Professional Documents
Culture Documents
a
Laboratorio de Parasitologa.
b
Laboratorio de Inmunohematologa, Hemorreologa e Inmunogentica. Facultad de
Ciencias. Bioqumicas y Farmaceticas.
c
Grupo de ptica Aplicada a la Biologa del Instituto de Fsica de Rosario. CONICET.
Universidad Nacional de Rosario. Argentina.
Resumen
Experiencias previas han reportado que los extractos de A. lumbricoides captan cido
silico del eritrocito humano modificando su carga. El objetivo fue evaluar in vitro las
posibles alteraciones biorreolgicas debidas al efecto de extractos del parsito adulto.
Se analiz la accin de 8 extractos sobre eritrocitos Grupo O, incubando el sedimento
globular con igual volumen de extracto y con PBS. Se determin la distribucin y
morfologa de los agregados (Anlisis Digital de Imgenes), carga porcentual (mtodo
Azul de Alcian), cintica de agregacin (eritroagregmetro) y viscoelasticidad
(eritrodefrmetro). Los resultados mostraron que todos los extractos causaron una
disminucin del porcentaje de clulas aisladas y un aumento en el tamao de los
agregados, sin alterar su morfologa. Los glbulos tratados con 6 extractos mediaron
una significativa alteracin de la carga superficial y con 5 de ellos la velocidad de
agregacin fue menor que en el control. Se observ una correlacin lineal entre los
parmetros de cintica y la concentracin proteica de los extractos. Uno de los
tratamientos modific la fluidez de membrana y dos disminuyeron la deformabilidad
eritrocitaria, pero ninguno afect la elasticidad. Estas experiencias in vitro permiten
concluir que el contacto de los extractos con los eritrocitos produce alteraciones
hemorreolgicas.
Introduccin
Debido a que en experiencias previas se ha reportado que los ejemplares adultos y los
estadios larvarios de A. lumbricoides pueden disminuir la carga eritrocitaria [10-12] y
aumentar la agregacin globular, y que estos fenmenos podran colaborar en la
interpretacin de algunos aspectos de la patologa, como son la formacin de trombos y
la anemia, el objetivo del trabajo fue estudiar in vitro las posibles alteraciones
biorreolgicas debidas al contacto de los glbulos rojos con extractos de A. lumbricoides.
Materiales y mtodos
Glbulos rojos (GR): Se utilizaron GR frescos provenientes del mismo donante sano
correspondiente al grupo O, previa separacin del plasma autlogo, los cuales fueron
lavados en buffer fosfato salino de pH 7,4 y osmolaridad de 295 mOsm/kg (PBS). En
experiencias previas se demostr que los EA pueden presentar eptopes de grupo
sanguneo A y/ o B [15-17], por lo que se trabaj con GR del grupo O para evitar posibles
interacciones antgeno-anticuerpo ABO que podran interferir con los resultados.
Tratamiento de los GR: Se incub el sedimento globular con igual volumen de EA durante
1 hora, a 37 C (GR tratados). Los GR utilizados como control, fueron incubados con
PBS. Finalizada la incubacin, los GR tratados y control fueron lavados en PBS.
Cuando el valor de CCA es igual a 0 indica que no hubo variacin en el nmero de clulas
aisladas por accin del EA, y cuando es igual a 1 seala la ausencia de clulas aisladas
(agregacin total).
Morfologa de los agregados por anlisis digital de imgenes: Las imgenes de los
agregados eritrocitarios se analizaron con un programa de Anlisis Digital de Imgenes
(Imagen J), para caracterizar su morfologa. En cada una de ellas se hicieron medidas
de rea (A) y permetro (p) obtenindose el factor de forma de cada agregado (ASP)
mediante la ecuacin:
Se promediaron para cada muestra todos los valores de ASP de los agregados de las
tres imgenes. Los agregados globulares presentan un valor de ASP cercano a 1, los que
se presentan como monedas apiladas (aproximadamente rectangular) tienen
un y los glbulos agrupados en forma desordenada un [18-
21].
Anlisis estadstico de los resultados: En cada muestra, para todos los parmetros y
coeficientes, se calcul a posteriori el nivel de significacin emprico de contraste entre
la hiptesis nula y la alternativa con respecto al control mediante el anlisis de t-Student
[32].
Resultados
La tabla 1 muestra la distribucin de los tamaos de los agregados y los valores de CCA.
Tabla 1. Estudio de la distribucin y morfologa de los agregados eritrocitarios y de la
carga aninica en los eritrocitos control y tratados con los extractos parasitarios.
Discusin
En experiencias previas fue reportado que A. lumbricoides capta cido silico del
eritrocito y altera su carga superficial [10-12,33]. Muchas investigaciones han
relacionado al AS con los procesos metablicos y con las vas de infeccin e invasin de
diferentes parsitos [34-40]. El AS es un monosacrido excepcional, de marcada
polaridad, resultante de la condensacin de una molcula de cido pirvico con otra de
manosamina. Klenk y Faillard (1954) determinaron su estructura correcta [41-43] y
Schauer, prosiguiendo con las investigaciones de estos autores, identific nuevos cidos
silicos y profundiz en el conocimiento de sus funciones, manifestando que presentan
importantes y variados roles biolgicos, incluso algunos diametralmente opuestos [41].
Entre sus funciones se hallan las debidas a su carga negativa, la influencia sobre la
estructura de macromolculas y sobre la especificidad de antgenos, el rol protector
frente a ataques enzimticos, la capacidad de tener sitios de reconocimiento, y a la vez
poseer efecto de enmascaramiento por carga o estrico. Por lo tanto, algunas funciones
de los glucoconjugados estn determinadas, al menos parcialmente, por la participacin
en su composicin de los cidos silicos [44].
Los valores de CCA variaron entre 0,4 y 10,05, indicando que el incremento en la
capacidad de agregacin fue dependiente del EA usado en el tratamiento. Estos
resultados corroboran los obtenidos previamente, en los que se observ variabilidad en
el grado de agregacin al incubar los GR con diferentes EA, posiblemente debido a
caractersticas intrnsecas de los mismos [10-12,33].
Las experiencias in vitro mostraron que la accin del EA produce agregados eritrocitarios
de mayor tamao, lo que podra explicar la trombosis observada in vivo en pacientes
con ascariosis [1,2].
Los valores de CCAE, comprendidos entre 0,3 y 0,40,02, indicaron que seis de los EA
alteraron en forma significativa la carga de los GR durante la incubacin, mientras que
los dos restantes, no modificaron el contenido de AS (0,03 y 0,060,02). Los GR
incubados con estos ltimos extractos (EA6 y EA8) fueron los que presentaron tambin
la menor disminucin del porcentaje de clulas aisladas iniciales (C CA: 0,40,05 y
0,50,05, respectivamente). El mtodo de AA no detect variacin de carga, cuando el
porcentaje de clulas aisladas disminuy al 50% y 60% de las iniciales, mientras que
cuando fueron iguales o menores al 30% de las del control, el mtodo mostr una
diferencia significativa entre la carga aninica antes y despus del tratamiento. Estos
resultados indicaran que el mtodo de anlisis digital de imgenes permite detectar una
menor alteracin de carga aninica, en los eritrocitos tratados con extractos parasitarios,
que el mtodo de AA.
El ndice de deformabilidad slo mostr una disminucin en los GR que fueron incubados
con los dos EA de mayor concentracin proteica, por lo que posiblemente la adhesin de
macromolculas cuticulares a la membrana del glbulo rojo afect su capacidad de
deformacin, aumentando la rigidez.
Los estudios hemorreolgicos indicaron que las alteraciones morfolgicas y los cambios
en la capacidad de deformacin del GR en infecciones por Tripanosoma cruzi causan el
aumento de la viscosidad sangunea [50] y en schistosomosis producen anemia y
conducen a hipoxia tisular asociada a decaimiento y fatiga [47]. Los resultados obtenidos
podran contribuir en explicar los trombos, la anemia, el cansancio y/ o debilidad que
pueden presentar los pacientes con ascariosis [51-54].
1. Beaver PCH, Jung RC, Cupp EW. Parasitologa Clnica. 2 ed. Barcelona: Salvat;
1986. [ Links ]
7. Bishop JJ, Nance PR, Popel AS, Intaglietta M, Johnson PC. Effect of erythrocyte
aggregation on velocity profiles in venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;
280:222-36. [ Links ]
12. Ponce de Len P, Biondi C, Valverde J. Efecto producido por Ascaris lumbricoides
sobre la carga superficial eritrocitaria utilizando el mtodo de polibrene. Acta Bioqum
Clin Latinoam. 2010; 44:689-96. [ Links ]
20. Danieli V, Fontana AB, Alessi AC, Foresto PG, Valverde JR, Grandfils y col.
Tratamiento de eritrocitos humanos con copolmeros sintticos: optimizacin del tiempo
de incubacin. Acta Bioqum Cln Latinoam. 2009; 43:43-8. [ Links ]
22. Oguzhan D, Dilek Y, Ayliz V, Hasan C, Nihal A, Goncagl H et al. Effects of ACE
inhibition and angiotensin II receptor blockade on glomerular basement membrane
protein excretion and charge selectivity in type 2 diabetic patients. J Renin Angiotensin
Aldosterone Syst. 2006; 7:98-103. [ Links ]
23. Levin M, Smith C, Walters MDS, Gascoine P, Barrett TM. Steroid responsive nephrotic
syndrome: a generalized disorder of membrane negative charge. Lancet 1985; 2:239-
42. [ Links ]
24. Beutler E, West C, Blume KG. The removal of leucocytes and platelets from whole
blood. J Lab Clin Med. 1976; 88:328-33. [ Links ]
28. Rasia RJ, Porta PE, Garca Rosasco M. Estudio comparativo entre filtrabilidad y
difractometra en medicin de deformabilidad eritrocitaria. Rev Argent Transfus.
1985;11(4):217-20. [ Links ]
29. Rasia RJ, Porta P, Garca Rosasco M. Shear deformation measurement of suspended
particles. Applications to erythrocytes. Rev Sc Instrum. 1986; 57: 33-5. [ Links ]
34. Souto Padron T. The surface charge of trypanosomatids. An Acad Bras Cinc. 2002;
74:649-75. [ Links ]
37. Anosa VO, Kaneko JJ. Pathogenesis of Trypanosoma brucei infection in deer mice
(Peromyscus maniculatus): Light and electron microscopic studies on erythrocyte
pathologic changes and phagocytosis. Am J Vet Res.1983; 44:645-51. [ Links ]
39. Pasvol G, Wainscoat JS, Weatherall DJ. Erythrocytes deficient in glycophorin resist
invasion by the malarial parasite Plasmodium falciparum. Nature. 1982; 297:64-
6. [ Links ]
40. Mayer DC, Cofie J, Jiang L, Hartl DL, Tracy E, Kabat J, Mendoza LH, Miller LH.
Glycophorin B is the erythrocyte receptor of Plasmodium falciparum erythrocyte-binding
ligand, EBL-1. Proc Natl Acad Sci. 2009; 106:5348-52. [ Links ]
41. Cabezas Fernndez del Campo JA. Influencia de la sialilacin y de la pegilacin
de la molcula de ciertos medicamentos en su actividad. An R Acad Nac Farm. 2008;
74:409-32. [ Links ]
42. Cabezas JA. Acides sialiques: Leur Signification Biochimique. Le Pharm. Biol. 1961;
2:9-19. [ Links ]
43. Cabezas JA. Estudio de los cidos silicos en diversos materiales biolgicos. (Discurso
de incorporacin como Acadmico Correspondiente de la Real Academia de Farmacia).
An R Acad Nac Farm.1968; 24:154-72. [ Links ]
45. Oelshlegal FJ, Sander BJ, Brewer GJ. Role of in vivo pyruvate kinase activity. A.
Inheritance of elevated red cells ATP levels. B Red cell malarial parasite interactions.
Erythorcyte Structure and Functions. New York: Alan R. Liss, 1975. [ Links ]
46. Yuthawong Y. Alterations of the erythrocytes induced by malaria parasites. J Sci Soc
Thailand.1985; 11:53-65. [ Links ]
50. Berra HH, Piaggio E, Revelli SS, Luquita A. Blood viscosity changes in experimentally
Trypanosoma cruzi- infected rats. Clin Hemorheol Microcirc. 2005; 32:175-
82. [ Links ]
52. Bardenwerper HE. Ascaris lumbricoides infestation with extreme anemia. J Am Med
Assoc.1928;91(14):1037. [ Links ]
54. Amuga GA, Onwuliri COE, Oniye SJ. Relative contribution of hookworm and Ascaris
lumbricoides to iron deficiency anemia among school pupils in Nasarawa area, Nigeria.
IJONAS. 2006; 2:205-9. [ Links ]