Kultura Stanica 6

Vjebe iz predmeta
Kultura elija
(stanica)
kolska godina 2010/2011

Uvod
Definicija:
Kultura elija podrazumijeva odravanje elija
u vjetaki kontroliranoj sredini koja pogoduje
njihovom rastu.
Prvo uspjeno kultiviranje animalnih elija je
uspjeno izvrio Ross Harrison 1907 godine
kada je pokuavajui posmatrati razvoj
nervnih vlakana uspio kultivirati tkivo
embriona abe 1-4 sedmice.
ira upotreba ove tehnike u nauci poela je
tek kasnih 1940. i ranih 1950. godina.
Uvod
U ranom periodu tehnike kulture elija

uglavnom se radilo na iznalaenju naina
prevazilaenja problema kontaminacije
elijskih kultura (razvoj antibiotika).
U novije vrijeme glavno obiljeje razvoja ove
tehnike kulture elija je njena
komercijalizacija.
Uvod
Tehnikom kulture elija se
kultiviraju pojedinane
elije ije su veze sa
okolnim elijama
pokidane.
Kultiviranje tkiva oznaava
se pojmom kultura tkiva
Tehnika kultiviranja cijelih
organa s ciljem praenja
njihove kontinuirane
funkcije ili razvoja zove se
kultura organa.
Uslovi uspostavljanja kulture
elija
Za uspjean rast humanih elijskih kultura

neophodno je obezbijediti sljedee uslove:
Sterilnost
Temperatura
Koncentracija CO2
pH
Adekvatnost sadraja i koliine hranljivog
medija
Posude za kultivaciju
Sterilnost
Mnogi mikroorganizmi rastu
intenzivnije i bre od
humanih elija u kulturi, a
veina njih proizvodi toksine
koji tete kultiviranim
elijama i na kraju mogu
uzrokovati totalno unitenje
kulture.
Kontaminanti elijskih
kultura mogu voditi porijeklo
iz organizma ije se elije
kultiviraju ili iz okolne
sredine (obino iz zraka).
Sterilnost
Postoji vie naina da se smanji rizik
uvoenja kontaminanata u kulture, a
najvaniji je dobra aseptina tehnika.
Osnovna pravila aseptine tehnike
podrazumijevaju izbjegavanje:
kontakta sterilnog pribora ili posua koji
dolaze u direktni dodir s uzorkom i
nesterilnog pribora ili golih ruku,
kaljanje, kihanje, prianje ili disanje
direktno nad sterilnim priborom koji dolazi u
direktni kontakt sa uzorkom.
Sterilnost
Pored ovoga pravila aseptine tehnike
obavezuju na adekvatnu upotrebu
odgovarajue opreme.
Rad sa elijskim kulturama iskljuivo se
odvija u vertikalnom ili horizontalnom
laminaru sa protokom sterilnog zraka.
Osoba koja radi sa elijama u kulturi mora
biti adekvatno odjevena (mantil, rukavice i
maska za lice)
pribor se sterilie upotebom autoklava i
suhog sterilizatora ili se koristi plastini
sterilni materijal za jednokratnu upotrebu.
Sterilnost
Smanjenje mogunosti kontaminacije samih
kultura postie se i dodavanjem antibiotika u
medije.
Antibiotici su komercijalno dostupni i
pripremljeni za elijske kulture, a obino
sadre: penicilin, streptomicin, kanamicin ili
gentamicin.
Prilikom uspostavljanja primarnih elijskih
kultura neophodno je u medij dodati i
odreene fungicide kako bi se sprijeila
kontaminacija gljivicama od kojih je najea
Candida albicans (npr. nistatin, fungizon).
Sterilnost
Kontaminacija primarnih elijskih kultura

virusima obino je posljedica prisustva virusa
u elijama prije biopsije
virusne infekcije kulture su obino hronine i
ne ubijaju domainske elije u kulturi.
Temperatura
Optimalna temperatura za humane kulture
elija je 37C
Blago poveanje temperature poveava
stopu multiplikacije elija do odreenog
nivoa. Kada se dostigne gornji prag daljnje
poveanje temperature djeluje inhibitorno na
elijski rast.
Temperature nie od 37C djeluju
depresorno na elijski metabolizam i
umanjuju elijski rast.
Veoma je vano da temperatura u
inkubatoru ne varira vie od 0.25C.
Temperatura
Generalno se smatra da vie temperature

djeluju tetnije na rast elija u kulturi nego
nie.
Kratko izlaganje temperaturi vioj za 3C od
normalne, moe dovesti do smrti cijele
kulture
Iste kulture mogu preivjeti kratkotrajna
izlaganja temperaturi nioj za 10C od
normalne.
elijske kulture izvedene iz odreenih tkiva,
kao i pojedine elijske linije mogu zahtjevati
neto drugaiju temperaturu za optimalan
rast.
Temperatura
Primjer: Normalna temperatura testisa je
znaajno nia od tjelesne temperature i
iznosi 33C, zato prilikom rada sa elijskim
kulturama dobivenim iz tkiva testisa,
spermatogeneza in vitro se nee odvijati
normalno na 37C.
Za dobijanje elijskih linija koriste se
mnogi sisari (npr. mievi, takori, make,
psi) koji imaju temperaturu znaajno
drugaiju od ovjekove. elije insekata,
crva ili riba zahtjevaju znaajno nie
temperature i ne mogu se kultivirati na
37C.
pH medija
Optimalan pH medija u kojem se kultiviraju

elije je 7 7.4.
Ovakav pH medija se u kulturi odrava
zahvaljujui puferima koje medij sadri i
koncentraciji gasova u inkubatoru.
Uobiajeno je da se za najvei broj elijskih
kultura u inkubatoru odrava mjeavina
gasova: 5% CO2 i 95% atmosferski
zrak.
Adekvatnost sadraja i koliine
hranljivog medija
Da bi elije bile sretne u mediju u kojem
se kultiviraju, medij mora biti podeen za
odreeni tip elija.
Najee se koriste mediji na bazi RPMI
1640, MEM-a (minimal essential medium) ili
angovog medija.
Ovi osnovni mediji sadre veliki broj materija
koje elije trebaju za uspjean rast u kulturi,
kao to su: neorganske soli, aminokiseline i
vitamini.
Nezaobilazan dodatak koji umanjuje
mogunost kontaminacije je antibiotik
(najee se koristi penicilin/streptomicin).
hranljivog medija
Nezaobilazan dodatak hranjivih medija
je L- glutamin, a za kulture limfocita periferne
krvi neophodan je mitogeni stimulator
fitohemaglutinin.
U kompletnom mediju za elijsku kulturu
obavezan sastojak je i serum (najee
BSA).
Uloga seruma nije do kraja razjanjena, ali je
dokazano da bez njega elije u kulturi ne
mogu preivjeti dugo.
Odravanje pH kompletnog medija
obezbjeuje prisustvo puferskih soli.
hranljivog medija
Primjer: Sastav medija za kultivaciju epitelnih

elija
200 ml RPMI 1640 (bazalni medij)

42.5 ml serum (govei fetalni)
2.5 ml L-glutamin
5 ml otopina penicilin/streptomicin
U zavisnosti od tipa elija koji se kultivira,

potrebe kultiviranja u otvorenom ili
zatvorenom sistemu, kao i specifinosti
eksperimenta koji se izvodi bira se adekvatna
posuda za kultivaciju.
Danas se preferira upotreba plastinih
sterilnih posuda koje su namijenjene za
jednokratnu upotrebu.
U in vitro tehnici kultiviranja elija najee
se koriste T-flaskovi zapremine 25-75 ml,
Petri posudice i tubice za centrifugiranje sa
konusnim dnom zapremine 15 ml.
15 ml i 50 ml tubice
Multiwell plejtovi
15 ml tubice
Petri posude
Flaskovi
Primarne elijske kulture i
subkultiviranje
Primarne elijske kulture
Kada se iz nekog organizma biopsijom ili

hirurki odstrane fragmenti odreenog tkiva,
a zatim stave u odgovarajuu vjetaki
kontroliranu sredinu za kultiviranje, elije e
se vezati za podlogu, dijeliti se i rasti.
Ovo je primarna elijska kultura.
elijska kultura se moe smatrati primarnom

do njenog prvog subkultiviranja
(pasairanja).
Termin kratkotrajne kulture se koristi za
primarne elijske kulture koje se ne mogu
subkultivirati.
Primarne elijske kulture koje su dobijene od
jedne ili nekoliko elija i koje su vezane za
podlogu rastu tako da formiraju koloniju
nazivaju se primarnim kolonijama.
Dvije osnovne metode dobijanja primarnih
elijskih kultura su:
Kulture eksplantata mali komadii
tkiva se uronjeni u medijum veu za dno
plastine ili staklene posude, a zatim se kroz
nekoliko dana pojedinane elije izdvajaju iz
tkivnih eksplantata i veu za podlogu posude
ili ostaju u mediju (zavisno od tipa elija),
gdje poinju da se dijele i rastu.
Enzimatska disocijacija ovo je
raireniji i bri metod koji podrazumijeva
disocijaciju tkiva na pojedinane elije
proteolitikim enzimima kolagenazom,
dispazom ili tripsinom. Ovim se dobija
suspenzija pojedinanih elija koje se zatim
stavljaju u posude sa kultivacijskim medijem
u inkubator gdje se dijele i rastu.
Uzimanje uzorka Digestija tkiva sa proteolotikim Kultiviranje elija

enzimima
Subkultiviranje (pasairanje)
Kada elije u primarnoj kulturi ispune sav
raspoloivi prostor (dno posude ili medij)
potrebno je premjestiti elije u nove posude s
svjeim medijem. Ovaj postupak oznaen je
terminom pasairanje.
Odvajanje kultiviranih elija od dna posude
postie se kratkotrajnim izlaganjem
djelovanju tripsina ili veoma njenim
struganjem specijalnim spatulama.
Subkultiviranje (pasairanje)
Ostatak elija u suspenziji moe se

krioprezervirati uz pomo dimetilsulfoksida
ili glicerola na -130C
Kasnije po potrebi odlediti i ponovno
kultivirati.
Dimetilsulfoksid i glicerol pomau
odravanje elija vijabilnim tokom procesa
zamrzavanja i odmrzavanja.
Sistemi elijskih kultura
Dva su osnovna sistema elijskih kultura.

Razlika izmeu ovih sistema zasnovana je na
sposobnosti elija da se veu za podlogu
staklene ili plastine posude.
Sistemi jednoslojnih elijskih kultura:
u ovim sistemima kultiviraju se elije koje

imaju sposobnost vezanja za podlogu, gdje
rastu u jednom sloju.
Jednoslojne kulture se uglavnom odravaju u
T-flaskovima, Petrijevim posudicama,
multiwell-plate posudama ili tubicama.
Na ovaj nain kultiviraju se fibroblasti,
epitelne elije, amniociti, veina tumorskih
elija itd.
Sistemi elijskih kultura u suspenziji :
obino se kultiviraju uz mukanje u
Erlenmajer posudama.
U nekim sluajevima se kultiviraju bez
mukanja u tubicama i T-flaskovima.
U sistemima elijskih kultura u suspenziji
kultiviraju se limfociti, kotana sr, kao i neki
tipovi tumora (npr. neuroblastomi i limfomi).
Neki tipovi uzoraka kao to su elije limfnih
vorova i odreenih tumora mogu biti
kultivirani na oba navedena naina.
Sistemi elijskih kultura dalje mogu biti
otvoreni i zatvoreni
Ovo zavisi od toga da li je ep posude
zavrnut potpuno ili djelimino
U otvorenim sistemima elijske kulture
razmjenjuju gasove sa okolnom atmosferom,
dok zatvoreni sistemi nemaju tu mogunost.
Zatvoreni sistemi imaju manju vjerovatnou
kontaminacije mikroorganizmima, ali zato
gomilaju produkte elijskog metabolizma koji
mogu biti toksini.
Tipovi elija u kulturi i
elijske linije
Tipovi elija u kulturi
Kultivirane elije se na osnovu njihove
morfologije, oblika i izgleda mogu podijeliti u tri
osnovna tipa.
1. Epitel sline elije (E-tip): rastu vezane
za podlogu, izgledaju pljosnato i poligonalnog
su oblika.
2. Limfoblast sline elije (L-tip): u kulturi

nisu vezane za podlogu, ostaju u suspenziji
ili semisuspenziji taloei se na dnu posude i
sferinog su oblika.
3. Fibroblast sline elije (F-tip): rastu
vezane za podlogu, izgledaju izdueno i
bipolarne su.
Amniociti (AF-tip) predstavljaju zaseban tip

elija. To su elije fetalnog porijekla koje se
kultiviraju iz amnionske tenosti, pleomorfne su
i multinukleirane.
elijske linije
elijske linije nastaju od primarnih elijskih

kultura nakon njihovog prvog subkultiviranja.
elijske linije su omoguile veliki napredak u
istraivanju i kontroli elijskog ciklusa,
proizvodnji vakcina i rekombinantnih
proteina.
Neke elijske linije vremenom poinju
pokazivati znakove starenja i prestaju da se
dijele, pa se nazivaju ogranienim elijskim
linijama.
Termin elijska linija ukazuje da kultura vodi
porijeklo od brojnih elija prisutnih u
primarnoj kulturi.
elijske linije
Ukoliko je poznato da elijska linija vodi
porijeklo od jedne jedine elije tada se naziva
klonalnom elijskom linijom.
Sojevi elijskih linija predstavljaju linije elija
koje imaju neke specifine ili unikatne
osobine.
Veina elijskih linija se moe dijeliti
neogranieno i nazivaju se trajnim ili
besmrtnim elijskim linijama.
Da bi ograniena elijska linija postala trajna
ona mora proi proces imortalizacije ili
transformacije, to se in vitro moe desiti
spontano ili pod dejstvom odreenih lijekova,
zraenja ili virusa.
elijske linije
Pionirske elijske linije su izvedene iz
normalnih adultnih animalnih tkiva.
Jedna od najpoznatijih trajnih animalnih
elijskih linija, koja se danas iroko koristi je
izvedena iz elija ovarija adultnog kineskog
hrka 1959. (CHO-eng. Chinese hamster
ovary).
Veina danas poznatih elijskih linija
izvedene su iz tumora ili in vitro
transformiranih elija
ima i elijskih linija koje se takoer iroko
koriste a izvedene su iz normalnih humanih
tkiva, kao npr. linija normalnih fibroblasta WI-
38, koje imaju ogranien ivotni vijek in vitro.
elijske linije primjer: elijska
linija HeLa
HeLa najpoznatija tumorska elijska linija
1952. Georg i Margaret Gey su tragali za
humanim elijama koje e preivjeti izvan
tijela neogranieno, i dobili su elijsku liniju
koja se dijelila kao ni jedna do tada, a
uspostavili su je iz elija cervikalnog kancera
Henriette Lacks.
Henrietta Lacks je umrla u 32. godini ivota, a
HeLa elijska linija postala je poznata irom
svijeta .
Danas se koristi kao model u mnogim
laboratorijama prilikom istraivanja elijskih
efekata lijekova i zraenja, a zasluna je i za
razvoj vakcine Polio.
elijske linije primjer: elijska
linija HeLa
Iako zbog dugotrajnog kultiviranja postoji
mnogo sojeva HeLa elija svi vode porijeklo od
istih tumorskih elija gospoe Lacks.
elijske linije primjer:
elijska linija HeLa
Definitivnu citogenetiku karakterizaciju HeLa
elija kao hipertriploida (3n+) utvrdili su
Macville et al. 1999.
Horizontalni transfer gena sa humanog
papilloma virusa 18 (HPV18) na cervikalne
elije od kojih je nastala HeLa linija uzrokovao
je njihovu transformaciju uz modifikaciju broja
hromosoma.
HeLa elije u svom genomu imaju 20
klonalnih abnormalnih hromosoma (poznatih
kao HeLa hromosomski potpis ili HeLa
markeri) i multiple kopije HPV18 integrirane
na specifinim mjestima u genomu.
Primjena kulture elija
Kultura elija se primjenjuje u nekoliko oblasti:

Istraivanja kancera
Genetiko savjetovanje
Genetiko inenjerstvo
Kulture elija kao fabrike
Genska terapija
Testiranje toksinosti
istraivanje kancera
U citogenetikim istraivanjima kancera neophodno je
prethodno in vitro uzgojiti elije istraivanog kancera
kako bi se mogle dobiti metafazne elije sa
hromosomima pogodnim za analizu.
Brojne hromosomske aberacije, kako strukturne tako i
numerike detektovane su u razliitim tipovima
kancera.
Hromosomska nestabilnost je karakteristina za sve
kancere, a neke tipove kancera karakteriu posebni
kariotipovi (npr. Ph hromosom hronina mijeloina
leukemija).
Takoer, kulture tumorskih elija mogu se koristiti kao
test sistemi za in vitro testiranja potencijalnih
antitumorskih supstanci i antitumorskih lijekova.
genetiko savjetovalite
Dobivanje kariograma iz kultiviranih

amniocita (fetalnih elija koje se nalaze u
plodovoj vodi) omoguava ranu i egzaktnu
detekciju irokog spektra genetikih
poremeaja fetusa.
genetiko inenjerstvo
Mogunost transfera genetikog materijala na

elije u kulturi omoguila je molekularnim
biolozima istraivanja gena od interesa i
proteina koje ovi geni kodiraju.
Ova tehnika je omoguila dobijanje velikih
koliina ovih novih proteina za dalja
istraivanja.
kultura elija kao fabrike
Kulture elija mogu se koristiti u proizvodnji mnogih
vanih produkata, ali tri su oblasti posebno
interesantne:
Masovna proizvodnja virusa: uzgojem virusa in
vitro i njihovih produkata u kulturi elija omogueno je
dobijanje vakcina za: pljuskavice, veliki kaalj,
bjesnilo, hepatitis B,....
Masovna proizvodnja proteina: genetiki
transformirane elije u kulturi mogu proizvoditi
medicinski ili komercijalno znaajne proteine (npr.
insulin).
Proizvodnja tkiva ili itavih organa: vjetaki
uzgojena tkiva koe danas se masovno koriste kod
pacijenata sa tekim opekotinama, a vjetaka
proizvodnja organa kao to su pankreas, jetra i
bubrezi je u fazi istraivanja.
Primjena kulture elija genska
terapija
elije uzete iz organizma pacijenta kojem

nedostaje funkcionalni gen mogu biti
uzgojene u kulturi, a zatim tehnikama
genetike transformacije oteeni gen moe
biti zamjenjen funkcionalnim.
Takve elije mogu se uzgojiti u kulturi u
velikom broju a zatim vratiti u organizam
pacijenta.
testiranje toksinosti
In vitro testovi na kultiviranim elijama se
esto koriste sami ili uz in vivo testove na
ivotinjama prilikom istraivanja bioaktivnosti
novih lijekova, kozmetike, hemikalija, ili
biolokih materija.
Pozitivni ili negativni efekti koje ovi agensi
mogu ispoljiti na kulturama elija obino se
dijele na:
- efekte na nivou elija citotoksinost i
- efekte na nivou genetikog materijala
genotoksinost.
U istraivanjima ovoga tipa veoma su
znaajne kulture elija izvedene iz jetre ili
bubrega, ali ipak prilikom testiranja toksinosti
(naroito genotoksinosti) najee koriteni
model su humani limfociti periferne krvi.
Najee analize koje se koriste za testiranje
toksinosti su: analiza hromosomskih
aberacija, citokineza-blok mikronukleus esej,
test izmjene sestrinskih hromatida, itd.
Meutim, nita manje nisu znaajni ni Allium
test, Tradescantia test, kao i mnogi drugi
testovi za dokazivanje genotoksinosti na
biljnom materijalu.
Bez obzira na irok izbor testova mutagenosti,

niti jedan od njih pojedinano ne moe
obuhvatiti sve nivoe i specifine aspekte
moguih efekata odreenih mutagenih
supstanci, odnosno genotoksikanata.
Ipak, ovi testovi, primjenjeni u razliitim
kombinacijama, u manjoj ili veoj mjeri
omoguavaju praenje i detekciju mutagenosti
na razliitim nivoima njihovog ispoljavanja.
Kultura elija u
citogenetici
Standardne citogenetike metode
podrazumijevaju analizu metafaznih
hromosoma, te se preparati mogu praviti samo
sa elijama koje su u mitozi.
Kultivacija elija predstavlja integralan i
nezamjenjiv dio rada svake citogenetike
laboratorije i prvi korak u svim citogenetikim
analizama.
Zavisno od vrste citogenetike analize i tipa
analiziranih elija kulture se mogu odravati
krai ili dui vremenski period.
Kratkotrajne elijske kulture se obino
odravaju 24-96 sati i odnose se na perifernu
krv, kotanu sr, amnionsku tenost i
horionske rese.
Dugotrajne elijske kulture mogu se odravati
od nekoliko sedmica do nekoliko mjeseci, a
najee koritene i najbolje poznate su
kulture fibroblasta.
elije brojnih tkiva sa zadovoljavajuom
proliferativnom sposobnou, kao to su koa,
korijen kose, kotana sr i druge, mogu se
koristiti za hromosomska ispitivanja.
Najee se koristi in vitro kultura limfocita
periferne krvi.
Od otkria mitogenih svojstava
fitohemaglutinina (PHA), limfociti su zbog
jednostavnosti njihovog uzimanja, najbolji
materijal za dobijanje hromosomskih
preparata.
Mnogim od spomenutih tkiva i elija
komplikovaniji je pristup, a uz to esto imaju
i visok procenat elija asinhronog ciklusa.
Jedna od prednosti kultiviranja humanih
limfocita periferne krvi, u citogenetikoj
dijagnostici, sadrana je u injenici da je to
jedno od rijetkih tkiva ije se elije mogu
kultivirati do 48 sati post-mortem.
Humani limfociti periferne krvi se kod zdravih
odraslih osoba normalno ne dijele (miruju u G0
stadiju interfaze), te se u kulturi stimuliraju na
diobu dodavanjem mitogenih stimulatora kao
to je fitohemaglutinin (mukoproteid izolovan iz
crvenog graha).
Stimuliranjem limfocita na diobu, oni dobivaju
sposobnost intenzivne proliferacije i prolaze
kroz sve faze elijskog ciklusa: DNK
presintetsku (G1), DNK sintetsku (S), DNK
postsintetsku (G2), te mitotsku (M) fazu.
Dvadesetetiri sata nakon dodatka mitogena
veina stanica je u S fazi.
Tokom inicijalna 24 sata limfociti proizvode
interleukin2 (IL2), faktor rasta limfocita,
koji omoguava odvijanje mitoze u
neprestanim lananim reakcijama.
U naredna 24 sata poinje odvijanje mitoze.
Iako postoje individualne varijacije u

vremenu zapoinjanja mitoze, 48 sati po
dodatku mitogenog stimulatora, u in vitro
uslovima, najvei broj limfocita je u prvoj
metafazi, a broj aktiviranih elija zavisi od
vie faktora: individualnih razlika izmeu
ispitanika, uslova kultiviranja itd.
Kultivacija humanih limfocita
periferne krvi
Kultivacija periferne krvi danas se izvodi
standardnim postupkom kojeg je utemeljio
Moorhead (1960)
Za kultiviranje se najee koristiti kompletni
medij PBMAXTM Karyotyping Medium
(Gibco).
Bitno je napomenuti da je ovaj medij
specijalno dizajniran za kultivaciju limfocita
periferne krvi.
Takoer se za kultiviranje limfocita esto
spravlja podloga na bazi RPMI 1640 medija
(Gibco) uz dodatak L-glutamina, 20% fetalnog
goveeg seruma, fitohemaglutinina i otopine
penicilina i streptomicina.
periferne krvi
U 5 ml medija zasijava se 400 ml pune krvi i
kultivira u sterilnim, plastinim, koso
postavljenim tubicama zapremine 15 ml sa
konusnim dnom (Gibco) u inkubatoru na
37C.
Limfociti se kultiviraju u zatvorenim tubicama
koje se postavljaju u kosi poloaj kako bi se
maksimalno poveala dodirna povrina
istaloenih elija sa medijem u kojem se
kultiviraju
Zavisno od potrebe limfociti se mogu
kultivirati 48, 72 ili maksimalno 96 sati.
periferne krvi
Prvi korak u veini procedura dobivanja elija
za standardnu citogenetiku analizu je
blokiranje diobe u metafazi, to se postie
dodavanjem kolcemida ili kolhicina u kulture
30 do 180 minuta prije fiksacije elija.
Efekat kolcemida (sintetiki analog kolhicina)
koji se u te svrhe najee koristi je
spreavanje formiranja diobenog vretena.
Kolcemid takoer uzrokuje kondenzaciju
hromosoma, koja zavisi od duine ekspozicije
i koncentracije kolcemida.
periferne krvi
Neke elije su osjetljivije na koncentraciju
kolcemida od drugih, ali openito, poveana
koncentracija kolcemida poveava mitotiki
indeks, pojaava konture hromosoma,
nazubljuje ivice hromatida i poboljava
rasprivanje hromosoma.
Iako se kolcemid iroko upotrebljava, neke
laboratorije i dalje preferiraju kolhicin (derivat
biljke Colchicum autumnale), koji je toksiniji i
stoga moe uticati na brzinu elijskog ciklusa,
te rezultirati duim hromosomima, koji su
pogodniji za citogenetiku dijagnostiku.
Izvoenje kulture limfocita i
pravljenje preparata za
citogenetiku analizu
Po isteku odreenog vremena kultivacije
limfocita, tubice sa elijskim kulturama se
promukaju, a zatim centrifugiraju 10 minuta
na 1100 obrtaja/min.
Supernatant se paljivo odstrani Pasterovom
pipetom.
Talog se izmjea u ostatku tene faze.
U izmjeani sadraj se lagano dodaje 6 ml

hipotonine otopine 0,56% (0,075M) KCl-a
uvanog na sobnoj temperaturi ili na 37C.
U hipotoninoj otopini se poveava volumen
elija usljed ega se hromosomi bolje
rasporede.
Zagrijavanje hipotonine otopine na 37C
moe poveati efikasnost, ubrzavajui
transport vode kroz elijsku membranu i
smekavajui citoplazmatsku membranu,
to joj poveava sposobnost rastezanja.
Vrsta soli koritena u hipotoniku moe
uticati na irinu a ponekad i duinu
hromatida.
Nakon inkubacije u hipotoninoj otopini u
trajanju od 25 minuta uzorci se centrifugiraju
10 minuta na 1100 obrtaja/min.
Supernatant se ponovno odstrani, a
izmjeanom talogu se dodaje fiksativ
(apsolutni etanol i glacijalna siretna kiselina
u omjeru 3:1) ohlaen na 4C.
Fiksacija elija ponavlja se 3 puta, dok
uzorci ne postanu prozirni.
Nakon treeg fiksiranja uzorci se
centrifugiraju i supernatant maksimalno
odstrani, a talog ponovo suspendira u 0,5 ml
svjeeg ohlaenog fiksativa.
Tokom fiksacije viak vode se uklanja iz
elija, a elije gube vijabilnost i prezerviraju
se.
Hladan fiksativ poboljava vidljivost kontura
hromosoma, te neki protokoli sugeriraju da
prva fiksacija i/ili zadnja fiksacija traje 124
sata u friideru ili zamrzivau.
Preparati se prave tako to se suspenzija
limfocita u fiksativu Pasterovom pipetom
nanosi na oprana i u friideru ohlaena
predmetna stakla.
Preparati se sue na sobnoj temperaturi
najmanje 24 sata.
Osueni preparati su spremni za bojenje,
koje prethodi mikroskopskoj analizi.
Kultivacija amniocita
Amniociti su elije amnionske tenosti fetalnog

porijekla koje najee vode porijeklo od tkiva koe i
urinarnog trakta fetusa.
Uzorci amnionske tenosti za citogenetiku analizu se
uzimaju procedurom koja se naziva amniocenteza.
Preporuljivo je prikupljanje uzorka u dvije sterilne
posudice od 15 do 20 ml, zavisno od gestacijskog
perioda.
S obzirom na osjetljivost amniocita preferira se to je
mogue bri transport uzorka amnionske tenosti u
citogenetiki laboratorij.
Amniociti se veoma uspjeno kultiviraju u AmnioMax
ili Chang D mediju, u T-flaskovima zapremine 25 ml,
formirajui jednoslojne kolonije vezane za dno posude
Pravila rada sa
kulturama elija
1. Uvijek nositi mantil i rukavice
2. Prije rada sa kulturama elija, sredstvom
za dezinfekciju potrebno je obrisati radne
povrine laminara u sterilnim uslovima i sue
koje se u njega unosi.
3. Paljivo obiljeiti hranljive podloge za
odreenu kulturu elija. Navesti naziv
hranljive podloge i datum njene pripreme.
Bilo bi najbolje da se za svaku elijsku liniju
koristi zasebna boca sa hranljivom
podlogom.
4. Ne raditi istovremeno sa vie elijskih
linija kako bi se izbjegla mogunost njihove
zamjene.
5. Svaki dan posmatrati elije (paziti na
zagaenje)
6. Provjeravati redovno kulture elija na
prisutnost mikoplazmi.
7. Osigurati redovno ienje i dezinfekciju
cijelog laboratorija, ukljuujui inkubator,
vodeno kupatilo, kao i redovno mjenjanje
filtera u laminarima.
8. Redovno mjenjati UV svjetiljke.
9. Dnevno prazniti posudu za teni otpad u

laminaru.
10. S oprezom koristiti elijske linije dobivene
iz neprovjerenih izvora.
11. Prilikom svakog odmrzavanja elija treba
na ampulama napisati broj pasaa elija
kako bi im se mogla odrediti starost.
12. Alternativno se elije mogu uvati i na
80 oC (ne due od nekoliko mjeseci).

13. Izbjegavati uzgoj elija do visoke
popunjenosti.
14. Ne koristiti tekue hranljive podloge
nakon isteka trajanja jer je veina hemikalija
u hranljivim podlogama nestabilno.
Uslovi koje treba ispuniti prije
uspostavljanja primarne kulture
elija
1. Prije poetka rada sa ljudskim ili
ivotinjskim tkivima, treba biti siguran da su
potovana medicinska etika pravila i vaei
zakoni o eksperimentima na ivotinjama.
2. Masno i nekrotino tkivo treba ukloniti
prilikom mehanikog usitnjavanja tkiva.
3. Tkivo treba mehaniki usitniti uz
minimalno oteenje elija.
4. Enzime, upotrebljene za usitnjavanje,
treba ukloniti centrifugiranjem. Enzimi koje
se najee koriste su: tripsin, kolagenaza,
elastaza, hijaluronidaza, DNAza, pronaza i
dispaza, a koriste se pojedinano ili u
kombinacijama.
5. Broj elija koriten za pripremu primarne
kulture elija treba biti mnogo vei nego onaj
koji se inae koristi za nasaivanje u
kulturama elija. Procenat elija koje preive
postupak pripreme primarne kulture moe
biti prilino mali.
6. Kombinacija bogate podloge za uzgoj
elija i serum goveeg fetusa esto daju
dobre rezultate u uzgoju primarnih kultura.
Naravno, odreene vrste elija zahtjevaju
specifine hranljive podloge za uzgoj .
7. Embrionalna tkiva lake je usitniti, daju
vei prinos elija, a elije se umnaaju bre
nego primarne kulture tkiva odraslih jedinki.
Uspostavljanje
primarnih kultura
fibroblasta i
keratinocita iz uzoraka
ljudske koe
Uvod
Zbog jednostavnog uzgoja i brzog rasta,

fibroblasti su esto koritena primarna kultura
elija.
Koriste se za prouavanje funkcije i
metabolizma proteina izvanelijskog
matriksa, modulacije imunolokog odgovora i
upalnog procesa, te za prouavanje niza
drugih temeljnih procesa elije.
Za uspostavljanje kulture ljudskih fibroblasta
najee se koriste uzorci zdrave koe
dobivene prilikom obrezivanja
novoroenadi, uzorci uzeti nakon biopsije,
plastinih operacija, i drugih tipova hirurkih
zahvata.
Uvod
Primarne kulture keratinocita koriste se u

medicini za pripremu autolognih konih
transplantata u tretiranju dubokih opeklina.
Uz ostalo, ljudski keratinociti koriste se za
prouavanje biologije elija, za ispitivanje
uinka raznih alergena, antibiotika i topikih
terapeutskih agenasa
Takoer se koriste u naunim istraivanjima
procesa diferencijacije i proliferacije, te
ekspresiji antigena kod tumora koe,
imunolokom odgovoru koe i sl.
Materijali potrebni za
uspostavljanje kulture
fibroblasta
Uzorak ljudske koe
DMEM hranljiva podloga (Dulbeccos modified
Eagles medium) sa visokom koncentracijom
glukoze (4500 mg/L) i Ca+2 (1.2 mM)
L-glutamin 200 mM
PBS (phosphate buffered saline) bez Mg+2 i Ca+2,
pH 7,3
0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina
Otopina antibiotika i antimikotika (ABAM antibiotic
antimycotic) (penicilin, streptomicin i amfotericin B
otopljeni u 1 ml PBS-a)
fibroblasta
5% ABAM / PBS otopina
Serum goveeg fetusa (fetal bovine serum
/FBS/) inaktiviran zagrijavanjem u vodenom
kupatilu pri 56oC u trajanju od pola sata.
Dispaza, matina otopina 3.4 U/ml
HAM F-12 hranljiva podloga
Adenin 2,43 mg/ml
Hidrokortizon 0,2 mg/ml
Trijodtironin 1,36 g/ml
Inzulin 5 mg/ml
fibroblasta
Kolera toksin 0,1 M
EGF epidermalni faktor rasta (10 g/ml)
ddH2O (pH 2,0)
FM hranljiva podloga:
250 ml hranljive podloge DMEM
25 ml FBS
2,5 ml L glutamin
2,5 ml ABAM
Nakon dodavanja svih reagenasa sterilizirati hranljivu
podlogu kroz filtar veliine pora 0,22 m.
fibroblasta
GM hranljiva podloga (pH 7,4)
75 ml HAM F-12 podloge
25 ml FBS
5 ml L glutamin
2,5 ml ABAM
2,5 ml adenin
0,5 ml hidrokortizon
0,250 ml trijodtironin
0,250 ml inzulin
0,250 ml kolera toksin
0,250 ml EGF
Nakon dodavanja svih reagenasa, podesiti pH sa ddH2O, pH 2,
(podloga postaje tamno crvena), te sterilno filtrirati.
fibroblasta
Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera 10
cm
Epruvete za centrifugiranje od 15 ml i 50 ml.
Nekoliko otrih makazica ili skalpela
Nekoliko pinceta sa tupim i zakrivljenim

vrhom
Staklene ae od 50 ml.
Aparati potrebni za
fibroblasta
Inkubator za uzgoj kultura elija pri 37oC s 5%
CO2
Laminar
Magnetna mjealica
Centrifuga
Spremnik sa tekuim nitrogenom
Fazno kontrastni mikroskop
Vodeno kupatilo
Analitika vaga preciznosti do 0,0001 g

Postupak uspostavljanja kulture
fibroblasta
1. Uzorak cjelovite ljudske koe preuzet
nakon operacije i transportiran u GM
hranljivoj podlozi pri 4 oC najbolje je odmah
obraditi.
fibroblasta
Ovisno o veliini uzoraka koe, pripremiti 5
staklenih aica od 50 ml sa 10 ml otopine
5% ABAM/PBS bez Mg+2 i Ca+2. Uzorak
koe prebaciti u aicu, priekati 10 minuta,
zatim prebaciti u drugu itd (sveukupno 40
tak minuta ispiranja. Izmeu svakog
ispiranja odstraniti masno tkivo (ako ga ima)
koristei makazice i pincetu.
fibroblasta
2. Isprani uzorak pincetom prebaciti u
petrijevku s predhodno pripremljenom
matinom otopinom dispaze. Paziti da
uzorak koe u posudi bude okrenut tako da
je epidermis dolje, a dermis gore.
fibroblasta
Petrijevku s uzorkom koe u dispazi paljivo
obloiti aluminijskom folijom koja je kratko
drana nad plamenikom te uzorak prebaciti
u hladnjak pri 4 oC preko noi.
fibroblasta
3. Sutradan, premjestiti petrijevku s
uzorkom koe u laminar. U petrijevki
paljivo odvojiti epidermis od dermisa
koristei pincete (prekonono djelovanje
dispaze omoguiti e lako odvajanje slojeva
koe).
fibroblasta
4. Pripremiti novu petrijevku s 4 ml PBS-a.
U nju treba prebaciti dermis da bi se
uzorak isprao od dispaze. U posudi
nasjeckati dermis na to manje komadie
(2-3 mm veliine) koristei otre makazice
ili skalpel i pincetu. Komadie ravnomjerno
rasporediti na dno nove, suhe petrijevke.
fibroblasta
5. Petrijevku sa nasjeckanim tkivom (bez

hranljive podloge) staviti 30 minuta u
inkubator pri 37oC.
6. Nakon 30 minuta petrijevku sa tkivom
prebaciti u laminar te vrlo paljivo dodavati 5
ml FM hranljive podloge. Petrijevku vratiti u
inkubator i ostaviti preko noi.
fibroblasta
7. Sutradan, u petrijevku sa komadiima
dermisa dodati jo 5 ml svjee FM hranljive
podloge. Hranljivu podlogu mjenjati svaka 2
dana. Nakon 7 dana, pod mikroskopom bi
se trebao bi se trebao zamjetiti vidljiv izrast
fibroblasta.
fibroblasta
8. Kada fibroblasti narastu dovoljno gusto,

obino nakon 2 3 sedmice, tripsinizirati
elije.
fibroblasta
9. Nakon odvajanja elija od hranljive
podloge, djelovanje tripsina zaustaviti
dodatkom jednake koliine FM hranljive
podloge. Suspenziju elija centrifugirati pri
800 x g, 4 minute. Ukloniti supernatant, a
talog elija resuspendirati u FM hranljivoj
podlozi. elije rasaditi u gustoi od 2,5 x 105
elija po 10 ml hranljive podloge (pasaa broj
1).
Hranljivu podlogu mjenjati svaka 2 3 dana,
elije dalje odravati u kulturi, a suviak
svake pasae smrznuti kada popunjenost
povrine posude elijama dostigne 60 70
%.
keratinocita
Uzorak ljudske koe
3T3 miji fibroblasti pripremljeni kao elije
hranilice.
L-glutamin 200 mM
PBS (phosphate buffered saline) bez Mg+2 i

Ca+2, pH 7,3
0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina
Otopina antibiotika i antimikotika (ABAM

antibiotic antimycotic) (penicilin,
streptomicin i amfotericin B otopljeni u 1 ml
PBS-a)
keratinocita
5% ABAM / PBS otopina
Serum goveeg fetusa (fetal bovine serum /FBS/)
inaktiviran zagrijavanjem u vodenom kupatilu pri
56oC u trajanju od pola sata.
SFM bazalna definisana hranljiva podloga za
keranocite bez seruma
SFM dodatak za rast keranocita:
- 0,2% ekstrakt hipofize teleta
- 0,2 ng/ml epidermalni faktor rasta
- 0,18 g/ml hidrokortizon
- 5 g/ml inzulin
- 5 g/ml transferin
0,1% FAF-BSA/PBS otopina
Dispaza, matina otopina 0,77 U/ml
keratinocita
HAM F-12 hranjljiva podloga
Adenin 2,43 mg/ml
Hidrokortizon 0,2 mg/ml
Trijodtironin 1,36 g/ml
Inzulin 5 mg/ml
otopina 10 g/ml epidermalnog faktora

rasta u 0,1% FAF-BSA/PBS otopini
1M NaOH
keratinocita
Kolera toksin 0,1 M
Tripansko plavo za bojenje elija
ddH2O (pH 2,0)
SFM kompletna hranljiva podloga

- 500 ml SFM bazalne definirane hranljive
podloge
- 1 ml SFM dodatka za rast keranocita
- 5 ml ABAM otopine
keratinocita
GM hranljiva podloga (pH 7,4)
75 ml HAM F-12 podloge
25 ml FBS
5 ml L glutamin
2,5 ml ABAM
2,5 ml adenin
0,5 ml hidrokortizon
0,250 ml trijodtironin
0,250 ml inzulin
0,250 ml kolera toksin
0,250 ml EGF
Nakon dodavanja svih reagenasa, podesiti pH sa ddH2O, pH 2,
(podloga postaje tamno crvena), te sterilno filtrirati.
keratinocita
Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera 10
cm
Epruvete za centrifugiranje od 15 i 50 ml
Staklene ae od 50 ml
Nekoliko otrih makazica ili skalpela
Nekoliko pinceta sa zakrivljenim i tupim vrhom
Sito za elije
pricaljka
Aparati potrebni za
keratinocita
Inkubator za uzgoj kultura elija pri 37oC s 5% CO2
Laminar
Magnetna mjealica
Centrifuga
Spremnik sa tekuim nitrogenom
Fazno kontrastni mikroskop
Vodeno kupatilo
Analitika vaga preciznosti do 0,0001 g
Friider +4oC
Hemocitometar
keratinocita
1. Uzorak cjelovite ljudske koe preuzet
nakon operacije i transportiran u GM
hranljivoj podlozi pri 4 oC najbolje je odmah
obraditi.
keratinocita
Ovisno o veliini uzoraka koe, pripremiti 5
staklenih aica od 50 ml sa 10 ml otopine
5% ABAM/PBS bez Mg+2 i Ca+2. Uzorak
koe prebaciti u aicu, priekati 10 minuta,
zatim prebaciti u drugu itd (sveukupno 40
tak minuta ispiranja. Izmeu svakog
ispiranja odstraniti masno tkivo (ako ga ima)
koristei makazice i pincetu.
keratinocita
2. Isprani uzorak pincetom prebaciti u
petrijevku s predhodno pripremljenom
matinom otopinom dispaze. Paziti da
uzorak koe u posudi bude okrenut tako da
je epidermis dolje, a dermis gore.
keratinocita
Petrijevku s uzorkom koe u dispazi paljivo
obloiti aluminijskom folijom koja je kratko
drana nad plamenikom te uzorak prebaciti
u hladnjak pri 4 oC preko noi.
keratinocita
3. Sutradan, premjestiti petrijevku s
uzorkom koe u laminar. U petrijevki
paljivo odvojiti epidermis od dermisa
koristei pincete (prekonono djelovanje
dispaze omoguiti e lako odvajanje slojeva
koe).
keratinocita
4. U staklenu au od 50 ml dodati
15 ml 0,25% tripsin / 1mM EDTA.
Ubaciti magnet. Koristei makaze i
pincetu u staklenoj ai s tripsinom
nasjeckati epidermis na to je
mogue manje komadie (3 4 mm).
au pokriti aluminijskom folijom
zagrijanom nad plamenikom
5. Prebaciti au sa uzorkom na
magnetnu mjealicu u predhodno
zagrijan termostat pri 37 oC i ostaviti
40 minuta uz sporo okretanje.
keratinocita
6. Nakon 40 minuta
prebaciti au u laminar
i zaustaviti djelovanje
tripsina dodavanjem 15
ml GM hranljive
podloge.
7. Sakupiti suspenziju
elija u 50 ml epruvetu
za centrifugiranje i
centrifugirati pri 800 x g,
4 minute.
keratinocita
8. Ukloniti paljivo supernatant
(masnoe), koristei pipetu, od
taloga (elije), kako se ne bi
povukle i elije koje su istaloene
na dnu epruvete.
9. Talog elija resuspendirati u 8
ml GM hranljive podloge i
promjeati pipetiranjem.
10. Propustiti itav uzorak kroz sito
za elije kako bi se dobila
jednolina suspenzija elija.
Suspenziju elija sakupiti u
epruvetu te ponovo centrifugirati
pri 800 x g, 4 minute.
keratinocita
11. Ukloniti supernatant i talog
resuspendirati u 2 ml GM hranljive podloge.
Izbrojiti elije koristei tripansko plavo i
hemocitometar
keratinocita
12. Ovisno o koliini dobivenih keratinocita,
elije rasporediti na pripremljene elije
hranilice tako da se u svaku petrijevku u 10
ml GM hranljive podloge, doda otprilike 5 x
106 izdvojenih keratinocita. Petrijevke lagano
protresti nekoliko puta kako bi se elije
ravnomjerno rasporedile i prihvatile za dno
posude. Petrijevke sa nasaenjim
keranocitima ostaviti u inkubatoru s 5 % CO2
pri 37 oC tijekom 48 sati. U meuvremenu ne
dirati elije.
keratinocita
13. Prvi poeci proliferacije keratinocita
trebali bi se primjetiti trei dan nakon
nasaivanja elija. Zamjeniti GM hranljivu
podlogu sa KGM kompletnom hranjljivom
podlogom. Uzgajati elije u KGM hranljivoj
podlozi uz mjenjanje podloge svaka dva
dana.
keratinocita
14. Kada primarna kultura keratinocita postigne
popunjenost od 60 %, obino nakon 7 10 dana,
elije je potrebno tripsinizirati koritenjem 5 ml
otopine 0,25 % tripsin / 1mM EDTA (pasaa broj 1).
15. Kada se elije odvoje od podloge, djelovanje
tripsina treba zaustaviti jednakom koliinom GM
hranljive podloge, a zatim suspenziju elija
centrifugirati pri 800 x g, 4 minute. Ukloniti
supernatant, a talog resuspendirati u KGM hranljivoj
podlozi i zasaditi u petrijevke promjera 10 cm.
Mjenjati hranljivu podlogu svaka 2 dana, , a suviak
svake pasae smrznuti kada popunjenost povrine
posude elijama dostigne 60 70 %.
Materijali potrebni za pripremu
elija hranilica
elije hranilice (feeder layer) se pripremaju
prema metodi Rheinwald i Green, 1975. To su
miji fibroblasti (poznatiji pod nazivom 3T3
elije), ozraeni smrtonosnom dozom gama
zraka. Ovde emo koristiti mitomicin C
umjesto gama zraka.
Materijali potrebni za pripremu
elija hranilica
1. 3T3 elije
2. PBS pufer bez Mg+2 i Ca+2 (pH 7,3)
3. 0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina
4. Mitomicin C 1,5 mM
5. FM hranljiva podloga
6. GM hranljiva podloga
7. Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera

10 cm
8. Epruvete za centrifugiranje od 15 i 50 ml
Priprema elija hranilica
1. 3T3 elije zasaditi u petrijevku sa FM

hranljivom podlogom i uzgajati u inkubtoru.
Hranljivu podlogu mjenjati svaka 3 dana
2. Kada elije popune oko 60% povrine posude,

ukloniti FM hranljivu podlogu sa elija i dodati 9,8 ml
svjee FM hranljive podloge. Dodati 200 l mitomicina
C i sadraj petrijevke promjeati naginjanjem pa
ostaviti u inkubatoru 1 sat.
3. Ukloniti hranljivu podlogu sa mitomicinom, isprati

3T3 elije sa 10 ml PBS a tri puta i tripsinizirati ih.
Suspenziju elija centrifugirati pri 800 xg, 4 miuta.
Ukloniti supernatant, a talog resuspendirati u FM
hranljivoj podlozi i izbrojati elije.
4. 3T3 elije nasaditi u petrijevke (1 x 106 elija u

petrijevku promjera 10 cm) u FM hranljivoj podlozi te
ih do upotrebe za uspostavljanje primarne kulture
keratinocita drati u inkubatoru.
Odreivanje elijske vijabilnosti
i proliferacije
Brojenje elija na brojau elija
i bojenje nigrozinom
Mjerenje elijske vijabilnosti i proliferacije
neophodno je u radu sa kulturama elioja
bez obzira da li se mjeri broj dioba elija
nakon djelovanja odreenog stimulansa ili
se mjeri uinak citotoksine tvari na
preivljenje elija.
Pri mjerenju citotoksinog uinka neke
tvari neophodno je imati na umu na emu
se odreena metoda temelji, odnosno
koje elijske funkcije mjeri.
Poeljno je koristiti najmanje dvije razliite
metode.
i bojenje nigrozinom
Ovaj postupak koristi se za mjerenje
proliferacije elija, kao i za ispitivanje
toksinog uticaja nekog spoja
odreivanjem broja elija i vitalnim
bojenjem elija pomou nigrozina
(anilinska boja).
Nigrozin ulazi samo u mrtve elije ije su
membarne izgubile svoju cjelovitost i boji
ih tamno plavo.
i bojenje nigrozinom - materijali
PBS pufer pH 7,5
Otopina tripsina
Tekua hranljiva podloga za uzgoj elija
Otopina nigrozina
i bojenje nigrozinom - oprema
Inkubator
Laminar
Svjetlosni mikroskop
Hemocitometar ili automatski broja elija

i bojenje nigrozinom - postupak
1. elije zasaditi 24 sata prije obrade u
ploicu za uzgoj elija sa 24 well-a.
2. Za krivulju rasta elije brojiti svaka 24
sata, a za test toksinosti 24 sata nakon
zasaivanja izloiti elije djelovanju
razliitih koncentracija istaivanog agensa
(etiri paralelne reakcije za svaku
koncentraciju)
3. Nakon inkubacije eljenog trajanja ili
proliferacije tripsinizirati elije koje se
nalaze u well ovima.
4. elije dobro resuspendirati u tripsinu te
cijeli sadraj well a prebaciti u epruvetu i
izbrojiti bar 2 puta.
5. Iz well-ova ostavljenih za odreivanje
vijabilnosti elija izvaditi tekuu hranljivu
podlogu, dodati 300 mikrolitara otopine
nigrozina i ostaviti 10 min na 37oC da se
elije oboje.
6. Prije brojenja obojenih elija izvaditi
otopinu nigrozina tako da ostane mala
koliina tekuine i brojiti mrtve (plave) i
ive elije. Izbrojiti ukupno najmanje 300
elija.
Obrada podataka za test citotoksinosti:
Izraunati srednju vrijednost broja ivih
elija u well-ovima obraenih istom
koncentracijom istraivanog agensa. Broj
ivih elija = ukupan broj elija u well-u
izbrojen brojaem * postotak ivih elija u
well-u obojenih nigrozinom.
Na osnovu dobivenih podataka odrediti
postotak preivljenja elija za svaku
koritenu koncentraciju agensa u odnosu
na neobraenu kontrolu.
% preivljavanja za odreenu
koncentraciju agensa = srednja vrijednost
broja ivih elija iz well-a obraenog tom
koncentracijom / srednja vrijednost broja
ivih elija iz neobraenih well ova *
100.
Bojenje elija bojom tripan plavo
spektrofotometrijsko bojenje
Ovo je pouzdana kolorimetrijska metoda

kojom se mjeri vijabilnost i proliferacija
elija.
Temelji se na injenici da mrtve elije
akumuliraju boju tripan plavo, dok ive
elije aktivno izbacuju boju putem
membranskih pumpi pa ostaju neobojene.
Klasina metodapoboljana je
spektrofotometrijskim mjerenjem
inteziteta bojenja tripanskim plavilom.
spektrofotometrijsko bojenje -
materijal
PBS pufer
0,25% otopina tripan plave boje
0,1% Triton X-100
Ploice za uzgoj kulture elija sa 96 well-

ova
spektrofotometrijsko bojenje
oprema
Inkubator
Laminar
ita mikrotitarskih ploica

(spektrofotometar)
Bojenje elija bojom tripan
plavo spektrofotometrijsko
bojenje - procedura
1. Na elije, predhodno nasaene u plaice
sa 96 well-ova, dodati 50 mikrolitara otopine
tripansko plavo i inkubirati pri 37oC.
2. Nakon 15 minuta, boju iznad elija ukloniti
naglim preokretanjem ploice iznad posude
za skupljanje otpada, ili usisavanjem
pomou vakuum pumpe, pa ploicu ocjediti
pritiskajui je na upijajui papir. Paljivo
isprati elije ledeno hladnim PBS-om.
Bojenje elija bojom tripan
plavo spektrofotometrijsko
bojenje - procedura
3. elije lizirati sa 200 mikrolitara 0,1% otopine
Triton x-100 po well-u te njeno vie outa promjeati
viekanalnom pipetom. Paziti da ne neastanu
mjehurii.
Oitati apsorbancu tripanskog plavila pomou
spektrofotometra pri talasnoj duini od 590 nm.
Od dobivenih vrijednosti mjerenja oduzeti vrijednost
nespecifinog signala (apsorbancija well-a
napunjenog samo tripanskim plavilom). Dobiveni
podaci mogu se izraziti kao postotak od
neobraenih, kontrolnih elija kojima se pripisuje
vijabilnost 100% ili od elija obraenih visokom
koncentracijom nekog agensa kojima se pripisuje
vijabilnost 0%.
Bojenje elija bojom kristal
ljubiasto
Ovaj kolorimetrijski test temelji se na vezanju
boje kristal ljubiasto na genomsku DNK i
proteine elija, odraavajui tako gustou
elija u uzorku.
ljubiasto - materijal
PBS pufer pH 7,5

Tekua hranljiva podloga za rast elija
Kristal ljubiasto 0,2%
1% SDS (sodium dodecil sulfat)
Ploice sa 96 well-ova
ljubiasto - postupak
1. elije zasaditi u tekuoj hranljivoj podlozi
na ploice sa 96 well-ova. Jedan well ostaviti
prazan za slijepu probu.
2. Nakon odgovarajueg inkubacijskog
perioda, ukloniti tekuu podlogu.
3. Isprati elije PBS-om
4. Ukloniti PBS i dodati 50 mikrolitara otopine

kristal ljubiastog
5. Inkubirati 10 minuta pri sobnoj temperaturi
6. Isprati 3 puta sa po 200 mikrolitara ddH2O i

osuiti na zraku.
ljubiasto - postupak
7. Dodati 100 mikrolitara 1% otopine SDS-a i
inkubirati ploicu dok se boja u potpunosti ne
otopi.
8. Oitati apsorbancu na 595 nm
spektrofotometrom. Od dobivene apsorbance
pojedinog well-a sa elijama oduzeti
apsorbancu slijepe probe kako bi se dobila
konana vrijenost koja je proporcionalna
broju elija u tom well-u. Izraunati relativni
broj elija u odnosu na kontrolu.
MTT test
Ova kolorimetrijska metoda temelji se na
mjerenju metabolike aktivnosti elija
U ivim elijama dolazi do redukcije
tetrazolijeve soli (MTT) u plavo obojene
kristale formazana pomou elijskih
dehidrogenaza.
Postoje dvije metode ovog testa:
A - prva metoda pogodna je za elije koje se

prihvataju za podlogu (adherentne elije)
B druga metoda pogodna je za elije koje
se ne prihvataju za podlogu nego ive u
suspenziji (neadherentne elije).
MTT test za adherentne elije -
materijal
PBS pufer pH 7,5
Matina otopina MTT (12.1 mM, 3-(4,5-

dimetiltiazol 2-il)-2,5-difeniltetrazolijev
bromid)
DMSO dimetilsulfoksid
Ploice za uzgoj elija sa 96 well-ova

postupak
1. elije zasaditi u tekuoj hranljivoj podlozi
na ploice sa 96 well-ova. Jedan well ostaviti
prazan za slijepu probu.
2. Nakon odgovarajueg inkubacijskog
perioda, ukloniti tekuu podlogu.
3. Razrijediti matinu otopinu MTT-a 10 puta
u tekuoj hranljivoj podlozi zagrijanoj pri
37oC i dodati 40 mikrolitara radne otopine u
svaki well.
4. Inkubirati elije 3 sata pri 37oC
postupak
5. U digestoru dodati 170 mikrolitara DMSO
u svaki well kako bi se otopio formazan.
6. Inkubirati ploicu na sobnoj temperaturi 5
min
7. Oitati apsorbancu na 570 nm
spektrofotometrom. Od dobivene
apsorbance pojedinog well-a sa elijama
oduzeti apsorbancu slijepe probe kako bi se
dobila konana vrijenost koja je
proporcionalna broju metaboliki aktivnih
elija u tom well-u. Izraunati relativni broj
elija u odnosu na kontrolu.
MTT test za elije u suspenziji -
materijal
PBS pufer pH 7,5
Matina otopina MTT (12.1 mM, 3-(4,5-

dimetiltiazol 2-il)-2,5-difeniltetrazolijev
bromid)
Otopina 2- propanola
Ploice za uzgoj elija sa 96 well-ova

procedura
1. elije koje rastu u suspenziji treba
istaloiti centrifugiranjem (1000xg, 5 min) i
resuspendirati u hranljivoj podlozi pa
napraviti razblaenja u ploicama za uzgoj
kuture elija sa 96 well-ova u volumenu od
100 mikrolitara po well-u.
2. Odmah ili nakon odgovarajueg
inkubacijskog vremena dodati elijama po 20
mikrolitara MTT otopine po well-u i vratiti
ploice u inkubator pri 37oC, 50-70 minuta
3. Dodati po 150 mikrolitara otopine 2-
propanola po well-u kako bi se otopio
formazan. Ploice ostaviti na +4oC, 1-2 sata.
procedura
4. Promjeati mikropipetom sadraj u well-u

pa izmjeriti apsorbancu pri 595 nm i od tih
vrijednosti oduzeti vrijednosti nespecifiog
signala izmjerenog pri 690 nm. Od tih
vrijednosti oduzeti vrijednosti slijepe probe i
tako dobiti konanu vrijednost koja je
proporcionalna broju metaboliki aktivnih
elija u tom well-u.
Metoda praenja vijabilnosti
elija mjerenjem aktivnosti
laktat dehidrogenaze
Laktat dehidrogenaza (LDH) je enzim koji

se nalazi u elijskoj citoplazmi, a koji
prilikom oteenja elijske membrane izlazi
iz elije.
Mjerenjem LDH u tekuoj hranljivoj podlozi
u kojoj elije rastu kvantitativno se odreuje
gubitak vijabilnosti elija.
laktat dehidrogenaze - materijal
100 mM Tris HCl, pH 7,1
Nikotinamid dinukleotid (NADH) 5 mM
otopina
NADH 0,6 mM otopina
Piruvat 100 mM otopina
Piruvat 3 mM otopina
Ploice za uzgoj kulture elija sa 96 well-

ova
Tekua hranljiva podloga za uzgoj kulture
elija
Mikrotitarske ploice sa 96 well-ova
laktat dehidrogenaze - postupak
1. Skupiti hranljivu podlogu u kojoj rastu
elije i centrifugirati je 5 min pri 1000 x g i
4oC, odvojiti supernatant i drati ga na ledu
do mjerenja.
2. Prije zapoinjanja enzimske reakcije,
otopine ugrijati pri sobnoj temperaturi.
Pripremu uzoraka raditi u zamraenom
prostoru blizu itaa mikrotitarskih ploica.
U ploice staviti 50 mikrolitara piruvata i 50
mikrolitara NADH i promjeati.
3. Na to brzo dodati 50 mikrolitara
supernatanta elija i izmjeriti apsorbancu u
spektrofotometru pri talasnoj duini od 340
nm. Reakciju mjeriti svake minute
4. Mjeriti reakciju 5-10 minuta, odnosno dok
traje linearna promjena apsorbancije.
5. Izraunati aktivnost LDH enzima koristei
se:
Aktivnost = (Areakcije/t Anespec./t) *
VT/6.22*d*Vs
Neradioaktivna metoda praenja
proliferacije elija pomou
bromodeoksiuridina
Bromodeoksiuridin (BrdU) se umjesto timina
ugrauje u DNK, a njegovo prisustvo se
moe odrediti pomou specifinog antitijela.
Ova metoda slui kao neradioaktivna
zamjena metodi praenja sinteze DNK
pomou radioaktivnog timina.
Koristi se za kvantitativno mjerenje
proliferacije kulture elija
BrdU
bromodeoksiuridina - materijal
Hranljiva podloga
Serum goveeg fetusa - FBS
PBS pufer pH 7,4
Fiksativ
100 mikromolarni BrdU
Anti BrdU antitijelo obiljeeno

peroksidazom
10 mg/ml tetrametilbenzidin (TMB)
Stop otopina 1M H2SO4
Ploice za uzgoj kulture elija sa 96 well-ova

bromodeoksiuridina - procedura
1. elije razrijediti u hranljivoj podlozi i
nasaditi u ploice za uzgoj kulture elija sa
96 well-ova
2. U well-ove sa elijama dodati spoj iji
uinak elimo ispitati i FBS do konanog
volumena od 200 mikrolitara
3. Ploicu sa elijama inkubirati 24 sata pri
37oC i 5% CO2
4. elijama dodati 20 mikrolitara BrdU i
inkubirati 24 sata
1. elije razrijediti u hranljivoj podlozi i
nasaditi u ploice za uzgoj kulture elija sa
96 well-ova
2. U well-ove sa elijama dodati spoj iji
uinak elimo ispitati i FBS do konanog
volumena od 200 mikrolitara
3. Ploicu sa elijama inkubirati 24 sata pri
37oC i 5% CO2
4. elijama dodati 20 mikrolitara BrdU i
inkubirati 24 sata
5. Po isteku inkubacije elijama ukloniti
hranljivu podlogu. Ukoliko se radi o elijama
koje se prihvaaju za podlogu, podlogu odliti
brzim zamahom ruke u posudu za otpad ili
ukloniti vakuum pumpom, a ukoliko elije
rastu u suspenziji, ploicu centrifugirati 10
min pri 300 xg, a zatim hranljivu podlogu
ukloniti na isti nain.
6. Na elije dodati 200 mikrolitara fiksativa i
inkubirati 30 minuta pri sobnoj temperaturi.
7. Po isteku inkubacije elijama ukloniti
fiksativ i isprati tri puta sa po 300 mikrolitara
PBS-a kao to je opisano u taki 5.
8. U uzorke dodati 100 mikrolitara anti
BrdU antitijela koje prepoznaje BrdU
ugraen u novostvorenu genomsku DNK i
inkubirati 90 minuta pri sobnoj temperaturi.
9. Ukloniti antitijelo kao u taki 5.
10. elije isprati tri puta s po 300 mikrolitara

PBS-a, kao u taki 7.
11. Uzorcima dodati 100 mikrolitara boje
(TMB) i inkubirati 5-30 minuta
12. Kada se razvije plava boja zaustaviti
reakciju dodatkom 25 mikrolitara stop
otopine, pri emi se boja mjenja u utu.
Protresti ploicu da se boja izjednai i
priekati 5 minuta
13. Apsorbanciju mjeriti pri 450 nm.
Vrijednosti apsorbancije su u direktnoj
ovisnosti o sintezi DNK, a time i broju
proliferirajuih elija u kulturi jer se BrdU
ugrauje samo u elije u kojima se dogaa
DNK sinteza.

Kultura Stanica 6

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Kultura Stanica 6

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Vjebe iz predmeta

kolska godina 2010/2011

U ranom periodu tehnike kulture elija

Za uspjean rast humanih elijskih kultura

Kontaminacija primarnih elijskih kultura

Generalno se smatra da vie temperature

Optimalan pH medija u kojem se kultiviraju

Primjer: Sastav medija za kultivaciju epitelnih

200 ml RPMI 1640 (bazalni medij)

U zavisnosti od tipa elija koji se kultivira,

Kada se iz nekog organizma biopsijom ili

elijska kultura se moe smatrati primarnom

Uzimanje uzorka Digestija tkiva sa proteolotikim Kultiviranje elija

Ostatak elija u suspenziji moe se

Dva su osnovna sistema elijskih kultura.

u ovim sistemima kultiviraju se elije koje

2. Limfoblast sline elije (L-tip): u kulturi

Amniociti (AF-tip) predstavljaju zaseban tip

elijske linije nastaju od primarnih elijskih

Kultura elija se primjenjuje u nekoliko oblasti:

Kulture elija kao fabrike

Dobivanje kariograma iz kultiviranih

Mogunost transfera genetikog materijala na

elije uzete iz organizma pacijenta kojem

Bez obzira na irok izbor testova mutagenosti,

Iako postoje individualne varijacije u

U izmjeani sadraj se lagano dodaje 6 ml

Amniociti su elije amnionske tenosti fetalnog

9. Dnevno prazniti posudu za teni otpad u

80 oC (ne due od nekoliko mjeseci).

Zbog jednostavnog uzgoja i brzog rasta,

Primarne kulture keratinocita koriste se u

HAM F-12 hranljiva podloga

Adenin 2,43 mg/ml

Hidrokortizon 0,2 mg/ml

Trijodtironin 1,36 g/ml

ddH2O (pH 2,0)

Nekoliko otrih makazica ili skalpela

Nekoliko pinceta sa tupim i zakrivljenim

Spremnik sa tekuim nitrogenom

Fazno kontrastni mikroskop

Analitika vaga preciznosti do 0,0001 g

5. Petrijevku sa nasjeckanim tkivom (bez

8. Kada fibroblasti narastu dovoljno gusto,

PBS (phosphate buffered saline) bez Mg+2 i

Otopina antibiotika i antimikotika (ABAM

Hidrokortizon 0,2 mg/ml

Trijodtironin 1,36 g/ml

otopina 10 g/ml epidermalnog faktora

ddH2O (pH 2,0)

SFM kompletna hranljiva podloga

Nekoliko otrih makazica ili skalpela

Nekoliko pinceta sa zakrivljenim i tupim vrhom

3. 0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina

7. Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera

1. 3T3 elije zasaditi u petrijevku sa FM

2. Kada elije popune oko 60% povrine posude,

3. Ukloniti hranljivu podlogu sa mitomicinom, isprati

4. 3T3 elije nasaditi u petrijevke (1 x 106 elija u

Tekua hranljiva podloga za uzgoj elija

Hemocitometar ili automatski broja elija

Ovo je pouzdana kolorimetrijska metoda

0,1% Triton X-100