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Secretaria do Meio Ambiente do Estado de So Paulo

Instituto de Botnica - Ncleo de Pesquisa em Ficologia

FERNANDA RIOS JACINAVICIUS, WATSON ARANT ES GAMA

JNIOR, MARIA TERESA DE PAIVA AZEVEDO & CLIA LEITE
SANTANNA

MANUAL PARA CULTIVO DE

CIANOBACTRIAS
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CONTEDO

INTRODUO 1

COLEO DE CULTURA DO INSTITUTO DE BOTNICA (CCIBT) 2

INFRAESTRUTURA E EQUIPAMENTOS 3

PLANEJAMENTO DO LABORATRIO 3

EQUIPAMENTOS 4

PARA ESTERILIZAO 4
PARA PREPARO E CONSERVAO DOS MEIOS DE CULTIVO 5
PARA TRANSFERNCIA E INOCULAO DAS CIANOBACTRIAS 5
PARA CULTIVO E MANUTENO DAS CEPAS 5

MTODOS PARA LAVAGEM E ESTERILIZAO 6

LAVAGEM DE VIDRARIA 6
ESTERILIZAO DE VIDRARIA 7
ESTERILIZAO DOS UTENSLIOS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NO ISOLAMENTO 7

MEIOS DE CULTURA 8

PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA 8

PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE CULTURA BG-11 9
PROCEDIMENTO BG-11 CONCENTRADO 10
PROCEDIMENTO BG-11 PARA USO IMEDIATO 10
PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE CULTURA ASM-1 11
PROCEDIMENTO ASM-1 CONCENTRADO 12
PROCEDIMENTO ASM-1 PARA USO IMEDIATO 12
PROCEDIMENTO MEIO SLIDO 13
PROCEDIMENTO MEIO LQUIDO E SLIDO COM CICLOHEXIMIDA 13

DISTRIBUIO DOS MEIOS DE CULTURA 14

DESCARTE DO MATERIAL CULTIVADO 15

CULTIVO E ISOLAMENTO 15

PROCEDIMENTO PARA O ISOLAMENTO DAS CEPAS 15

PLAQUEAMENTO 16
PESCARIA 17
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MANUTENO DAS CEPAS 18

PROTOCOLO PARA LAVAGEM DE CLULAS DE CIANOBACTRIAS COM EXTRAN 0,1% 19

TIPOS DE CULTURA 21

PRODUO DE BIOMASSA 21

ESQUEMA PARA OBTENO DE UMA CULTURA UNIESPECFICA 23

DETERMINAO DAS CURVAS DE CRESCIMENTO 24

DENSIDADE (CLULAS. ML-1) 24

BIOMASSA (BIOVOLUME MM L-1) 25

DETERMINAO DAS TAXAS DE CRESCIMENTO, TEMPO DE DUPLICAO E RENDIMENTO

CELULAR MXIMO 26

HIGIENIZAO E BIOSSEGURANA 26

REFERNCIAS 27
 1

FIGURA 1: ESQUEMA DA TCNICA DE PLAQUEAMENTO............................................................................................ 17

FIGURA 2: ESQUEMA DA TCNICA DE PESCARIA ..................................................................................................... 18

FIGURA 3: ESQUEMA DO PROCESSO DE REPICAGEM ................................................................................................ 19

FIGURA 4: LINHAGEM ANTES E DEPOIS DA LAVAGEM COM EXTRAN 0,1% .................................................................. 20

FIGURA 5: CULTURA BATCH .............................................................................................................................. 21

FIGURA 6: OBTENO DE BIOMASSA ................................................................................................................... 23

FIGURA 7: RESUMO DO ORGANOGRAMA.............................................................................................................. 23

FIGURA 8: CMARA DE FUCHS-ROSENTHAL UTILIZADA PARA CONTAGEM DE CLULAS OU FILAMENTOS E EM DESTAQUE UM DOS

CAMPOS DA CMARA. .............................................................................................................................. 25

-1
TABELA 9: FATORES DE CONVERSO PARA DETERMINAO DO N DE CLULAS. ML .................................................... 25

T ABELA 1. C OMPOSIO E QUANTIDADE DAS SOLUES ESTOQUES .................................................................. 9

TABELA 2. COMPOSIO DOS METAIS TRAOS ( * ) .................................................................................................. 9

TABELA 3. QUANTIDADES UTILIZADAS PARA O PREPARO DO MEIO PARA USO IMEDIATO ................................................. 11

TABELA 4. COMPOSIO E QUANTIDADE DAS SOLUES ESTOQUES ........................................................................... 11

TABELA 5. QUANTIDADES UTILIZADAS PARA O PREPARO DO MEIO PARA USO IMEDIATO ................................................. 12
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INTRODUO

As cianobactrias so organismos procariontes capazes de realizar fotossntese

oxignica por possurem clorofila a e fotossistema II (Reviers 2006). Atualmente, a
taxonomia destes organismos fundamenta-se na chamada abordagem polifsica, isto , a
identificao taxonmica de acordo com caractersticas de mltiplas reas de pesquisa,
tais como morfologia, ecologia, fisiologia, ultraestrutura e biologia molecular (Komrek
2005).

Alm de produtores primrios, as cianobactrias tambm tm grande

importncia para o meio ambiente e para a sade pblica, dado que algumas so capazes
de formar floraes e produzir toxinas (SantAnna et al. 2008), alm de geosmina e
MIB (2-metil isoborneol) que causam forte odor na gua (Tanaka et al. 1996).
Adicionalmente, muitas espcies tm demonstrado capacidade de produzir grande
diversidade de substncias com propriedades bioativas (Gault & Marler 2009).
Contudo, nem a taxonomia polifsica e tampouco a investigao de toxinas, compostos
causadores de odor e bioativos seriam possveis sem o cultivo das cianobactrias.

Inicialmente, as pesquisas envolvendo estudos em cultura eram voltadas

principalmente para investigaes taxonmicas e ecofisiolgicas. Contudo, com o
avano da interdisciplinaridade, estudos de biotecnologia revelaram um potencial at
ento desconhecido das cianobactrias. Mais recentemente, o conhecimento sobre
protemica e genmica ampliou muito o entendimento sobre a evoluo destes
organismos, sendo isso possvel graas ao cultivo desses procariotos.

No Brasil, o primeiro manual sobre cultivo de microalgas foi desenvolvido por

Vieira (1977), sendo uma adaptao de vrias tcnicas amplamente utilizadas em outros
pases e voltadas para o cultivo do fitoplncton marinho. Desde ento, outros trabalhos
descrevendo tcnicas para cultivos de microalgas foram desenvolvidos no Brasil (Vieira
& Tundisi 1979, Loureno 2006), todos tratando do cultivo de microalgas aquticas em
geral, tanto marinhas como de gua doce. Na literatura brasileira no h um compilado
especfico de tcnicas de cultivo voltado apenas para cianobactrias, sendo estas
informaes encontradas dispersas em dissertaes/teses e artigos cientficos.

Conforme Loureno (2006), os bancos de cultura de cianobactria existentes no

Brasil so os seguintes:
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Coleo de Cultura do Instituto de Botnica (CCIBt) Instituto de Botnica de

So Paulo (IBt)
Laboratrio de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactrias (LETC) - Instituto
de Biofsica Carlos Chagas Filho (UFRJ)
Brazilian Cyanobacteria Collection (BCCUSP) Universidade de So Paulo
(USP)
Laboratrio de Cincias Ambientais Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF)
Coleo de Culturas de Microalgas de gua Doce Universidade Federal de
So Carlos (UFSCar)
Coleo de Culturas do Laboratrio de Ecologia Molecular de Cianobactrias
(CENA) Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA)
Coleo de Cultura de Cianoprocariotos (CCC) Universidade Estadual de So
Paulo (UNESP- So Jos do Rio Preto)
Unidade de Pesquisas em Cianobactrias (UPC) Fundao Universidade
Federal do Rio Grande (FURG)

Visando disseminao das tcnicas de cultura, este manual tem como objetivo
descrever mtodos para o estabelecimento e manuteno de laboratrios para o cultivo
de cianobactrias.

COLEO DE CULTURA DO INSTITUTO DE BOTNICA (CCIBT)

A Coleo de Cultura do Instituto de Botnica (CCIBt) possui culturas de trs

grupos distintos de organismos: fungos, cianobactrias e macroalgas marinhas. As
culturas de cada grupo so coordenadas separadamente: Dra. Clia Leite SantAnna,
responsvel pelas culturas de cianobactrias, Dra. Nair Sumie Yokoya, responsvel
pelas culturas de macroalgas marinhas e Dra. Marina Capelari/Dra. Carmen L.A.P.
Zotarelli/Msc. Marcela Castilho Boro responsveis pelas culturas de fungos. O
laboratrio no qual mantido o cultivo de cianobactrias e macroalgas marinhas
denominado Marilza Cordeiro Marino em homenagem pesquisadora que iniciou a
estruturao do laboratrio e os estudos em cultura de algas marinhas no Instituto de
Botnica.
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O cultivo de cianobactrias no Instituto de Botnica iniciou-se em 1986 com as

Dras. Maria Teresa P. Azevedo e Clia L. SantAnna, sendo utilizado como ferramenta
complementar para a taxonomia (Yokoya & Azevedo 2002). As primeiras cepas
depositadas na coleo foram isoladas de diversos corpos dgua do estado de So
Paulo, sendo a maioria de espcies planctnicas. Recentemente, alm dos ambientes
aquticos, vrias cepas tm sido isoladas de ambientes terrestres, principalmente da
Mata Atlntica e Pantanal, alm de algumas cepas do cerrado.

Hoje, a CCIBt possui 479 linhagens de cianobactrias isoladas de diferentes

ecossistemas brasileiros, incluindo ambientes aquticos e terrestres. Com a consolidao
do laboratrio e ampliao das linhas de pesquisa, estas linhagens vm sendo utilizadas
em estudos ecofisiolgicos, toxicolgicos e de bioprospeco, alm de serem
ferramentas em estudos de taxonomia e biologia molecular.

INFRAESTRUTURA E EQUIPAMENTOS

PLANEJAMENTO DO LABORATRIO

Para o cultivo apropriado de cianobactrias, o ideal contar com quatro salas

distintas:

o Sala para preparo dos meios: deve contar com bancadas, pia e armrios
para armazenar, separadamente, vidrarias e reagentes. Equipamentos
como potencimetro, agitador magntico e balana analtica tambm
devem estar presentes nesta sala. Ressalta-se que a balana analtica deve
ficar numa bancada anti-vibratria separada daquelas utilizadas para
preparo dos meios e solues.
o Sala para repicagem e isolamento: esta sala deve conter apenas a
cmara de fluxo laminar, uma bancada de suporte, microscpio e ar
condicionado.
o Sala para manuteno das culturas: local onde sero mantidas as
cepas. Esta sala deve ter acesso restrito e condies controladas
(temperatura, fotoperodo e luminosidade).
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Alternativa
A sala de cultivo pode ser substituda por cmaras de cultivo.
uma opo quanto h falta de espao disponvel ou quando
preciso manter cepas em diferentes condies.

o Sala de lavagem: nesta sala ficam a pia principal para lavagem da

vidraria, a estufa para secagem de vidraria, alm de outros itens de
laboratrio. Dentre os principais equipamentos dispostos nesta sala tm-se
a autoclave e o destilador de gua, que ficam em rea prxima janela e
existe ventilador de teto para circular o ar. Ateno: importante separar
todos estes equipamentos dos demais devido elevada umidade e calor
gerados por eles, o que pode levar a oxidao de outros equipamentos e
problemas com fungos nas outras salas. A osmose reversa uma tima
alternativa ao destilador de gua convencional, sendo um equipamento que
produz gua de melhor qualidade e diminui bastante o desperdcio.

EQUIPAMENTOS

PARA ESTERILIZAO

o Autoclave esterilizao de vidraria, meios de cultura e descarte das cepas.

o Cmara de fluxo laminar, equipada com:
o Bico de Bunsen esterilizao de materiais utilizados no momento
da transferncia e inoculao das cianobactrias.
o Lmpada germicida (UV) esterilizao do fluxo laminar e da sala
de repicagem e isolamento.
o Estufas para esterilizao e secagem.
o Estojos para autoclavagem de pipetas e tubos.
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PARA PREPARO E CONSERVAO DOS MEIOS DE CULTIVO

o Vidraria
Erlenmeyer: 50 mL, 100 mL, 200 mL, 500 mL, 1L, 2L e 4L;
Proveta: 50 mL, 100 mL, 500 mL, 1L e 2L;
Pipeta graduada: 5 mL, 10 mL e 20 mL;
Balo Volumtrico: 1L e 2L;
Becker: 100 mL, 200 mL, 500 mL, 1L.
o Agitador magntico
o Potencimetro
o Balana analtica
o Frascos plsticos: 100 mL, 500 mL, 1L e 2L
o Freezers
o Refrigeradores
o Pra de suco

PARA TRANSFERNCIA E INOCULAO DAS CIANOBACTRIAS

o Alas de nquel cromo

o Agulhas de inoculao
o Pipetas Pasteur de vidro
o Ala de Drigalski
o Bulbo de borracha para pipetas Pasteur

PARA CULTIVO E MANUTENO DAS CEPAS

o Sala de cultivo e/ou cmara de cultivo

o Tubos de ensaio
o Placas de Petri
o Parafilm
o Rolhas de gaze e algodo hidrfobo ou rolha plstica
o Grades para tubos de ensaio
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o Prateleiras com lmpadas luz do dia para manuteno de cepas e crescimento de

cianobactrias.

Para obteno de biomassa:

o Erlenmeyer de 6L e 9L
o Rolhas para Erlenmeyer com sada de ar
o Compressor de ar/ Bomba de aqurio
o Mangueiras para conduo de ar
o Filtro de ar
o Agitador

MTODOS PARA LAVAGEM E ESTERILIZAO

LAVAGEM DE VIDRARIA

A lavagem da vidraria, seja ela nova ou j de uso rotineiro do laboratrio, deve

obedecer seguinte sequncia:

Imerso em soluo de cloro ativo com concentrao entre 2 e 2,5% por

12 horas para desinfeco;
Lavagem manual com sabo no residual (Extran ou similar) para
remover os resqucios mais grosseiros como material orgnico ou gar
aderido no interior na vidraria;
Enxgue em gua corrente at que todo sabo seja retirado;
Enxgue em gua destilada, no mnimo trs vezes, para remoo de
possveis sais deixados pelo sabo ou pela gua da torneira;
Secagem em estufa a temperatura aproximada de 60C;
Embalagem da vidraria com filme PVC transparente;
Estocagem das vidrarias devidamente embaladas em armrios fechados.
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ESTERILIZAO DE VIDRARIA

A vidraria previamente lavada deve ser esterilizada pouco antes do uso, a fim de
se evitar contaminao. O processo de esterilizao deve seguir os seguintes passos:

Vedao apropriada da vidraria

No caso de tubos de ensaio e Erlenmeyers a vedao pode ser
feita com rolhas de gaze e algodo ou com rolhas plsticas
autoclavveis;
As placas de Petri devem ser envoltas em papel sulfite ou pardo e
colocadas em sacos plsticos autoclavveis;
Autoclavagem por 30 minutos a 125C e presso de 1,5 atm;
Secagem em estufa a temperatura de 60C
Neste ponto importante averiguar se as rolhas de gaze e algodo
e os papis envoltos nas placas esto devidamente secos, para
evitar que futuramente sejam colonizados por fungos.

Ressalta-se que toda vidraria autoclavada s deve ser aberta no momento do uso
e dentro da cmara de fluxo laminar.

ESTERILIZAO DOS UTENSLIOS E EQUIPAMENTOS

UTILIZADOS NO ISOLAMENTO

Os utenslios no autoclavveis e equipamentos utilizados no isolamento devem

ser esterilizados com lmpada germicida (UV) dentro da cmara de fluxo laminar
durante, no mnimo, 30 minutos imediatamente antes do uso. Alm disso, os materiais
utilizados devem ser limpos com soluo de etanol 70% e aqueles resistentes ao fogo
(pinas e alas) devem ser flambados em bico de Bunsen imediatamente antes do uso
por cerca de 60 segundos.

A lmpada germicida acoplada cmara de fluxo laminar tambm funciona

como esterilizador do ar da sala de repicagem. Por este motivo, durante o uso da cmara
fundamental que o fluxo de ar entre a sala de repicagem e o ambiente externo seja o
menor possvel.
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MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura so utilizados com a finalidade de isolar e cultivar as

cianobactrias em laboratrio, geralmente em culturas uniespecficas. Um meio de
cultura pode ser classificado quanto consistncia como slido ou lquido. O meio
slido contm agentes solidificantes (gar) e utilizado para o isolamento. O meio
lquido utilizado para a manuteno das cepas e produo de biomassa para anlises
diversas. Em relao aos estudos taxonmicos, deve-se atentar para o meio utilizado no
cultivo, pois a cepa pode apresentar morfometria distinta segundo a consistncia ou/e
composio do meio.

Alguns dos meios comumente utilizados para cultivo de cianobactrias so:

Meio BG-11 lquido; slido (com ou sem cicloheximida)

Meio ASM-1 lquido; slido (com ou sem cicloheximida)

A utilizao de diferentes meios de cultura em diferentes condies motivada

pelas distintas concentraes e tipos de nutrientes, o que propiciam as condies
nutricionais adequadas especficas para alguns grupos de cianobactrias. A
cicloheximida um antibitico usado para eliminar organismos eucariontes, facilitando
o isolamento de cianobactrias.

PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios so preparados em trs etapas:

1. So preparadas as solues que compem o meio com concentrao 100:1
que so suficientes para um perodo aproximado de 12 meses e so
armazenadas em frascos plsticos e levadas para o freezer, onde
permanecem congeladas at o momento de uso (chamadas solues-estoque
- tabelas 1 e 2);
2. A partir das solues estoque preparado o meio concentrado que render
20 L de meio para uso imediato;
3. A ltima etapa, o preparo do meio para uso imediato, onde o meio
concentrado descongelado e em seguida diludo em gua deionizada
(tabela 3).
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PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE

CULTURA BG-11

(RIPPKA, R. 1979)

Tabela 1. Composio e quantidade das solues estoques

NUTRIENTES - Solues Estoque Quantidade (g)
EDTA (C10H16N2O8) 0,1000
Citrato frrico amoniacal (C6H8O7 x Fe 3+ + yNH3) 0,6000
Soluo de metais traos * ( *)
Nitrato de Sdio (NaNO3) 150,0000
Fosfato cido dipotssio trihidratado (K2HPO4 + 3H2O) 4,0000
Sulfato de magnsio heptahidratado (MgSO4 + 7H2O) 7,5000
Cloreto de clcio dihidratado (CaCl2 + 2H2O) 3,6000
Carbonato de sdio (Na2CO3) 2,0000
cido ctrico (C6H8O7+ H2O) 0,6000

Tabela 2. Composio dos metais traos (*)

Solues Estoque Quantidade (g)

H3BO3 2,8600
MnCl2 + 4H2O 1,8100
ZnSO4 + 7H2O 0,2220
NaMoO4 0,3900
CuSO4 + 5H2O 0,0790
Co(NO3)2 + 6H2O 0,0494

Estes compostos so diludos em 1.000 mL de gua deionizada e as solues

formadas so armazenadas no freezer em frascos plsticos.
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PROCEDIMENTO BG-11 CONCENTRADO

Para render 20 L de meio de cultura:

200 mL da soluo de EDTA;

200 mL da soluo de citrato frrico amoniacal;

20 mL da soluo de metais traos;

200 mL da soluo de NaNO3;

200 mL da soluo de K2HPO4 + 3H2O;

200 mL da soluo de MgSO4 + 7H2O;

200 mL da soluo de CaCl2 + 2H2O;

200 mL da soluo de Na2CO3;

200 mL da soluo de cido Ctrico.

Adicionar todas as solues acima e nesta sequncia, especialmente os dois primeiros

porque do contrrio o ferro precipita, em um Erlenmeyer com volume suficiente para a
agitao do meio (utilizar agitador magntico). Feito isto, preciso ajustar o pH da
soluo que deve ser 7,4, adicionando HCl (cido clordrico) 1M para acidificar o meio
e NaOH (hidrxido de sdio) 1M para elevar o pH. Seguidas todas as etapas, o meio de
cultura concentrado guardado no freezer at ser diludo para uso.

PROCEDIMENTO BG-11 PARA USO IMEDIATO

Descongelar o meio BG-11 concentrado e acrescentar gua deionizada

dependendo da quantidade a ser utilizada. importante lembrar que a gua deionizada
no pode ser estocada, pois perde sua validade de ser isenta de sais. Portanto deve-se
recolher a gua apenas no momento de uso. Adicionada gua e completando o volume
de meio, agita-se bem para homogeneizar.
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Tabela 3. Quantidades utilizadas para o preparo do meio para uso imediato

gua Deionizada (mL) Meio Concentrado (mL)

50 4,05
100 8,1
200 16,2
500 40,5
1.000 81
5.000 405

PREPARO DAS SOLUES - ESTOQUE PARA O MEIO DE

CULTURA ASM-1

Modificado de Gorham et al. (1964) e Zagatto & Arago (1992).

Tabela 4. Composio e quantidade das solues estoques

Solues Estoque Nutrientes Quantidade (g)

Sol. A NaNO3 8,5000
MgSO4 + 7H2O 2,4500
MgCl2 + 6H2O 2,0500
CaCl2 + 2H2O 1,4500
Sol. B KH2PO4 8,7000
Na2HPO4 + 12H2O 17,8000
Sol. C H3BO3 28,4000
MnCl2 + 4H2O 13,9000
FeCl2 + 6H2O 10,8000
ZnCl2 3,3500
CoCl2 + 6H2O 0,1900
CuCl2 + 2H2O 0,0140
Sol. D EDTA titriplex 18,6000
Para cada soluo (A, B, C e D) os compostos so diludos em 1.000 mL de gua
deionizada e armazenados no freezer em frascos plsticos.
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PROCEDIMENTO ASM-1 CONCENTRADO

Para render 20 L de meio so necessrios:

400 mL de soluo - estoque A;

40 mL de soluo - estoque B;

2 mL de soluo - estoque C;

8 mL de soluo - estoque D;

Adicionar todas as solues acima e nesta sequncia em um Erlenmeyer com

volume suficiente para a agitao do meio (utilizar agitador magntico). Feito isto,
preciso ajustar o pH da soluo que deve ser 7,4, adicionando HCl (cido clordrico)
1M para acidificar o meio e NaOH (hidrxido de sdio) 1M para elevar o pH. Seguidas
todas as etapas, o meio de cultura concentrado guardado no freezer at ser diludo para
uso.

PROCEDIMENTO ASM-1 PARA USO IMEDIATO

O modo de preparo para os meios ASM-1 (lquido/slido/cicloheximida)

idntico ao procedimento anteriormente descrito para o meio BG-11. O que modifica
so apenas as concentraes dos nutrientes (Tabela 5).

Tabela 5. Quantidades utilizadas para o preparo do meio para uso imediato

gua Deionizada (mL) Meio Concentrado (mL)

50 1,125
100 2,250
200 4,500
500 11,25
1.000 22,50
5.000 112,50
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PROCEDIMENTO MEIO SLIDO

Para o preparo do meio slido, deve-se pesar 10g de gar para cada 1.000 mL de
meio de cultura.

Para dissolver a mistura, so utilizados dois mtodos: autoclavagem ou banho-

maria, dependendo do recipiente a ser utilizado.

PROCEDIMENTO MEIO LQUIDO E SLIDO COM

CICLOHEXIMIDA

Meio lquido

A quantidade de cicloheximida indicada no mtodo de 50 mg/L.

Para preparar o meio lquido, deve-se dissolver o meio concentrado normalmente,

autoclavar e deixar que esfrie at aproximadamente 50C. Isso importante, pois a
cicloheximida perde atividade acima desta temperatura. Em seguida, o antibitico deve
ser adicionado ao meio dentro da cmara de fluxo laminar, a fim de evitar
contaminao.

Quantidade de meio diludo (mL) Quantidade de Cicloheximida (g)

1.000 0,05
500 0,025
300 0,015
100 0,005

Meio slido

Para preparar 1.000 mL de meio, utilizamos 1 Erlenmeyer de 2.000 mL e outro de

1.000 mL. (A quantidade de cicloheximida indicada no mtodo de 50 mg/L e o gar
de 10 g/L.)

Pesar a cicloheximida e o gar, reservar;

Medir meio concentrado (81 mL de meio BG-11 ou 22,50 mL de meio ASM-1) e

diluir em 500 mL de gua deionizada, reservar;
 14

Reservar tambm 500 mL de gua deionizada;

No Erlenmeyer de 2.000 mL, colocar o gar (10g) e a gua deionizada (500 mL);

No Erlenmeyer de 1.000 mL, colocar o meio concentrado diludo em 500 mL de

gua;

Levar ambos os Erlenmeyers para a autoclave durante 30 minutos, a 125C e 1,5

atm. Aps este perodo, resfriar o Erlenmeyer que contm o meio at aproximadamente
50C para que a cicloheximida possa ser dissolvida sem perder suas propriedades;

Em seguida, levar os dois Erlenmeyers para o fluxo laminar e adicionar a

cicloheximida naquele com meio e agitar at dissolver totalmente. Posteriormente,
transferir o meio com cicloheximida para o Erlenmeyer que contm o gar,
homogeneizar levemente e ento distribuir em placas de Petri previamente esterilizadas.

DISTRIBUIO DOS MEI OS DE CULTURA

Os meios lquidos so distribudos em tubos de ensaio, num volume de 17 mL

para cada tubo; em seguida so tampados com rolhas de algodo com gaze e ento
autoclavados durante 30 minutos.

Depois de retirados da autoclave e atingirem temperatura ambiente esto prontos

para uso ou ento so guardados na geladeira em temperatura de 8C.

Os meios slidos so distribudos em dois recipientes diferentes: tubos de ensaio

e/ou placas de Petri.

Tubos de ensaio: o meio preparado colocado em banho-maria at

dissolver, feito isso o meio deve ser rapidamente distribudo nos tubos
antes do seu resfriamento, o que dificultaria a distribuio uniforme. Aps
distribuio, os tubos so tampados e autoclavados. Quando sarem da
autoclave, devero ser resfriados inclinados a fim de aumentar a superfcie
para o crescimento das cianobactrias, facilitando a visualizao do
crescimento sem ter necessidade de abrir o tubo.

Placas de Petri: o meio preparado autoclavado antes da distribuio e s

deve ser colocado nas placas dentro da cmara de fluxo laminar.
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Ainda dentro da cmara de fluxo laminar, as placas permanecem semi-abertas at

que o meio chegue temperatura ambiente e solidifique e no forme condensao na
tampa. Em seguida so fechadas, embrulhadas em papel e guardadas em geladeira com
a tampa para baixo, evitando assim que o meio fique mido.

DESCARTE DO MATERIAL CULTIVADO

O material a ser descartado, tanto aquele mantido em meio slido como lquido,
deve ser retirado das condies de cultivo e mantido isolado em seu recipiente original
at que o processo de descarte seja finalizado. Para tanto, os tubos (com as rolhas) e
placas de Petri (sem o parafilm) devem ser autoclavados em temperatura de 125C e
presso de 1,5 atm. Em seguida o material descartado e os recipientes so colocados
imersos em soluo de cloro ativo com concentrao entre 2 e 2,5% por cerca de 12
horas, sendo lavados normalmente em seguida.

Tal procedimento de suma importncia para a segurana das pessoas que

manipulam o material e para evitar contaminao do laboratrio e do meio ambiente
atravs da produo de resduos.

CULTIVO E ISOLAMENTO

PROCEDIMENTO PARA O ISOLAMENTO DAS CEPAS

H dois mtodos bsicos para o isolamento das cianobactrias em cultura:

plaqueamento e seleo por capilar (pescaria). Ambos so eficazes, porm algumas
cepas no se adequam bem ao meio slido e a tcnica de pescaria requer prtica e
pacincia.

Para se obter melhor resultado, recomenda-se que os procedimentos de isolamento

sejam feitos na maior variabilidade possvel de meios, a no ser que se saiba
previamente qual o melhor para o cultivo da cepa de interesse. A seguir os mtodos so
detalhados:
 16

PLAQUEAMENTO

Coloca-se nas placas de Petri os meios de cultura, ASM-1 ou BG-11, slidos e

com cicloheximida;

Na cmara de fluxo laminar, homogenizar a amostra e colocar trs gotas de

material sobre o meio slido, espalhando uniformemente com o auxilio da ala
de Drigalski ou basto, previamente flambados no bico de Bunsen. importante
que, ao se espalhar o material, no haja sobreposio de inculo (figura 1);

Aps inoculao, as placas so vedadas com parafilm e colocadas na sala de

cultivo. importante que a parte na qual se encontra o meio esteja para cima,
pois comum que na tampa acumule gua, o que pode ocasionar contaminao;

Cada placa com o inculo deve ser etiquetada com informaes relevantes como
local e data de coleta, data do plaqueamento e meio utilizado, ou algum cdigo
que resuma estas informaes;

Aps 2-3 semanas possvel visualizar o crescimento de diferentes massas de

cianobactrias. Nesse exame (visualmente e depois ao microscpio) so
analisadas: cor, estrutura, e consistncia do crescimento. Os diferentes
crescimentos so marcados e colnias isoladas ou pequenas fraes dos
crescimentos so retirados com o auxlio de uma ala metlica e ento so
inoculados em um tubo de ensaio contendo meio lquido;

Estas placas ainda so mantidas para isolamento, pois algumas cianobactrias

tm crescimento lento e sero visveis apenas aps 30 ou mais dias aps o
plaqueamento.
 17

Figura 1: Esquema da tcnica de plaqueamento

Caso no ocorra o isolamento aplica-se novamente a tcnica, at que se obtenha

culturas uniespecificas.

PESCARIA

Flamba-se uma lmina de vidro, espera-se esfriar e em seguida coloca-se uma gota
da amostra e vrias gotas de meio de cultura estril (figura 2);
Ao microscpio, visualiza-se o espcime a ser isolado, escolhendo-se
preferencialmente um que esteja numa rea limpa;

Para formao do capilar, afina-se uma pipeta Pasteur na chama do bico de Bunsen,
quebrando-se a ponta de acordo com o tamanho do organismo de interesse
selecionado;

Aps a pescaria do organismo, passa-se o espcime pescado para a gota de meio

estril, sendo esse procedimento repetido at que se obtenha apenas o indivduo de
interesse;
 18

Em seguida feita a transferncia para o tudo de ensaio contendo meia carga de

meio de cultura (cerca de 8 mL);

Se for necessrio, utilizar mais de uma lmina e deve-se fazer o processo da mesma
forma.

Pode acontecer que o organismo selecionado no se desenvolva, tanto pela sua

fragilidade ou pela perda do mesmo durante o processo. Assim, o ideal que sejam
feitos vrios tubos, em mdia 5 para cada cepa.

Amostra com vrios indivduos

Gota com apenas o indivduo que ser inoculada

no tubo de ensaio com meio de cultura

Figura 2: Esquema da tcnica de pescaria

MANUTENO DAS CEPAS

Cada cultura uniespecifica deve ser mantida em trplicas em tubos de ensaio

contendo 17 mL de meio de cultura, sob condies controladas. No caso da
coleo de culturas de cianobactrias do Instituto de Botnica, as condies so
as seguintes: temperatura 232 o
C, irradincia 40-50 mol ftons m-2.s-1 e
fotoperodo 14-10h claro-escuro. Dos trs tubos, um mais antigo (repicagem
anterior) e os outros dois so da repicagem atual, portanto tm a mesma data. A
troca do meio de cultura feita aproximadamente a cada 30 dias, seguindo o
procedimento abaixo (figura 3):

Dentre os tubos com a mesma data escolhe-se um para funcionar como

inculo e os outros dois so descartados;

A partir do tubo escolhido so feitas duas repicagens em tubos com meios

novos, resultando nos trs tubos a serem mantidos;
 19

importante que se mantenha o tubo com a cultura antiga por segurana,

pois a repicagem pode falhar;

Figura 3: Esquema do processo de repicagem

PROTOCOLO PARA LAVAG EM DE CLULAS DE

CIANOBACTRIAS COM E XTRAN 0,1%

(Protocolo desenvolvido por Ricardo Y. Honda e Elaine Crespim Centro de

Energia Nuclear na Agricultura, CENA-USP)

O objetivo das lavagens com Extran dissolver e eliminar grande parte da

mucilagem produzida por cianobactrias, visando a eliminao das bactrias
(contaminantes) que crescem endogleicamente (dentro da mucilagem) (figura 4). As
lavagens so feitas seguidamente com meio de cultura com o objetivo de retirar o
Extran das clulas de cianobactrias e diminuir o impacto causado s mesmas durante
o procedimento. Abaixo so descritas todas as etapas:

1. O inculo inicial pode partir de 500 L a 1 mL de cultura em meio lquido,

sendo este transferido para um microtubo de 1,5 mL. Para todo o processo,
utilizar somente material e solues estreis;
2. Centrifugar os tubos a 5.000 rpm (ou, no mximo, 7.000 rpm) por 5 minutos,
para a formao de pellet. Com relao centrifugao, para manter as clulas a
temperatura adequada, aconselha-se programar a temperatura da centrfuga para
cerca de 20 C. No aumentar a rotao para 10.000 rpm, pois o pellet formado
pode ficar compactado demais e no se dissolver novamente;
3. Retirar o sobrenadante com pipeta, se possvel evitando que as clulas que
ficaram aderidas parede do tubo sejam retiradas junto. Descartar o
 20

sobrenadante. Aconselha-se retirar o sobrenadante com pipeta durante todo o

procedimento para evitar maior perda de clulas que poderia ocorrer se os tubos
fossem virados no frasco de descarte;
4. Suspender o pellet em 500 L de Extran 0,1% e homogeneizar completamente,
com cuidado para no lisar as clulas. (Obs.: se durante qualquer parte do
protocolo o contedo dos tubos ficar mais azulado, isto pode indicar lise das
clulas);
5. Deixar os tubos em repouso por 30 minutos;
6. Adicionar aos tubos 500 L de meio de cultura lquido e homogeneizar
cuidadosamente por inverso. Centrifugar por 5 minutos a 5000 rpm;
7. Descartar o sobrenadante. Suspender o pellet novamente em 500 L de Extran
0,1%, homogeneizar e deixar os tubos em repouso por 30 minutos;
8. Adicionar aos tubos 500 L de meio de cultura lquido, homogeneizar,
centrifugar a 7000 rpm por 5 minutos e descartar o sobrenadante;
9. Suspender o pellet em 1 mL de meio de cultura lquido, homogeneizar e
centrifugar a 7000 rpm por 5 minutos. Descartar o sobrenadante;
10. Suspender o pellet em 500 L de meio de cultura, homogeneizar e centrifugar
novamente a 7000 rpm por 5 minutos. Descartar novamente o sobrenadante;
11. Suspender o pellet novamente em 500 L de meio de cultura. Homogeneizar e
centrifugar a 5000 rpm por 15 minutos. Descartar todo o sobrenadante e
suspender o pellet cuidadosamente em 1 mL de meio de cultura lquido;
12. Transferir essa cultura do micro tubo para Erlenmeyers de 50 mL e deixar as
culturas crescendo nas condies apropriadas.

Figura 4: Linhagem antes e depois da lavagem com Extran 0,1%

 21

TIPOS DE CULTURA

CULTURA BATCH: Volume de meio fixo (sistema fechado), figura 5

CULTURA EM FED- BATCH: Adio gradual de meio (aumento do volume)

CULTURA EM BATCH SEMI-CONTNUA: adio de meio e remoo de meio e

clulas (a intervalos pr-estabelecidos)

CULTURA CONTNUA adio de meio e remoo de meio e clulas (contnua)

Figura 5: Cultura Batch

PRODUO DE BIOMASSA

As cepas uniespecficas e no axnicas tambm so cultivadas em grandes

quantidades (figura 6). O processo consiste em 3 etapas e em cada uma delas o inculo
em fase exponencial de 10% do volume total do meio. As condies abaixo so
usadas nas etapas 1 e 2:

Agitao: 70 rotaes por minuto

Iluminao: 15-20 mol ftons m-2s-1
Temperatura: 24 1 C
 22

Fotoperodo: 14-10h claro-escuro

Na etapa 3:
Aerao: constante
Iluminao: constante
Temperatura: 24 1 C
Fotoperodo: 14-10h claro-escuro

A produo de biomassa realizada a partir de um repique do banco de cultura,

conforme as seguintes etapas:

1) 5 mL de inculo so transferidos para recipiente com 50 mL de meio de cultura: os

frascos so mantidos em agitador de bancada com rotao constante (70
rotaes.minuto-1).
2) constatado o crescimento da cultura, transfere-se os 50 mL do inculo para 500 mL
de meio, mantendo sempre a mesma rotao mencionada. As cepas ficam sob
esta condio durante 1-2 semanas (tempo mdio para que a cultura atinja a fase
exponencial de crescimento). Portanto, o inculo inicial para determinao da
curva foi retirado na fase exponencial.
3) 500 mL de inculo so transferidos para Erlenmeyer de 6.000 mL com 5.000 mL de
meio de cultura. Os Erlenmeyers so colocados na sala de cultivo com
iluminao constante, sem rotao, mas com aerao.
 23

Figura 6: Obteno de biomassa

ESQUEMA PAR A OBTENO DE UMA CULTURA

UNIESPECFICA

Figura 7: Resumo do organograma

 24

DETERMINAO DAS CUR VAS DE CRESCIMENTO

As curvas de crescimento podem ser estabelecidas a partir do biovolume das

cianobactrias (mm.L-) ou por nmero de clulas (clulas. mL-1) plotados contra o
tempo de cultivo (n=3). Para realizar a contagem de clulas necessrio que a
mucilagem seja eliminada para que as clulas fiquem livres no meio e, para isto,
utilizamos alguns procedimentos:

Para colnias grandes, com muita mucilagem, tratar o cultivo com adio de
NaOH 1M na proporo de 2:1 (1 mL da cultura : 0,5 mL de NaOH) e deixar em banho-
maria a 60C durante 10 min.

Para colnias pequenas, com pouca mucilagem, tratar apenas em banho-maria a

80C, durante 5 min.

Obs.: em alguns casos, como colnias que possuem mucilagem difcil de romper,
utilizado concentrao de NaOH 2-3M, em banho-maria a 80C, durante
15 min.

Fixar as amostras com soluo de formol 4% sempre que a contagem for realizada
em outro momento.

Contar em cmara de Fuchs-Rosenthal (hemocitmetro) (figura 8).

DENSIDADE (CLULAS. ML -1 )

Para determinao das curvas de crescimento realiza-se a contagem das clulas

de no mnimo uma rea da cmara, o que corresponde a 16 quadrados da mesma. As
contagens so realizadas diariamente ou a cada dois dias, sendo estabelecido um
nmero mximo de 400 clulas por contagem (quando exceder este nmero, uma nova
contagem ter que ser realizada aps a diluio da amostra). So feitas contagens nos
dois lados da cmara e, caso haja diferena maior que 10% entre os lados, tambm
realizada uma nova contagem.
Para determinao da curva de crescimento de gneros filamentosos so
realizadas contagens dos tricomas e este nmero multiplicado pelo nmero mdio de
clulas dos tricomas (n=90). As contagens tambm so realizadas diariamente ou a cada
dois dias em cmara de Fuchs-Rosenthal, em todo o campo (16 reas) o que
corresponde a 256 quadrados da cmara.
 25

1 rea

Figura 8: Cmara de Fuchs-Rosenthal utilizada para contagem de clulas ou

filamentos e em destaque um dos campos da cmara.

A tabela 9 apresenta o fator de multiplicao necessrio para converso do

nmero de clulas contadas para n. de clulas. mL-1.

Tabela 9: Fatores de converso para determinao do n de clulas. ML-1

(Honda 2005)

rea N de Clulas.mL-1
1/16 de A n de cel. X 80.000
1/8 de A n de cel. X 40.000
1/4 de A n de cel. X 20.000
1/2 de A n de cel. X 10.000
1 A (16 ) n de cel. X 5.000
2 A (32 ) n de cel. X 2.500
4 A (64 ) n de cel. X 1.250
8 A (128 ) n de cel. X 625
16 A (256 ) n de cel. X 312,5

BIOMASSA (BIOVOLUME MM L -1 )

O volume celular (V) pode ser obtido a partir da mdia do comprimento (a) e
dimetro (b) de trinta clulas, usando modelos geomtricos aproximados forma das
clulas das cianobactrias (Sun & Liu 2003).
 26

O biovolume total estimado multiplicando-se a densidade celular por seus

respectivos volumes (Sun & Liu 2003). Os valores obtidos em m.mL- so divididos
por 10-6 para converso em mm.L-.

DETERMINAO DAS TAXAS DE CRESCIMENTO, T EMPO DE

DUPLICAO E RENDIME NTO CELULAR MXIMO.

Aps a determinao da curva de crescimento, so calculadas as taxas de

crescimento (.dia -1) e o tempo de duplicao (G.dia -1) para a fase exponencial de cada
cepa analisada. Estas taxas so calculadas com a mdia das contagens dos trs frascos
(n=3), segundo as frmulas apresentadas por Fogg & Thake (1987):

= ( Ln N- Ln No). (t-to)-1 G= ln 2. -1

a velocidade especfica de crescimento.

G o tempo de duplicao celular, calculado a partir de .
No o nmero inicial de clulas. mL-1 no tempo inicial to.
N o nmero final de clulas. mL-1 no tempo t .

Pode ser calculado tambm o rendimento celular mximo (R), medido em

clulas. mL-1, que corresponde ao nmero mximo de clulas menos o nmero de
clulas do inculo (Carneiro 2009).

HIGIENIZAO E BIOSS EGURANA

Para o bom andamento do trabalho algumas normas gerais de segurana e

higiene precisam ser adotadas:

- Uso obrigatrio do avental branco em todas as atividades laboratoriais,

preferencialmente de algodo;

-Desinfeco das superfcies com lcool etlico 70%;

-Higiene e desinfeco das mos;

- Trabalhar dentro da zona de segurana do bico de Bunsen: recipientes com meios de

cultura devem ser abertos prximos chama do bico;

-Ao utilizar tringulos, alas e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por
flambagem antes e aps cada operao efetuada com as culturas;
 27

- Evite falar enquanto distribui os meios de cultura para no contamin-los;

- Flambar rapidamente a boca dos frascos imediatamente aps abri-los e antes de fech-
los;

-Use apenas pipetas previamente aultoclavadas e armazenadas em embalagens

hermeticamente fechadas;

- Nunca pipetar com a boca, o correto usar peras ou pipetadores apropriados.

REFERNCIAS

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