MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

Las clulas son muy pequeas y complejas, caractersticas stas que dificultan
observar su estructura y descubrir su organizacin molecular y ms difcil an,
comprender el funcionamiento de sus diversos constituyentes. Lo que podamos
conocer de las clulas depender de los instrumentos disponibles y adecuados para
observar y analizar, tanto clulas individualizadas (Biologa Celular) como los
tejidos y rganos (Histologa). Las tcnicas de laboratorio son cada vez ms
especficas y actualizadas; de all que, para familiarizarse con los conceptos, es
necesario conocer los mtodos empleados para el estudio de las clulas y tejidos.

Una clula animal tpica, cuyo dimetro aproximado puede estar entre los 10 y 25
micrmetros (m), es mucho ms pequea que una partcula que pueda ser
observada a simple vista por el ojo humano. Se tuvo que esperar entonces a
principios del siglo XIX la aparicin de instrumentos pticos, buenos microscopios
fotnicos, para descubrir que los tejidos vegetales y animales estaban constituidos
por agregados de clulas, independientes desde el punto de vista estructural, pero
interrelacionadas funcionalmente.

Las clulas no son solamente minsculas, tambin son incoloras y translcidas en su

mayora. Dilucidar este hecho permiti el desarrollo de un surtido de tcnicas
colorantes que aseguraran un contraste suficiente para poder visualizar las clulas
en toda su estructura y complejidad, y ms adelante, en el siglo XX, la observacin
de detalles de la ultra estructura de los componentes ms finos del citoplasma,
gracias al empleo de la microscopa electrnica.

Hasta mediados del siglo XX un gran nmero de microscopios de luz haban salido
al mercado, destacando los microscopios de la firma Carl Zeiss, debido a la
colaboracin entre Ernst Abbe y Zeiss. Esta firma logr la produccin de
microscopios de gran calidad, gracias a la aplicacin de la teora de formacin de
imgenes de Abbe, diseando por primera vez un microscopio basado en clculos
matemticos y conocimientos de ptica geomtrica. No obstante, ello, se
presentaban problemas muy grandes al tratar de observar muestras transparentes a
la luz visible, como es el caso de algunos seres vivos.

En el ao 1935, el fsico holands Fritz Zernike desarroll el Microscopio de

Contraste de Fase, con lo cual se le otorg el Premio Nobel de Fsica en el ao 1953.
Su contribucin consisti al afirmar que la imagen vista bajo un microscopio
convencional, es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se observa
en el ocular. Si la muestra no absorbe la luz, no habr esencialmente contraste en la
imagen visible (ser toda blanca); por ejemplo, la mayora de las clulas vivas
absorben poca luz (a excepcin de las clulas rojas de la sangre y los cloroplastos) y,
por lo tanto, son difciles de visualizar a travs de un microscopio convencional. Por
otro lado, aunque las clulas absorben poca luz, tienen diversos espesores y diversos
ndices de refraccin en sus partes, lo que conduce a las diferencias de fase de las
ondas de luz que pasan a travs de ellas. La fase de un haz de luz es inobservable a
la vista (apenas se ve la intensidad, no la fase). Zernike calcul la manera de hacer
que las diferencias de fase se observaran en la imagen como en la intensidad,
logrando as, visualizar detalles que no eran posibles apreciar en un microscopio
convencional. Este tipo de microscopios se utiliza habitualmente para estudiar
clulas vivas.

Las investigaciones iniciales de Fritz Zernike al inicio de la dcada de 1930 revelaron

que, en microscopa, al crear interferencias en la luz empleada para iluminar el
espcimen se creaban condiciones que producan un incremento del contraste. Este
descubrimiento le vali el premio Nobel en fsica en el ao 1953 y revolucion la
investigacin en biomedicina al permitir el estudio de clulas vivas. Con esta tcnica
de iluminacin se aumenta el contraste de manera notoria entre las partes claras y
oscuras de las clulas transparentes.

El principio es semejante al de campo oscuro; se ilumina la muestra con un cono

hueco de luz, pero mucho ms estrecho. Se emplea un filtro en forma de anillo que
disminuye la intensidad de la luz y al mismo tiempo provoca un retraso o desfase
en la longitud de onda de la luz. Este mtodo induce variaciones sutiles en el ndice
de refraccin (determinado por el espesor) de los especmenes translcidos
permitiendo visualizar una riqueza de detalles muy finos en la estructura, los cuales
pasaran desapercibidos con una iluminacin de campo claro.

Los heterogneos componentes celulares absorben la luz de diferente manera y

causan pequeas variaciones de fase en las radiaciones luminosas, es decir, las
retrasan ligeramente al disminuir la velocidad a la cual viajan y el retraso vara
segn el tipo de estructura. En las clulas y tejidos no coloreados, el escaso contraste
se mejora y acenta al transformar las diferencias de fase (invisibles al ojo humano)
en diferencias de intensidad luminosa las cuales s son detectables. Este tipo de
microscopio tambin se denomina de Fases o Diferencia de Fases.

Para convertir un microscopio convencional en uno de contraste de fases se sustituye

el condensador y el objetivo por los de contraste de fases, los cuales contienen un
filtro en anillo y una placa de fases respectivamente. Los objetivos de contraste de
fases se identifican por sus letras verdes y la indicacin del tamao del anillo de
fases (Ph1, Ph2, Ph3 o PhC, PhL, PhP).

El mtodo de Zernike consiste en acelerar las ondas en de longitud de onda y

como resultado la interferencia produce una imagen con detalles oscuros sobre un
fondo claro, denominndose contraste de fase oscuro o positivo. Otro mtodo
consiste en el efecto contrario, es decir, retrasar o disminuir la velocidad de la luz en
de longitud de onda y la interferencia produce una imagen con detalles brillantes
en un fondo oscuro y se denomina contraste de fase brillante o negativo.