica 69
y
k1
[S ] = Kd (43)
k 1
Por ende, 1/Km slo aproxima 1/Kd en condiciones en las cuales la
asociacin y disociacin del complejo ES son rpidas en compara-
cin con la catlisis. Para las muchas reacciones catalizadas por en-
zima para las cuales k1 + k2 no es aproximadamente igual a k1,
1/Km subestimar 1/Kd.
La ecuacin de Hill describe la conducta
de enzimas que muestran unin
cooperativa de sustrato
Si bien casi todas las enzimas despliegan la cintica de saturacin
simple descrita en la figura 8-4, y se describen de manera adecuada
mediante la expresin de Michaelis-Menten, algunas se unen a sus
sustratos de una manera cooperativa, anloga a la unin de oxgeno
por la hemoglobina (cap. 6). La conducta cooperativa es una propie-
dad exclusiva de enzimas multimricas que unen sustrato en mlti-
ples sitios.
Para enzimas que despliegan cooperacin positiva en la unin
de sustrato, la forma de la curva que relaciona los cambios en vi con
los cambios en [S] es sigmoidea (fig. 8-7). Ni la expresin de Mi-
chaelis-Menten ni sus grficos derivados pueden usarse para eva-
luar cintica cooperativa. Por ende, los enzimlogos emplean una
representacin grfica de la ecuacin de Hill que en su origen fue
obtenida para describir la unin cooperativa de O2 por la hemoglo-
bina. La ecuacin (44) representa la ecuacin de Hill dispuesta en
una forma que predice una lnea recta, donde k es una constante
compleja.
log v i
= n log [S] log k
Vmx v i (44)
La ecuacin (44) declara que cuando [S] es bajo en comparacin
con k, la velocidad de reaccin inicial aumenta como la ensima
potencia de [S].
vi
0 [S]
FIGURA 8-7 Representacin de una cintica de saturacin de
sustrato sigmoidea.
27/11/09 13:52:30
 70 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

1 Los inhibidores competitivos tpicamente

vi semejan sustratos
0 Pendiente = n
Los efectos de los inhibidores competitivos pueden superarse al au-
mentar la concentracin de sustrato. Con mayor frecuencia, la inhi-
bicin competitiva del inhibidor (I) se une a la porcin de unin a
Log

1 sustrato del sitio activo, lo que bloquea el acceso por el sustrato. Por
4 S50 3 llaman anlogos de sustrato. La inhibicin de la enzima succinato
Log [S]
FIGURA 8-8 Representacin grfica de una forma lineal de la
ecuacin de Hill usada para evaluar S50, la concentracin de sustrato
que produce la mitad de la velocidad mxima, y el grado de
cooperacin n.
Un grfico de log vi/(Vmx vi) contra log[S] da una lnea rec-
ta (fig. 8-8), donde la pendiente de la lnea n es el coeficiente de
Hill, y un parmetro emprico cuyo valor est en funcin del n-
mero, la clase y la fuerza de las interacciones de los sitios de unin
ende, las estructuras de casi todos los inhibidores competitivos cl-
sicos tienden a asemejarse a las estructuras de un sustrato y, as, se
deshidrogenasa por el malonato ilustra la inhibicin competitiva
por un anlogo de sustrato. La succinato deshidrogenasa cataliza la
eliminacin de un tomo de hidrgeno de cada uno de los dos car-
bonos metileno del succinato (fig. 8-9). Tanto el succinato como su
anlogo estructural malonato (OOCCH2COO) pueden unir-
se al sitio activo de la succinato deshidrogenasa, lo que forma un
complejo ES o uno EI, respectivamente. Sin embargo, dado que el
malonato slo contiene un tomo de metileno, no puede pasar por
deshidrogenacin. La formacin y disociacin del complejo EI es
un proceso dinmico descrito por
1 k
E+I
EI
k
(45)
1

a sustrato mltiples sobre la enzima. Cuando n = 1, todos los sitios para la cual la constante de equilibrio Ki es
de unin se comportan de manera independiente, y se observa
conducta cintica de Michaelis-Menten simple. Si n es de ms de 1, [E ][I] ki
se dice que la enzima muestra cooperacin positiva. La unin de Ki = = (46)
sustrato a un sitio aumenta entonces la afinidad de los sitios res-
[E I] k i

tantes para unin a sulfato adicional. Mientras mayor es el valor En efecto, un inhibidor competitivo acta al disminuir el nmero
para n, ms alto es el grado de cooperacin, y ms sigmoideo ser de molculas de enzima libres disponibles para unin a sustrato,
el grfico de vi contra [S]. Una perpendicular trazada desde el pun- esto es, para formar ES y, as, finalmente para formar producto,
to donde el trmino y log vi/(Vmx vi) es cero interseca el eje x en como se describe a continuacin:
una concentracin de sustrato llamada S50, la concentracin de
sustrato que da por resultado la mitad de la velocidad mxima. De
este modo, S50 es anloga a la P50 para la unin de oxgeno a hemo-
globina (cap. 6).

EL ANLISIS CINTICO DISTINGUE

ENTRE INHIBICIN COMPETITIVA
Y NO COMPETITIVA
Los inhibidores de las actividades catalticas de enzimas propor-
cionan tanto agentes farmacolgicos como recursos de investiga-
cin para estudiar el mecanismo de accin de las enzimas. La fuer-
za de la interaccin entre un inhibidor y una enzima depende de
las fuerzas importantes en la estructura de protena y la unin
de ligando (enlaces de hidrgeno, interacciones electrostticas, in-
teracciones hidrofbicas y fuerzas de van der Waals; cap. 5). Los
inhibidores pueden clasificarse con base en su sitio de accin en la
enzima, en si producen modificacin qumica de la enzima, o en
los parmetros de cintica sobre los cuales influyen. Los compues-
tos que imitan el estado de transicin de una reaccin catalizada
por enzima (anlogos de estado de transicin) o que aprovechan la
Un inhibidor competitivo y sustrato ejercen efectos recprocos
sobre la concentracin de los complejos EI y ES. Dado que la forma-
cin de complejos ES elimina la enzima libre disponible para com-
binarse con el inhibidor, el aumento de [S] disminuye la concentra-
cin del complejo EI y aumenta la velocidad de reaccin. El grado al
cual [S] debe aumentarse para superar por completo la inhibicin
depende de la concentracin del inhibidor presente, su afinidad por
la enzima, Ki, y la afinidad, Km, de la enzima por su sustrato.
H
COO COO
H C 2H H C

maquinaria cataltica de una enzima (inhibidores basados en me-

OOC C H
Succinato

OOC C H
canismo) pueden ser inhibidores en particular potentes. Desde el H
deshidrogenasa
punto de vista cintico, se distinguen dos clases de inhibidores con Succinato Fumarato
base en si el aumento de la concentracin de sustrato supera o no
la inhibicin. FIGURA 8-9 Reaccin de succinato deshidrogenasa.

08 Bender.indd 70 27/11/09 13:52:38


Los grficos del doble recproco facilitan
la evaluacin de inhibidores
Los grficos del doble recproco distinguen entre inhibidores com-
petitivos y no competitivos, y simplifican la evaluacin de constan-
tes de inhibicin. La vi se determina a varias concentraciones de
sustrato tanto en presencia como en ausencia de inhibidor. Para la
inhibicin competitiva clsica, las lneas que conectan los puntos
experimentales convergen en el eje y (fig. 8-10). Dado que la inter-
seccin y es igual a 1/Vmx, este modelo indica que cuando 1/[S] se
aproxima a 0, vi es independiente de la presencia de inhibidor. Sin
embargo, note que la interseccin en el eje x no vara con la concen-
tracin del inhibidor y que puesto que 1/Km es de menor tamao
que 1/Km, Km (la Km aparente), se hace ms grande en presencia
de concentraciones cada vez mayores del inhibidor. De este modo,
un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre Vmx pero aumen-
ta Km, la Km aparente para el sustrato. Para la inhibicin competi-
tiva simple, la interseccin en el eje x es
1 [I]
x = 1 + (47)
Km Ki
Una vez que Km se ha determinado en ausencia de inhibidor, Ki
puede calcularse a partir de la ecuacin (47). Los valores de Ki se
usan para comparar diferentes inhibidores de la misma enzima.
Mientras ms bajo es el valor para Ki, ms eficaz es el inhibidor. Por
ejemplo, los frmacos estatina que actan como inhibidores compe-
titivos de la HMG-CoA reductasa (cap. 26) tienen valores de Ki de
varios rdenes de magnitud ms bajos que la Km para el sustrato
HMG-CoA.
Los inhibidores no competitivos simples
disminuyen Vmx pero no afectan Km
En la inhibicin no competitiva, la unin del inhibidor no afecta la
unin de sustrato, por ende, es factible la formacin de complejos
tanto EI como EIS. Sin embargo, si bien el complejo inhibidor de
enzima an puede unirse a sustrato, su eficiencia para transformar
sustrato en producto, reflejada por Vmx, est disminuida. Los inhi-
bidores no competitivos unen enzimas en sitios distintos del sitio de
unin a sustrato y, por lo general, muestran poca o ninguna seme-
janza estructural con el sustrato.
1
vi
r
do
bi
hi
dor
In
bi
inhi
+
1 No
K m
K1 1
m Vmx
0 1
[S]
FIGURA 8-10 Grfico de Lineweaver-Burk de inhibicin
competitiva. Note la completa distensin de inhibicin a [S] alta
(esto es, 1/[S] baja).
08 Bender.indd 71
captulo 8 Enzimas: cintica 71
Para la inhibicin no competitiva simple, E y EI poseen afini-
dad idntica por el sustrato, y el complejo EIS genera producto a un
ndice insignificante (fig. 8-11). La inhibicin no competitiva ms
compleja ocurre cuando la unin del inhibidor afecta la afinidad
aparente de la enzima por el sustrato, lo que hace que las lneas se
intersequen en el tercero o cuarto cuadrantes de un grfico del do-
ble recproco (que no se muestra). Si bien ciertos inhibidores mues-
tran caractersticas de una mezcla de inhibicin competitiva y no
competitiva, la evaluacin de estos inhibidores va ms all del obje-
tivo de este captulo.
Grfico de Dixon
A veces se emplea como una alternativa para el grfico de Li-
neweaver-Burk, para determinar constantes de inhibicin. La velo-
cidad inicial (vi) se mide a varias concentraciones de inhibidor, pero
a una concentracin fija de sustrato (S). Para un inhibidor competi-
tivo o no competitivo simple, un grfico de 1/vi contra la concentra-
cin del inhibidor [I] da una lnea recta. El experimento se repite a
diferentes concentraciones fijas de sustratos. El conjunto de lneas
resultantes interseca a la izquierda del eje y. Para inhibicin compe-
titiva, una perpendicular trazada hacia el eje x negativo desde el
punto de interseccin de las lneas da Ki (fig. 18-12, arriba). Para
inhibicin no competitiva la interseccin del eje x negativo es Ki
(fig. 8-12, abajo). En las publicaciones farmacuticas a menudo se
emplean grficos de Dixon para evaluar la potencia comparativa
de inhibidores competitivos.
IC50
Una alternativa menos rigurosa, pero de uso frecuente, para Ki
como una medida de la potencia inhibidora es la concentracin de
inhibidor que produce inhibicin de 50%, Ic50. Al contrario de la
constante de disociacin de equilibrio Ki, el valor numrico de IC50
vara en funcin de las circunstancias especficas de la concentra-
cin de sustratos, etc., bajo la cual se determina.
Inhibidores estrechamente unidos
Algunos inhibidores se unen a enzimas con afinidad tan alta, Ki
109 M, que la concentracin de inhibidor requerida para medir Ki
cae por debajo de la concentracin de enzima tpicamente presente
or
id
b
hi
In r
mx +
hi bido
No in
Vmx
FIGURA 8-11 Grfico de Lineweaver-Burk para inhibicin no
competitiva simple.
27/11/09 13:52:44
 72 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas
1 con un residuo esencial desde el punto de vista cataltico, y bloquea
vi
[S]
Ki [I]
1
vi
[S]
Ki [I]
FIGURA 8-12 Aplicaciones de los grficos de Dixon. Arriba:
inhibicin competitiva, estimacin de Ki. Abajo: inhibicin no
competitiva, estimacin de Ki.
en una valoracin. En estas circunstancias, una fraccin importante
del inhibidor total puede estar presente como un complejo EI. De
ser as, esto viola la suposicin, implcita en cintica de estado esta-
ble clsica, de que la concentracin de inhibidor libre es indepen-
diente de la concentracin de enzima. El anlisis cintico de estos
inhibidores muy unidos requiere ecuaciones cinticas especializa-
das que incorporan la concentracin de enzima para estimar Ki o
IC50, y para distinguir entre inhibidores competitivos y no competi-
tivos estrechamente unidos.
Los inhibidores irreversibles envenenan
enzimas
En los ejemplos anteriores, los inhibidores forman un complejo di-
sociable, dinmico, con la enzima; por ende, la enzima por comple-
to activa puede recuperarse con tan slo eliminar el inhibidor del
medio circundante. Sin embargo, varios otros inhibidores actan de
manera irreversible al producir modificacin qumica de la enzima.
Estas modificaciones, por lo general, comprenden hacer o romper
enlaces covalentes con residuos aminoacilo esenciales para la unin
a sustrato, catlisis o mantenimiento de la conformacin funcional
de la enzima. Dado que estos cambios covalentes son hasta cierto
punto estables, una enzima que ha sido envenenada por un inhibi-
dor irreversible, como un tomo de metal pesado o un reactivo aci-
lante, permanece inhibida incluso despus de eliminar del medio
circundante el inhibidor que resta.
Inhibicin basada en mecanismo
Los inhibidores basados en mecanismo o suicidas son anlogos
de sustrato especializados que contienen un grupo qumico que
puede transformarse mediante la maquinaria cataltica de la enzima
blanco. Despus de la unin al sitio activo, la catlisis por la enzi-
ma genera un grupo muy reactivo que forma un enlace covalente
08 Bender.indd 72
la funcin del mismo. La especificidad y la persistencia de inhibido-
res suicidas, que son tanto especficos para enzima como no reacti-
vos fuera de los confines del sitio activo de la enzima, los hacen
promisorios para la creacin de frmacos especficos para enzima.
El anlisis cintico de inhibidores suicidas est ms all del objetivo
de este captulo. Ni el mtodo de Lineweaver-Burk ni el de Dixon
son aplicables porque los inhibidores suicidas violan una condicin
limtrofe clave comn a ambos mtodos, a saber, que la actividad de
la enzima no disminuye en el transcurso de la valoracin.
CASI TODAS LAS REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMA
COMPRENDEN DOS O MS SUSTRATOS
Si bien muchas enzimas tienen un sustrato nico, muchas otras tie-
nen dos y a veces ms sustratos y productos. Los principios
fundamentales, antes comentados, si bien se ilustran para enzimas
con un sustrato nico, tambin aplican a enzimas con mltiples sus-
tratos. Sin embargo, las expresiones matemticas utilizadas para
evaluar reacciones de mltiples sustratos son complejas. Aun cuan-
do un anlisis detallado del rango completo de reacciones de mlti-
ples sustratos va ms all del objetivo de este captulo, a continua-
cin se consideran algunos aspectos comunes de conducta cintica
para reacciones de dos sustratos y dos productos (llamadas reaccio-
nes Bi-Bi).
Reacciones secuenciales
o de desplazamiento nico
En reacciones secuenciales, ambos sustratos deben combinarse con
la enzima para formar un complejo ternario antes de que pueda pro-
ceder la catlisis (fig. 8-13, arriba). Las reacciones secuenciales a
veces reciben el nombre de reacciones de desplazamiento nico
porque el grupo que se est transfiriendo por lo general pasa de ma-
nera directa, en un solo paso, desde un sustrato hacia el otro. Las
reacciones Bi-Bi secuenciales pueden distinguirse ms con base en
si los dos sustratos se agregan en un orden al azar o en uno forzoso.
Para reacciones de orden al azar, el sustrato A o el B puede combi-
narse primero con la enzima para formar un complejo EA o uno EB
(fig. 8-13, centro). En reacciones de orden forzoso, A debe combi-
narse primero con E antes de que B pueda combinarse con el com-
plejo EA. Una explicacin para un mecanismo de orden forzoso es
que la adicin de A induce un cambio conformacional en la enzi-
ma que alinea residuos que reconocen B y se unen al mismo.
Reacciones de ping-pong
El trmino ping-pong aplica a mecanismos en los cuales uno o
ms productos son liberados desde la enzima antes de que se hayan
aadido todos los sustratos. Las reacciones de ping-pong compren-
den catlisis covalente y una forma transitoria, modificada, de la
enzima (fig. 7-4). Las reacciones Bi-Bi de ping-pong son reacciones
de doble desplazamiento. El grupo que se transfiere primero es
desplazado del sustrato A por la enzima para formar productos P y
una forma modificada de la enzima (F). La transferencia de grupo
subsiguiente desde F hacia el segundo sustrato B, que forma el pro-
27/11/09 13:52:47

A B P Q
E EA EAB-EPQ EQ
A B P Q
EA EQ
E EAB-EPQ
EB EP
B A Q P
A P B Q
E EA-FP F FB-EQ
FIGURA 8-13 Representaciones de tres clases de mecanismos de
reaccin Bi-Bi. Las lneas horizontales representan la enzima. Las flechas
indican la adicin de sustratos y la salida de productos. Arriba: una
reaccin Bi-Bi ordenada, caracterstica de muchas oxidorreductasas
dependientes de NAD(P)H. Centro: una reaccin Bi-Bi al azar,
caracterstica de muchas cinasas y algunas deshidrogenasas. Abajo: una
reaccin de ping-pong, caracterstica de aminotransferasas y serina
proteasas.
ducto Q y regenera E, constituye el segundo desplazamiento (fig.
8-13, abajo).
Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman
a la cintica de Michaelis-Menten
Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman a una forma un poco
ms compleja de cintica de Michaelis-Menten, en la cual Vmx se
refiere al ndice de reaccin que se alcanza cuando ambos sustratos
estn presentes a concentraciones que producen saturacin. Cada
sustrato tiene su propio valor Km caracterstico, que corresponde a
la concentracin que da la mitad de la velocidad mxima cuando el
segundo sustrato est presente a concentraciones que producen sa-
turacin. Al igual que para las reacciones de un solo sustrato, pue-
den usarse grficos del doble recproco para determinar Vmx y Km.
La vi se mide como una funcin de la concentracin de un sustrato
(el sustrato variable), mientras que la concentracin del otro sustra-
to (el sustrato fijo) se mantiene constante. Si las lneas obtenidas
para varias concentraciones de sustrato fijo se grafican en el mismo
grfico, es posible distinguir entre una enzima ping-pong, que da
lneas paralelas, y un mecanismo secuencial, que da un modelo
de lneas que se intersecan (fig. 8-14).
Los estudios de inhibicin del producto se usan para comple-
mentar anlisis cinticos y distinguir entre reacciones Bi-Bi ordena-
das y al azar. Por ejemplo, en una reaccin Bi-Bi ordenada al azar,
cada producto ser un inhibidor competitivo al margen de cul sus-
trato es designado como el sustrato variable. Sin embargo, para un
mecanismo secuencial (fig. 8-13, arriba), slo el producto Q dar el
modelo indicativo de inhibicin competitiva cuando A es el sustrato
variable, mientras que slo el producto P producir este modelo con
B como el sustrato variable. Otras combinaciones de inhibidor del
producto y sustrato variable producirn formas de inhibicin no
competitiva compleja.
08 Bender.indd 73
captulo 8 Enzimas: cintica 73
[S2]
en aumento
E
1
vi
E
1
[S1]
E
FIGURA 8-14 Grfico de Lineweaver-Burk para una reaccin de
ping-pong de dos sustratos. Un aumento de la concentracin de un
sustrato (S1) mientras que de la del otro sustrato (S2) se mantiene
constante, cambia las intersecciones x y y, no as la pendiente.
EL CONOCIMIENTO DE LA CINTICA,
EL MECANISMO Y LA INHIBICIN
DE ENZIMAS, AYUDAN A LA CREACIN
DE FRMACOS
Muchos frmacos actan como inhibidores
de enzimas
El objetivo de la farmacologa es identificar agentes que pueden
1. Destruir o alterar el crecimiento, la invasividad o el
desarrollo de agentes patgenos invasores
2. Estimular mecanismos de defensa endgenos
3. Suspender u obstaculizar procesos moleculares aberrantes
desencadenados por estmulos genticos, ambientales o
biolgicos, con trastorno mnimo de las funciones celulares
normales del husped.
En virtud de sus diversas funciones fisiolgicas y alto grado de se-
lectividad de sustrato, las enzimas constituyen blancos naturales
para la creacin de frmacos que son tanto potentes como especfi-
cos. Los frmacos estatina, por ejemplo, disminuyen la produccin
de colesterol al inhibir la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
reductasa (cap. 26), mientras que la emtricitabina y el tenofovir di-
soproxil fumarato bloquean la replicacin del VIH al inhibir una
inverso transcriptasa viral (cap. 34). La farmacoterapia de la hiper-
tensin a menudo incluye la administracin de un inhibidor de la
enzima convertidora de angiotensina, lo que disminuye la concen-
tracin de angiotensina II, un vasoconstrictor (cap. 42).
La cintica enzimtica define condiciones
de investigacin apropiadas
La cintica enzimtica tiene un papel crucial en el descubrimiento
de frmacos. El conocimiento de la conducta cintica de la enzi-
ma de inters se necesita, ante todo, para seleccionar condiciones
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 74 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas
de valoracin apropiadas que detectan con facilidad la presencia de
un inhibidor. La concentracin de sustrato, por ejemplo, debe ajus-
tarse de modo que se genere suficiente producto para permitir la
deteccin fcil de actividad de la enzima sin que sea tan alta que
enmascare la presencia de un inhibidor. Adems, la cintica enzi-
mtica proporciona el medio para cuantificar y comparar la poten-
cia de diferentes inhibidores y definir su modo de accin. Los inhi-
bidores no competitivos son, en particular, deseables, porque en
contraste con los competitivos sus efectos nunca pueden supe-
rarse por completo mediante incrementos de la concentracin de
sustrato.
Muchos frmacos se metabolizan in vivo
La creacin de frmacos a menudo comprende ms que la evalua-
cin cintica de la interaccin de inhibidores con la enzima blanco.
Enzimas presentes en el paciente o en el agente patgeno actan
sobre frmacos, dicho proceso se denomina metabolismo de fr-
maco. Por ejemplo, la penicilina y otros antibiticos -lactmicos
bloquean la sntesis de la pared celular en bacterias al envenenar de
manera irreversible la enzima alanil alanina carboxipeptidasa-trans-
peptidasa. Sin embargo, muchas bacterias producen -lactamasas
que hidrolizan la funcin -lactmica crucial en la penicilina y fr-
macos relacionados. Una estrategia para superar la resistencia al
antibitico resultante es administrar de manera simultnea un inhi-
bidor de -lactamasa y un antibitico -lactmico.
Tambin se requiere transformacin metablica para convertir
un precursor farmacolgico inactivo, o profrmaco, en su forma
biolgicamente activa (cap. 53). El cido 2-desoxi-5-fluorouridli-
co, un potente inhibidor de la timidilato sintasa, un blanco comn
de la quimioterapia de cncer, se produce a partir de 5-fluorouracilo
por medio de una serie de transformaciones enzimticas catalizadas
por una fosforribosil transferasa y las enzimas de la va de salvamen-
to de desoxirribonuclesido (cap. 33). El diseo y la administracin
eficaces de profrmacos requieren conocimiento de la cintica y de
los mecanismos de las enzimas encargadas de transformarlos en sus
formas biolgicamente activas.
RESUMEN
El estudio de la cintica enzimtica los factores que afectan los
ndices de reacciones catalizadas por enzima revela los pasos
individuales mediante los que las enzimas transforman sustratos en
productos.
La G, el cambio general de la energa libre para una reaccin, es
independiente del mecanismo de reaccin, y no proporciona
informacin respecto a los ndices de reacciones.
Las enzimas no afectan la Keq; esta ltima, una proporcin de
constantes de ndice de reaccin, se calcula a partir de las
concentraciones de sustratos y productos en equilibrio, o a partir de
la proporcin k1/k1.
Las reacciones proceden por medio de estados de transicin en
los cuales GF es la energa de activacin. La temperatura, la
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concentracin de ion hidrgeno, la concentracin de enzima,
la concentracin de sustrato y los inhibidores, afectan los ndices de
reacciones catalizadas por enzima.
En la medicin del ndice de una reaccin catalizada por enzima por
lo general se emplean condiciones de ndice iniciales, para las cuales
la ausencia esencial de producto impide la reaccin inversa.
Las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten simplifican
la determinacin de Km y Vmx.
Una forma lineal de la ecuacin de Hill se usa para evaluar la cintica
de unin a sustrato cooperativa mostrada por algunas enzimas
multimricas. La pendiente n, el coeficiente de Hill, refleja el nmero,
la naturaleza y la fuerza de las interacciones de los sitios de unin a
sustrato. Un valor de n de ms de 1 indica cooperacin positiva.
Los efectos de inhibidores competitivos simples, que por lo general
semejan sustratos, se superan al aumentar la concentracin del
sustrato. Los inhibidores no competitivos simples disminuyen la Vmx
pero no afectan la Km.
Para inhibidores competitivos y no competitivos simples, la constante
inhibitoria Ki es igual a la constante de disociacin de equilibrio para
el complejo de enzima-inhibidor relevante. Un trmino ms simple y
menos riguroso para evaluar la eficacia de un inhibidor es la IC50, la
concentracin del inhibidor que produce inhibicin de 50% en las
circunstancias particulares del experimento.
Los sustratos pueden aadirse en un orden al azar (cualquier sustrato
puede combinarse primero con la enzima) y en un orden forzoso (el
sustrato A debe unirse antes que el sustrato B).
En reacciones de ping-pong, uno o ms productos se liberan a partir
de la enzima antes de que se hayan aadido todos los sustratos.
La cintica enzimtica aplicada facilita la identificacin y
caracterizacin de frmacos que inhiben de manera selectiva enzimas
especficas. De este modo, la cintica enzimtica desempea una
funcin crucial en el descubrimiento de frmacos, en la
farmacodinmica comparativa, y en la determinacin del modo de
accin de frmacos.
REFERENCIAS
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