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TRABAJO FIN DE GRADO EN DOBLE GRADO

EN CIENCIAS AMBIENTALES Y GEOLOGA

Efecto genotxico temprano de la


exposicin a cobre, arsnico y plomo
en dorada (Sparus aurata, L.) como
modelo de monitorizacin ambiental

Alumna: Mara del Carmen lvarez Beret


Tutores: Rafael Torronteras Santiago
Antonio Canalejo Raya

Julio, 2017

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Efecto genotxico temprano de la exposicin a
cobre, plomo y arsnico en dorada (Sparus
aurata, L.) como modelo de monitorizacin
ambiental.
Resumen / Abstract
El siguiente trabajo de fin de grado trata sobre el estudio del efecto genotxico
producido en doradas, Sparus aurata, (Linnaeus, 1758), debido a la exposicin a
metales pesados como el plomo, arsnico y cobre. Los resultados se han obtenido
mediante el ensayo de microncleos, el cual evala la proporcin de estos en los
eritrocitos de sangre perifrica. Los peces fueron tratados con distintas
concentraciones de los metales, y a distintos tiempos de exposicin, 24 y 96 horas.
Estas anomalas han sido cuantificadas y estudiadas, con el fin de establecer la
relacin entre el aumento de la concentracin, y la aparicin de microncleos. El
estudio cuantifica la genotoxicidad producida en esta especie, con el fin de establecer
su idoneidad para la biomonitorizacin ambiental de ecosistemas acuticos.

The objective of these final graduation project work with the study of the genotoxic
effect produced in Sea bream , Sparus aurata, (Linnaeus, 1758), due to exposure to
heavy metals such as lead, arsenic and copper. The results were obtained by the
micronucleus assay, which evaluates the proportion of these in peripheral blood
erythrocytes. The fish were treated with different concentrations of metals, and at
different exposure times, 24 and 96 hours. These anomalies have been quantified and
studied, in order to establish the relationship between the increase in concentration and
the appearance of micronuclei. The study quantifies the genotoxicity produced in this
species, in order to establish its suitability for environmental biomonitoring of aquatic
ecosystems.

Palabras-Clave
Microncleos. Metales pesados. Genotoxicidad. Dao cromosmico. Sparus aurata.

Key-words
Micronuclei. Heavy metals. Genotoxicity. Chromosomic damaged. Sparus aurata.

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INDICE
1. INTRODUCCIN (PG 8)
1.1. LOS METALES PESADOS EN EL AMBIENTE (PAG 8)

1.2. ORIGEN DEL COBRE, ARSNICO Y PLOMO EN EL MEDIO (PAG


9)
1.2.1. Cobre
1.2.2. Arsnico
1.2.3. Plomo
1.3. EFECTO TXICO DE LOS METALES (PAG 11)

1.4. LEGISLACIN SOBRE LA CONTAMINACIN EN MEDIOS


ACUTICOS (PAG 12)

1.5. LA CONTAMINACIN ACUTICA EN LA COSTA ANDALUZA (PAG


13)

1.6. IMPORTANCIA DEL METODO DE MICRONUCLEOS (PAG 14)

2. OBJETIVOS (PAG 15)


3. MATERIAL Y METODOS (PAG 16)
3.1. INDIVIDUOS UTILIZADOS (PAG 16)

3.2. ACONDICIONAMIENTO TANQUES (PAG 16)

3.3. PREPARACIN DE LOS ENSAYOS (PAG 17)


3.3.1 Test de toxicidad con cobre en dorada
3.3.2. Test de toxicidad con arsnico en dorada
3.3.3. Test de toxicidad con plomo en dorada

3.4. TOMA DE MUESTRAS DE AGUA (PAG 19 )

3.5. TOMA DE MUESTRAS DE SANGRE. (PAG 20)

3.6. PREPARACIN DE MUESTRAS Y TINCIN CELULAR DE LOS


NCLEOS DE LOS ERITROCITOS. (PAG 20 )

3.7. MTODO DE RECUENTO DE MICRONCLEOS (PAG 20)

4. RESULTADOS (PAG 22)


4.1. CARACTERIZACIN MORFOLGICA EN LOS ENSAYOS CON
JUVENILES DE DORADA. (PAG 22)

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4.1.1. Datos de peces en los test con Cu (juveniles de dorada).
4.1.2. Datos de peces en los test con As (juveniles de dorada).
4.1.3. Datos de peces en los test con Pb (juveniles de dorada).

4.2. ANLISIS DE PARMETROS FSICO-QUMICOS DEL AGUA


EMPLEADA EN LOS TEST DE GENOTOXICIDAD. (PAG 22)

4.3. ANLISIS DE GENOTOXICIDAD POR EFECTO DE METALES


PESADOS (TEST DE MICRONCLEOS). (PAG 23)
4.3.1. Efectos genotxicos del Cobre.
4.3.2. Efectos genotxicos del Arsnico.
4.3.3. Efectos genotxicos del Plomo.
4.3.4. Anlisis comparativo del efecto genotxico de los tres metales.

4.4. ESTADSTICA. (PAG 29)

5. DISCUSIN (PAG 29)


5.1. SOBRE EL COBRE (PAG 30)

5.2. SOBRE EL ARSNICO (PAG 31)

5.3. SOBRE EL PLOMO. (PAG 31)

5.4. SOBRE LOS TRES METALES ANALIZADOS. (PAG 32)

6. CONCLUSIONES (PAG 33)


7. BIBLIOGRAFA (PAG 34)
ANEXO I
ANEXO II
ANEXO III

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NDICE DE CONTENIDOS

TABLAS
3.1.: Concentraciones de cobre en los distintos tanques para 24 h (PAG 18)

3.2.: Concentraciones de cobre en los distintos tanques para 96 h (PAG 18)

3.3.: Concentraciones de arsnico en los distintos tanques para 24 h (PAG 18)

3.4: Concentraciones de arsnico en los distintos tanques para 96 h (PAG 19)

3.5.: Concentraciones de plomo en los distintos tanques para 24 h (PAG 19)

3.6.: Concentraciones de plomo en los distintos tanques para 96 h. (PAG 19)

FIGURAS
3.1: Tanques para bioensayos de doradas con metales pesados. (PAG 16)

3.2: Tanques para bioensayos con doradas (Sparus aurata, L.) (PAG 17)

3.3: Tcnica de limpieza para la toma de muestra de aguas. (PAG 20)

4.1: Imgenes de microncleos en eritrocitos perifricos. (PAG 25)

4.2: Efecto genotxico (frecuencia de microncleos) inducido por cobre en


eritrocitos perifricos de dorada (Sparus aurata, L.) despus de 24 y 96 horas
de exposicin. (PAG 25)

4.3: Efecto genotxico (frecuencia de microncleos) inducido por arsnico en


eritrocitos perifricos de dorada (Sparus aurata, L.) despus de 24 y 96 horas
de exposicin. (PAG 27)

4.4: Efecto genotxico (frecuencia de microncleos) inducido por plomo en


eritrocitos perifricos de dorada (Sparus aurata, L.) despus de 24 y 96 horas de
exposicin. (PAG 28)

4.5: Comparacin de los efectos genotxicos (frecuencia de microncleos)


inducidos en dorada (Sparus aurata, L.), por cobre, arsnico y plomo, a las 24
horas de exposicin. (PAG 29)

4.6: Comparacin de los efectos genotxicos (frecuencia de microncleos) inducidos


en dorada (Sparus aurata, L.) por cobre, arsnico y plomo, a las 96 horas de
exposicin (PAG 30)

ANEXO I

Tabla 1: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Cu a las 24
horas en juveniles de dorada

Tabla 2: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Cu a las 96
horas en juveniles de dorada

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Tabla 3: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de As a las 24
horas en juveniles de doradas

Tabla 4: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de As a las 96
horas en juveniles de dorada

Tabla 5: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Pb a las 24
horas en juveniles de dorada

Tabla 6: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Pb a las 96
horas en juveniles de dorada

ANEXO II
Tabla 1: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles
de dorada a las 0 h

Tabla 2: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles


de dorada a las 24 h
Tabla 3: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles
de dorada a las 48 h
Tabla 4: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles
de dorada a las 72 h
Tabla 5: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles
de dorada a las 96 h
Tabla 6: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles
de dorada a las 0 h
Tabla 7: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles
de dorada a las 24 h
Tabla 8: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles
de dorada a las 48 h
Tabla 9: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles
de dorada a las 72 h

Tabla 10: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en


juveniles de dorada a las 96 h

Tabla 11: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en


juveniles de dorada a las 0 h
Tabla 12: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en juveniles de dorada a las
24 h

Tabla 13: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en


juveniles de dorada a las 48 h
Tabla 14: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en
juveniles de dorada a las 72 h
Tabla 15: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en
juveniles de dorada a las 96 h

ANEXO III
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Tabla 1: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en
los test de toxicidad del Cu a las 24 horas.

Tabla 2: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en
los test de toxicidad del Cu a las 96 horas.

Tabla 3: Comparacin del anlisis de microncleos en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del Cu en los dos tiempos de exposicin analizados (24 y 96 h).

Tabla 4: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en
los test de toxicidad del As a las 24 horas.

Tabla 5: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en
los test de toxicidad del As a las 96 horas.

Tabla 6.. Comparacin del anlisis de microncleos en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del As en los dos tiempos de exposicin analizados (24 y 96 h)

Tabla 7: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en
los test de toxicidad del Pb a las 24 horas.

Tabla 8: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en
los test de toxicidad del Pb a las 96 horas

Tabla 9: Comparacin del anlisis de microncleos en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del Pb en los dos tiempos de exposicin analizados (24 y 96 h)

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1. INTRODUCCIN
1.2. LOS METALES PESADOS EN EL AMBIENTE

Los metales pesados estn presentes en el medio ambiente, tanto de manera


natural como por la actividad antrpica. Los metales pesados son un grupo de
elementos con peso molecular de 63,5 a 200,6, y con una distribucin electrnica
similar en su capa externa (Rainbow, 1993). Se pueden diferenciar entre esenciales,
que se usan en funciones biolgicas del organismo, y los no esenciales.

El suelo se forma por la interaccin de los sistemas atmsfera, hidrosfera y


biosfera sobre la superficie de la geosfera. Ocupa la interfase entre la geosfera y los
dems sistemas, la llamada Zona Crtica (National Research Council, 2001; Brantley
et.al. 2007). En el suelo los elementos qumicos y compuestos pueden degradarse
produciendo la contaminacin de ste. Ms tarde pueden ser arrastrados por la
escorrenta y llegar a las aguas continentales o al mar.

El impacto ambiental que producen los contaminantes metlicos, tanto en el


suelo como en los sedimentos, depende de cmo se produce la unin entre stos y los
componentes del medio, y las condiciones fsicas qumicas en las que se encuentran.
No se pueden degradar, por lo que una vez estos entran en el medio, se distribuyen
por el agua, aire y suelo.

La mayor parte los encontramos en los sedimentos, jugando estos un papel


muy importante en modificar la calidad del agua. El agua que encontramos alrededor
de los sedimentos se llama agua intersticial, y presentan concentraciones intermedias,
entre el agua superficial y los sedimentos.

El equilibrio del ecosistema acutico puede verse alterado cuando se supere


las concentraciones naturales, pudiendo incluso destruir el biotopo. La toxicidad de
estos elementos sobre los individuos no depende solo de la concentracin en la que
se encuentren dichos elementos, sino tambin de otros factores tanto naturales como
del propio individuo (Jurado, 2003).

En el medio acutico se encuentran transportados, disueltos de manera inica


o unida a complejos orgnicos o inorgnicos. Pueden estar unidos a partculas en
suspensin, retenidos en el sedimento o presentes en los distintos seres vivos.
Muchos son necesarios en pequeas cantidades para el funcionamiento de la
naturaleza. Cuando la cantidad aumenta sus efectos se transforman en perjudiciales
por lo que es necesario saber el efecto genotxico que causa en las distintas especies
comerciales consumidas por el ser humano.

Los peces son excelentes bioindicadores de contaminacin. En peces, donde


se encuentra menos concentracin de contaminantes es en el msculo, siendo mayor
en otros rganos. Responden a los agentes genotxicos de manera similar a los
vertebrados superiores, por lo tanto el resultado de su estudio puede extrapolarse a
estos. Los peces acumulan los metales pesados en sus tejidos, por tanto estos
muestran en efecto pasado y presente de la acumulacin de estos, y a partir de ellos
se puede hacer un estudio sobre los distintos efectos genotxicos. Monitorear su
contaminacin en los tejidos colabora en la evaluacin de los ecosistema acutico
para establecer estrategias en el control de la polucin y saber el riesgo en la vida
humana (Ahmad, 2009; Wang et al. 2005).

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1.3. ORIGEN DEL COBRE, ARSNICO Y PLOMO EN EL MEDIO

1.3.1. Cobre

El cobre es un metal muy abundante en el medio, esencial en el metabolismo


del de los seres vivos, ya que realiza funciones dentro del organismo. El cobre no se
encuentra en yacimientos directos, ya que estos son escasos, sino que se extrae en
forma de sulfuros principalmente, y xidos que ms tarde son tratados para extraerlo.

Algunas funciones en el organismo son por ejemplo las reacciones redox,


formando parte de la citocromo oxidasa, o constituyendo numerosas enzimas. Adems
es necesario en la absorcin de hierro, y la sntesis de la hemoglobina.

En la corteza terrestre, podemos encontrar el cobre en una concentracin


aproximada de 70 ppm. Y su forma puede ser inica o, formando compuestos. En el
medio encontramos dos formas muy estables Cu1+ y Cu 2+ (Budavari, 1996).

Las formas de vertido son puntuales y provienen de plantas industriales,


refineras y fundiciones. El Cu se descarga ampliamente de distinta fuentes como son,
plantas industriales de metales, , refineras y fundiciones, otras industrias, vertidos
domsticos, y lixiviados metlicos. Adems, como arrastre en los lixiviados,
transportado por la atmsfera, o por la escorrenta, la cual arrastra sustancias usadas
en la agricultura.

Los sulfuros son tratados en un proceso llamado pirometalurgia y los xidos


por el mtodo de la hidrometalurgia. Los principales minerales de sulfuro de cobre son
calcopirita (CuFeS2), calcosita (Cu2S), covelita (CuS), bornita (Cu5FeS4) y tetraedrita
((Cu, Fe)12Sb4S13). La fuente principal son las formaciones de tipo porfdico, en las que
se producen los compuestos citados siendo el primero el ms importante.

Hay dos formas en la extraccin del cobre, la mina a cielo abierto y las minas
subterrneas, siendo la primera la ms utilizada a nivel mundial. En las ltimas
dcadas, la industria dedicada al cobre, ha hecho progresos en mejoras tecnolgicas
que reduzcan los impactos ambientales, y aumente el reciclado de los productos. Con
el fin de reducir al mximo posible la contaminacin, el cobre se vuelve realmente
difcil, ya que en el proceso de reciclado, no se degrada ni pierde sus propiedades
fsicas y qumicas.

La toxicidad del Cu afecta principalmente a la forma Cu2+, ya que forma de


manera muy rpida complejos, y puede ser absorbido por las partculas formando
parte de los sedimentos, encontrndose raramente de forma libre en el agua, excepto
en aguas blandas y de carcter cido (Robinson y Avenant-Oldewage, 1997).

El Cu afecta adversamente a los peces causando alteraciones histopatolgicas


en las branquias, rin, tejido hematopoytico, mecanorreceptores, quimiorreceptores
y otros tejidos. El Cu2+ causa dao en la clula alterando los sitios activos de los
enzimas y peroxidacin de las membranas, causando as serias modificaciones en la
clula. Los efectos sobre la reproduccin, son por ejemplo: la produccin reducida de
huevos en hembras, anormalidades en las progenies y reduccin de la supervivencia
(Hall et al., 1998).

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1.3.2. Arsnico

El arsnico se encuentra ampliamente en la naturaleza. Es muy abundante en


la corteza terrestre y qumicamente lo clasificamos como un metaloide, ya que tiene
propiedades metales y no metales. Lo encontramos sobretodo asociado a minerales
sulfurosos.

En la naturaleza no se encuentra ningn yacimiento puro, sino asociado a


elementos como cobre o plomo. Tambin pueden formar compuestos, en los cuales
diferenciamos dos tipos de arsnico:

Arsnico inorgnico que combina con oxgeno, cloro, y azufre.


Arsnico orgnico que combina con carbono e hidrgeno

Este arsnico inorgnico lo podemos encontrar en rocas ligadas a plomo o


cobre, es de ah de donde puede ser arrastrado por la escorrenta, o liberado al aire,
en algunos casos se queda retenido en sedimentos, donde es consumido por plantas y
animales.

Los peces lo integran en su sistema, en forma de arsinocolina y arsenobetaina,


ms comnmente conocida, como arsnico de pez. Este no presenta mayor problema
de intoxicacin o toxicidad, ya que es una de las formas menos contaminantes del
arsnico, y los peces excretan la mayor parte de esta sustancia por la orina. No tienen
por tanto efecto toxico para el ser humano.

1.3.3. Plomo

De los tres elementos estudiados el ms txico es el plomo. La concentracin


media que se encuentra de plomo (Pb) en la superficie terrestre es de 1,6 g por cada
100 kg de suelo segn Clark (1992). La produccin total de plomo es de alrededor de
43 millones de toneladas/ao. En la naturaleza podemos hallar Pb2+, que es la forma
estable del Pb, pero tambin en forma de complejos poco solubles como carbonatos,
sulfuros, sulfatos e hidrxidos. Los compuestos orgnicos (derivados alqulicos del
Pb), tambin forman complejos con materiales hmicos (Schulz, Baldes et al., 1983).

Las fuentes de Pb son muy variadas y tienen diferentes mbitos de


procedencia. La mayor parte de los residuos del plomo se obtiene de los desechos de
la chatarra proveniente de bateras, o escorias de la soldadura, recubrimientos, o
vertidos antropognicos al medio, como son los resultantes de la combustin de las
gasolina de los automviles .Segn Clark (1992), las actividades humanas liberan
mucho ms Pb a la atmsfera (449.000 toneladas/ao) que las fuentes naturales
(19.000 toneladas/ao).

Las emisiones o vertidos industriales de Pb son una gran fuente de


contaminacin. El problema ms importante de contaminacin aparece cuando el
plomo llega a medios acuticos, ya que el efecto est muy estudiado en aves, pero
muy poco en peces. El plomo al llegar al medio acutico forma compuestos que se
dispersan por este medio alcanzando grandes distancias. Scheuhammer y Norris
(1996) analizaron los productos de la corrosin que se produca en cerusita (PbCO3),
hidrocerusita (Pb (CO3)2(OH)2) y algo de anglesita (PbSO4). La contaminacin del
agua no se produce directamente por el plomo sino por sus sales solubles, las cuales
se encuentran en pinturas, acumuladores, productos de alfarera, residuos de
pirotecnia, actividades mineras, etc.

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Las dos principales maneras en la que el plomo entra en el organismo son, el
tracto gastrointestinal y las vas respiratorias. Un porcentaje de plomo es excretado
con la orina, el resto se establece en el esqueleto seo y es inerte, la parte que va por
el torrente sanguneo se deposita en los tejidos. El plomo puede afectar la sntesis de
la hemoglobina y el tiempo de vida media de los glbulos rojos, as como, al sistema
nervioso central y perifrico. La contaminacin por el plomo en los riones produce
cambios en las mitocondrias e inflamacin de las clulas del epitelio del tbulo
proximal y alteraciones funcionales que provocan aminoaciduria, glucosuria e
hiperfosfaturia, sndrome de Fanconi, segn Seoanez, (1999).

Todos los compuestos que contienen plomo son txicos, aunque a distintos
niveles, dependiendo de la naturaleza qumica y su nivel de solubilidad. Las
variaciones de parmetros hematolgicos como el hematocrito, la concentracin de
hemoglobina, el recuento de leucocitos y la frmula leucocitaria, pueden ser utilizadas
como indicadores de contaminacin (Haider, 1975; Hontela, 1998; Wahli, 2002)

El nivel de toxicidad de las aguas con plomo vara dependiendo la


disponibilidad y la ingestin que se produce del mismo. Hay diferentes factores que
afectan a su disponibilidad, algunos de ellos son la dureza del agua, el pH, la salinidad
y la materia orgnica. Adems la ingestin se ve afectada por otros cationes y, la
cantidad de oxgeno. El Pb orgnico se absorbe ms rpidamente que el Pb
inorgnico. Afecta a nivel mitocondrial y nivel celular, y a nivel hematolgico ejerce
inhibicin de las enzimas, a nivel nervioso puede incluso a alterar la sinapsis.

1.4. EFECTO TXICO DE LOS METALES

La toxicidad es la manera en que los materiales o compuestos txicos que no


tienen origen biolgico, exceptuando las toxinas, afectan negativamente a una funcin
biolgica. Los contaminantes pueden abandonar el suelo por volatilizacin, disolucin,
lixiviado o erosin, y pasar a los organismos cuando pueden ser asimilables
(bioasimilables), lo que normalmente ocurre cuando se encuentran en forma ms o
menos soluble.
La bioacumulacin es la capacidad de una sustancia de ser concentrada en los
organismos a niveles ms elevados que los niveles medioambientales existentes
(Dallinger et al., 1987; Viana, 2001). Cuanto mayor facilidad tenga una sustancia para
bioacumularse mayor efecto toxico puede producir .En los peces, los mayores niveles
se encuentran en los de mayor talla y ms longevidad. La importancia de la
bioacumulacin en especies marinas, es que muchas de estas son explotadas
comercialmente para consumo humano.

La bioacumulacin depende tambin, de la biodisponibilidad, que es la facilidad


con la que un qumico es absorbido por un organismo vivo. Todas las clulas estn
protegidas por un membrana lipdica, cuando la sustancia es biodisponible entra por
ella, mediante diferentes mecanismos, pasando a formar parte de los tejidos.

En general, los efectos de los metales pesados en los peces son en gran
medida la asfixia por coagulacin de mucus en las branquias, acumulacin de los
mismos en tejidos y lesiones en los dos casos citados (Anadon et al., 1984).

La manera en la que la sustancia txica afecta a la clula se debe en gran


medida a la permeabilidad de la membrana y a la manera en que la sustancia es

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usada por el organismo. El dao gentico puede causar cambios tales como,
disfuncin enzimtica, citotoxicidad, inmunotoxicidad, desajustes metablicos, y
reproductivos, inhibicin del crecimiento, o la carcinognesis (Ohe et al, 2004;
Bolognesi y Hayashi, 2010).

Algunos organismos excretan las sustancias que son incorporadas,


manteniendo los niveles ms o menos constantes independientemente de la
concentracin que haya en el medio. Aquellos que no se excretan, son bioacumulados
en el organismo.

Los efectos de contaminantes a largo plazo pueden causar mutaciones, dao


cromosmico o deficiencias en procesos del organismo, es ah la importancia de su
estudio, ya que un conocimiento ms profundo nos hace establecer ms
correctamente que niveles son ptimos para estar presentes en el medio.

Los peces son excelentes bioindicadores de contaminacin. En peces, donde


se encuentra menos concentracin de contaminantes es en el msculo, siendo mayor
en otros rganos. Responden a los agentes genotxicos de manera similar a los
vertebrados superiores, por lo tanto el resultado de su estudio puede extrapolarse a
estos. Los peces acumulan los metales pesados en sus tejidos, por tanto estos
muestran en efecto pasado y presente de la acumulacin de estos, y a partir de ellos
se puede hacer un estudio sobre los distintos efectos genotxicos. Monitorear su
contaminacin en los tejidos colabora en la evaluacin de los ecosistema acutico
para establecer estrategias en el control de la polucin y saber el riesgo en la vida
humana (Torre, 2013., Ahmad, 2009; Wang et al. 2005).

1.5. LEGISLACIN SOBRE LA CONTAMINACIN EN MEDIOS


ACUTICOS

Segn la directiva de la unin europea, todos los residuos que contengan


metales pesados, se consideran residuos txicos y requieren un tratamiento especial.
El problema reside pues en los focos de vertido y residuos no controlados, que alteran
la cantidad permitida por el Ministerio de medio ambiente en el medio natural. Las
mutaciones son un efecto, dao cromosmico o deficiencias en procesos del
organismo, es ah la importancia de su estudio. Un conocimiento ms profundo nos
hace establecer ms correctamente qu niveles son ptimos para estar presentes en
el medio, y si coinciden con los establecidos actualmente o es necesario modificar los
ya dispuestos en la legislacin vigente. Es necesario, adems, tener un mayor control
de los vertidos ilegales que se suman a los permitidos y afectan en gran medida a los
controles.

En el real decreto 589/1989, del 10 de marzo, se dispone que las comunidades


autnomas son las que deben responder por la calidad de las aguas, y en caso de no
cumplir lo establecido, son las encargadas de elaborar programas de remediacin y
programas de prevencin de dichos vertidos; adems, en dicho decreto se establece
que es necesario evitar el vertido de las sustancias de la lista uno del anexo b, en el
cual se encuentran las sustancias estudiadas en este trabajo. La importancia
fundamental reside en la permanencia de estas sustancias en los seres vivos
(bioacumulacin).

La Ley 9/2010, de 30 de julio, de Aguas para Andaluca, regula la calidad de las aguas
y las condiciones de vertido y recuperacin de las aguas. La Ley estatal ya

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contemplaba un ttulo dedicado a la administracin de las aguas en Andaluca. Este
ttulo separa las principales funciones entre administracin y el ente local en materia
de agua. Dentro de la ley encontramos ciertos artculos en relacin a la contaminacin
de agua:

El artculo 6 referente a objetivos medioambientales, indica que hay que reducir


la contaminacin procedente de vertido, los cuales perjudiquen la calidad de
las aguas.

El artculo 49 referente a planes y programas de inspeccin y control. indica


que la consejera o sus entidades instrumentales establecer un sistema de
inspeccin de vertido que establecer una frecuencia basada en las
existencias de ncleos urbanos, vertidos altamente contaminantes o por
volmenes excesivamente grandes.

1.6. LA CONTAMINACIN ACUTICA EN LA COSTA ANDALUZA

La contaminacin costera est aumentando debido a las descargas terrestres,


fruto de las actividades industriales. Los principales vertidos en las costas andaluzas
provienen de los ros Tinto, Odiel y Guadalquivir

La muerte de los organismos acuticos es un sntoma de que hay graves


inconvenientes en el medio acutico y si la muerte se produce por metales pesados,
puede afectar a la salud humana, (Muoz, 1994), por todo esto es importante y
justificado el gran nmero de estudios sobre dicho problema, (Johnson, 1987; Ajmal,
1988; Gonzlez ,1989 y Brugman, 1991).

Segn Marijun, D. L. (2010), en el litoral andaluz diferenciamos 5 puntos de


vertidos principalmente:

Litoral de Huelva.: La contaminacin proviene de los ros Tinto y Odiel, unindose


adems a las aguas residuales de las poblaciones costeras y a las del Polo Qumico.

Litoral atlntico de Cdiz: Los ros Guadalquivir, Guadalete y Barbate constituyen


potentes focos de contaminacin del litoral. Adems hay ciertos municipios que no
tienen sistemas adecuados de depuracin de agua como son Chipiona y Tarifa

Baha de Cdiz.: los efluentes de la construccin naval y los efluentes urbanos de las
zonas de costa.

Baha de Algeciras: este trmino municipal no tiene ningn sistema de depuracin, y


en los ltimos aos ha implantado una extensa red de industria petroqumica,
centrales trmicas, y las industrias de papel y acero, las cuales aumentas estos focos
de contaminacin.

Litoral mediterrneo: en esta parte de la costa andaluza los vertidos principales se


deben a las grandes zonas costeras, como la costa del sol; y a los vertidos agrcolas
que encontramos en Granada y Almera.

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1.7. IMPORTANCIA DEL METODO DE MICRONUCLEOS

El ensayo de microncleo (MN) y el ensayo cometa han demostrado ser muy tiles en
la monitorizacin de la toxicidad (Russo et al., 2004, Ahmed et al, 2011a, Barbosa et al,
2010, Monteiro et al., 2011, Cavas 2011).

La prueba de MN se considera como la tcnica ms adecuada para evaluar los efectos


genotxicos de una amplia gama de compuestos en peces (Al-Sabti y Metcalfe 1995,
Sanchz-Galn et al., 1999, Rodriguez-Cea et al., 2003, Bolognesi Et al., 2006, Udroiu
2006, Koca et al., 2008, Ahmed et al., 2011a, Bolognesi y Hayashi 2011, Carrola et al.,
2014). Los microncleos (MNi) son pequeas masas de cromatina citoplasmtica
separadas del ncleo de la clula principal por lo tanto son un ndice de ruptura
cromosmica o disfunciones del huso mittico (Schmid 1975) , es decir , van en
desfase de velocidad , y no migran a la clula hija. Por lo tanto, la evaluacin de MNi
permite abordar potenciales clastognicos y aneugnicos de agentes ambientales.

La prueba MN puede realizarse en cualquier tejido activo proliferante. Se han utilizado


principalmente clulas sanguneas, las branquias, el hgado, los riones y las aletas (Al-
Sabti y Metcalfe 1995, Cavas et al, 2005, Udroiu 2006, Cava 2008, Ahmed et al,
2011b). Sin embargo, los eritrocitos perifricos son las clulas ms comnmente
empleadas en el test de MN porque evita la compleja disociacin celular requerida en
otros tejidos, lo que puede conducir a estrs mecnico y dao celular, as como a la
muerte de los animales (Bolognesi et al. 2006, Cava 2008).

14/73
2. OBJETIVOS
El Objetivo principal de este trabajo es evaluar el efecto genotxico temprano
de tres metales pesados, cobre, arsnico y plomo, en dorada, (Sparus aurata,
Linnaeus, 1758), en condiciones controladas de laboratorio, como modelo de
biomonitorizacin ambiental.

Para ello, se establecen los siguientes objetivos especficos:

- Cuantificar la induccin de microncleos en eritrocitos perifricos tras la


exposicin de los peces durante dos perodos diferentes, 24 y 96 horas, a
concentraciones crecientes de estos metales.

- Establecer la idoneidad de la dorada y del ensayo de microncleos como


modelo de biomonitorizacin ambiental de efectos genotxicos en ecosistemas
acuticos.

15/73
3. MATERIAL Y METODOS
3.1. INDIVIDUOS UTILIZADOS

Los especmenes de Sparus aurata (Linnaeus, 1758) utilizadas en este estudio


provienen de las instalaciones del laboratorio de cultivos marinos y de acuicultura de la
Universidad de Cdiz (situadas en la Facultad de Ciencias Ambientales de dicha
Universidad). Los especmenes tuvieron un rango de peso 38,90 y 54,92 g, y un
intervalo de longitud de los 13,75 y 15,62 cm de talla estndar (vase en resultados y
en las tablas del Anexo I).

Los peces no estaban enfermos y no tenan antecedentes de exposicin a


sustancias qumicas.

3.2. ACONDICIONAMIENTO TANQUES

Antes de los experimentos, los peces estaban en grandes acuarios que


contenan agua marina en condiciones de laboratorio con agua saturada a 25C y
12/12 ciclo de oscuridad / luz durante 1 semana. No se produjo mortalidad durante el
perodo de aclimatacin.

Posteriormente, se agruparon aleatoriamente en cinco grupos (n = 12 / grupo)


en tanques de 30 L y expuestos bajo laboratorio a 0 (control), 0,01, 0,1, 1 y 10 mg / L,
concentraciones nominales de soluciones de metales pesados preparadas disolviendo
Pb (CH3COOH)2, As2O3, y polvo de Cu (como CuSO4), adquirido de Sigma-Aldrich,
EE.UU., durante 24 y 96 h. Las concentraciones tomadas para el experimento se
seleccionaron segn referencias sobre su efecto genotxico, bioensayos con los
metales txicos, y estudiando concentraciones de lugares ya contaminados. Los
peces no fueron alimentados durante el perodo experimental.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron en conformidad con la


Directiva 2010/63 / UE.

Figura 3.1: Tanques para bioensayos de doradas con metales pesados.

16/73
3.3. PREPARACIN DE LOS ENSAYOS

Para la realizacin de los test de toxicidad se utilizaron peces en estado juvenil,


los cuales fueron sometidos a diferentes concentraciones de Cu, Pb y As durante 24 y
96 horas.

Para cada experimento los peces fueron depositados en tanques, de 30 litros


de agua marina. Al principio del experimento fueron sometidos a un periodo de
aclimatacin, durante 24 horas, en los que no se les suministro alimento. Los anlisis
con los diferentes metales se realizaron por duplicado. Antes de comenzar con la
administracin de las concentraciones, se tom muestras de control equivalentes a 0
mg/L de concentracin.

El mantenimiento y cuidado de los animales se realiz de acuerdo a la directiva


CEE 86/609, correspondiente a la gua de uso y cuidado de animales de laboratorio.

Previamente a la realizacin del experimento, y como se indic en el apartado


3.1., se comprob que los individuos estaban libres de enfermedad o estrs aparente,
lo cual podra afectar a los resultados obtenidos en este estudio.

Figura 3.2: Tanques para bioensayos con doradas (Sparus aurata, L.)

17/73
3.3.1. Test de toxicidad con cobre en dorada

Para la realizacin de este experimento fueron utilizados 10 tanques. Ya que el


anlisis se realiza por duplicado. Las dos series de 5 tanques tenan concentraciones
crecientes siendo 0 (control), el primero, y 10 mg/L el ultimo. Estos tanques tenan una
capacidad de 30 litros, y utilizando polvo de cobre, tal como se indica anteriormente.

Muestras en 24 H

Tanque Tanque 1 Tanque 2 Tanque 3 Tanque 4 Tanque 5


mg/l de Cu 0 0,01 0,1 1 10
Tanque Tanque 6 Tanque 7 Tanque 8 Tanque 9 Tanque 10
mg/l de Cu 0 0,01 0,1 1 10

Tabla 3.1.: Concentraciones de cobre en los distintos tanques para 24 h

Muestras en 96 H

Tanque Tanque 11 Tanque 12 Tanque 13 Tanque 14 Tanque 15


mg/l de Cu 0 0,01 0,1 1 10
Tanque Tanque 16 Tanque 17 Tanque 18 Tanque 19 Tanque 20
mg/l de Cu 0 0,01 0,1 1 10

Tabla 3.2.: Concentraciones de cobre en los distintos tanques para 96 h

Se tom una muestra a 0 previa a depositar los individuos en los tanques, y


una muestra de los tanques 1 a las 10 (24 horas) y del 11 a las 20 (96 horas).

3.3.2. Test de toxicidad con arsnico en dorada

Para la realizacin de este experimento fueron utilizados 10 tanques. Ya que el


anlisis se realiza por duplicado. Las dos series de 5 tanques tenan concentraciones
crecientes siendo 0 (control), el primero, y 10 mg/L el ultimo. Estos tanques tenan una
capacidad de 30 litros, y utilizando trixido de arsnico (As2O3), tal como se indica
anteriormente.

Muestras en 24 H

Tanque Tanque 1 Tanque 2 Tanque 3 Tanque 4 Tanque 5


mg/l de As 0 0,01 0,1 1 10
Tanque Tanque 6 Tanque 7 Tanque 8 Tanque 9 Tanque 10
mg/l de As 0 0,01 0,1 1 10

Tabla 3.3.: Concentraciones de arsnico en los distintos tanques para 24 h

18/73
Muestras en 96 H :

Tanque Tanque 11 Tanque 12 Tanque 13 Tanque 14 Tanque 15


mg/l de As 0 0,01 0,1 1 10
Tanque Tanque 16 Tanque 17 Tanque 18 Tanque 19 Tanque 20
mg/l de As 0 0,01 0,1 1 10

Tabla 3.4: Concentraciones de arsnico en los distintos tanques para 96 h.

Se tom una muestra a 0 previa a depositar los individuos en los tanques, y


una muestra de los tanques 1 a las 10 (24 horas) y del 11 a las 20 (96 horas).

3.3.3. Test de toxicidad con plomo en dorada

Para la realizacin de este experimento fueron utilizados 10 tanques. Ya que el


anlisis se realiza por duplicado. Las dos series de 5 tanques tenan concentraciones
crecientes siendo 0 (control), el primero, y 10 mg/L el ultimo. Estos tanques tenan una
capacidad de 30 litros, y utilizando trixido de Pb (CH3COOH)2, tal como se indica
anteriormente.

Muestras en 24 H:

Tanque Tanque 1 Tanque 2 Tanque 3 Tanque 4 Tanque 5


mg/l de Pb 0 0,01 0,1 1 10
Tanque Tanque 6 Tanque 7 Tanque 8 Tanque 9 Tanque 10
mg/l de Pb 0 0,01 0,1 1 10

Tabla 3.5.: Concentraciones de plomo en los distintos tanques para 24 h

Muestras en 96 H:

Tanque Tanque 11 Tanque 12 Tanque 13 Tanque 14 Tanque 15


mg/l de Pb 0 0,01 0,1 1 10
Tanque Tanque 16 Tanque 17 Tanque 18 Tanque 19 Tanque 20
mg/l de Pb 0 0,01 0,1 1 10

Tabla 3.6.: Concentraciones de plomo en los distintos tanques para 96 h.

3.4. TOMA DE MUESTRAS DE AGUA

Una vez preparados los tanques de los test de toxicidad, se realizaron la toma
de muestras de agua, para determinar in-situ los siguientes parmetros fsico-
qumicos: pH, temperatura, salinidad, conductividad, total de slidos disueltos y
oxgeno disuelto mediante el empleo de una sonda multiparamtrica (HI 9828, Hanna
Instruments).

19/73
Los anlisis fsico-qumicos se realizaron a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas, para
tener un seguimiento lo ms exhaustivo posible de las condiciones del agua empleada
en los distintos ensayos de genotoxicidad con los distintos metales.

Figura 3.3: Tcnica de limpieza para la toma de muestra de aguas.

3.5. TOMA DE MUESTRAS DE SANGRE.

Tras el periodo de experimentacin, los peces se anestesiaron con 2-


fenoxietanol al 2%, se tomaron medidas y decapitaron. Inmediatamente tras la
defuncin, se tomaron muestras sanguneas de la vena caudal, las cuales sern
usadas en el anlisis de genotoxicidad mediante el mtodo de microncleos.

3.6. PREPARACIN DE MUESTRAS Y TINCIN CELULAR DE LOS


NCLEOS DE LOS ERITROCITOS.

El objetivo de esta tincin es diferenciar los distintos componentes celulares de


nuestra muestra, en el caso que nos atae diferenciar dentro del ncleo celular los
pequeos microncleos, los cuales son fragmentos cromosmicos de forma ovoide,
con un tamao de un cuarto del ncleo.

A partir de las diferentes muestras de sangre, obtenemos una gota la cual a


partir de la tcnica de frotis la extenderemos por nuestro porta. Fijamos con metanol
durante 3 minutos con el fin de fijar y deshidratar nuestra muestra. Paralelamente en
un tubo de ensayo se prepar la tincin mezclando Giemsa con la solucin tampn, a
continuacin se cubre con ella y se espera durante 25 min.

Transcurrido el tiempo, es necesario quitar el exceso de tinte con agua, para


terminar aplicando de nuevo la solucin tampn. Finalmente se deja escurrir en
posicin vertical hasta que se seque y se deposita encima un portaobjetos.

3.7. MTODO DE RECUENTO DE MICRONCLEOS

Los microncleos son pequeos fragmentos de cromatina separados de la


clula principal durante la mitosis, debido a que van en desfase de velocidad y no
migran a la clula hija. Su forma es ovoide o circular, de color igual al ncleo y tamao
aproximadamente de un cuarto con respecto al ncleo.

20/73
La presencia de microncleos indica efecto genotxico del metal sobre el
organismo. Es por tanto el mtodo de los microncleos el ms til en la evaluacin de
toxicidad en sistemas, determinando a partir de ellos el dao cromosmico.

El efecto genotxico en este estudio se determin por la presencia de


microncleos, los cuales se producen en la clula en el proceso de mitosis, donde se
duplica el material gentico de una clula, para migrar este a la clula hija; se
producen en la transicin de metafaseanafase y pueden ser cromosomas completos
rezagados por dao al uso mittico (efecto aneuploidgeno), o bien fragmentos de
cromosomas sin centrmero (dao clastognico).

Slo las clulas claramente aisladas del entorno fueron consideradas. Los
criterios para la identificacin de microncleos fueron los siguientes: (a) los
microncleos debe ser menores que un tercio de los ncleos principales, (b) Los
microncleos deben estar claramente separados de los ncleos principales, y (c) los
microncleos deben estar en el mismo plano de foco y tienen el mismo color. Para
evitar el sesgo, las preparaciones de cada tratamiento fueron codificadas y la
evaluacin realizada de forma ciega por parte de la persona investigadora.

La frecuencia de los microncleos se evalu en cada preparacin (porta) bajo


un Microscopio Nikon Eclipse 400 (Tokio, Japn) y se expres como el nmero de
microncleos contabilizados por cada 1000 eritrocitos. El recuetno ciego de los
microncleos se realiz en preparaciones aleatorias y codificadas para evitar cualquier
variacin tcnica.

21/73
4. RESULTADOS
4.1. CARACTERIZACIN MORFOLGICA EN LOS ENSAYOS CON
JUVENILES DE DORADA.

4.1.1. Datos de peces en los test con Cu (juveniles de dorada).

En las Tabla 3.1 y 3.2, que se muestran en el Anexo I, se presentan los valores
medios de las tallas totales, tallas estndar y pesos de los juveniles de dorada
utilizados en los experimentos de toxicidad del cobre, distribuidos en los distintos
grupos experimentales de 24 horas y 96 horas, utilizados en el test para analizar los
efectos del cobre.

4.1.2. Datos de peces en los test con As (juveniles de dorada).

En las Tabla 3.3 y 3.4, que se muestran en el Anexo I, se presentan los valores
medios de las tallas totales, tallas estndar y pesos de los juveniles de dorada
utilizados en los experimentos de toxicidad del arsnico, distribuidos en los distintos
grupos experimentales de 24 horas y 96 horas, utilizados en el test para analizar los
efectos del arsnico.

4.1.3. Datos de peces en los test con Pb (juveniles de dorada).

En las Tabla 3.5 y 3.6, que se muestran en el Anexo I, se presentan los valores
medios de las tallas totales, tallas estndar y pesos de los juveniles de dorada
utilizados en los experimentos de toxicidad del plomo, distribuidos en los distintos
grupos experimentales de 24 horas y 96 horas, utilizados en el test para analizar los
efectos del plomo.

En total, los peces utilizados en los 3 experimentos independientes de toxicidad


de metales (cobre, arsnico y plomo) mostraron unas tallas totales medias que
oscilaron entre los 13,75 y 15,62 cm, una talla estndar media que estuvo entre los
11,42 y 13,27 cm y un peso medio entre los 38,90 y 54,92 g.

4.2. ANLISIS DE PARMETROS FSICO-QUMICOS DEL AGUA


EMPLEADA EN LOS TEST DE GENOTOXICIDAD.

Los valores obtenidos de las medidas de los parmetros realizados in situ se


registraron para todos los tanques y para cada da de estudio. As pues, se estudi la
evolucin de la temperatura, pH, salinidad, total de slidos disueltos (STD),
conductividad y oxgeno disuelto del agua que contena los peces.

As, en las Tablas 3.7., 3.8., 3.9., 3.10., y 3.11., que se muestran en el Anexo II
se recogen todos los valores obtenidos de cada parmetro fsico-qumico para la
experiencia realizada con doradas sumergidas en tanques que contenan aguas con
Cu. De forma general, en el test de Cu, la temperatura vara entre 15,7 y 18,6C; el pH
se mantiene entre los rangos de 7,5 y 9,5; el oxgeno disuelto vara entre 4,9 y 8,8
ppm; la conductividad, entre 49,5 y 53,0 mScm-1; el total de slidos disueltos, entre
26,9 y 31,4 ppt; y la salinidad entre 38,5 y 53,4 gL-1.
22/73
En las Tablas 3.12., 3.13., 3.14., 3.15., y 3.16., de ese mismo Anexo II se
encuentran los datos para el estudio de As. Hay que destacar que todos los
parmetros entran dentro de los mrgenes considerados adecuados para la
supervivencia de las especies en estudio y no varan significativamente dentro del
tiempo de estudio. Con respecto al test de As, los valores de temperatura varan entre
16,6 y 18,4C, el pH oscila entre 7,6 y 10,4; el oxgeno disuelto est comprendido
entre 6,9 y 9,8 ppm; la conductividad, entre 51,0 y 53,7 mScm-1; el total de slidos
disueltos, entre 29,5 y 38,9 ppt; y la salinidad, entre 32,7 y 42,3 gL-1.

Finalmente, en las Tablas 3.17, 3.18., 3.19, 3.20., y 3.21, del Anexo II se
recogen los valores fsico-qumicos para el estudio de Pb. En el test de Pb para
juveniles de dorada, la temperatura oscila entre 14,9 y 18,6C; el pH est comprendido
entre los valores de 7,3 y 9,7; el oxgeno disuelto vara entre 5,8 y 9,5 ppm; la
conductividad, entre 49,7 y 53,5 mScm-1; el total de slidos disueltos, entre 29,6 y
40,0 ppt; y la salinidad, entre 39,6 y 44,0 gL-1

Hay que destacar que en el test de Cu, las especies en los tanques 15 y 20
murieron a las 72 horas.

4.3. ANLISIS DE GENOTOXICIDAD POR EFECTO DE METALES


PESADOS (TEST DE MICRONCLEOS).

Con los resultados obtenidos se han dispuesto grficas (presentadas en este


apartado) y en tablas (presentadas en el Anexo III), relacionando las diferentes
concentraciones de los metales estudiados con la cantidad de microncleos hallados
en aproximadamente 1000 eritrocitos por tratamiento analizado de cada individuo
(pez). Ello significa que para cada concentracin de metal estudiada y para cada
periodo de tiempo se han analizado del orden de 12.000 eritrocitos en la bsqueda de
efectos genotxicos, es decir, de la aparicin de microncleos que indica rotura de
ADN.

La frecuencia de microncleos en los eritrocitos perifricos de los peces expuestos


a los tratamientos experimentales se muestran en la/s figura/s 3.2 a 3.6 de este
apartado y en las tabla/s 3.22 a 3.30, que contiene el Anexo III.

Los datos de microncleos observados por efecto del cobre se exponen en la


Tabla 3.22 (24 horas de tratamiento), en la Tabla 3.23 (96 horas de tratamiento),
Tabla 3.24 (cuadro comparativo del efecto del tiempo de tratamiento) y en las Figuras
3.2. (24 y 96 horas de tratamiento), 3.5 y 3.6.

Los datos correspondientes a los microncleos observados por efecto del arsnico
se presentan en la Tabla 3.25 (24 horas de tratamiento), en la Tabla 3.26 (96 horas de
tratamiento), Tabla 3.27 (cuadro comparativo del efecto del tiempo de tratamiento) y
en las Figuras 3.3 (24 y 96 horas de tratamiento), 3.5 y 3.6.

Asimismo, los datos de microncleos observados por efecto del plomo se


presentan en la Tabla 3.28 (24 horas de tratamiento), en la 3.29 (96 horas de
tratamiento), Tabla 3.30 (cuadro comparativo del efecto del tiempo de tratamiento) y
en las Figuras 3.4 (24 y 96 horas de tratamiento), 3.5 y 3.6.

23/73
a) Ejemplos de microncleos presentes en eritrocitos perifricos de Sparus aurata L.,
producidos por el efecto genotxico de metales (cobre, arsnico o plomo).

Figura 4.1. Imgenes de microncleos en eritrocitos perifricos (vanse en el centro de


las fotomicrografas), con ampliacin de detalles en la esquina inferior derecha. En este
caso se trata de eritrocitos de juveniles de doradas tratadas con distintos metales, con
cobre (fotomicrografa derecha) y con plomo (fotomicrografa izquierda).

4.3.1. Efectos genotxicos del Cobre.

Las frecuencias de microncleos inducidas por el tratamiento con cobre se


representan en la Figura 3.2. Como se puede observar en la dicha figura, se registr
una tendencia hacia un aumento dependiente de la concentracin de metal en las
frecuencias de microncleos a las 24 horas.

Las dosis de 1 y 10 mg/L indujeron un aumento significativo en la frecuencia de


microncleos. Tambin se observ una tendencia a mayores frecuencias de
microncleos con menores concentraciones de cobre, pero no alcanzaron significacin
estadstica. En la figura 3.2 y la tabla 3.22, tambin se puede observar que con las
concentraciones ms bajas, no se produce un crecimiento significativo de
microncleos.

a
b

Figura 4.2: Efecto genotxico (frecuencia de microncleos)


inducido por cobre en eritrocitos perifricos de dorada (Sparus
24/73
aurata, L.) despus de 24 y 96 horas de exposicin. Los datos se
representan como media SEM. Las diferencias significativas
encontradas son las siguientes: a, p<0,05 vs. Control y 0,01 mg/L
de cobre a las 24 h; b, p<0,05 vs. Control, 0,01 y 0,1 mg/L de
cobre a las 96 h.

Despus de la exposicin de 96 h de cobre (Fig. 3.3), las cuatro dosis no


letales aumentaron significativamente las frecuencias de microncleos. La dosis
mxima no letal de 96 h fue 1 mg/L y caus un aumento de 4,5 veces la frecuencia de
microncleos en comparacin con el control.

No se observ diferencia entre las frecuencias de microncleos a las 24 y 96 h


de exposicin para la dosis de 1 mg/L. (Fig. 3.3)

Las tablas 3.22 y 3.23 del Anexo III muestran la cantidad de microncleos
encontrados en el anlisis de los eritrocitos bajo el efecto de distintas concentraciones
de cobre y para los dos tiempos de exposicin, respectivamente. En la ltima columna
de dichas tablas encontramos los datos normalizados para 1000 clulas analizadas.
Los datos que presentan asteriscos indican que los peces de dichos tanques han
fallecido.

En la tabla 3.24 del Anexo III, se compara el anlisis de microncleos en


ambos tiempo de exposicin al cobre. En los peces tratados con Cu se registr una
mortalidad completa para la dosis nominal de 10 mg /L despus de 96 h.

Se puede observar, por tanto, como la duracin del tratamiento afecta a la


genotoxicidad, siendo superior a mayores tiempos de exposicin. Debido a que los
peces murieron con la dosis ms alta tras 96 h. de exposicin, no se puede conocer la
incidencia que dicha dosis pudiera tener sobre la frecuencia de los microncleos, pero
se puede suponer que podras habar sido ms alta que con las dosis inferiores.

Por tanto el efecto txico se produce a altas concentraciones de metal (1 y 10


mg/L), produciendo efecto letal en los peces en 96 horas, y un incremento significativo
de microncleos en 24 horas (Fig. 3.2)

4.3.2. Efectos genotxicos del Arsnico.

La exposicin a concentraciones crecientes de arsnico dio como resultado un


aumento dependiente de la dosis en las frecuencias de microncleos despus de las
24 h (figura 3.3), que se evidenci desde la dosis de As inferior (0,01 mg/L), aunque
solo la frecuencia de microncleos con la dosis mxima (10 mg/L) es
significativamente distinta del resto, e indujo un aumento de 2,45 veces en dicha
frecuencia respecto a su control. No obstante, los datos de arsnico analizados en 24
h, (figura 3.3 y tabla 3.25), establecen una correlacin entre el aumento de
concentracin, y la cantidad de microncleos encontrados.

25/73
b

Figura 4.3. Efecto genotxico (frecuencia de microncleos) inducido por


arsnico en eritrocitos perifricos de dorada (Sparus aurata, L.) despus
de 24 y 96 horas de exposicin. Los datos se representan como media
SEM. Las diferencias significativas encontradas son las siguientes: a,
p<0,05 vs. control, 0,01, 0,1 y 1 mg/L de arsnico a las 24 h; b, p<0,05
vs. control, 0,01, 0,1 y 1 mg/L de arsnico a las 96 h.

En el caso de 96 h., con la dosis mxima de 10 mg/L se indujo un aumento de


4,35 veces en la frecuencia de microncleos. Sin embargo, para las dosis anteriores
no se detectaron diferencias significativas entre ellas. A las 96 h., la frecuencia de
microncleos aumenta levemente en las dosis bajas, siendo los datos en 0.01 y 0.1
mg/ prcticamente iguales.

En la tabla comparativa 3.27 del Anexo II, se observa cmo se produce un


descenso en la frecuencia de microncleos con la dosis de 1 mg/L, para finalizar con
un aumento muy significativo en dicha frecuencia a la dosis ms alta (10 mg/L de
arsnico), donde la cantidad de microncleos encontrados es muy alta, y triplica al
nmero de microncleos encontrados en las dosis ms bajas.

Al igual que en el cobre, con el arsnico tambin se observa que el dao


genotxico es mucho mayor en 96 h., cuyo valor en frecuencia de microncleos con 10
mg/L triplica el valor de microncleos hallados a las 24 h (tabla 3.27). Es, por tanto, el
tiempo de exposicin al metal un factor a tener en cuenta.

4.3.3. Efectos genotxicos del Plomo.

En cuanto a los experimentos de exposicin a Pb, no se indujo muerte en


ninguno de los periodos de tiempo estudiados. En la figura 3.4, se observa que en 24
26/73
horas los valores no son altos, pero con una cierta tendencia en el aumento de las
frecuencias de microncleos a partir de la dosis 0,1 mg/L, tendencia que luego se
mantuvo estable hasta la dosis ms alta (10 mg/L), y que fueron significativas respecto
a su control. La dosis mxima de Pb produjo un aumento de 2,66 veces en la
frecuencia de microncleos despus de 24 h de exposicin, respecto al control.

a a a b

Figura 4.4. Efecto genotxico (frecuencia de microncleos) inducido por


plomo en eritrocitos perifricos de dorada (Sparus aurata, L.) despus
de 24 y 96 horas de exposicin. Los datos se representan como media
SEM. Las diferencias significativas encontradas son las siguientes: a,
p<0,05 vs. Control de plomo a las 24 h; b, p<0,05 vs. 0,1 y 1 mg/L de
plomo a los 96 h.

Sin embargo, tras 96 h de tratamiento, las frecuencias de microncleos no


fueron significativamente diferentes respectos a los controles, ni entre las distintas
dosis utilizadas. Adems, comparando la misma dosis, no se observ diferencia
significativa en dichas frecuencias entre las 24 y 96 horas.

Segn la Figura 3.4 y la tabla 3.28 del Anexo III, con una exposicin de 96 h. la
frecuencia de microncleos se mantiene baja y estable en el control y la concentracin
de 0.01 mg/l, para experimentar un descenso en las dos concentraciones siguientes
0.1 y 1 mg/L. En la concentracin ms alta de 10mg/L se produce el leve incremento,
pero significativo, encontrndose el mayor nmero de microncleos.

De los tres metales estudiados, el plomo es el que menos efecto genotxico


produce en nuestra especie, ya que sus valores son ms bajos. A diferencia tambin
se puede observar que el dao es mayor en 24 horas y no en 96 h como en los
anteriores.

4.3.4. Anlisis comparativo del efecto genotxico de los tres metales.

27/73
Para comparar el potencial de los tres metales pesados para inducir la
aparicin de microncleos, las frecuencias medias microncleos se representaron
frente a las concentraciones reales de metales en el agua (Fig. 3.5 para 24 horas y
Fig. 3.6 para 96 h.).

En las concentraciones bajas, todos los metales mostraron una capacidad


similar para inducir microncleos despus de las 24 h de exposicin, a
concentraciones altas el Cu pareca inducir mayores niveles de microncleos que As y
Pb, que mostraron potenciales similares (Figura 3.5). Sin embargo, despus de la
exposicin Cu durante 96 h., este metal continu siendo un inductor ms potente de
microncleos que los otros dos metales (al menos en el rango de concentraciones
subletales), y el As sobre la capacidad de Pb en todo el rango de concentraciones de
metal evaluadas (Fig. 3.6).

Figura 4.5: Comparacin de los efectos genotxicos (frecuencia de


microncleos) inducidos en dorada (Sparus aurata, L.), por cobre,
arsnico y plomo, a las 24 horas de exposicin. Los datos se
representan como media. Las diferencias significativas encontradas son
las siguientes: a, p<0,05 vs. 10 mg/L de arsnico y plomo.

Estudiando el efecto toxico de los tres metales, en 24 horas (figura 3.5),


podemos determinar que el cobre produce un incremento de la frecuencia de
microncleos mucho ms elevada que el resto de metales, seguido del arsnico, y
siendo el plomo el que menos dao produce. Los valores de cobre son los mayores y
presentan muchas diferencias con los otros metales, en cambio el arsnico y el plomo
presentan valores muy similares con respecto a la concentracin de microncleos.

28/73
a

Figura 4.6. Comparacin de los efectos genotxicos (frecuencia de


microncleos) inducidos en dorada (Sparus aurata, L.) por cobre, arsnico y
plomo, a las 96 horas de exposicin. Los datos se representan como media. Las
diferencias significativas encontradas son las siguientes: a, p<0,05 vs. 10 mg/L
de plomo. En el caso del cobre (10 mg/L), todos los individuos murieron.

Sin embargo, analizando los valores de manera conjunta en 96 horas, (Figura


3.6), es en el arsnico en el que se observa un pico elevado en las frecuencias de
microncleos a la concentracin ms alta (10mg/L). Dicha frecuencia es 5 veces
mayor a la inducida por el plomo, con el cual era muy similar en 24 horas. Aun as el
que mayor efecto txico produce es el cobre pues es el que provoca la muerte de los
peces con la mayor concentracin. Destaca que el arsnico aun presentando mayores
valores de microncleos no produce la muerte de los peces y en el cobre con valores
menores, s.

4.4. ESTADSTICA.

Los datos se presentan como la media el error estndar de la media (SEM)


de microncleos/1000 clulas analizadas de cada pez para cada situacin
experimental (metal, concentracin y tiempo de exposicin). Todos los experimentos
fueron realizados con 6 peces por tanque de tratamiento y por duplicado, por lo que
finalmente n=12 datos para cada metal, concentracin y tiempo de exposicin.

Para la comparacin de medias entre los grupos de tratamientos


(concentracin y tiempo de exposicin) dentro de un mismo metal se utiliz un anlisis
de varianza no paramtrico, de Kruskal-Wallis, seguido del test post hoc de Dunn.
Para ello, se utiliz el paquete estadstico SPSS 20. Todas las diferencias
significativas se consideraron a un nivel de p < 0,05.

29/73
5. DISCUSIN

En el presente estudio se determin la capacidad de inducir la formacin de


microncleos en la dorada europea (Sparus aurata, L., 1758), para evaluar los efectos
genotxicos tempranos de tres metales prioritarios de Salud Pblica como son el
cobre, arsnico y plomo. Los resultados mostraron que todos estos tres metales
pesados transportados por el agua tenan el potencial de aumentar, algunos
dramticamente, la frecuencia de microncleos en eritrocitos despus de 24 y/o 96 h
de exposicin.

Sparus aurata, es una especie autctona eurihalina que habita desde las Islas
Britnicas hasta Cabo Verde y por todo el Mediterrneo, e incluso el Mar menor.
Adems, es uno de los pescados comerciales ms importantes cultivados desde el
Atlntico a la regin mediterrnea, con el consecuente alto consumo humano
(Fernandes et al., 2009). Adems, tienen un gran inters para este tipo de estudios por
tener un elevado valor comercial, ser muy til como modelo para investigacin bsica
y en el caso de la dorada, por tener un notable inters filogentico, lo que representa
un valor aadido para profundizar en el estudio de sus caractersticas biolgicas y en
el efecto de la contaminacin metlica.
En nuestro estudio, la exposicin a los metales se llev a cabo a travs del
agua del tanque porque imita mejor la exposicin natural de los metales usualmente
disueltos o suspendidos en el agua (Rodriguez-Cea et al., 2003). Debido a que
estbamos interesados en dilucidar un biomarcador de respuesta temprana de la
genotoxicidad, y que las exposiciones a largo plazo pueden dar lugar a respuestas
adaptativas en los peces (Cavas et al., 2005, Ahmed et al., 2011a), se seleccion un
perodo experimental de 24 y 96 horas. Adems se prefiri estos modelos de plazo
corto y de cultivo esttico teniendo en cuenta que pueden evitar cualquier alteracin en
las condiciones experimentales que puedan dar lugar a estrs en los peces. Tambin,
se evalu una amplia gama de concentraciones de metales.

Recientemente, la investigacin se est centrando en los efectos genotxicos


en animales acuticos de campo y en ensayos con sedimentos utilizando peces
(Costa et al, 2008). Se han publicado varios estudios de este tipo sobre Cu, Pb o As
en ambientes marinos (Edwards et al, 2001, Ergene et al, 2007, Costa et al, 2008,
Della Torre et al, 2013, Martnez Gmez et al, 2012). Aunque estos estudios son muy
tiles para monitorear los efectos biolgicos adversos que ocurren en reas
especficas que sufren de mezclas complejas de contaminantes, a menudo es muy
difcil determinar el efecto especfico de un xenobitico en particular. Por el contrario,
una ventaja importante de los estudios de laboratorio es que el efecto de un metal
nico puede ser aislado y relacionado con exactitud a las concentraciones de
exposicin definidas.

Todos los parmetros fsico-qumicos del agua donde se han cultivado los
peces estudiados entran dentro de los mrgenes considerados adecuados para la
supervivencia de las especies en estudio y no varan significativamente dentro del
tiempo de estudio. Por tanto, se puede descartar que los efectos genotxicos que se
observan en este estudio se deban a otros parmetros que no sean los metales
analizados.

En total, los peces utilizados en los distintos experimentos independientes de


toxicidad de metales (cobre, plomo y arsnico) mostraron unas tallas totales medias
que oscilaron entre los 13,75 y 15,62 cm, una talla estndar media que estuvo entre
los 11,42 y 13,27 cm y un peso medio entre los 38,90 y 54,92 g. Estas tallas y pesos

30/73
quedan dentro de lo que se considera normal y adecuado para los individuos juveniles
de esta especie, Sparus aurata.

Las frecuencias de microncleos observadas en los controles de todos los


experimentos, alrededor de 0.002-0.003, son muy semejantes, y quedan dentro del
rango encontrado en otros estudios con peces (Cavas, 2011). De esta manera, se
valida la metodologa de evaluacin utilizada.

5.1. SOBRE EL COBRE

El cobre funciona como cofactor en un gran nmero de enzimas, pero cuando


su concentracin supera los valores ptimos tiene un efecto toxico en el organismo.
Segn Pedradas (2007), una exposicin al cobre a corto plazo incrementa sus efectos
txicos como, por ejemplo, la peroxidacin lipdica en el hgado de la dorada. Y
estudios de Gioda et al. (2007), demostraron que esta peroxidacin depende del
rgano estudiado, lo cual abri la oportunidad al estudio del efecto toxico concreto de
este metal en cada rgano.

En nuestro estudio, la exposicin de los peces a Cu caus una mortalidad total


en los grupos tratados con una dosis nominal de 10 mg / L despus de 96 h. Esto
demuestra el alto potencial de toxicidad de Cu para S. aurata incluso a corto plazo.
Asimismo, las dosis de 1 y 10 mg/L de cobre indujeron un aumento significativo en la
frecuencia de microncleos a las 24 horas. Sin embargo, tras 96 h. de exposicin, ya
la dosis de 1 mg/L fue la que caus un aumento de 4,5 veces en comparacin con el
control.

Estos efectos genotxicos se han observado previamente en otras especies de


peces. En Solea senegalensis (lenguado) expuesta a 1 mg/L de cobre mostr una
mortalidad corregida de 26,6% a las 24 h, y 100% a 96 h de exposicin (Oliva et al
2009, Torres et al., 1987), mientras que en Scyliorhimus cancula, 4 mg/L de cobre
produjo un 50% de mortalidad a las 48 h de exposicin; y por otra parte, tambin se
observ que la exposicin a las concentraciones subletales de Cu dio lugar a una
espectacular elevacin de la frecuencia de microncleos.

El potencial de Cu para inducir microncleos en eritrocitos de peces haba sido


abordado previamente, pero los resultados no haban sido realmente consistentes.
Zhu et al. (2004) no pudieron encontrar ningn efecto significativo del cobre entre 0,01
y 1 mg/L despus de 48 o 96 h de exposicin en la carpa (Cyprinus carpio); Por el
contrario, las mismas concentraciones de Cr y Cd aumentaron la frecuencia de
microncleos dependiente de la dosis. Del mismo modo, Sanchz-Galn et al. (1999)
encontraron que en truchas marrones (Salmo trutta), las inyecciones intraperitoneales
(1,7 mg kg-1 de peso corporal) de cadmio y mercurio indujeron microncleos en
eritrocitos renales despus de 24 h de tratamiento, pero el cobre no lo hizo. Adems,
el pez volador europeo (Phoxinus phoxinus) no se mostr sensible al cobre ni al
mercurio, sino al cadmio. Tambin se observaron resultados anlogos en la anguila
Anguilla anguilla (Sanchz-Galn et al., 2001, Gravato et al, 2006). En esta misma
especie expuesta durante 7 das a Cu 0,2 M, (Oliveira et al., 2008) no se observaron
cambios significativos en la integridad del ADN (medido por el ensayo de
desenrollamiento alcalino del ADN) en sangre, branquias, hgado y rin, pero el
selenio (Se) s aument significativamente la frecuencia de anomalas nucleares de
eritrocitos (ENA). Cavas et al. (2005) evalu la induccin de microncleos de sangre
por 0,01 y 0,21 mg/L de Cu despus de una exposicin de 21 das, pero no encontr

31/73
un efecto significativo en la carpa de Prusia (Carassius gibelio), aunque s provoc una
induccin de microncleos en la carpa comn (Cyprinus carpio).

5.2. SOBRE EL ARSNICO

La presencia del arsnico en los seres vivos difiere a los otros metales
estudiados, puesto que como ya se expuso anteriormente este metal podemos
encontrarlo en los organismos tanto de manera orgnica como inorgnica. Segn Liao
et al. (2003), la cantidad de arsnico inorgnico presente en especies de agua dulce
es superior a la de arsnico orgnico. Esta biodisponibilidad de un tipo de arsnico u
otro habra que tenerla presente a la hora de evaluar su posible efecto txico en
medios acuticos.

Por otra parte, la mayora de los efectos txicos del arsnico a nivel celular y/o
tisular estn relacionados con la produccin de estrs oxidativo y las alteraciones que
este proceso induce en las clulas de los organismos. As, se ha mostrado que
muchos efectos txicos del arsnico se producen va la inhibicin de la enzima
catalasa presente en los peroxisomas, ms que por la inhibicin de la enzima
citoslica (Bhattacharya et al., 2007). Sin embargo, el efecto txico de la peroxidacin
lipdica, a diferencia del cobre, no ocurre siempre de la misma manera sino que
depende de las especies (Schenk, 1997).

En nuestro caso, no hemos estudiado las alteraciones que el arsnico produce


en las enzimas o metabolitos encargados de la defensa antioxidante, sino el posible
efecto genotxico que pueda producir. En este caso, en nuestro estudio se observ
que la dosis mxima de As empleada (10 mg/L) fue capaz de inducir un aumento de
2,45 y 4.35 veces en la frecuencia de microncleos a las 24 y 96 h. de exposicin al
metal, respectivamente, en comparacin a los controles.

Estos resultados estn de acuerdo con los estudios previos realizados en otras
especies. Yadav y Trivedi (2009) observaron un incremento gradual dependiente del
tiempo en la frecuencia de microncleos en clulas sanguneas inducida por As2O3
(6,94 mg/L) desde 24 a 168 h de exposicin en Channa punctata. As mismo, Ahmed
et al. (2011a) encontraron que, en individuos de Oreochromis mossambicus expuestos
a NaAsO2 (3, 28 y 56 mg/L) desde 48 a 192 horas, la frecuencia de microncleos en
clulas sanguneas aument de manera dependiente de la concentracin, y adems el
valor ms alto se registr despus de 96 h. Cabe destacar que en Ramrez y Garca
(2005) tambin se observaron un incremento de 56 veces en la frecuencia de
microncleos en clulas branquiales de peces cebra (Danio rerio), mantenidas en
aguas de pozos con contenido de As entre 0.395 y 0.630 mg/L.

5.3. SOBRE EL PLOMO.

El plomo no es un elemento esencial, y no reporta ningn valor nutricional para


los seres vivos. En pequeas cantidades causa efectos dainos para el ser humano y
los animales. Recientes estudios han mostrado el incremento de peroxidacin lipdica
inducida por plomo como elemento clave del dao oxidativo en el hgado (Patra et al.,
2001). Tambin se han demostrado daos genotxicos como aberraciones
cromosmicas, mutaciones, roturas de ADN, e inhibicin en la sntesis de ADN, que
puede causar incluso efectos letales. Los peces juveniles en la mayora de los casos
son ms sensibles al plomo que los peces adultos (Eisler, 1988), este dato es
importante porque se puede detectar el efecto contaminante antes de que afecte a
toda la comunidad.

32/73
En nuestro estudio, no se observ mortalidad en peces sometidos a exposicin
a Pb, y la frecuencia de microncleos no present valores altos, pero se observ que
la dosis ms alta (10 mg/L) provoc incrementos significativos, de hasta 2,7 veces
respecto al control, en el dao genotxico a las 24 horas. Por otra parte, tambin se
observ que en determinadas dosis a las 96 horas, la presencia de los microncleos
disminuye con respecto a lo que ocurre a las 24 h., lo cual puede deberse a una
precipitacin del plomo, producindose un descenso de la biodisponibilidad de este
metal para los peces.

Aunque los estudios de laboratorio realizados sobre el efecto genotxico del


plomo en los peces a travs del ensayo de microncleos son bastante escasos, los
datos anteriores tambin mostraron un efecto genotxico de Pb evaluado por este u
otros ensayos de dao al ADN. En cultivos de clulas de rin de H. malabaricus, se
observaron aberraciones cromosmicas despus de un tratamiento a largo plazo (18 y
46 das) con Pb (Cestari et al., 2004). Este mismo grupo observ un aumento
significativo en la frecuencia de microncleos en clulas sanguneas en la misma
especie despus de dos meses (Ferraro et al., 2004). Por su parte, Cavas et al. (2008)
encontraron que los tratamientos con acetato de plomo en dosis de 0,01 a 0,1 mg / L
durante 2 a 6 das indujeron significativamente la formacin de microncleos en
eritrocitos, branquias y clulas de aleta de Carassius auratus. Curiosamente, la
respuesta de la sangre demostr ser la ms sensible ya que las frecuencias de
microncleos se incrementaron significativamente, alcanzando un aumento mximo,
similar a nuestros datos, de 2,7 veces en comparacin con los controles y no se
observaron diferencias entre los perodos de tiempo de exposicin, aunque en este
caso no hubo diferencias en los tiempos de exposicin.

Ms recientemente, en los peces de agua dulce Prochilodus lineatus tratados


con 5 mg/L de nitrato de plomo desde 6 a 96 h, Monteiro et al. (2011) observaron que
mientras por un lado el ensayo cometa mostraba efectos genotxicos en las clulas de
la sangre, de las branquias y del hgado solamente despus de 96 h, por otro lado, la
frecuencia de microncleos no aument en ninguna exposicin. Sin embargo, la
frecuencia de otras anomalas nucleares de eritrocitos aumentaba significativamente
despus de 24 y 96 h. Del mismo modo, y mediante el ensayo del cometa, tambin se
demostr dao en el ADN dependiente de la concentracin del metal en las branquias,
el rin y el hgado de perca Anabas testudineus expuesta a cloruro de plomo 0,1-2
mg / L durante 96 h (Ahmed et al., 2011b).

5.4. SOBRE LOS TRES METALES ANALIZADOS.

Analizando el efecto toxico de cada uno de los tres metales durante 24 horas
podemos determinar que el cobre es el ms daino, seguido del arsnico, y siendo el
plomo el que menos dao produce. Los valores del cobre son los mayores y presentan
muchas diferencias con los otros dos metales, en cambio el arsnico y el plomo
presentan valores muy similares con respecto a la frecuencia de microncleos que
inducen. Por tanto, el potencial genotxico se ordena como: Cu> As > Pb.

Por su parte, cuando se comparan los efectos de cada uno de los tres metales
a las 96 horas de exposicin, se observa que el arsnico induce un fuerte incremento
en la frecuencia de microncleos con la concentracin ms alta (10mg/L), incremento
que llega a ser 5 veces mayor al observado con el plomo, el cual era muy similar al de
las 24 horas. Aun as el que mayor efecto genotxico produce es el cobre (que
adems induce la muerte de todos los peces con esa concentracin ms alta).
Destaca que el arsnico aun presentando mayores valores en las frecuencias de
33/73
microncleos, no produce la muerte de los peces ni en sus dosis ms altas, mientras
que el cobre s provoca la muerte de algn individuo con dosis menores. Por tanto, el
orden del potencial genotxico de estos metales en tiempos de exposicin ms largos
es diferente: As> Cu> Pb en lo que a la capacidad de incrementar la frecuencia de
microncleos se refiere, puesto que si se tiene en cuenta su capacidad letal, el cobre
parece seguir siendo mucho ms txico que los otros dos metales.

Estos resultados demuestran un efecto genotxico muy temprano a distintas


concentraciones por los metales analizados en Sparus aurata. Adems, el test de
microncleos en eritrocitos aparece como un buen biomarcadores de alerta temprana
para monitorizar la calidad del agua en ecosistemas acuticos y facilitar la proteccin
de la vida acutica.

6. CONCLUSIONES
Este estudio revel importantes aumentos de la frecuencia de MN en eritrocitos
perifricos de Sparus aurata dependientes de la dosis despus de la exposicin
individual a Cu, As y Pb durante 24 y 96 h.

Estos hallazgos son especialmente preocupantes desde el punto de vista


ambiental porque representan un potencial genotxico de Cu, As y Pb despus de una
exposicin muy corta a concentraciones ambientalmente relevantes.

Adems, el ensayo de microncleos de sangre en esta especie, uno de los


peces comerciales ms importantes cultivados extensamente en el mediterrneo,
podra ser considerado un biomarcador temprano apropiado para monitorizar la
genotoxicidad inducida por los metales pesados en ambientes acuticos naturales o
cultivados.

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41/73
ANEXO I
TABLAS CON LA CARACTERIZACIN MORFOLGICA DE LOS PECES
EMPLEADOS EN LOS DISTINTOS ENSAYOS CON METALES.

42/73
mgL-1 de Sal mgL-1 N
TANQUE Talla Std Talla Total Peso
CuSO45H2O de Cu Peces
TQ 1 0 0 6 11,450,22 14,270,24 40,201,19
TQ 6 0 0 6 11,800,26 14,520,20 44,581,88
TQ 2 0,01 0,01 6 11,530,12 13,750,28 38,901,51
TQ 7 0,01 0,01 6 11,600,15 14,470,19 45,222,32
TQ 3 0,1 0,1 6 11,670,19 14,680,17 46,522,46
TQ 8 0,1 0,1 6 11,530,18 14,120,44 40,724,06
TQ 4 1 1 6 11,420,13 14,530,22 44,602,15
TQ 9 1 1 6 11,820,16 14,850,26 46,923,77
TQ 5 10 10 6 + + +
TQ 10 10 10 6 12,270,28 14,630,32 41,631,84

Total = 58 11,610,06 14,410,09 43,460,88

Tabla 1: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Cu a las 24 horas en
juveniles de dorada

mgL-1 de Sal mgL-1 N


TANQUE Talla Std Talla Total Peso
CuSO45H2O de Cu Peces

TQ 11 0 0 6 13,100,26 15,130,25 48,051,69


TQ 16 0 0 6 12,520,16 14,570,19 44,722,13
TQ 12 0,039 0,01 6 12,800,20 14,980,26 47,682,41
TQ 17 0,0039 0,01 6 12,700,34 14,630,19 43,601,02
TQ 13 0,393 0,1 6 13,170,26 15,280,18 46,171,99
TQ 18 0,393 0,1 6 12,320,40 14,740,27 45,362,90
TQ 14 3,929 1 6 + + +
TQ 19 3,929 1 6 + + +
TQ 15 a 39,291 10 4 + + +
TQ 20 39,291 10 6 + + +

Total = 58 12,810,10 14,850,09 45,590,73

Tabla 2: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Cu a las 96 horas en
juveniles de dorada

43/73
mgL-1 de
Sal mgL-1 N
TANQUE Talla Std Talla Total Peso
de As Peces
(As2O3)
TQ 1 0 0 6 12,980,10 15,370,24 51,722,17

TQ 6 0 0 6 13,260,08 15,620,18 51,741,32

TQ 2 0,01 0,0076 6 12,770,28 14,720,22 45,671,15

TQ 7 0,01 0,0076 6 12,900,20 15,280,23 51,052,37

TQ 3 0,1 0,076 6 12,970,20 15,230,19 50,031,23

TQ 8 0,1 0,076 6 12,720,11 15,150,23 52,001,09

TQ 4 1 0,757 6 12,950,20 15,500,21 53,732,48

TQ 9 1 0,757 6 13,270,11 15,280,17 54,272,74

TQ 5 10 7,574 6 13,070,10 15,420,17 54,921,87

TQ 10 10 7,574 6 12,470,17 14,880,26 47,773,49

Total = 58 13,84 0,08 16,760,10 52,295,00


Tabla 3. Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de As a las 24 horas en
juveniles de doradas

mgL-1 de Sal mgL-1 de N


TANQUE Talla Std Talla Total Peso
(As2O3) As Peces

TQ 11 0 0 6 13,120,10 15,620,20 51,872,51


TQ 16 0 0 6 13,180,12 15,120,30 48,383,38
TQ 12 0,01 0,0076 6 13,130,09 15,200,29 47,652,55
TQ 17 0,01 0,0076 6 12,950,12 15,400,17 50,201,73
TQ 13 0,1 0,076 6 13,170,10 15,580,26 53,382,66
TQ 18 0,1 0,076 6 13,020,07 15,530,27 50,972,90
TQ 14 1 0,757 6 12,980,11 15,580,21 50,521,81
TQ 19 1 0,757 6 12,980,18 15,520,24 53,022,74
TQ 15 10 7,574 4 12,730,14 15,020,19 47,823,13
TQ 20 10 7,574 6 12,650,16 15,150,45 51,974,59

Total = 58 13,280,11 16,180,13 50,572,07


Tabla 4: Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de As a las 96 horas en
juveniles de dorada

44/73
mgL-1 de Sal mgL-1 N
TANQUE Talla Std Talla Total Peso
(Pb(CH3COOH)2 de Pb Peces

TQ 1 0 0 6 12,280,15 14,650,14 44,021,61

TQ 6 0 0 6 12,640,19 14,900,38 49,085,08

TQ 2 0,01 0,0064 6 12,120,05 14,770,19 44,421,60

TQ 7 0,01 0,0064 6 12,350,23 14,070,24 40,631,55

TQ 3 0,1 0,064 6 12,520,18 14,550,27 43,832,29

TQ 8 0,1 0,064 6 12,500,23 14,720,14 44,271,55

TQ 4 1 0,637 6 12,220,10 14,570,10 43,501,65

TQ 9 1 0,637 6 12,200,09 14,780,10 45,681,61

TQ 5 10 6,369 6 12,170,09 14,700,21 45,451,63

TQ 10 10 6,369 6 12,180,16 14,550,28 42,501,71

Total = 58 12,3205 14,6206 44,36065

Tabla 5. Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Pb a las 24 horas en
juveniles de dorada

mgL-1 de Sal
mgL-1 N
TANQUE Talla Std Talla Total Peso
de Pb Peces
(Pb(CH3COOH)2
TQ 11 0 0 6 12,570,25 14,670,24 42,571,40

TQ 16 0 0 6 12,500,26 14,260,28 40,201,08

TQ 12 0,01 0,0076 6 12,100,10 14,350,17 40,681,77

TQ 17 0,01 0,0076 6 12,420,10 14,680,19 41,922,41

TQ 13 0,1 0,076 6 12,080,13 14,450,21 41,571,47

TQ 18 0,1 0,076 6 12,320,05 14,780,17 44,873,04

TQ 14 1 0,757 6 12,320,09 14,730,27 41,781,51

TQ 19 1 0,757 6 12,220,14 14,600,27 42,771,75

TQ 15 10 7,574 4 12,070,10 14,700,25 42,831,74

TQ 20 10 7,574 6 12,270,10 14,630,17 41,631,20

Total = 58 12,300,10 14,430,20 42,081,30

Tabla 6. Datos de tallas y pesos de los peces para los test de toxicidad de Pb a las 96 horas en
juveniles de dorada

45/73
ANEXO II

TABLAS CON LOS PARMETROS FSICO-QUMICOS DEL AGUA DEL


AGUA EMPLEADA EN LOS TEST DE GENOTOXICIDAD.

46/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 1 18,21 7,88 53,1 4,97 52,30 30,01 40,31

TQ 6 18,28 8,03 53,7 5,11 52,88 30,30 40,75

TQ 11 18,27 7,83 51,7 4,93 52,03 29,89 40,02

TQ 16 18,18 8,10 57,1 5,48 52,45 30,13 40,49

TQ 2 18,22 8,03 56,6 5,41 52,99 30,39 40,88

TQ 7 18,14 7,47 52,1 5,15 51,71 29,65 39,71

TQ 12 18,59 7,82 56,7 5,15 52,08 29,70 39,86

TQ 17 18,22 7,89 59,2 5,41 51,95 29,76 39,94

TQ 3 17,40 9,45 67,1 6,32 51,48 30,01 40,31

TQ 8 17,33 8,58 70,7 6,54 52,29 30,69 41,92

TQ 13 17,23 8,20 75,3 7,05 51,95 30,32 40,77

TQ 18 17,32 7,96 79,1 7,47 51,56 30,11 40,48

TQ 4 17,13 9,47 72,3 7,00 50,74 30,21 40,62

TQ 9 16,77 8,77 76,5 7,18 51,04 30,62 41,37

TQ 14 17,08 8,45 87,2 8,47 51,52 30,41 41,02

TQ 19 17,01 8,32 87,1 8,45 51,18 30,09 41,08

TQ 5 17,37 8,39 84,3 8,12 50,86 29,85 40,06

TQ 10 17,39 8,32 85,9 8,02 51,19 29,85 40,09

TQ 15 17,34 8,07 87,9 8,44 50,99 29,81 40,13

TQ 20 17,74 8,03 82,0 7,56 50,11 29,00 38,89

Tabla 1. Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles de


dorada a las 0 h

47/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 1 16,08 7,49 70,3 6,73 49,70 26,87 40,16

TQ 6 17,01 7,94 86,9 8,28 50,64 29,68 39,99

TQ 11 16,86 7,45 77,3 7,14 51,31 30,53 53,44

TQ 16 16,84 8,34 78,9 7,60 51,46 30,50 41,07

TQ 2 17,40 8,25 86,7 8,15 51,51 30,07 40,39

TQ 7 17,48 7,64 88,1 8,44 50,78 29,99 40,39

TQ 12 16,12 8,09 78,2 7,56 51,93 30,75 41,53

TQ 17 16,88 8,25 74,2 6,88 51,88 30,77 41,65

TQ 3 17,04 7,81 78,4 7,58 50,74 30,02 40,33

TQ 8 17,38 8,19 79,5 7,50 50,57 29,59 39,72

TQ 13 18,24 8,27 79,6 7,27 49,60 29,31 38,53

TQ 18 18,48 8,09 79,7 7,25 51,17 30,80 41,57

TQ 4 17,64 8,62 77,7 7,32 50,74 29,55 39,61

TQ 9 17,57 7,86 81,1 7,57 50,89 29,54 39,67

TQ 14 17,39 8,10 84,4 7,63 51,79 30,52 41,09

TQ 19 16,90 8,05 85,0 7,52 51,55 30,56 41,15

TQ 5 17,86 8,41 84,4 7,65 51,41 29,79 40,00

TQ 10 17,43 8,39 77,6 7,15 52,20 30,46 40,00

TQ 15 17,17 8,20 83,5 7,44 51,73 30,75 41,46

TQ 20 16,66 8,21 82,6 7,55 51,12 30,64 41,28


Tabla 2. Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles de
dorada a las 24 h

48/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 16,22 7,76 70,6 7,76 50,70 30,33 40,80

TQ 16 15,39 8,45 77,5 8,23 50,30 30,66 41,35

TQ 12 16,19 8,17 83,7 8,24 50,38 30,15 40,56

TQ 17 15,65 8,22 88,4 8,78 49,70 30,87 41,68

TQ 13 16,22 8,36 80,1 7,82 51,81 31,07 41,92

TQ 18 15,82 8,21 82,1 7,90 49,48 30,68 41,43

TQ 14 16,38 8,20 81,1 8,34 51,40 30,59 41,27

TQ 19 15,96 8,12 84,4 8,82 50,26 30,30 40,67

TQ15 16,16 8,05 78,2 7,97 49,78 29,95 40,33

TQ 20 15,53 8,08 83,8 7,65 49,89 30,72 41,37


Tabla 3: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles de
dorada a las 48 h

O2 % O2 Conductividad STD Salinidad


TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 16,35 8,16 69,7 6,93 51,12 30,58 41,58

TQ 16 15,83 8,76 70,4 6,85 51,76 31,37 42,37

TQ 12 16,39 8,55 70,4 6,77 52,24 31,24 42,18

TQ 17 15,92 8,50 71,1 6,89 51,78 31,31 42,29

TQ 13 16,24 8,42 73,5 7,08 51,80 31,05 41,93

TQ 18 16,06 8,30 73,1 7,11 51,63 31,10 41,95

TQ 14 16,63 8,28 71,5 6,94 51,77 30,79 41,54

TQ 19 16,21 8,22 70,8 6,65 51,60 31,02 41,84

TQ15 16,31 8,34 71,8 6,91 51,69 30,95 41,75

TQ 20 15,71 8,27 72,3 6,95 50,87 30,91 41,68


Tabla 4: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles de
dorada a las 72 h

49/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 17,6 7,57 65,5 6,10 51,72 30,40 40,84

TQ 16 16,59 8,34 73,8 6,07 51,67 30,76 41,47

TQ 12 16,93 8,19 60,2 5,66 50,33 29,76 40,65

TQ 17 16,77 8,15 66,7 6,35 50,83 30,11 40,49

TQ 13 17,14 8,67 69,7 6,70 52,07 30,61 41,23

TQ 18 17,08 8,32 72,1 6,86 51,62 30,41 40,97

TQ 14 17,01 8,31 65,8 6,33 51,94 30,62 41,22

TQ 19 16,68 8,18 64,3 6,18 50,42 29,94 40,23

TQ15 17,06 8,08 64,8 5,70 50,54 30,15 40,56

TQ 20 16,03 8,28 65,2 6,13 49,79 29,99 40,50


Tabla 5: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Cu en juveniles de
dorada a las 96 h

50/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 1 18,26 8,53 89,6 7,88 53,34 30,60 41,22

TQ 6 18,38 8,17 92,7 8,07 53,08 30,36 40,55

TQ 11 18,37 8,19 98,8 8,14 52,50 30,03 40,37

TQ 16 18,27 8,07 87,7 7,79 51,84 29,80 40,09

TQ 2 18,23 8,41 91,6 8,06 52,57 30,19 40,61

TQ 7 18,38 7,68 88,9 7,49 51,94 29,80 40,09

TQ 12 18,31 7,59 87,1 7,85 52,10 29,80 40,00

TQ 17 18,29 7,57 85,9 7,69 52,24 29,95 40,25

TQ 3 18,01 8,30 91,0 8,43 52,03 30,01 40,32

TQ 8 18,14 8,43 93,8 8,84 52,23 30,02 40,33

TQ 13 18,23 7,84 95,1 9,03 51,43 29,52 39,65

TQ 18 18,19 7,64 91,7 8,57 52,21 30,00 40,33

TQ 4 17,98 8,38 95,0 8,49 52,00 30,10 40,49

TQ 9 17,95 8,72 93,3 8,64 51,40 29,71 39,95

TQ 14 18,07 8,07 95,5 8,12 51,79 29,89 40,04

TQ 19 17,98 8,20 96,2 8,67 51,76 29,89 40,15

TQ 5 18,03 9,17 96,4 8,76 51,65 29,80 40,07

TQ 10 18,02 8,40 96,6 8,76 51,37 29,60 39,72

TQ 15 17,99 8,12 96,5 8,46 51,50 29,71 39,91

TQ 20 17,79 7,95 96,1 8,53 51,32 29,72 39,88


Tabla 6: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles de
dorada a las 0 h

51/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 1 17,71 8,63 98,5 9,02 51,68 30,09 40,55

TQ 6 18,03 8,51 94,2 8,61 51,58 29,74 39,91

TQ 11 17,22 8,34 98,7 7,26 52,15 30,62 32,66

TQ 16 17,32 8,33 93,1 6,99 51,86 30,37 40,92

TQ 2 17,87 8,38 96,3 8,80 52,26 30,23 40,65

TQ 7 17,91 8,33 97,0 8,76 52,13 30,11 40,47

TQ 12 17,47 8,28 96,8 6,93 52,46 30,31 41,30

TQ 17 17,48 7,84 97,2 8,81 52,37 30,70 41,36

TQ 3 17,71 8,44 98,2 9,05 51,33 29,80 40,05

TQ 8 17,38 8,84 97,5 9,00 51,34 30,04 40,40

TQ 13 17,49 8,32 90,8 8,16 52,21 30,47 41,00

TQ 18 17,27 8,25 99,4 9,33 51,87 30,44 41,05

TQ 4 17,98 8,76 96,2 8,65 52,24 30,14 40,51

TQ 9 17,74 7,98 97,6 9,77 51,29 29,75 39,97

TQ 14 17,55 8,31 94,7 8,73 53,22 31,01 41,84

TQ 19 17,49 8,10 93,0 8,29 52,75 30,83 41,61

TQ 5 18,02 8,59 98,00 9,00 51,70 29,87 40,19

TQ 10 17,74 8,32 97,8 7,12 51,03 29,69 39,89

TQ 15 17,07 8,09 96,8 9,05 51,48 30,36 40,87

TQ 20 16,56 8,22 97,8 9,28 51,77 30,85 41,73


Tabla 7 : Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles de
dorada a las 24 h

52/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 17,62 9,04 98,3 9,05 53,64 31,18 42,10

TQ 16 17,83 8,42 94,9 8,63 53,67 31,07 41,93

TQ 12 18,12 8,38 98,3 9,07 53,63 30,95 41,76

TQ 17 17,95 7,90 97,7 9,01 53,13 30,70 41,42

TQ 13 18,03 8,29 97,3 8,98 53,20 30,71 41,41

TQ 18 17,63 8,13 97,3 8,98 53,19 30,86 41,64

TQ 14 18,07 8,32 97,6 8,92 52,51 30,26 40,81

TQ 19 17,83 8,18 97,4 8,97 52,89 30,63 41,28

TQ15 17,69 8,24 97,4 8,97 52,69 30,66 41,41

TQ 20 17,21 8,29 97,0 8,98 52,54 38,87 41,66


Tabla 8: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles de
dorada a las 48 h

O2 % O2 Conductividad STD Salinidad


TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 17,28 8,52 98,8 9,20 52,66 30,87 41,64

TQ 16 17,43 8,76 97,3 7,05 52,98 30,95 41,75

TQ 12 17,73 8,54 95,5 6,92 52,72 30,63 41,34

TQ 17 17,59 8,38 96,4 8,90 53,23 30,97 41,80

TQ 13 17,59 8,40 98,0 9,03 53,25 31,00 41,84

TQ 18 17,28 8,39 98,4 9,12 53,12 31,16 42,07

TQ 14 17,62 8,39 98,3 9,07 52,67 30,64 41,30

TQ 19 17,38 8,37 98,4 9,09 52,82 30,90 41,72

TQ15 17,34 8,24 99,3 9,18 53,04 31,04 41,91

TQ 20 16,87 8,40 98,2 9,17 52,96 31,32 42,31


Tabla 9: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en juveniles de
dorada a las 72 h

53/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 17,52 10,44 98,2 7,13 52,19 30,43 40,97

TQ 16 17,46 9,30 97,5 7,11 51,82 30,26 40,74

TQ 12 17,74 9,16 98,9 7,13 51,69 30,02 40,46

TQ 17 17,86 8,64 97,7 8,92 52,16 30,19 40,65

TQ 13 17,57 9,61 98,4 7,12 52,35 30,49 41,06

TQ 18 17,59 9,03 98,0 7,14 51,83 30,16 40,54

TQ 14 17,61 9,07 98,6 7,01 52,79 30,72 41,41

TQ 19 17,51 8,89 98,3 7,13 51,83 30,19 40,58

TQ15 17,35 8,71 96,4 7,06 51,71 30,26 40,71

TQ 20 17,13 9,38 97,7 7,15 52,26 30,72 41,39

Tabla 10: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de As en


juveniles de dorada a las 96 h

54/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 1 17,94 7,78 93,4 6,56 53,53 30,93 41,72

TQ 6 18,09 7,99 97,5 7,01 52,33 30,15 40,58

TQ 11 18,06 7,64 8,69 6,14 52,02 39,95 40,24

TQ 16 18,11 7,56 94,1 8,14 53,35 30,69 41,39

TQ 2 18,17 7,36 98,1 6,13 53,44 30,61 41,43

TQ 7 18,12 7,25 93,2 7,28 53,41 30,61 41,39

TQ 12 17,97 7,44 83,7 5,83 52,83 30,49 41,05

TQ 17 17,03 7,36 88,7 6,26 52,14 30,67 41,26

TQ 3 17,66 7,60 81,9 5,89 52,62 30,60 41,23

TQ 8 17,79 7,69 90,6 6,44 51,84 30,06 40,41

TQ 13 17,93 8,19 90,7 6,81 52,31 30,23 40,66

TQ 18 17,83 7,60 92,1 7,22 52,08 30,14 40,52

TQ 4 17,40 8,63 99,3 7,08 52,12 30,46 40,99

TQ 9 17,50 8,20 99,2 7,12 51,88 30,26 40,68

TQ 14 17,64 7,74 95,6 6,67 52,03 30,22 40,63

TQ 19 17,59 7,98 98,5 7,02 52,14 30,35 40,84

TQ 5 17,66 7,75 89,7 6,43 51,60 29,98 40,27

TQ 10 17,64 7,48 93,3 6,11 50,83 29,55 39,63

TQ 15 17,63 7,39 93,6 6,88 51,34 29,85 40,08

TQ 20 17,31 7,37 89,30 7,20 51,18 29,91 40,20


Tabla 11. Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en juveniles de
dorada a las 0 h

55/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 1 17,75 8,76 95,0 8,72 51,29 29,78 39,92

TQ 6 17,71 8,45 93,2 8,6 51,24 29,79 39,99

TQ 2 18,12 8,86 96,4 8,73 51,63 29,69 39,84

TQ 7 18,16 8,57 95,9 8,70 51,60 29,65 39,77

TQ 3 17,92 8,46 98,7 9,06 51,75 29,92 40,19

TQ 8 17,62 8,02 92,8 8,43 51,06 29,71 39,90

TQ 4 18,11 8,80 90,6 7,93 52,14 30,02 40,37

TQ 9 17,77 7,94 80,00 6,97 52,98 30,83 41,65

TQ 5 18,58 8,68 90,7 8,11 52,49 29,88 40,13

TQ 10 18,18 8,57 92,7 8,37 52,08 29,89 40,14


Tabla 12. Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en juveniles de dorada a las 24 h

O2 % O2 Conductividad STD Salinidad


TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 15,62 9,64 95,3 9,18 51,36 31,23 41,13

TQ 16 16,17 9,29 92,5 8,86 49,65 30,73 41,48

TQ 12 16,06 9,13 88,5 8,52 51,01 30,82 41,57

TQ 17 16,12 8,80 87,2 8,39 51,02 31,15 42,04

TQ 13 15,96 8,85 87,4 8,51 51,01 30,71 41,28

TQ 18 14,91 8,75 88,3 8,65 50,52 31,24 42,05

TQ 14 14,98 8,56 91,2 8,88 51,36 31,28 42,02

TQ 19 15,57 8,61 89,5 8,76 51,78 31,17 42,08

TQ15 15,21 8,59 90,1 8,80 51,02 31,44 42,41

TQ 20 15,07 8,51 90,1 8,76 50,79 30,99 41,69


Tabla 13. Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en juveniles de
dorada a las 48 h

56/73
O2 % O2 Conductividad STD Salinidad
TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 15,51 8,55 92,5 9,00 52,07 31,66 41,82

TQ 16 16,20 8,72 91,1 8,62 52,10 30,95 41,63

TQ 12 16,46 8,62 89,9 8,55 52,64 31,20 42,05

TQ 17 16,44 8,40 89,8 9,52 52,03 30,71 41,41

TQ 13 16,16 8,59 91,5 8,78 52,37 31,42 42,47

TQ 18 15,80 8,71 89,6 8,56 52,75 32,37 43,98

TQ 14 16,59 8,37 89,6 8,49 52,30 31,19 42,14

TQ 19 16,45 8,50 91,1 8,50 51,81 30,86 41,64

TQ15 15,73 8,31 91,6 8,81 52,38 31,51 42,56

TQ 20 16,13 8,45 93,5 8,69 52,06 31,14 42,04


Tabla 14:Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en juveniles de
dorada a las 72 h

O2 % O2 Conductividad STD Salinidad


TANQUE T (C) pH
saturacin ppm (mScm-1) (ppt) (gL-1)

TQ 11 17,81 9,71 92,2 8,43 52,90 30,65 41,30

TQ 16 17,64 9,21 94,2 8,55 52,70 30,64 41,29

TQ 12 17,71 9,56 93,4 8,48 52,80 30,65 41,30

TQ 17 17,73 8,72 90,9 8,40 51,93 30,22 40,69

TQ 13 17,77 9,01 94,8 8,66 52,99 30,73 41,45

TQ 18 17,22 8,75 95,9 8,87 52,54 30,86 41,67

TQ 14 17,76 8,66 97,0 8,80 51,88 30,12 40,54

TQ 19 17,41 8,63 95,2 8,66 51,64 30,22 40,70

TQ15 17,76 9,55 97,4 8,85 52,47 30,41 40,94

TQ 20 17,18 8,57 96,8 8,88 51,97 30,55 41,14


Tabla 15: Datos de parmetros fsico-qumicos para test de toxicidad de Pb en juveniles de
dorada a las 96 h

57/73
ANEXO III

TABLAS CON LOS RESULTADOS DEL RECUENTO Y DE LAS


FRECUENCIAS DE MICRONCLEOS EN LOS ERITROCITOS
PERIFRICOS DE DORADAS JUVENILES (SPARUS AURATA, L.)
EXPUESTAS A DISTINTOS TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES PARA
LOS METALES ANALIZADOS.

58/73
EFECTOS DEL TRATAMIENTO CON COBRE

media de
Nmero de
mg/L Tiempo del Microncleos Microncleos microncleos
Tanque N peces eritrocitos
cobre tratamiento cuantificados (%o) por
analizados
tratamiento
1 0 24 h 1 1079 0,00 0,000
2 1066 3,00 2,814
3 1005 0,00 0,000
0,630
4 1033 1,00 0,968
5 1007 0,00 0,000
6 1018 0,00 0,000
6 0 24 h 1 1013 0,00 0,000
2 1012 3,00 2,964
3 1011 1,00 0,989
1,326
4 1046 1,00 0,956
5 1022 0,00 0,000
6 985 3,00 3,046
2 0,01 24 h 1 1007 3,00 2,979
2 1016 1,00 0,984
3 1124 0,00 0,000
0,661
4 1046 0,00 0,000
5 1007 0,00 0,000
6 706 0,00 0,000
7 0,01 24 h 1 1059 0,00 0,000
2 1012 0,00 0,000
3 1017 0,00 0,000
0,323
4 1003 0,00 0,000
5 1047 0,00 0,000
6 1032 2,00 1,938
3 0,1 24 h 1 1078 1,00 0,928
2 1051 2,00 1,903
3 1045 0,00 0,000
0,793
4 1037 2,00 1,929
5 1069 0,00 0,000
6 1023 0,00 0,000
8 0,1 24 h 1 1064 0,00 0,000
2 1062 0,00 0,000
3 1019 2,00 1,963
0,327
4 1054 0,00 0,000
5 1073 0,00 0,000
6 943 0,00 0,000
4 1 24 h 1 1008 0,00 0,000
1,071
2 1001 1,00 0,999
59/73
3 1151 2,00 1,738
4 1109 3,00 2,705
5 1016 1,00 0,984
6 1061 0,00 0,000
9 1 24 h 1 1027 0,00 0,000
2 1091 1,00 0,917
3 1047 1,00 0,955
3,167
4 1001 1,00 0,999
5 1080 14,00 12,963
6 ** ** **
5 10 24 h 1 1019 2,00 1,963
2 1004 1,00 0,996
3 899 1,00 1,112
1,951
4 1006 0,00 0,000
5 1018 5,00 4,912
6 1102 3,00 2,722
10 10 24 h 1 ** ** **
2 ** ** **
3 ** ** **
4 ** ** **
5 ** ** **
6 ** ** **

Tabla 1: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del Cu a las 24 horas.

60/73
Nmero Media de
de microncleos
mg/L Tiempo del eritrocitos Microncleos Microncleos por
Tanque cobre tratamiento Npeces analizados cuantificados (%o) tratamiento
1 0 96 h 1 1003 0,00 0,000
2 1030 0,00 0,000
3 1062 2,00 1,883
0,314
4 1003 0,00 0,000
5 1038 0,00 0,000
6 1035 0,00 0,000
6 0 96 h 1 1097 0,00 0,000
2 1052 0,00 0,000
3 1049 0,00 0,000
0,160
4 1065 0,00 0,000
5 1039 1,00 0,962
6 1073 0,00 0,000
2 0,01 96 h 1 1141 0,00 0,000
2 1008 1,00 0,992
3 1046 6,00 5,736
1,346
4 1090 0,00 0,000
5 1086 0,00 0,000
6 ** ** **
7 0,01 96 h 1 1015 0,00 0,000
2 1071 0,00 0,000
3 1047 1,00 0,955
0,159
4 1029 0,00 0,000
5 1014 0,00 0,000
6 1107 0,00 0,000
3 0,1 96 h 1 1028 0 0,000
2 1010 0,00 0,000
3 1047 0,00 0,000
0,000
4 1019 0,00 0,000
5 1067 0,00 0,000
6 1023 0,00 0,000
8 0,1 96 h 1 1095 0,00 0,000
2 1047 0,00 0,000
3 1072 0,00 0,000
0,000
4 1009 0,00 0,000
5 1019 0,00 0,000
6 1054 0,00 0,000
4 1 96 h 1 1029 0,00 0,000
2 1049 0,00 0,000
0,314
3 1061 2,00 1,885
4 1113 0,00 0,000
61/73
5 1029 0,00 0,000
6 1132 0,00 0,000
9 1 96 h 1 1026 6,00 5,848
2 1042 1,00 0,960
3 1015 1,00 0,985
1,559
4 1068 0,00 0,000
5 1103 0,00 0,000
6 ** ** **
5 10 96 h 1 1003 0,00 0,000
2 ** ** **
3 1083 0,00 0,000
0,000
4 1007 0,00 0,000
5 1108 0,00 0,000
6 1099 0,00 0,000
10 10 96 h 1 * * *
2 * * *
3 * * *
4 * * *
5 * * *
6 * * *

Tabla 2: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del Cu a las 96 horas.

62/73
Total Cantidad de
mg/L Tiempo de N eritrocitos Total microncleos
Tanque cobre tratamiento peces Muertes contados microncleos %0
1 0 24 h 6 0 6208 4 0,644
6 0 24 h 6 0 6089 8 1,314
2 0,01 24 h 6 0 5906 4 0,677
7 0,01 24 h 6 0 6170 2 0,324
3 0,1 24 h 6 0 6303 5 0,793
8 0,1 24 h 6 0 6215 2 0,322
4 1 24 h 6 0 6346 7 1,103
9 1 24 h 6 0 5246 17 3,241
6 10 24 h 6 0 6087 12 1,971
10 10 24 h 6 6 0 0 0,000
11 0 96 h 6 0 6171 2 0,324
16 0 96 h 6 0 6375 1 0,157
12 0,01 96 h 6 0 5371 7 1,303
17 0,01 96 h 6 0 6283 1 0,159
13 0,1 96 h 6 0 6194 0 0,000
18 0,1 96 h 6 0 6296 0 0,000
14 1 96 h 6 0 6413 2 0,312
19 1 96 h 6 0 5254 9 1,713
15 10 96 h 6 1 5300 0 0,000
20 10 96 h 6 6 0 0 0,000

Tabla 3:Comparacin del anlisis de microncleos en dorada (Sparus auratus, L.) en los test de
toxicidad del Cu en los dos tiempos de exposicin analizados (24 y 96 h).

63/73
EFECTOS DEL TRATAMIENTO CON ARSNICO

Nmero media de
de microncleos
mg/L Tiempo del eritrocitos Microncleos Microncleos por
Tanque Arsnico tratamiento Npeces analizados cuantificados (%o) tratamiento
1 0 24 h 1 1040 0,00 0,000
2 1008 0,00 0,000
3 1011 2,00 1,978
0,967
4 1059 0,00 0,000
5 1033 1,00 0,968
6 1050 3,00 2,857
6 0 24 h 1 1060 0,00 0,000
2 1022 0,00 0,000
3 1073 0,00 0,000
0,324
4 1041 0,00 0,000
5 1008 1,00 0,992
6 1051 1,00 0,951
2 0,01 24 h 1 1036 0,00 0,000
2 1057 0,00 0,000
3 1062 0,00 0,000
0,000
4 1009 0,00 0,000
5 989 0,00 0,000
6 1027 0,00 0,000
7 0,01 24 h 1 1017 0,00 0,000
2 1014 0,00 0,000
3 1008 2,00 1,984
1,811
4 1069 0,00 0,000
5 1082 0,00 0,000
6 1013 9,00 8,885
3 0,1 24 h 1 1019 0,00 0,000
2 1004 0,00 0,000
3 1000 0,00 0,000
0,166
4 1143 0,00 0,000
5 1003 1,00 0,997
6 1042 0,00 0,000
8 0,1 24 h 1 1015 2,00 1,970
2 1050 2,00 1,905
3 1003 0,00 0,000
0,646
4 1044 0,00 0,000
5 1026 0,00 0,000
6 1101 0,00 0,000
4 1 24 h 1 1142 0,00 0,000 0,332

64/73
2 1012 0,00 0,000
3 1013 0,00 0,000
4 998 1,00 1,002
5 1010 1,00 0,990
6 1017 0,00 0,000
9 1 24 h 1 1049 0,00 0,000
2 1002 0,00 0,000
3 1080 0,00 0,000
0,622
4 1154 2,00 1,733
5 1001 2,00 1,998
6 1012 0,00 0,000
5 10 24 h 1 996 0,00 0,000
2 10077 0,00 0,000
3 1006 1,00 0,994
0,821
4 1008 3,00 2,976
5 1043 1,00 0,959
6 1035 0,00 0,000
10 10 24 h 1 1020 1,00 0,980
2 1050 0,00 0,000
3 1080 0,00 0,000
1,131
4 1012 0,00 0,000
5 1006 0,00 0,000
6 1034 6,00 5,803

Tabla 4: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del As a las 24 horas.

65/73
Nmero Media de
de microncleos
mg/L Tiempo del eritrocitos Microncleos Microncleos por
Tanque Arsnico tratamiento Npeces analizados cuantificados (%o) tratamiento
1 0 96 h 1 1022 0,00 0,000
2 1067 0,00 0,000
3 1013 1,00 0,987
0,962
4 1023 1,00 0,978
5 1047 2,00 1,910
6 1053 2,00 1,899
6 0 96 h 1 1077 0,00 0,000
2 1094 2,00 1,828
3 1096 1,00 0,912
0,610
4 1127 0,00 0,000
5 1086 1,00 0,921
6 1102 0,00 0,000
2 0,01 96 h 1 1011 1,00 0,989
2 1011 1,00 0,989
3 1017 1,00 0,983
1,472
4 1098 1,00 0,911
5 1008 4,00 3,968
6 1007 1,00 0,993
7 0,01 96 h 1 1031 0,00 0,000
2 1029 0,00 0,000
3 1049 0,00 0,000
0,483
4 1047 2,00 1,910
5 1067 0,00 0,000
6 1013 1,00 0,987
3 0,1 96 h 1 1070 1,00 0,935
2 1045 1,00 0,957
3 1058 4,00 3,781
0,945
4 1003 0,00 0,000
5 1001 0,00 0,000
6 1034 0,00 0,000
8 0,1 96 h 1 1119 0,00 0,000
2 1039 2,00 1,925
3 1051 1,00 0,951
0,925
4 1022 0,00 0,000
5 1074 0,00 0,000
6 1123 3,00 2,671
4 1 96 h 1 1002 0,00 0,000
2 1038 1,00 0,963 0,637
3 1073 0,00 0,000

66/73
4 1020 1,00 0,980
5 1065 2,00 1,878
6 1049 0,00 0,000
9 1 96 h 1 1068 0,00 0,000
2 1142 3,00 2,627
3 1129 0,00 0,000
0,898
4 1008 0,00 0,000
5 1002 0,00 0,000
6 1087 3,00 2,760
5 10 96 h 1 1033 0,00 0,000
2 1056 1,00 0,947
3 1002 0,00 0,000
0,476
4 1041 0,00 0,000
5 1010 0,00 0,000
6 1047 2,00 1,910
10 10 96 h 1 1044 5,00 4,789
2 1060 0,00 0,000
3 1058 14,00 13,233
6,128
4 1044 8,00 7,663
5 1173 13,00 11,083
6 1072 0,00 0,000

Tabla 5: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del As a las 96 horas.

67/73
Total
mg/L Tiempo de N eritrocitos Total Cantidad de
Tanque Arsenico tratamiento peces Muertes contados micronucleos micronucleos %0
1 0 24 h 6 0 6201 6 0,968
6 0 24 h 6 0 6255 2 0,320
2 0,01 24 h 6 0 6180 0 0,000
7 0,01 24 h 6 0 6203 11 1,773
3 0,1 24 h 6 0 6211 1 0,161
8 0,1 24 h 6 0 6239 4 0,641
4 1 24 h 6 0 6192 2 0,323
9 1 24 h 6 0 6298 4 0,635
6 10 24 h 6 0 15165 5 0,330
10 10 24 h 6 0 6202 7 1,129
11 0 96 h 6 0 6225 6 0,964
16 0 96 h 6 0 6582 4 0,608
12 0,01 96 h 6 0 6152 9 1,463
17 0,01 96 h 6 0 6236 3 0,481
13 0,1 96 h 6 0 6211 6 0,966
18 0,1 96 h 6 0 6428 6 0,933
14 1 96 h 6 0 6247 4 0,640
19 1 96 h 6 0 6436 6 0,932
15 10 96 h 6 0 6189 3 0,485
20 10 96 h 6 0 6451 32 4,960
Tabla 6.. Comparacin del anlisis de microncleos en dorada (Sparus auratus, L.) en los test
de toxicidad del As en los dos tiempos de exposicin analizados (24 y 96 h)

68/73
EFECTOS DEL TRATAMIENTO CON PLOMO

Nmero
de Media de
mg/L Tiempo del eritrocitos Microncleos Microncleos microncleos
Plomo tratamiento Npeces analizados cuantificados (%o) por tratamiento
0 24 h 1 1027 0,00 0,000
2 1080 1,00 0,926
3 1065 3,00 2,817
0,624
4 1060 0,00 0,000
5 1001 0,00 0,000
6 1096 0,00 0,000
0 24 h 1 1034 0,00 0,000
2 1059 0,00 0,000
3 1008 0,00 0,000
0,158
4 1023 0,00 0,000
5 1056 1,00 0,947
6 1034 0,00 0,000
0,01 24 h 1 1121 0,00 0,000
2 1043 0,00 0,000
3 1102 0,00 0,000
0,000
4 1054 0,00 0,000
5 1057 0,00 0,000
6 1086 0,00 0,000
0,01 24 h 1 1050 0,00 0,000
2 1046 0,00 0,000
3 1088 0,00 0,000
0,313
4 1051 0,00 0,000
5 1175 0,00 0,000
6 1064 2,00 1,880
0,1 24 h 1 1009 1,00 0,991
2 1037 1,00 0,964
3 1043 1,00 0,959
0,486
4 1080 0,00 0,000
5 1089 0,00 0,000
6 1018 0,00 0,000
0,1 24 h 1 1053 2,00 1,899
2 1057 0,00 0,000
3 1078 0,00 0,000
0,814
4 1009 0,00 0,000
5 1006 3,00 2,982
6 1018 0,00 0,000
1 24 h 1 1003 0,00 0,000
0,318
2 1074 1,00 0,931
69/73
3 1082 0,00 0,000
4 1004 0,00 0,000
5 1025 1,00 0,976
6 1068 0,00 0,000
1 24 h 1 1050 0,00 0,000
2 1085 4,00 3,687
3 1083 0,00 0,000
0,614
4 1078 0,00 0,000
5 1098 0,00 0,000
6 1174 0,00 0,000
10 24 h 1 1042 0,00 0,000
2 1165 1,00 0,858
3 1041 1,00 0,961
0,303
4 1073 0,00 0,000
5 1076 0,00 0,000
6 1080 0,00 0,000
10 24 h 1 1018 0,00 0,000
2 1116 6,00 5,376
3 1063 0,00 0,000
0,896
4 1016 0,00 0,000
5 1052 0,00 0,000
6 1084 0,00 0,000

Tabla 7:Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en los test
de toxicidad del Pb a las 24 horas.

70/73
Nmero
de Media de
mg/L Tiempo del eritrocitos Microncleos Microncleos micronucleos
Plomo tratamiento Npeces analizados cuantificados (%o) por tratamiento
0 96 h 1 1039 0,00 0,000
2 1039 1,00 0,962
3 1109 0,00 0,000
0,961
4 1010 0,00 0,000
5 1015 0,00 0,000
6 1041 5,00 4,803
0 96 h 1 1116 0,00 0,000
2 1141 0,00 0,000
3 1100 0,00 0,000
0,000
4 1101 0,00 0,000
5 1054 0,00 0,000
6 1060 0,00 0,000
0,01 96 h 1 1004 0,00 0,000
2 1072 1,00 0,933
3 1020 0,00 0,000
0,474
4 1003 0,00 0,000
5 1065 0,00 0,000
6 1048 2,00 1,908
0,01 96 h 1 1049 1,00 0,953
2 1120 2,00 1,786
3 1042 1,00 0,960
0,616
4 1134 0,00 0,000
5 1188 0,00 0,000
6 1007 0,00 0,000
0,1 96 h 1 1006 0,00 0,000
2 1039 1,00 0,962
3 1027 0,00 0,000
0,316
4 1084 0,00 0,000
5 1074 1,00 0,931
6 1019 0,00 0,000
0,1 96 h 1 1102 0,00 0,000
2 1075 0,00 0,000
3 1135 0,00 0,000
0,301
4 1109 2,00 1,803
5 1051 0,00 0,000
6 1031 0,00 0,000
1 96 h 1 1055 0,00 0,000
2 1016 0,00 0,000 0,000
3 1018 0,00 0,000

71/73
4 1075 0,00 0,000
5 1155 0,00 0,000
6 1057 0,00 0,000
1 96 h 1 1002 0,00 0,000
2 1097 0,00 0,000
3 1030 3,00 2,913
0,642
4 1062 1,00 0,942
5 1025 0,00 0,000
6 1075 0,00 0,000
10 96 h 1 * * 0,000
2 1015 0,00 0,000
3 108 0,00 0,000
0,000
4 1014 0,00 0,000
5 1065 0,00 0,000
6 1051 0,00 0,000
10 96 h 1 1009 2,00 1,982
2 1038 0,00 0,000
3 1085 0,00 0,000
0,330
4 1029 0,00 0,000
5 1194 0,00 0,000
6 1001 0,00 0,000

Tabla 8: Cantidad de Microncleos (por mil eritrocitos) en dorada (Sparus auratus, L.) en los
test de toxicidad del Pb a las 96 horas

72/73
Total Cantidad de
mg/L Tiempo de N eritrocitos Total microncleos
Tanque Plomo tratamiento peces Muertes contados microncleos %0
1 0 24 h 6 0 6329 4 0,632
6 0 24 h 6 0 6214 1 0,161
2 0,01 24 h 6 0 6463 0 0,000
7 0,01 24 h 6 0 6474 2 0,309
3 0,1 24 h 6 0 6276 3 0,478
8 0,1 24 h 6 0 6221 5 0,804
4 1 24 h 6 0 6256 2 0,320
9 1 24 h 6 0 6568 4 0,609
6 10 24 h 6 0 6477 2 0,309
10 10 24 h 6 0 6349 6 0,945
11 0 96 h 6 0 6253 6 0,960
16 0 96 h 6 0 6572 0 0,000
12 0,01 96 h 6 0 6212 3 0,483
17 0,01 96 h 6 0 6540 4 0,612
13 0,1 96 h 6 0 6249 2 0,320
18 0,1 96 h 6 0 6503 2 0,308
14 1 96 h 6 0 6376 0 0,000
19 1 96 h 6 0 6291 4 0,636
15 10 96 h 6 0 4253 0 0,000
20 10 96 h 6 0 6356 2 0,315

Tabla 9 : Comparacin del anlisis de microncleos en dorada (Sparus auratus, L.) en los test
de toxicidad del Pb en los dos tiempos de exposicin analizados (24 y 96 h)

73/73