El calcio extracelular modula la

diferenciacin e identidad de los adipocitos

marrones
Ines Pramme-Steinwachs ,
Martin Jastroch &
Siegfried Ussar

Scientific Reports 7 , Nmero del artculo: 8888 ( 2017 )

Doi : 10.1038 / s41598-017-09025-3
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o Calcio y vitamina D
o Sealizacin del calcio
o Metabolismo de la grasa

Recibido:
31 de marzo de 2017
Aceptado:
19 de julio de 2017
Publicado en lnea:
21 de agosto de 2017

Abstracto

Los adipocitos marrones son importantes en la regulacin de la termognesis

no temblorosa, la glucosa de cuerpo entero y la homeostasis lipdica. El
aumento de la evidencia apoya un importante papel de los metabolitos, as
como macro y micronutrientes en la diferenciacin de los adipocitos marrn y
la funcin. El calcio es uno de los iones ms abundantes en el cuerpo que
regula mltiples procesos celulares. Se observ que el aumento de la
concentracin de calcio extracelular durante la diferenciacin de los adipocitos
marrn bloquea la acumulacin de lpidos y suprime la induccin de los
principales factores de transcripcin adipognicos como PPAR y C / EBP
. Por el contrario, el agotamiento del calcio en el medio aumenta la
adipognesis y la expresin de los genes selectivos de los adipocitos marrones,
tales como UCP1. Mecanicamente, mostramos que el calcio extracelular
elevado inhibe la actividad de C / EBP mediante la hiperactivacin de
ERK, Un proceso que es independiente de los niveles de calcio intracelular y
de forma reversible detiene la diferenciacin. Adems, el aumento del calcio
extracelular nicamente despus de la fase de induccin de la diferenciacin
suprime especficamente la expresin gnica de UCP1, PRDM16 y PGC1-
. En particular, el agotamiento del calcio extracelular provoca efectos
opuestos. Juntos, mostramos que la modulacin de la concentracin de calcio
extracelular controla la diferenciacin de los adipocitos marrones y la
expresin de los genes termognicos, destacando la importancia del
microambiente tisular en la heterogeneidad y funcin de los adipocitos
marrones. El agotamiento del calcio extracelular provoca efectos
opuestos. Juntos, mostramos que la modulacin de la concentracin de calcio
extracelular controla la diferenciacin de los adipocitos marrones y la
expresin de los genes termognicos, destacando la importancia del
microambiente tisular en la heterogeneidad y funcin de los adipocitos
marrones. El agotamiento del calcio extracelular provoca efectos
opuestos. Juntos, mostramos que la modulacin de la concentracin de calcio
extracelular controla la diferenciacin de los adipocitos marrones y la
expresin de los genes termognicos, destacando la importancia del
microambiente tisular en la heterogeneidad y funcin de los adipocitos
marrones.

Introduccin

El tejido adiposo marrn (BAT) difiere significativamente del tejido adiposo

blanco (WAT) con respecto a la funcin, la morfologa y el
desarrollo 1 , 2 . Aunque ambos tejidos son importantes rganos endocrinos, la
funcin primaria del tejido adiposo blanco es almacenar energa en forma de
triglicridos, mientras que la MTD disipa energa en forma de calor a travs de
la respiracin mitocondrial desacoplada usando la protena desacoplante 1
(UCP1) 3 , 4 , 5 . La MTD se encuentra en las regiones cervicales y
supraclaviculares de los seres humanos adultos 6 , as como en la regin
interescapular de los lactantes y roedores 7. Las gotitas lipdicas multiloculares
y una alta densidad de mitocondrias distinguen morfolgicamente los
adipocitos marrones y blancos y por lo tanto son caractersticas principales de
los adipocitos marrones. Trabajos anteriores de Spiegelman 8 y otros 9 , 10 han
demostrado que los adipocitos marrones se originan de distintas poblaciones
precursoras Myf5-positivas. Sin embargo, datos ms recientes indican que las
clulas precursoras Myf5 positivas tambin pueden dar lugar a distintos
adipocitos blancos, preferentemente dentro de los depsitos viscerales de tejido
adiposo, lo que sugiere un complejo programa de desarrollo que distingue
adipocitos marrones y blancos 11 .

Varios factores extrnsecos 12 , 13 , 14 y endocrinos 15 , 16 , 17 , tales como la

temperatura ambiente, protenas morfogenticas seas (BMP), etc., modulan la
diferenciacin y la actividad de los adipocitos marrones. Curiosamente, se
conoce relativamente poco cmo el microambiente local, que comprende la
matriz extracelular, la proximidad a los vasos sanguneos y las concentraciones
locales de nutrientes, regula la diferenciacin y la funcin de los adipocitos
marrones. Entre la diversidad de macro y micronutrientes, el calcio es uno de
los iones ms abundantes e importantes en el cuerpo. El calcio regula las
funciones esenciales del cuerpo, como la calcificacin de los huesos, la
transmisin neuronal, la contraccin muscular, la liberacin de insulina y
muchos ms18 , 19 , 20 , 21 . Con este fin, no es de extraar que los niveles de
calcio srico estn estrictamente regulados y alteraciones pueden tener
consecuencias perjudiciales para la salud humana [ 22 , 23 , 24] . Las
concentraciones locales de calcio intersticial, sin embargo, son mucho menos
estudiadas y podran ser ms variables. Hay un conocimiento limitado sobre el
papel de las fluctuaciones extracelulares de calcio en la obesidad, pero reducir
el exceso de calcio en la sangre por suplementos nutricionales como la
calcitonina mejora el peso corporal en las ratas obesas [ 25] . El impacto de esta
reduccin sobre la homeostasis del calcio y la funcin del tejido adiposo
(marrn) no ha sido abordado en detalle todava.

En contraste, varios estudios investigaron el papel de la elevacin del calcio -

extracelularmente, oa travs de la liberacin de calcio intracelular - sobre la
adipognesis y la funcin del adipocito blanco, con resultados algo
contradictorios. El trabajo con preadipocitos blancos humanos 26 y
murinos 27 mostr que la elevacin de los niveles intracelulares de calcio en la
diferenciacin temprana inhibe la induccin de acumulacin de PPAR y
triglicridos. Estos efectos estn ms probablemente mediados a travs de la
activacin calcio-dependiente de la calcineurina 27 y quinasas quinasas
dependientes de calcio / calmodulina 28, Inhibiendo los factores de
transcripcin adipognicos tempranos. Sin embargo, se observ una inhibicin
similar de la diferenciacin de los adipocitos blancos al elevar las
concentraciones de calcio extracelular, sin afectar los niveles intracelulares de
calcio 29 . Por el contrario, la elevacin de las concentraciones de calcio
intracelular ms tarde durante la adipognesis promueve la lipognesis y la
expresin de los marcadores de adipocitos [ 26] . Estos efectos del calcio
extracelular e intracelular sobre la adipognesis parecen ser especficos de los
adipocitos blancos "clsicos", ya que el tratamiento de las clulas estromales
de la mdula sea (BMSC) con alto calcio extracelular e intracelular acelera la
proliferacin y diferenciacin en adipocitos 30. Este impacto diferencial del
calcio en la diferenciacin de BMSCs y preadipocitos blancos sugiere que las
alteraciones en la concentracin local de calcio pueden tener un impacto
especfico en las poblaciones individuales de preadipocitos. Dadas las
similitudes en la red transcripcional que media la adipognesis blanca y
marrn, las concentraciones de calcio extracelular que varan pueden tambin
afectar la diferenciacin y la funcin del adipocito marrn.

Por lo tanto, se investig el impacto de la elevacin del calcio extracelular a lo

largo de diferentes etapas de la diferenciacin de adipocitos marrn. En lnea
con los datos de adipocitos blancos, se observ la supresin de la
diferenciacin de adipocitos marrones que han sido continuamente expuestos a
alto calcio extracelular. El medio libre de calcio, por otro lado, mejor la
diferenciacin de los adipocitos marrones. En ambos casos, la normalizacin
de las concentraciones de calcio extracelular despus de la fase de induccin
inicial permiti a los adipocitos reanudar la diferenciacin y acumular
lpidos. Estos efectos son independientes del aumento de los niveles de calcio
intracelular y de la actividad de la calcineurina, pero al menos parcialmente
dependen de la hiperactivacin de ERK y la regulacin de la actividad de C /
EBP.

Resultados

El calcio extracelular modula la diferenciacin de los

adipocitos marrones
Para estudiar el impacto del calcio extracelular sobre la diferenciacin de los
adipocitos marrones, los preadipocitos marrones inmortalizados se
diferenciaron durante ocho das en medio de cultivo celular regular que
contena 1,8 mM de calcio, medio suplementado con 10 mM de calcio o 10
mM de magnesio o medio sin calcio Como bajo contenido de calcio debido a ~
0,3 mM de calcio suplementado a todos los medios mediante el uso de FBS al
10%). El magnesio se us para controlar los efectos osmticos y de carga. Las
muestras se recogieron cada dos das durante el curso de tiempo de
diferenciacin de ocho das. El tratamiento de clulas con calcio 10 mM a lo
largo de la diferenciacin (da 0 - 8) disminuy la acumulacin de lpidos
segn se midi mediante la tincin con tincin de aceite rojo O
(figura 1A). Por el contrario, restringiendo la exposicin al calcio a los das 2-
8, despus de la fase de induccin inicial (das 0-2), slo se redujo ligeramente
la acumulacin de lpidos, con diferencias significativas detectadas slo en el
da 8 de diferenciacin. La limitacin de la exposicin al calcio alto a los dos
das iniciales de diferenciacin de los adipocitos impidi la acumulacin de
lpidos durante los primeros cuatro das. Tras la normalizacin de las
concentraciones de calcio extracelular al da dos, adipocitos marrones fueron
capaces de acumular lpidos, aunque la cantidad permaneci significativamente
reducido en comparacin con las clulas de control (Fig. 1A ). La exposicin a
magnesio 10 mM, o el uso de medio libre de calcio no perjudic la
acumulacin de lpidos en los adipocitos marrones (Figuras 1A , S1A). Es
importante destacar que ninguno de los tratamientos afect la viabilidad celular
(Figura S1B ).

Figura 1
El calcio extracelular modula la diferenciacin de los adipocitos
marrones. ( A ) Recorrido temporal del contenido lipdico de adipocitos
marrones diferenciados in vitro . Las clulas se trataron con 1,8 mM
(control), 10 mM de magnesio, 10 mM de calcio o calcio medio libre
durante 8 das (da 0-8), slo durante la induccin (da 0-2), o despus
de la induccin (da 2-8 ). Se muestran los contenidos de lpidos
sustrados de fondo, medidos por Oil Red O (500 nm) (n = 6) e
imgenes representativas de clulas teidas al da 8 despus del
control o tratamiento con calcio 10 mM. (Barra de tamao = 20 \ mu
m). ( B ) expresin de PPAR normalizada en TBP durante un curso de
tiempo de ocho das en las condiciones anteriores (n = 5). ( C) Western
Blot para PPAR y -actina durante el transcurso de ocho das de
diferenciacin con calcio normal 1,8 mM (control), calcio 10 mM
(Ca2 ), magnesio 10 mM (Mg2 ) y medio libre de calcio durante la
+ +
indicada puntos de tiempo. ( D ) La expresin gnica de los
marcadores osteognicos ColI y Runx2, as como los marcadores
musculares ACTA2 y MyoD normalizaron en TBP durante el transcurso
del tiempo de diferenciacin de ocho das en las condiciones indicadas
(n = 3). Para ( A , B y D ) los datos se muestran como media
SEM. ANOVA bidireccional con la prueba posthoc de Dunnett ( A , B ) y
la prueba posthoc de Tukey ( D); P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, ****
p <0,0001. Las imgenes completas de Western Blot se proporcionan
en la Informacin Complementaria.

Imagen a tamao completo

El anlisis de expresin gnica de PPAR (Figura 1B ) y C / EBP

(Figura S1C ) confirm el efecto supresor del calcio extracelular sobre la
diferenciacin de los adipocitos marrones. El alto contenido de calcio
extracelular a lo largo de la diferenciacin suprimi los niveles de ARNm de
PPAR y C / EBP, mientras que la exposicin de los das 2-8 no alter
significativamente la expresin de estos marcadores de diferenciacin. La
exposicin a niveles altos de calcio (10 mM) durante la fase de induccin
suprimi la expresin de PPAR y C / EBP hasta el da cuatro, pero la
normalizacin de los niveles de calcio restaur la expresin en puntos
posteriores (Fig. 1B , S1C). Curiosamente, la diferenciacin en medio libre de
calcio durante ocho das o desde los das 2-8 aument significativamente la
expresin de PPAR, mientras que la exposicin a magnesio alto no tuvo
ningn efecto en comparacin con las clulas diferenciadas en el medio de
control. La disminucin de la expresin de ARNm PPARy y su rescate sobre la
normalizacin del calcio se confirmaron a nivel de protena (Fig. 1C , S1D ).

Se sabe que el calcio extracelular regula el compromiso del linaje osteognico

versus adipognico en las BMSC 31 y los adipocitos marrones comparten
clulas progenitoras comunes con el msculo esqueltico. Por lo tanto, se
investig la expresin de los marcadores osteognicos Colgeno I (ColI) y
factor de transcripcin 2 relacionados con Runt (Runx2), as como los
marcadores miognicos -actina del msculo liso (ACTA2) y factor miognico
3 (Myf-3, MyoD) En clulas diferenciadas bajo condiciones de control, o
continuamente expuestas a altas concentraciones de calcio o magnesio alto. Ni
los marcadores osteognicos ni miognicos aumentaron significativamente en
el calcio tratado comparado con las clulas control o tratadas con magnesio en
cualquier momento durante la diferenciacin (Figura 1D ).

El calcio extracelular regula la actividad de C / EBP

y ERK independientemente del calcio intracelular
La induccin de la expresin de PPAR durante la adipognesis temprana
requiere la unin del promotor de C / EBP y \ delta 32 . Se ha demostrado que
las alteraciones de la expresin y / o activacin de C / EBP y inhiben la
diferenciacin de adipocitos en mltiples estudios 33 , 34 , 35 . Por lo tanto, se
estudi la cintica de C / EBP y expresin durante las primeras 48 horas de
diferenciacin (Fig. 2A ]. La expresin de C / EBP y alcanz su mximo
dos horas despus de la induccin de la diferenciacin. Sin embargo, no se
observaron diferencias entre los grupos de tratamiento, excepto la tendencia de
expresin de C / EBP a niveles ms altos en momentos posteriores en clulas
tratadas con alto contenido de calcio extracelular (Fig. 2A). Por el contrario, la
protena isoforma de C / EBP en la protena activadora enriquecida en hgado
(LAP) fue hiperfosforilada durante las primeras 24 horas, mientras que la otra
isoforma C / EBP transcripcionalmente activa (LAP *) fue comparable a los
controles (Figura 2B , S2A ) . La fosforilacin de la protena inhibidora
inhibidora de la protena inhibidora (LIP) C / EBP no cambi
significativamente tras el tratamiento con calcio. La relacin LAP / LIP es
importante para regular la expresin gnica adipognica 34 , lo que sugiere que
la incapacidad para inducir la expresin de PPARy tras la exposicin a alto
calcio extracelular es ms probable debido a una relacin desplazada pLAP /
pLIP.

Figura 2
El calcio extracelular regula las MAPKs y la actividad de C / EBP
independientemente del calcio intracelular. ( A ) expresin de C / EBP
y C / EBP normalizada a TBP durante las primeras 48 horas de
diferenciacin en 1,8 mM de calcio (control), 10 mM de magnesio, 10
mM de calcio y libre de calcio medio (n = 6). ( B ) Western Blot para
fosfo- (Thr235) / C / EBP total as como fosfo / total ERK y fosfo-
(Ser473) / AKT total durante las primeras 48 horas de diferenciacin
bajo 1,8 mM de calcio (control), 10 mM Magnesio (Mg2 ) y 10 mM de
+

calcio (Ca2 ) con -actina como control de carga. ( C) Western Blot

+

para ERK y -Actina fosfo- y total como control de carga de los ciclos
de 8 das de tiempo bajo control (1,8 mM de calcio), 10 mM de calcio y
10 mM de magnesio, as como condiciones de control y libres de calcio
durante la duracin indicada . ( D ) El aumento relativo de calcio
intracelular en preadipocitos marrones se mantuvo en 1,8 mM de calcio
(control) o 10 mM de calcio directamente y 10 minutos despus de la
inyeccin de IBMX o mezcla de induccin mostrada como incremento
porcentual de fluorescencia al nivel basal. Las clulas se cargaron con
el fluorforo de unin de calcio Fluo-4 (4 M) y la fluorescencia se
registr en Ex / Em = 485/520 en promediacin orbital (n = 3 con 3-4
repeticiones cada una). ( E) La expresin de PPAR se normaliz en
TBP en preadipocitos (da 0) y clulas diferenciadas en da 8 tratadas
da 0-8 con 1,8 mM de calcio (Da de control 0-8) o 10 mM de calcio (10
mM Ca da 0-8) suplementado Con DMSO, ionomicina (2 M) y / o el
2+

inhibidor de calcineurina FK506 (1 M) (n = 3). ( F ) Western blot para

ERK fosfo / total en preadipocitos (0 h) y preadipocitos inducidos (18 h)
con diferentes concentraciones del inhibidor de MEK PD0325901. ( G )
expresin de PPAR como porcentaje de control en adipocitos
diferenciados tratados con calcio 1.8 mM (control) o 10 mM de calcio
+/- el inhibidor de MEK PD0325901 (250 nM) durante 0-8 das (n =
5). Para ( A, D, E y G) Se muestran como media SEM, * p <0,05, ** p
<0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001; ( A ) ANOVA de dos vas ordinaria
con el test postoqumico de Dunnett, ( D , G ) Mediciones repetidas
ANOVA unidireccional con prueba postoqumica de Tukey y ANOVA
unidireccional de Kruskal-Wallis con la prueba de comparacin mltiple
de Dunn ( E ). Las imgenes completas de Western Blot se
proporcionan en la Informacin Complementaria.

Imagen a tamao completo

La fosforilacin de C / EBP est mediada principalmente por ERK. Se

observ la hiperactivacin de ERK en el tratamiento de alto contenido
extracelular de calcio de 6-48 horas, con efectos ms fuertes despus de seis
horas (Fig. 2B , S2B ) ya lo largo de los ocho das de tiempo de diferenciacin
(Fig. 2C , S2C ). Curiosamente, la reduccin de calcio extracelular disminuy
la fosforilacin de ERK a lo largo de los ocho das de tiempo de
diferenciacin, lo que indica que los niveles ms bajos de ERK fosforilacin
asociar con elevadas adipocitos diferenciacin en esta configuracin
experimental. En contraste, la fosforilacin de Akt, no se alter
significativamente en la exposicin al calcio alto (Fig. 2B). La regulacin de
la sealizacin de ERK a travs del calcio extracelular a travs del receptor de
deteccin de calcio (CaSR) es muy poco probable ya que su expresin no es
detectable en nuestras clulas, independientemente del tratamiento
(Figura S2D ). Por lo tanto, la hiptesis de que el aumento de calcio
extracelular podra activar el calcio / calmodulina dependiente de serina /
treonina protena fosfatasa calcineurina, que a su vez regula ERK y C / EBP
fosforilacin y por lo tanto adipocitos diferenciacin [ 27 , 36 , 37] . Las
concentraciones de calcio citoplasmtico aumentaron con la adicin de 3-
isobutil-1-metilxantina (IBMX) o la mezcla de induccin completa
(figura 2D). Sin embargo, no se observaron diferencias en las concentraciones
citoplasmticas de calcio entre el control y los altos niveles de calcio
extracelular, ni tampoco la inhibicin farmacolgica de la calcineurina
utilizando la adipognesis de rescate FK506 (Fig. 2D y 2E ). Los
experimentos con tampn libre de calcio mostraron que el aumento del calcio
citoslico se debe a la movilizacin intracelular de calcio, independientemente
de las concentraciones extracelulares de calcio (Figura S2E ). Estos datos
sugieren que la hiperfosforilacin de ERK y la inhibicin de la adipognesis
son independientes de la afluencia de calcio del espacio extracelular en nuestra
configuracin experimental.

Sobre la base de estos resultados, se investig si la titulacin ERK

fosforilacin a los niveles observados en clulas cultivadas en medio de
control podra rescatar marrn adipocito diferenciacin. Se encontr que 250
nM del inhibidor de MEK PD0325901 redujo la fosforilacin de ERK a la de
las clulas inducidas con el medio de control durante 18 horas (Fig. 2F ]. Sin
embargo, la reduccin de la fosforilacin de ERK de esa manera slo rescatar
parcialmente la adipognesis como se indica por la expresin de PPARy
(Figura 2G ).

El calcio extracelular modula la identidad del

adipocito marrn
Como se muestra para los adipocitos blancos, la diferenciacin de los
adipocitos marrones se inhibe por la elevacin prolongada de las
concentraciones de calcio extracelular. Por lo tanto, de forma similar a los
marcadores generales de la adipognesis, la induccin de la protena
desacoplante 1 (UCP1), PR dominio conteniendo 16 (PRDM 16) y PPAR
coactivator 1- (PGC1-) fue inhibido durante la diferenciacin a la
exposicin continua al alto calcio extracelular, Esto se recuper tras la
eliminacin despus del da 2 (figura 3A , S3A ). La reduccin del calcio en el
medio o la adicin de magnesio durante la diferenciacin mostraron tendencias
a la expresin elevada de UCP1, PRDM16 y PGC1-, en lnea con la expresin
de PPAR (Figura 3A , S3A). Por el contrario, la elevacin del calcio
extracelular despus de la induccin adipognica no poner en peligro la
acumulacin de lpidos o la expresin del marcador adipognico, pero la
expresin de genes completamente inhibida de UCP1 y otros genes marcadores
adipocito pardo como PGC1- y PRDM16 (Fig. 3B ). Es importante destacar
que el aumento de los niveles de ARNm de UCP1 en condiciones de bajos de
calcio y disminucin de la expresin bajo alta de calcio eran an ms
pronunciada en el nivel de protena, mientras que la recuperacin total de
UCP1 despus de la normalizacin de los niveles de calcio no se observ a
nivel de protena (Fig. 3C , S3C). Entre muchas otras funciones, PRDM16 y
PGC1- regulan la biognesis mitocondrial. Con este fin, analizamos la
abundancia y funcin mitocondrial en los adipocitos marrones expuestos al
alto calcio extracelular de los das 2-8 ya los controles. El factor de
transcripcin mitocondrial A (TFAM) fue ligeramente aumentado, lo que
sugiere algn aumento en el contenido mitocondrial durante la diferenciacin,
pero sin diferencias entre los grupos de tratamiento (Figura S3B ). Western
Blots para las subunidades de los cinco complejos de la cadena respiratoria
mitocondrial (complejo I-V) revel una ligera reduccin en la expresin de
algunas subunidades de los grupos tratados con calcio alto en comparacin con
los controles en el da 8 de la diferenciacin (Fig. 3D , S3D). Sin embargo, no
pudimos observar diferencias significativas en la respiracin mitocondrial
evaluada por la respirometra basada en placas usando un analizador de flujo
extracelular Seahorse (Fig. 3E y S3E ). La sntesis de ATP, la fuga de
protones y la respiracin mxima, tambin con el suministro adicional de
sustrato por la adicin de piruvato, no se alteraron en las clulas expuestas al
calcio (Fig. 3E y S3E ). Sin embargo, las clulas diferenciadas en medio que
contena alto contenido extracelular de calcio de los das 2-8 mostraron tasas
de acidificacin extracelular ms bajas, aunque iguales concentraciones de
lactato sobrenadante entre los grupos (Fig. 3E ). La expresin de FABP3 se
correlaciona con una mayor absorcin de cidos grasos de cadena larga y -
oxidacin en BAT de ratones knockout UCP1 38, 39 , 40 , 41 . En nuestro modelo
celular, FABP3 expresin fue fuertemente inducida durante la diferenciacin
en las clulas expuestas a alto calcio extracelular de das 2-8 y cuando las
clulas fueron continuamente expuestos a calcio (Fig. 3F y S3F ). Similar a las
clulas continuamente expuestas al calcio, tambin se observ una tendencia al
aumento de MyoD en la expresin en el da 8 en las clulas tratadas 2-8 con 10
mM de calcio (Figura 1D, S3G ).

figura 3
El calcio extracelular modula la identidad de los adipocitos marrones y
los marcadores termognicos. ( A ) La expresin de UCP1 y PRDM16
normaliz a TBP de preadipocitos diferenciados in vitro en un curso de
tiempo de ocho das bajo condiciones normales de calcio 1.8 mM
(control), 10 mM de calcio, 10 mM de magnesio y libre de calcio
durante los das 0-8 y los das 0 -2 (UCP1, PRDM16 n = 5). ( B )
expresin de UCP1, PGC1- y PRDM16 normalizada en TBP en estos
diferentes grupos de tratamiento durante los das 2-8 (UCP1, PRDM16
n = 7, PGC1- n = 4). ( C ) Western Blot para UCP1 y -actina durante
el curso de tiempo de diferenciacin de ocho das con calcio normal 1,8
mM (control), calcio 10 mM (Ca2 ), magnesio 10 mM (Mg2 ) O medio
+ +

libre de calcio durante los puntos de tiempo indicados. ( D ) OxPhos

Western Blot de preadipocitos (Con da 0) y adipocitos diferenciados en
1,8 mM de calcio (Con) o 10 mM de calcio durante los das 2-8 o das
0-8 con -actina como control de carga. ( E) Tasa de consumo de
oxgeno (OCR) y tasa de acidificacin extracelular (ECAR) en
adipocitos diferenciados al da 8, medida por el analizador de flujo
extracelular Seahorse. Las clulas se trataron con 1,8 mM de calcio
(control) o 10 mM de calcio durante 2-8 das durante la
diferenciacin. OCR se dividi en la respiracin basal, la produccin de
ATP, fugas de protones y la respiracin mxima, tambin en presencia
de piruvato (5 mM), mientras que ECAR inform tasa glicoltica, la
capacidad glicoltica y la diferencia de la capacidad glicoltica (ECAR)
antes y despus de 5 mM pyruvate (Junto con FCCP) (n = 3 para el
piruvato n = 2, 3-5 repeticiones tcnicas cada uno). Concentracin de
lactato del sobrenadante celular de adipocitos diferenciados de 8 das
tratados con calcio 1.8 mM (control) y calcio 10 mM (2-8 das) (n =
3). ( F) Expresin FABP3 normalizado a TBP durante el tiempo de
diferenciacin con 1,8 mM de calcio (control), 10 mM de calcio o 10 mM
de magnesio durante 2-8 das (n = 3). Los datos se muestran como
media SEM, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p
<0,0001; Mediciones ordinarias ( A , B ) y repetidas ( F ) ANOVA
bidireccional con la prueba de Dunnett posthoc. Dos pares de wilcoxon
emparejados pares firmaron la prueba de rango ( E : lactato). ( E :
OCR) Kruskal-Wallis ANOVA unidireccional con la prueba de
comparacin mltiple de Dunn. ( E : ECAR) ANOVA unidireccional
ordinario con la prueba posthoc de Tukey. Las imgenes completas de
Western Blot se proporcionan en la Informacin Complementaria.

Imagen a tamao completo

Discusin

El calcio juega un papel importante en mltiples procesos celulares. Aqu

mostramos que la modulacin de la concentracin de calcio extracelular y la
duracin de la exposicin regula la diferenciacin de los adipocitos marrones y
componentes clave del linaje de los adipocitos marrones. En lnea con los datos
anteriores sobre adipocitos blancos 29 , 34, Confirmamos que la exposicin
continua al alto contenido de calcio extracelular inhibe la acumulacin de
lpidos y la induccin de PPAR y C / EBP, ambos factores determinantes del
destino adipognico. Sin embargo, la exposicin a altos niveles de calcio
durante la fase de induccin no altera el compromiso de linaje a favor de
osteoblastos o miocitos. Por el contrario, el alto calcio extracelular hace una
pausa reversible de la adipognesis inmediatamente despus del compromiso
del linaje, ya que la eliminacin del bloque de calcio despus de la iniciacin
restaura la acumulacin de lpidos y la expresin del marcador adipognico. La
interrupcin de la diferenciacin de los adipocitos parece estar mediada por la
inhibicin de la actividad de C / EBP y , factores claves de transcripcin que
inician la diferenciacin de los adipocitos a travs de la induccin de PPAR y
C / EBP 42. Mostramos que el calcio extracelular elevado altera la proporcin
de fosforilacin de las isoformas C / EBP activadoras LAP y LAP * y el LIP
inhibitorio. La actividad de C / EBP es activada principalmente por ERK en
respuesta a la insulina 35 , 43 , 44 . Sin embargo, la sealizacin prolongada de
ERK tambin puede inhibir la diferenciacin de adipocitos 45. As, la
hiperactivacin continua de ERK, observada en respuesta al calcio extracelular
elevado, puede explicar tanto la inhibicin como la restauracin de la
diferenciacin adipocitaria. De hecho, la reduccin farmacolgica de la
actividad de ERK para controlar los niveles celulares restaur parcialmente la
diferenciacin de los adipocitos marrones, aunque la capacidad de
diferenciacin fue mucho menor que en las clulas de control. La disminucin
de la capacidad de este enfoque para restaurar la diferenciacin de los
adipocitos podra explicarse en parte por el hecho de que la inhibicin
farmacolgica MEK reduce los niveles totales de fosfo-ERK y no tiene en
cuenta las diferencias espaciales y temporales en fosfo-ERK dentro de
diferentes complejos de sealizacin. En esta etapa, no podemos excluir que
otras vas de sealizacin tambin contribuyen a la regulacin de la
adipognesis por el calcio extracelular. Sin embargo,

Quedan por determinar las seales aguas arriba que median la mayor
fosforilacin de ERK. En el contexto del calcio, es factible especular que la
calcineurina fosfatasa sensible al calcio, que se sabe que modula la actividad
ERK 27 , 36 , media estos efectos. Sin embargo, no se detecta un aumento de las
concentraciones intracelulares de calcio en respuesta a un aumento del calcio
extracelular que sera necesario para activar la calcineurina. Adems, la
inhibicin de la calcineurina no restaura la diferenciacin de adipocitos
marrones. Estos resultados estn en lnea con los datos anteriores de Jensen y
colegas que muestran que el alto calcio extracelular inhibe la adipognesis en
3T3-L1 clulas sin aumentar los niveles intracelulares [ 29], Lo que sugiere que
el calcio extracelular acta fuera de la clula para modular la actividad de las
protenas transmembrana. El receptor de deteccin de calcio acoplado a
protena G (CaSR), por ejemplo, se mostr que se expresaba en adipocitos y
activaba cascadas de sealizacin intracelular, especialmente ERK sobre unin
de calcio 46. Sin embargo, no se detect la expresin de CaSR en ni adipocitos
marrones aislados ni en nuestro modelo celular. Adems, no se observ un
aumento en el calcio intracelular asociado con la activacin CaSR. Por lo
tanto, aunque la implicacin de este receptor parece ser muy improbable, es
presumible que el calcio promueva la unin del receptor a ligandos, tales como
integrinas o cadherinas, lo que a su vez alterara la sealizacin
intracelular. En general, nuestros datos sugieren un papel muy general del
calcio extracelular durante la fase temprana de la diferenciacin de los
adipocitos, que parece conservarse entre los adipocitos blancos y marrones. En
futuros estudios, tambin se puede abordar por qu los adipocitos derivados de
mdula sea parecen responder de manera diferente.

Sin embargo, encontramos que el calcio extracelular tiene un efecto muy

especfico sobre los adipocitos marrones en etapas posteriores de
diferenciacin. La exposicin al calcio extracelular alto despus de la fase de
induccin inhibe la expresin de genes especficos de adipocitos marrones
tales como UCP1, PRDM16 y PGC1- con poco o ningn impacto en la
expresin de marcadores adipognicos generales y acumulacin de
lpidos. Como no se observaron diferencias en la respiracin mitocondrial entre
los grupos de tratamiento, la actividad de UCP1 es demasiado baja o requiere
activacin como se sugiri anteriormente 47 en nuestro modelo
celular. Alternativamente, se demostr que FABP3 acelera la -oxidacin y la
captacin de cidos grasos libres independientemente de UCP1 y mediar en la
respiracin desacoplada 38 , 41. Por lo tanto, es tentador especular que el
aumento observado en la expresin de FABP3 en las clulas tratadas durante
ocho das o de los das 2-8 con 10 mM de calcio, podra proporcionar una
explicacin alternativa para la falta de diferencias en la respiracin
mitocondrial, aunque los cambios en UCP1 expresin. La induccin de
FABP3, que se expresa predominantemente en cardiomiocitos y miocitos [ 39] ,
tambin podra sugerir un papel de calcio en la determinacin de compromiso
de linaje entre el msculo y adipocitos marrones. Sin embargo, no se observ
la expresin sustancial de los genes especficos del msculo, aunque una
exposicin prolongada podra ser necesaria para diseccionar este fenmeno.

En conclusin, proporcionamos evidencia de que la manipulacin del calcio

extracelular como un componente importante del microambiente puede tener
profundos efectos sobre la cintica y la naturaleza de laadipognesis de
novo . Hasta la fecha, diferentes plataformas biotecnolgicas tienen como
objetivo establecer protocolos para cultivar y expandir el tejido adiposo marrn
humano derivado del paciente ex vivo para trasplante de aloinjerto. Con este
fin, nuestros datos muestran que la omisin de calcio en el medio de cultivo
celular puede mejorar sustancialmente la diferenciacin de los adipocitos
marrn y la expresin del programa termognico. Por el contrario, nuestro
estudio no abordar si las alteraciones en las concentraciones locales de calcio
modular la funcin del tejido adiposo marrn in vivo, Especialmente en seres
humanos. Sin embargo, es tentador especular que la alteracin de las
concentraciones locales de calcio podra contribuir a la menor masa de grasa
marrn y la actividad de los sujetos obesos [ 22] .

Mtodos
Aislamiento celular y cultura
Se aislaron preadipocitos marrones de acuerdo con 48De adultos de ocho
semanas de edad C57Bl / 6 ratones. En detalle, se diseccion tejido adiposo
pardo murino (BAT) de la regin interescapular de ratn, se cort en trozos de
~ 1 mm y se digiri durante 30-45 minutos a 37C en DMEM que contena 1
mg / ml de colagenasa tipo IV (Gibco) y 10 mg / Ml de BSA (fraccin de
albmina V, Roth). La digestin se detuvo lavando las clulas con PBS
(Gibco) que contena 10 mg / ml de BSA. Se eliminaron los adipocitos
maduros y se cultivaron preadipocitos en medio Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM + GlutaMAX + glucosa alta, Gibco). Se inmortalizaron las
clulas utilizando un retrovirus T grande SV40 ecotrpico. Los experimentos
con animales se realizaron de acuerdo con la ley alemana de bienestar animal.

Para todos los experimentos con cultivos celulares se utilizaron medios

normales de crecimiento que contenan penicilina (100 unidades / ml) y
estreptomicina (100 g / ml) (Pen Strep, Gibco) as como suero fetal bovino al
10% (FBS, Gibco), suplementado con cloruro de calcio (Alto contenido de
calcio) o cloruro de magnesio (magnesio alto) para alcanzar una concentracin
final de 10 mM respectivamente. Se realizaron experimentos con bajo
contenido de calcio usando DMEM, glucosa alta, sin glutamina, sin calcio
(Gibco 21068) suplementado con piruvato de sodio 1 mM (Gibco), 1x
GlutaMAX TM-1 (Gibco) [equimolar con L - alanil - L - glutamina 2 mM], Pen
Strep y FBS al 10% (que contiene 3,5 mM de calcio). Los preadipocitos
marrones inmortalizados se hicieron crecer hasta 100% de confluencia (da 0)
y se indujo la diferenciacin con 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX,
Sigma), 125 M de indometacina (Santa Cruz), 5 M de dexametasona
(Sigma) NM de insulina (Sigma) y Triyodotironina 1 nM (T3, Calbiochem) en
el medio apropiado. El medio (suplementado con insulina y T3) se cambi
cada dos das hasta el da 8.

Para los experimentos con inhibidores, los compuestos se mantuvieron como

soluciones madre 1 mM (FK506, Ionomicina) y 10 mM (PD325901) en DMSO
a -20C y se suplementaron al medio en la dilucin apropiada: 2 M de sal de
calcio de iononomicina (Fisher Scientific) 1 \ mu M de inhibidor de
calcineurina FK506 ( Tacrolismus - Abcam), inhibidor de MEK 250 nM
PD0325901 (Sigma).

Aceite tinto rojo

Las clulas diferenciadas se fijaron en formalina al 10% (Roth), se lavaron en
agua y se deshidrataron en isopropanol al 60%. A continuacin, se aadi una
solucin de filtracin de aceite Red O al 60% (v / v) en agua (stock: 0,35% (p /
v) de aceite Red O (Alfa Aesar) en isopropanol 100% (Sigma), se incub
durante 10 minutos a Temperatura ambiente, se lav con agua y se sec. La
tincin se resolvi con isopropanol al 100% y se midi la absorcin a 500 nm
con un sistema de deteccin PHERAstar FS (BMG Biotech) referente al
contenido lipdico relativo de las clulas.

QPCR
La extraccin de RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen) y la sntesis de cDNA (0,5-
1 \ mu g de ARN total, Kit de Transcripcin Reverse Transcription cDNA de
Alta Capacidad, Applied Biosystems) se realizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El qPCR se realiz en un termociclador tctil
C1000 (Bio Rad), utilizando cebadores directos e inversos de 300 nM y una
supermezcla iTaq Universal SYBR Green (BioRad). La expresin del gen de
destino se normaliz en la expresin de la protena de unin a la caja de TATA
del gen de limpieza (TBP) [ 49] . Las secuencias de cebadores se muestran en la
Tabla 1 complementaria . Los clculos para la expresin relativa (RE) de los
genes de inters (GOI) se realizaron de la siguiente manera: 2 CT (TBP) -CT (GOI) .

Mancha occidental
Las clulas se lisaron en Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%,
EDTA 1 mM, glicerol al 5%, SDS al 0,1% que contena inhibidor de proteasa e
inhibidores de fosfatasa (Sigma). Se cargaron 15-20 g de protena (15-30 g
para la deteccin de UCP1) en geles de SDS prefabricados de 4-12%
(Invitrogen) o en geles de SDS de acrilamida al 10% y se transfirieron sobre
membranas de PVDF de 0,45 m, las cuales se bloquearon en 5 % De BSA en
TBS con Tween 20 al 0,1% (TBS-T) una hora a temperatura ambiente (2 horas
para UCP1). Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (lista en
la Tabla Suplementaria 2) Durante la noche a 4C, se lavaron en TBS-T y se
incubaron con los anticuerpos secundarios acoplados a HRP apropiados una
hora a temperatura ambiente. Las membranas se desarrollaron con un sustrato
de HRP quimioluminiscente (Immobilon Western, Millipore) usando pelculas
(Hyperfilm ECL, GE Life Sciences, CL-XPosure Film, Thermo Scientific). La
cuantificacin de Western Blots se realiz utilizando el software ImageJ.

Medicin de calcio con Fluo-4

Las clulas se hicieron crecer hasta 100% de confluencia (da 0) en placas de
fondo de vidrio de 96 pocillos (Eppendorf) para medir la fluorescencia con un
PHERAstar FS (BMG Biotech) usando la ptica inferior del mdulo ptico FI
485 520 (Ex / Em) A 915 con 20 destellos por pocillo en un modo de promedio
orbital que rodea en 3 mm de dimetro. Todos los pasos adicionales se
realizaron a 37 C con diluciones pre-calentado en el tampn de control, 1x
SBS (mM KCl 5, NaCl 140 mM, glucosa 8 mM, HEPES 10 mM, 0,8 mM
MgCl 2 , 1,8 mM CaCl 2, PH 7,4). Para experimentos con alto contenido de
magnesio (10 mM), calcio alto (10 mM) y libre de calcio (0 mM) se prepararon
tampones 1x SBS especficos que contenan las concentraciones apropiadas de
magnesio y calcio. Las clulas se lavaron en tampn SBS que contena
probenecid 1 mM (Santa Cruz) y se incubaron con 4 M Fluo-4 AM (Cat. #
F14201, Thermo Scientific), 0,02% de Pluronic F-127 (Biotium) y 1 mM de
probenecid (Santa Cruz ) Durante una hora a 37 C y se lav de
nuevo. Despus de 30 minutos, la fluorescencia basal se detect en intervalos
de varios segundos. IBMX o mezcla de induccin completa diluida en 1x SBS
libre de calcio (concentraciones finales bajo aislamiento celular y cultivo) Con
una velocidad de 190 l / s. Despus de la mezcla orbital (100 rpm) se detect
la emisin de fluorescencia a 520 nm. Los valores se muestran como aumento
del doble en la intensidad de fluorescencia (%) despus de la inyeccin.

Consumo de oxgeno celular y tasas de acidificacin

extracelular
Las clulas se sembraron en placas Seahorse de 96 pocillos y se diferenciaron
durante ocho das con calcio 1.8 mM (control), altas concentraciones de
magnesio (10 mM), calcio alto (10 mM) o libre de calcio durante 2-8 das. La
velocidad de consumo de oxgeno (OCR) y la tasa de acidificacin extracelular
(ECAR) se midieron con un analizador de flujo extracelular XF96 (Seahorse
Bioscience, tecnologas Agilent). Las clulas se equilibraron a 37C en DMF
modificado con medio de ensayo XF (Seahorse Bioscience) suplementado con
glucosa 25 mM una hora antes de la medicin. Todos los compuestos se
diluyeron en concentraciones de diez veces en medio de ensayo y se cargaron
en los orificios de cartucho equilibrados de la siguiente manera: A)
oligomicina (Merck) 20 \ mu g / ml, B) FCCP 10 \ mu M (sistemas R & D) +/-
50 mM de piruvato de sodio Gibco), C) rotenona 25 M y antimicina A
(Sigma), D) 1 M $ $ desoxi-D-glucosa (Alfa Aesar). Cada ciclo comprenda
dos minutos cada uno de mezcla, espera y medicin. La respiracin no
mitocondrial (OCR) y la acidificacin no glicoltica (ECAR) se restaron de
otros valores para determinar la captacin de oxgeno mitocondrial. Para el
anlisis, los valores medios de los dos ltimos ciclos previos a la inyeccin
(respiracin basal, acidificacin / gluclisis) o los dos primeros despus de la
inyeccin (suma de produccin de ATP y fugas de protones o respiracin
mxima (OCR) y mxima acidificacin / capacidad glicoltica ECAR)) se
calcularon y calcularon.

Ensayo de lactato
Las clulas se diferenciaron en 1,8 mM de calcio (control) o para el da 2-8 en
alto de calcio (10 mM) medio. El sobrenadante de clulas al da 8 se diluy y
se midi el lactato con el Kit de Ensayo Colorimtrico / Fluoromtrico de
Lactato (Biovision).

Anlisis estadstico
Los datos se presentan como medias SEM. Todos los anlisis estadsticos se
realizaron con GraphPad Prism. Las muestras se sometieron a prueba para la
 distribucin normal con la prueba de normalidad de D'Agostino-Pearson, la
prueba de normalidad de Shapiro-Wilk o la prueba de Kolmogorov-Smirnov
con Dallal-Wikinson Lillie para el valor de P. Las pruebas paramtricas o no
paramtricas se realizaron segn lo indicado en las leyendas de la figura. La
prueba t de Student de dos colas, ANOVA unidireccional y bidireccional para
comparaciones mltiples se utilizaron con el nivel a 0,05 para determinar los
valores de P.

Disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos generados durante y / o analizados durante el presente
estudio estn disponibles en el autor correspondiente a peticin razonable.

Informacin Adicional

Nota del editor: Springer Nature permanece neutral con respecto a las
reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y en las afiliaciones
institucionales.

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