INMUNIZACIN DE ANIMALES

La Inmunizacin es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente

desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmungeno. El tipo y magnitud de la
respuesta producida se deben a mltiples variables entre ellas se encuentra: la inmunogenicidad de
un antgeno, que depende de su complejidad estructural, peso molecular, conformacin y naturaleza
qumica, dosis, va de administracin etc.

La sntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra molculas especficas que el organismo no

reconoce como propias (determinantes antignicos), para que esta sntesis ocurra, primero debe
existir un contacto entre las clulas presentadoras de antgeno y el determinante antignico, contacto
que es mediado por algunas clulas involucradas en la respuesta celular (linfocitos T y B). Como
resultado se induce una respuesta inmunolgica.

Cuando un organismo se expone a un antgeno desconocido, el sistema inmune puede requerir

mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos, los se detectan en el suero a
partir del dia de inmunizacin (fase lag), incrementa su produccin (fase log) hasta llegar a un
mximo (meseta) Al final de la infeccin la concentracin alcanzada de anticuerpos declina. A tal
respuesta se le llama primaria. La parte ms reconocible de inmunoglobulina es IgM. Cuando el
organismo se expone posteriormente al antgeno, la respuesta ocurre mucho ms rpido (la fase lag
disminuye) y la concentracin alcanzada, es apreciablemente mayor, en este caso se habla de
respuesta secundaria. La parte ms reconocible en este caso es la inmunoglobulina IgG. Esta parte
reconocible del Ac refleja la diferencia en la ruta de inmunizacin y la naturaleza del inmunogeno.
Un mismo antgeno puede no tener la misma inmunogenicidad en diferentes especies de animales,
ya que depende de las caractersticas genticas, la edad y el sexo del individuo inmunizado.

La dosis del inmunogeno es un factor importante para lograr una respuesta inmunolgica, ya que
cantidades excesivas o minimas del antgeno pueden inducir el fenmeno de tolerancia (estado de
no respuesta de a un antgeno en particular).

El estado fsico del antgeno debe tomarse en cuenta para designar la ruta de inmunizacin, es decir,
los antgenos particulados preferentemente son introducidos al organismo por va intravenosa,
mientras que los antgenos en solucin pueden introducirse por diversas vas, como intramuscular,
intraperitoneal, subcutnea e intradrmica. En estas dos ltimas se utiliza preferentemente el
antgeno acompaado de un inmunopotenciador o adyuvante. Estos actan inespecficamente para
incrementar la respuesta inmune especfica a un antgeno dado. Los adyuvantes pueden actuar a
travs de la retencin y liberacin del antgeno. El adyuvante ms utilizado en animales de
experimentacin es el de Freund.

ADYUVANTES INMUNOLGICOS

Son sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterognea si se toman en
consideracin su origen, naturaleza qumica y actividad biolgica especfica; Como los agentes
inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2 funciones fundamentales: la estimulacin de la
resistencia no especfica del husped contra las enfermedades infecciosas y el cncer; y, por otra
parte, la potenciacin de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los
animales de laboratorio durante la inmunizacin experimental con vistas a la produccin de
antisueros.
Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antgeno o inyectados
simultneamente con l, hacen ms efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una
economa de antgeno y de tiempo, as como un mayor nivel de anticuerpos especficos. El aumento
de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios de los siguientes procesos:

a) Incremento de la produccin de anticuerpos especficos frente a un antgeno

vacunal.

b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciacin de su

funcin neutralizante, germicida, opsonizante etc.

c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por clulas T

d) Generacin de una respuesta humoral y/o celular de mayor duracin.

e) Generacin de una respuesta incrementada de memoria inmunolgica.

Los principales adyuvantes son:

ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND: es una emulsin estabilizada de aceite no metabolizable en

agua. Las emulsiones tienden a producir concentraciones ms altas y duraderas de anticuerpos.

ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND: es igual que el incompleto pero contiene bacterias

atenuadas de Mycobacterium tuberculosis. Este produce granulomas y es muy irritante, por lo que no
est indicado para su uso en el ser humano.

ALUMN: compuesto de aluminio (fosfato o hidrxidos) y es el ms utilizado en el hombre. Para

incrementar la estimulacin no especfica, se asocia en ocasiones a bacterias muertas de Bordetella
pertussis. Si se emplea estas bacterias no se puedeinyectar por va intravenosa, pero si por el resto
de las vas de inmunizacin.

VIAS DE INMUNIZACIN

La eleccin de la va de inmunizacin va a depender de varios factores: cantidad que hade

administrarse, Solucin en la que a resuspenderse o diluirse el inmungeno y qu otros
componentes se han asociado (por ejemplo la B. pertussis no puede inocularse por va intravenosa) y la
rapidez o velocidad a la cual el inmungeno debe ser liberado a los vasos linfticos y a la circulacin. Las
principales vas de inmunizacin son:

Subcutnea: es muy fcil de realizar y permite inocular volmenes grandes, pueden administrarse
en sucesivas veces.
Intramuscular: el antgeno se libera lentamente, el volumen a inocular vara en funcin del tamao
del animal.
Intradrmica: es ms difcil de realizar y permite inyectar volmenes reducidos.
Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberacin rpida del antgeno
en el ratn, la inyeccin se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola)
Ndulos linfoides: empleada principalmente en el campo de la investigacin, se realiza en raras
ocasiones
Intraperitoneal: se utiliza frecuentemente en animales pequeos (cobaya, ratn, rata, hmster, etc.)
permite inocular una grandes volmenes en ratones, no est recomendada para conejos.
Excepto inmungenos particulares (tipo virus, hongos, bacterias, etc.) que slo deben inyectarse va
subcutnea, intramuscular o intradrmica, el resto (protena solubles, insolubles ,carbohidratos y
cidos nucleicos) pueden inyectarse de forma intravenosa adems de las vas anteriores.

ASPECTOS DEL ANTIGENO, DEL ANIMAL DE EXPERIMENTACION Y METODOS DE

INMUNIZACION QUE AFECTAN LAS RESPUESTAS INMUNOLOGICAS.

El desarrollo de la respuesta inmune se ve afectado por numerosos procesos que dependen del
propio hospedador, del agente patgeno o del medio externo.

Factores intrnsecos

La especie animal es un factor fundamental en la respuesta inmune, pero dentro de ella se pueden
observar grandes variaciones debidas a otros factores intrnsecos.

a) Individuo: depende de las caractersticas genticas, la edad y el sexo.

b) Estado fisiolgico: Reproduccin: En adultos, el sistema inmune se ve gravemente
comprometido en la maduracin sexual y durante la poca reproductiva, momento en el que
se da una conjuncin de factores que afectan negativamente a las defensas del organismo.
c) Estrs: El estrs es una respuesta adaptativa del organismo que produce cambios en el
sistema de defensa, pero que cuando es muy agudo o prolongado en el tiempo conlleva la
supresin de la respuesta o un desarrollo desmesurado de la misma, lo que puede
desequilibrar al resto de sistemas fisiolgicos y desencadenar el desarrollo de enfermedad. La
primera respuesta del organismo frente a un factor estresante, es la liberacin de
corticosteroides, siendo el cortisol su principal componente. Dependiendo de la naturaleza,
intensidad y duracin de los factores estresantes, los efectos en la resistencia a la
enfermedad pueden ser completamente diferentes

Aspectos del Antgeno:

Las respuestas inmunitarias son inducidas por los antgenos. Por ello, encontramos varios factores
que afectan a la regulacin de estas respuestas:

Naturaleza del antgeno: Las bacterias extracelulares, los productos bacterianos, y

en general los antgenos solubles suelen inducir principalmente una respuesta
humoral. Ahora bien, los antgenos polisacardicos y lipdicos, al no poder ser ligados
al MHC, no son presentados a los linfocitos TH restringidos por el MHC propio
(aunque como dijimos, recientemente se ha comprobado que al menos algunos
lpidos de micobacterias pueden ser asociados con molculas CD1 y presentado a
linfocitos T) por lo que no hay respuesta celular, sino que generan produccin de IgM,
sin memoria inmunolgica ni maduracin de la afinidad (respuesta humoral timo-
independiente).

Los patgenos intracelulares provocan sobre todo respuesta celular. Si los parsitos
no logran ser eliminados, pueden aparecer patologas

Cuando el antgeno es eliminado, las clulas T y B vuelven a reposo, por lo que el sistema inmune
va disminuyendo la intensidad de su respuesta.
 Dosis de antgeno: una dosis excesiva o mnima puede generar un respuesta de no respuesta o
tolerancia.

Competencia de antgenos: La presencia de un antgeno determinado es una mezcla de antgenos

puede provocar una gran disminucin de la respuesta inmune a estos otros antgenos. Esto puede
ocurrir incluso entre epitopos de una misma molcula antignica. La posible explicacin estriba en la
competencia entre distintos pptidos procesados (de distintas molculas o de la misma) por unirse al
surco de las molculas MHC, de modo que el pptido ms inmunodominante se une a casi todas las
MHC disponibles, evitando la unin de otros pptidos; ello evita la activacin de clulas T que
reconocen esos otros pptidos Cuando el antgeno es eliminado, los linfocitos B y T vuelven a una
situacin de reposo y la respuesta inmune va disminuyendo de intensidad.

Aspectos del mtodo de inmunizacin:

Subcutnea: es muy fcil de realizar y permite inocular volmenesgrandes, pueden administrarse

en sucesivas veces.
Intramuscular: el antgeno se libera lentamente, el volumen a inocular vara en funcin deltamao
del animal.
Intradrmica: es ms difcil de realizar y permite inyectar volmenes reducidos.
Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberacin rpida delantgeno en
el ratn, la inyeccin se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola). Intraperitoneal: se utiliza
frecuentemente en animales pequeos (cobaya, ratn, rata,hmster, etc.) permite inocular una
grandes volmenes en ratones, no est recomendada para conejos.

Mtodos de purificacin de protenas:

El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para posteriormente poder
extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo de rotura a elegir depende de las
caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se va a aislar la protena, as como de su
localizacin. Entre los distintos mtodos ellos estn:

Lisis celular: Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos animales, pero no es
suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin
hipotnica (ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al
interior de la clula, causando su hinchamiento y rotura.

Destruccin mecnica: Entre estos mtodos se encuentran la homogenizacin (hacer pasar las
clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con
arena o almina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las clulas a gran
velocidad a travs de un pequeo orificio), la sonicacin (someter las clulas a vibraciones de
ultrasonido).

Congelacin-descongelacin: La rotura se produce al someter las clulas a un cambio brusco de

temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a
temperatura ambiente (25 C).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extraccin
para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones
especficos para protenas solubles o bien que contengan adems detergentes si se pretende
purificar protenas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se
desnaturalice.

Mtodos cromatogrficos para separacin de protenas:

Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga, tamao o afinidad de las
diferentes protenas. Uno de los mtodos ms habitualmente utilizados para la separacin de
protenas es la cromatografa en columna, aunque tambin existe la cromatografa en papel y en
placa. La columna est rellena con un material slido con las caractersticas qumicas adecuadas
(fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace pasar a travs de la columna (fase mvil). El
extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna
con la fase mvil. Cada protena migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidad por la fase
estacionaria.

Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos: La filtracin o exclusin molecular, El

cromatografa de intercambio inico , La cromatografa hidrofbica, La cromatografa de afinidad.

Filtracin en gel o cromatografa de exclusin molecular: La fase estacionaria esta constituida

por partculas de polmeros de diferente porosidad. La separacin se basa en el tamao de las
partculas. Las protenas ms grandes que no pueden penetrar en los poros de las partculas de la
matriz de filtracin son eluidas con ms rapidez que las protenas ms pequeas que penetran por
los poros de las partculas y siguen un camino ms tortuoso y ms largo. El tamao de los poros
internos depende de la naturaleza del polmero en cuestin, y permite la entrada a protenas por
debajo de un determinado peso molecular.

Cromatografa de intercambio inico: En ella, la columna est rellena con un soporte al que van
unidos grupos cargados positivamente (intercambio aninico) o negativamente (intercambio
catinico). Estos grupos cargados normalmente estn neutralizados por iones del tampn. Estos
iones son reversiblemente reemplazados por las protenas con ms tendencia a unirse al soporte.
Las protenas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catinicos o aninicos
dependiendo de su carga neta. Las protenas ms cargadas se unirn ms fuertemente al
intercambiador y por lo tanto sern ms difciles de eluir. Una vez pegadas las protenas, para
eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza inica de la fase mvil (aumentando
la concentracin de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las protenas mas dbilmente
retenidas y cuando la fuerza inica sea mayor saldrn las protenas ms cargadas y por lo tanto ms
retenidas.

Cromatografa hidrofbica: Se trata de un mtodo similar al anterior con la nica diferencia de que
la fase estacionaria es apolar (hidrofbica), es decir, la protena se pega al soporte por los resto de
aminocidos apolares, cuanto ms residuos de este tipo tenga en su superficie, ms apolar ser,
ms se retendr en la columna y se eluir ms tarde. En este caso a elusin se realiza aumentando
la apolaridad de fase mvil.

Cromatografa de afinidad: Muchas protenas tienen la capacidad de unirse especficamente a

ciertas molculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta tcnica la molcula que se
une especficamente a la protena se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a
una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de protenas se aplica a la columna, la protena
buscada se unir al ligando inmovilizado mientras que las dems saldrn de la columna con el
tampn.

Dialisis: utiliza un gradiente de concentracin para forzar la difusin de molculas de bajo peso
molecular a travs de una membrana semipermeable.

Centrifugacin diferencial: despus de la homogenizacin las clulas se someten a centrifugacin

diferencial, la muestra se hace girar a unas 500 veces la fuerza de la gravedad. Si la protena
deseada no se consigue, entonces la velocidad aumenta para separar las mitocondrias y asi hasta
obtener las protenas deseadas para la investigacin.

Precipitacin por sales: utiliza sulfato de amonio para separar protenas por salazn debido a que
el sulfato de amonio es una sal divalente, son necesarias una mayor cantidad de molculas de agua
para solvatar los iones de sal presentes. De esta maneraexiste una menor cantidad de molculas de
agua disponibles para interactuar con la protena y las interacciones protena-protena aumentan y
la hacen precipitar.

Electroforesis: se basa en el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico, hacia un

electrodo con carga opuesta. El soporte para la electroforesis es un polmero de agarosa o
acrilamida