TESIS de Maestra en

Tecnologa de los Alimentos

"ESTUDIO DE LA VIDA TIL DE QUESO CREMA

UTILIZANDO MICROBIOLOGA PREDICTIVA"

Tesista: Miryam Siciliano

Director: Sandra Guerrero

Codirector: Stella Alzamora

Ciudad Autnoma de Buenos Aires, 2010

 A mi marido, Guillermo, por alentarme siempre en mi superacin como
profesional.

A mis hijas,Brbara y Cecilia, a quienes dediqu principalmente mi vida.

A mi nietito, Juani , rey de mi corazn.

A mi madre y a la memoria de mi padre.

INDICE
1-INTRODUCCIN, 2

1.1 Origen del queso, 2

1.2 Produccin y consumo nacional e internacional del queso, 3

1.3 Proceso de elaboracin del queso, 5

1.3.1 Preparacin de la leche, 6

1.3.2 Cuajado, 7

1.3.3 Corte de la cuajada, 7

1.3.4 Moldeado, 8

1.3.5 Prensado, 8

1.3.6 Salado, 9

1.3.7 Madurado, 9

1.3.8 Acabado, 10

1.4 Produccin de queso untable sin conservante (sorbato de potasio)

efectuada por Danone para el presente estudio, 10

1.5 Variedades de quesos, 13

1.6 Clasificacin de quesos, 14

1.7 El queso y la salud, 16

1.8 El queso como alimento nutritivo,16

1.8.1 Aporte de macronutrientes, 17

1.8.2 Aporte de micronutrientes, 18

1.9 El queso como alimento seguro, 19

1.10 Tecnologas combinadas de preservacin, 22

1.10.1 Efecto de la reduccin de la aw, 23

 1.10.2 Efecto de la reduccin de pH, 24

1.10.3 Efecto del sorbato de potasio, 26

1.10.4 Utilizacin de antimicrobianos naturales, 26

1.10.4.1 Timol, 27

1.11 Calidad, vida til y seguridad, 28

1.12 Microbiologa predictiva, 29

1.12.1 Generalidades, 29

2-OBJETIVOS, 36

2.1 Objetivo general, 36

2.2 Objetivos especficos, 36

3- MATERIALES Y MTODOS, 39

3.1 Matriz utilizada, 39

3.1.1 Elaboracin del queso untable base, 39

3.1.2 Medicin del pH, 40

3.1.3 Medicin de la actividad de agua (aw),40

3.2 Reactivos utilizados, 41

3.2.1 Medios lquidos de enriquecimiento selectivo y no selectivo, 41

3.2.2 Medios slidos de aislamiento diferencial y selectivo, 42

3.2.3 Otros reactivos utilizados, 43

3.3 Microorganismos utilizados, 43

3.3.1 Caracterizacin de los microorganismos utilizados en este

estudio, 45

3.4 Metodologa, 46

3.4.1 Preparacin de los inculos, 46

 3.4.2 Preparacin de la solucin de timol.Evaluacin sensorial,46

3.4.3 Inoculacin del queso untable base, 46

3.4.4 Recuento de los microorganismos, 47

3.5 Estudios realizados, 47

3.5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento, 47

3.5.2 Estudio del efecto de la ausencia de sorbato de potasio (queso

untable base), 48

3.5.3 estudio sobre el efecto del pH, 48

3.5.4 Estudio de reto microbiano, 50

3.5.5 Utilizacin de timol, 50

3.6 Obtencin de las curvas de crecimiento o supervivencia.Modelado

matemtico, 51

3.6.1 Modelado primario, 51

3.6.1.1 Modelo para caracterizar curva de crecimiento, 51

3.6.1.2 Modelo para caracterizar curva de supervivencia, 53

3.6.2 Modelado terciario, 54

3.7 Anlisis estadstico, 56

4- RESULTADOS, 58

4.1 Estudio de la microbiologa predictiva en queso untable base. Efecto

de la temperatura de almacenamiento, 58

4.2 Estudio en queso untable base, 64

4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento, 68

 4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas
responsables de ETAS, 86

4.4.1 S.aureus, 86
4.4.2 E.coli, 96
4.4.3 S.Enteritidis, 105
4.4.4 L.monocytogenes, 113

4.5 Uso de antimicrobianos naturales:timol, 121

5-CONCLUSIONES, 132

6-APNDICE, 136

6.1 Definiciones y frmulas, 137

6.1.1 Poblacin estadstica, 137

6.1.2 Distribucin normal, 137

6.1.3 Parmetros y estimadores, 138

6.1.4 Significancia estadstica, 140

6.2 Anlisis de la varianza (ANOVA), 141

6.2.1 Test F de significacin de la regresin, 143

6.2.2 Coeficiente de determinacin R2, 144

6.2.3 Anlisis de residuales, 145

6.2.3.1 Versus valores predichos,Y1, 145

7- BIBLIOGRAFA, 147
 RESUMEN

En microbiologa predictiva los modelos matemticos son utilizados para

predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.
Antes de ser utilizados en una situacin prctica, estos modelos matemticos
deben ser validados con el propsito de demostrar que las bacterias se comportan
de igual modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo que se
utilizaron para generar dichos modelos. En este trabajo se estudi el crecimiento
o la inactivacin de diferentes microorganismos ptogenos de relevancia en
queso untable (S.aureus; E. coli; S. Enteritidis y L. monocytogenes) bajo
diferentes condiciones microambientales (pH; temperatura; presencia de sorbato
de potasio; presencia de timol). Dichas respuestas fueron caracterizadas por los
modelos primarios de Gompertz y Gompertz modificado para muerte obteniendo
los parmetros caractersticos. Tambin se utiliz para la prediccin el programa
terciario de modelado de patgenos PMP. Los modelos fueron validados
estadsticamente y tambin por los estudios de reto microbiano en queso untable.
El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no
present limitaciones estadsticas. No ocurri lo mismo con el modelo de
Gompertz modificado para muerte, el cul sobreestim la cada global al final del
almacenamiento en muchas situaciones. El programa de simulacin modelado de
patgenos mostr debilidades al momento de predecir la conducta microbiana en
el queso untable debido seguramente a las limitaciones biolgicas imperantes en
el queso. Este estudio resalt la necesidad de validar los modelos matemticos en
un alimento real.
 RECONOCIMIENTOS

A la Dra. Sandra Guerrero por el tiempo que me ha dedicado y por su excelente

direccin y dedicacin .

A la Dra. Stella Alzamora por su valiosa co-direccin.

Al Director Municipal de Salud Ambiental de la Secretara de Salud Pblica de la

Municipalidad de Lomas de Zamora quien comprendi , incentiv y aval
siempre y desde un principio toda la capacitacin que enriquece
profesionalmente a las personas, Ingeniero Arturo Villafae.

A los Ingenieros Jorge Orlandini y Jorge Millosi de la empresa Danone-La

Serensima por proveerme gentilmente el queso expresamente preparado para
esta Tesis y toda la informacin necesaria.

A los tcnicos y auxiliares del Laboratorio de Control de Alimentos de la

Municipalidad de Lomas de Zamora ,Sra. Hilda Alvarez, Srita.Mara Victoria
Alves Fernandes y Sra.Nelly Santilln, por asistirme con la preparacin de
medios y material en todo momento que fuera necesario.

A mis compaeros de trabajo por amenizar largas horas de trabajo.

 LISTADO DE FIGURAS Y TABLAS

INTRODUCCIN Y MATERIALES Y MTODOS

Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (ao 2002)

(PAG.3)

Figura 1. Consumo mundial de quesos per cpita (PAG.4)

Figura 2.Produccin nacional de quesos (PAG.4)

Figura 3. Consumo nacional per cpita de diferentes quesos (PAG.5)

Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboracin de Queso (PAG.6)

Figura 5: Preparacin de la leche (PAG.7)

Figura 6: Proceso de cuajado (PAG.7)

Figura 7: Corte de la cuajada (PAG.8)

Figura 8: Moldeado (PAG.8)

Figura 9: Prensado (PAG.9)

Figura 10: Salado (PAG.9)

Figura 11: Madurado (PAG.10)

Figura 12: Acabado (PAG.10)

Figura 13. Pirmide nutricional (PAG.17)

Figura 14. Parmetros matemticos de la ecuacin de Gompertz

(PAG.52)

Figura 15. Parmetros de la ecuacin de Gompertz modificada para

muerte (PAG.53)

Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano (PAG.55)

Figura 17: Ejemplo de curva de supervivencia bacteriana (PAG.55)

 RESULTADOS

Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5C (-- ) y

15C ( -- ) en el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en
queso untable (b); (I) desvo estndar. (PAG.59)
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable almacenado a 5C, (
) valores
experimentales; () prediccin (PAG.61)
Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable almacenado a 5 C. (PAG.61)
Figura 3 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin
de S.aureus en queso untable almacenado a 5C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin. (PAG.62)
Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable almacenado a 15C, (
)
valores experimentales; () prediccin. (PAG.63)
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable almacenado a 15 C. (PAG.64)
Figura 5: Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin
de S.aureus en queso untable almacenado a 15 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin. (PAG.64)
Figura 6: Comportamiento de S.aureus a 15C en queso untable sin
(base, --) y con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (--); (I)
desvo estndar. (PAG.65)
Figura 7 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base almacenado a 15C, (
)
valores experimentales; () prediccin . (PAG.66)
Tabla 3 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base almacenado a 15 C. (PAG.66)
Figura 8 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin
de S.aureus en queso untable base almacenado a 15 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
(
) valores experimentales; () prediccin. (PAG.67)
Figura 9 : Comportamiento de S. aureus en el queso untable base
almacenado a 10C (-- ), 15C ( -- ) y 22C ( --). (a) pH 5,0; (b) pH
4,3; (I): desvo estndar. (PAG.69)
Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH
5,0 y diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10 C, (b): 15C y
(c): 22C . ( ) prediccin , ( --- ) limite de confianza superior predicho,
( --- ) limite de confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales;
(I) desvo estndar. (PAG.71)
Figura 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a
10C, (
) valores experimentales; () prediccin . (PAG.73)
Tabla 4: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base almacenado a 10 C. (PAG.73)
Figura 12 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin
de S.aureus en queso untable base almacenado a 10 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
(
) valores experimentales; () prediccin. (PAG.74)
Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
22C, (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.75)
Figura 14 : Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.76)
Tabla 5: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parmetros caractersticos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 22 C (PAG.76)
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10 C(a), 15C (b) y
22C (c): () prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, (
--- ) lmite de confianza inferior predicho ,(-- ) datos experimentales.
(PAG.78)
Figura 16 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a
10C, (
) valores experimentales; () prediccin . (PAG.79)
Tabla 6: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parmetros caractersticos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 4,3) almacenado a 10 C (PAG.80)
Figura 17: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto
para el crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3)
almacenado a 10 C: a) Valores observados vs valores predichos; b)
Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin (PAG.80)
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a
15C, (
) valores experimentales; () prediccin . (PAG.81)
Tabla 7: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parmetros caractersticos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 4,3) almacenado a 15 C (PAG.82)
Figura 19: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . (
) valores experimentales; () prediccin.(PAG.82)
Figura 20 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base ( pH 4.3) almacenado a
22C, (
) valores experimentales; () prediccin . (PAG.83)
Tabla 8: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parmetros caractersticos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 4,3) almacenado a 22 C (PAG.84)
Figura 21: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C: Valores
observados vs valores predichos (PAG.84)
Figura 22: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22
C:Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin (PAG.85)
Figura 23: Evaluacin del comportamiento de S.aureus en queso untable
base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ),
17C ( -- ) y 25C ( --); (I) desvo estndar. (PAG.87)
Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6 C (a),
17C (b) y 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior
predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (--) datos
experimentales. (PAG.88)
Figura 25: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base almacenado a 6C, (
)
valores experimentales; () prediccin (PAG.89)
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C (PAG.90)
Figura 26: Validacin del modelo propuesto para la inactivacin de
S.aureus en queso untable base almacenado a 6 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin (PAG.90)
Figura 27: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base almacenado a 17C, (
)
valores experimentales; () prediccin. (PAG.91)
Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17 C. (PAG.91)
Figura 28 : Validacin del modelo propuesto para la inactivacin de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
(
) valores experimentales; () prediccin. (PAG.92)
Figura 29: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
25C, (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.94)
Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C (PAG.94)
Figura 30: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos. (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.95)
Figura 31: Evaluacin del comportamiento de E.coli en queso untable
base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (--
),17C ( -- ) y 25C (-- ); (I):desvo estndar. (PAG.97)
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6 C (a),
17C (b) y 25C (c): ( ) prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior
predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (-- ) datos
experimentales (PAG.98)
Figura 33: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de E.coli en queso untable base almacenado a 6C, (
)
valores experimentales; () prediccin (PAG.99)
Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C (PAG.99)
Figura 34: Validacin interna del modelo propuesto para la
supervivencia de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6
C: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . (
) valores experimentales; () prediccin. (PAG.100)
Figura 35: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de E.coli en queso untable base almacenado a 17C, (
)
valores experimentales; () prediccin. (PAG.100)
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C. (PAG.101)
Figura 36: Validacin interna del modelo propuesto para el
comportamiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
17 C: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs.
valores predichos . (
) valores experimentales; () prediccin
(PAG.101)
Figura 37: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C,
(
) valores experimentales; () prediccin (PAG.102)
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C (PAG.103)
Figura 38: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
(
) valores experimentales; () prediccin. (PAG.104)
Figura 39: Evaluacin del comportamiento de S.Enteritidis en queso
untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-
- ),17C ( -- ) y 25C ( -- ); (I):desvo estndar. (PAG.105)
Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6 C
(a), 17C (b) , 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza
superior predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (-- )
datos experimentales. (PAG.106)
Figura 41 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado
a 6C, (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.107)
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C
(PAG.108)
Figura 42: Validacin interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin (PAG.108)
Figura 43: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado
a 17C, (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.109)
Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C
(PAG.109)
Figura 44: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.110)
Figura 45: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
25C, (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.111)
Tabla 17 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C
(PAG.112)
Figura 46: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto
para el crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0)
almacenado a 25 C: a) Valores observados vs valores predichos; b)
Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin (PAG.112)
Figura 47: Evaluacin del comportamiento de L.monocytogenes en
queso untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento:
6C (-- ),17C ( -- ) y 25C ( -- ); (I): desvo estandar (PAG.113)
Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6
C (a), 17C (b) y 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza
superior predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (-- )
datos experimentales. (PAG.114)
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0)
almacenado a 6C (a),17C (b) y 25C (c) (
) valores experimentales;
() prediccin (PAG.116)
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C
(PAG.117)
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C
(PAG.117)
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C
(PAG.118)
Figura 50: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto
para el crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0).
a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.119)
Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (--)
y sin agregado de (--) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres
temperaturas: (a) 6C, (b) 17C, (c) 25C ; (I):desvo estndar.
(PAG.122)
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con
(--) y sin agregado de (--) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a
17C; (I): desvo estandar. (PAG.123)
Figura 53: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0)
almacenado a 6C (a); 17C (b); y de S. Enteritidis en igual matriz
almacenada a 17C (c) (
) valores experimentales; () prediccin
(PAG.126)
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 C
(PAG.127)
Tabla 22 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 C.
(PAG.127)
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 17
C. (PAG.128)
Figura 54: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6C ;
17C; y de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
(
) valores experimentales; () prediccin. (PAG.129)
Figura 55: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.aureus en queso untable base con timol almacenado a
25C, (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.130)
Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 C
(PAG.130)
Figura 56: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25
C: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos. (
) valores experimentales; () prediccin (PAG.131)
1. INTRODUCCIN

1
1.1 Origen del queso

Segn el Cdigo Alimentario Argentino (C.A.A.), queso es el producto fresco

madurado que se obtiene por separacin del suero de leche leche reconstituda
(entera, parcial totalmente descremada), de sueros lcteos , coagulados por la
accin fsica, del cuajo, de enzimas especficas, de bacterias especficas, de cidos
orgnicos, solos combinados, todos de calidad apta para uso alimentario; con sin
el agregado de sustancias alimenticias y/o especias y/o condimentos, aditivos
especficamente indicados, sustancias aromatizantes y materiales colorantes (Art
605, C.A.A.)
La elaboracin de quesos es una actividad que comenz aproximadamente
8000 aos atrs y en la actualidad existen cerca de 1000 variedades diferentes de
queso cada uno de los cuales resulta ser nico con respecto a sus caractersticas
organolpticas.
La elaboracin del queso seguramente fue descubierta por diversas
comunidades al mismo tiempo. En el antiguo Egipto se cuidaban vacas y se les
ordeaban para tener la leche por lo que se piensa que tambin esas comunidades
elaboraran quesos. La leche se conservaba en recipientes de piel, cermica porosa o
madera, pero como era difcil mantenerlos limpios, la leche fermentaba con rapidez.
El siguiente paso fue el de extraer el suero de la cuajada para elaborar algn tipo de
queso fresco, sin cuajo, de sabor fuerte y cido. Cuenta la leyenda que un pastor
rabe volva a su morada con la leche de las ovejas dentro de una bolsa hecha con la
tripa de uno de sus corderos y que despus de caminar a pleno sol, al abrir la bolsa la
leche estaba cuajada, slida y hecha queso. Los romanos lo incluan en su dieta
condimentndolo con tomillo, pimienta, piones y otros frutos secos, cuando sus
soldados se asentaban en un campamento, elaboraban queso. Con el auge del
comercio y el aumento de la poblacin urbana, el queso se convirti en producto
importante para la economa, empez a comercializarse con queso, fuera de las zonas
de produccin y ms all de las fronteras y cuando se coloniz el Nuevo Mundo, se
llevaron sus tradiciones queseras.
Al principio se utilizaba leche cruda, pero en la dcada de 1850 el
microbilogo Louis Pasteur estableci el proceso de pasteurizacin como una
herramienta fundamental en la preservacin de alimentos, hecho que cambi

2
radicalmente el proceso de elaboracin de este producto. Empez a mezclarse leche
de distinta procedencia y distintos rebaos para obtener un producto homogneo y de
ese modo disminuy considerablemente el riesgo de aparicin de organismos que
pudieran contaminar el producto.

1.2. Produccin y consumo nacional e internacional de quesos

El queso tiene una produccin anual superior a otros productos del mundo
muy importantes tales como caf, t, cacao y tabaco. Estados Unidos es el mayor
productor mundial y casi la totalidad de esa produccin est dirigida al mercado
local, siendo casi nula su exportacin. Alemania es el mayor exportador en cuanto a
cantidad y Francia el mayor exportador en cuanto a valor monetario. As mismo,
siguen a Estados Unidos en cuanto a produccin. Dentro de los pases productores
en cuarta posicin encontramos a Italia y en dcimo lugar a la Argentina. Los pases
importadores de quesos por excelencia son: Alemania, Reino Unido e Italia. El
mayor consumo per cpita lo registra Grecia, seguido de Francia y en tercera
posicin, Italia. Luego siguen Suiza, Alemania, Pases Bajos, Austria, Suecia,
etc.(SAGyP, MINAGRI,2010)

En el cuadro 1 se presenta un resumen de los volmenes producidos,

consumidos y los stocks finales de los principales productos comercializados en el
mercado mundial.

Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (ao 2002)

Produccin Consumo Stocks

Productos
(tonelada)
Leche en Polvo descremada 3.473 3.127 970
Leche en Polvo entera 3.116 2.438 186
Quesos 12.470 12.091 716
Manteca 6.211 5.854 310

Fuente: United States Department of Agriculture ( 2009) USDA

3
 La Argentina se encuentra dentro de los pases cuyas costumbres dietarias
incluyen el consumo de este producto alimenticio tal como se evidencia en la Figura
1.

Figura 1. Consumo mundial de quesos per cpita

Fuente: SAGPyA, (2000).

Segn la Food and Agriculture Organization FAO, en 2004, Argentina fue el

9 pas productor mundial de quesos (con una participacin del 2,4%) con una
estadstica que se describe en el grfico de la Figura 2.

Figura 2.Produccin nacional de quesos

Fuente: Dir. de Industria Alimentaria y Agroindustrias

..sobre la base de datos del Convenio SAGPyA-CIL-FIEL (2009)

4
 La produccin nacional de quesos segn el tipo de pasta se puede observar en
la Figura 3. Si se observan los datos estadsticos de elaboracin de quesos de pasta
blanda, se denota un aumento progresivo en los ltimos aos (2004-2008). Luego de
alcanzar el rcord histrico de casi 455.000 toneladas en 1999, la produccin
argentina acus una merma del 27% hasta 2003. En 2004 se produjo un interesante
repunte del 20%, hasta ubicarse en las 398.000 toneladas. Mientras que los quesos
blandos crecieron el 13% en 2004, los quesos semiduros y duros exhibieron ritmos
superiores al promedio general del grupo, con alzas del 28 y 31%, respectivamente.
El crecimiento de la elaboracin de quesos verificado en 2004 fue impulsado
principalmente por la demanda interna alrededor del 80% de la produccin
adicional respecto de 2003 fue absorbido por el consumo domstico- y en menor
medida por las exportaciones, que se llevaron el 20% restante (SAGyP, MINAGRI,
2010).

Figura 3. Consumo nacional per cpita de diferentes quesos

Fuente: Dir. de Industria Alimentaria y Agroindustrias

sobre la base de datos del Convenio SAGPyA-CIL-FIEL (2009).

1.3. Proceso de elaboracin de queso

Son numerosas las recetas queseras tradicionales con las que se cuenta
actualmente y que dan lugar a la gran variedad de quesos artesanales. Pero
independientemente del tipo de leche y del lugar de procedencia, hay un proceso
general (Figura 4) que a continuacin se describe (ICMSF, 1980):

5
Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboracin de Queso

Leche

Filtrado

Pasteurizacin

Enfriamiento

Inoculacin con fermentos lcticos

Adicin de CaCl2 y cuajo

Cuajado

Corte de la cuajada

Moldeado

Prensado

Salado

Maduracin, previo oreado, volteado y limpieza de los quesos

Acabado

1.3.1 Preparacin de la leche

Una vez que la leche llega a la quesera, procedente del establecimiento

lcteo, es sometida a una serie de anlisis qumicos y microbiolgicos (Figura 5)
para asegurar la calidad inicial de la misma. En esta etapa, la leche es filtrada y/o
higienizada para eliminar cualquier tipo de impurezas que hayan podido pasar a la
leche durante el ordeo. Posteriormente se almacena en los tanques de refrigeracin
donde permanece a una temperatura de 4C. En el caso de las queseras que elaboran
quesos con leche pasteurizada, la leche es sometida a temperaturas superiores de
70C durante unos segundos.

6
Figura 5: Preparacin de la leche

1.3.2 Cuajado

Una vez la leche en la cuba de cuajado (Figura 6), se aaden los fermentos
lcticos, bacterias que contribuirn a la posterior maduracin del queso. Es en esta
fase donde se le adiciona el cuajo, que dependiendo del tipo de queso podr ser
vegetal, animal o microbiano, formndose la cuajada. Fsicamente, consiste en la
precipitacin de las micelas de casena formando un gel que retiene adems los
glbulos de grasa, agua y sales.

Figura 6: Proceso de cuajado

1.3.3 Corte de la cuajada

Una vez transcurrido el tiempo de coagulacin, el cul ser distinto

dependiendo del tipo de queso, se procede al corte de la cuajada (Figura 7). Esta
fase consiste en la divisin de la cuajada mediante las liras en granos ms pequeos
para favorecer el desuerado. El tamao del grano viene determinado por el queso a

7
elaborar. Luego se trabaja el grano mediante agitacin y elevacin de la temperatura
favoreciendo todava ms la expulsin del suero.

Figura 7: Corte de la cuajada

1.3.4. Moldeado

El moldeado consiste en el llenado de los moldes con los granos de cuajada

(Figura 8).

Figura 8: Moldeado

1.3.5. Prensado

Una vez llenados los moldes se pasa a la etapa de prensado, la cual en la

actualidad se realiza con unas prensas neumticas en la mayora de las queseras.
Debido a la presin, que variar dependiendo del tipo de queso que estemos
elaborando, se facilita la unin entre los granos de la cuajada y el desuerado (Figura
9).

8
Figura 9: Prensado

1.3.6. Salado

Una vez finalizado el tiempo de prensado, se procede al salado del queso a

mano bien, sumergindolo en salmuera (Figura 10). Con la fase de salado, se
consigue realzar el sabor del queso; preservar del crecimiento de microorganismos
indeseables, favorecer la prdida de suero y la formacin de la corteza.

Figura 10: Salado

1.3.7. Madurado

A esta fase pasan los quesos tiernos, semicurados y curados. Son mantenidos
en cmaras donde se controla la temperatura y la humedad. Durante esta fase los
quesos son volteados frecuentemente para evitar que se deformen y la corteza se
forme de forma uniforme. La maduracin comprende una serie de cambios en las

9
propiedades fsicas y qumicas adquiriendo el queso su aspecto, textura y
consistencia as como aromas y sabores caractersticos (Figura 11).
Figura 11: Madurado

1.3.8. Acabado

La fase de acabado se refiere a las distintas presentaciones en las que podemos

encontrar algunos de los quesos, por ejemplo, quesos al pimentn, al romero,
etc.(Figura 12)

Figura 12: Acabado

VBCV

1.4. Produccin de queso sin conservante (base) efectuada por Danone para el
presente estudio.

El proceso de elaboracin del queso untable base utilizado en el presente

estudio y realizado por la empresa Danone posee varios pasos alguno de los cuales
son especficos para esta variedad.
Como primer paso se realiz la pasteurizacin con el fin de destruir flora
indeseada.
Posteriormente al tratamiento trmico se di comienzo a un proceso
bioqumico pero de decisiva importancia: se adicionaron el cuajo, los cultivos

10
iniciadores o fermentos lcticos (fermentacin) y cloruro de calcio (por tratarse de
leche pasteurizada) (Johnson,1997).
La funcin principal de este paso es la de producir cido, principalmente
cido lctico, destinado a: a) favorecer la formacin de la cuajada por enzimas
coagulantes, como el cuajo; b) favorecer el drenaje del suero de los granos de
cuajada; c) impedir o inhibir el crecimiento de los microorganismos patgenos y de
los causantes de alteraciones, y d) gobernar las actividades de las enzimas que
inducen los cambios organolpticos deseados. Los cultivos lcticos iniciadores
producen cido lctico a partir de la lactosa propia de la leche rindiendo
componentes del sabor y aroma como diacetilo. Estos cultivos solo son adecuados
para aquellos quesos en los que la temperatura de esta etapa no supera los 40C
durante algunos minutos. El cuajo ,con la colaboracin del cido formado, precipita
la casena (protena principal de la leche) y forma un gel.
La termizacin se realiz a 65C durante 6 minutos a un pH < 4,6
y tiene tres aspectos tecnolgicos:
Aumentar la tasa de recuperacin de protenas solubles, por
insolubilizacin de algunas lacto albminas en medio cido y mejorar el
rendimiento del proceso.
Ajustar la temperatura ptima de separacin de la masa magra del suero.
Disminuir la carga microbiolgica del fermento presente en la cuajada la
cual pasa aproximadamente de 1 x 107 UFC/mL (unidades formadoras de
colonias por mililitro) a valores del orden de 1 x 103 / 1 x 104 UFC/mL.
Esta disminucin es necesaria para reducir la pos-acidificacin del
producto.
Cuando la masa misma (luego de la adicin del resto de los ingredientes como el
cloruro de sodio cuyo objetivo es potenciar el sabor y ayudar a controlar el
crecimiento de microorganismos alterantes) adquiri la firmeza adecuada se
someti al proceso de homogenizacin y envasado. Esta operacin puede ir
acompaada por la aplicacin de una determinada presin (acondicionamiento). El
enfriamiento se realiz a una temperatura de aproximadamente 40C. Finalmente se
almacen en cmara fra (0-5C).

11
Proceso de elaboracin del queso untable base utilizado en el presente trabajo.

Recepcin, descarga
y pasteurizacin de la
leche cruda

Pasteurizacin

Incorporacin de
cloruro de calcio,cuajo y
fermento

Fermentacin
Fermentacin

Termizacin

Inyeccin de crema

Inyeccin de
ingredientes

Homogeneizacin

Envasado

Acondicionamiento

Enfriamiento

Homogeneizacin

Almacenamiento en
cmara fra

12
1.5 Variedades de quesos

Aunque es casi imposible realizar una lista nica de quesos, slo en Francia
hay ms de 400 variedades de quesos, y en Espaa encontramos, por ejemplo, queso
Burgos, Cabrales, Cebreiro, Mat, Quesaillas, Roncal (por slo nombras algunos) y
el queso manchego, tpico de la regin de La Mancha . En Argentina, existen
numerosas variedades de queso (http://www.todoagro.com.ar). Una clasificacin
muy general comprende:

Quesos blandos: son los que tienen abundante materia grasa y humedad. La textura
de ellos es muy cremosa, Eso hace que se los pueda extender con facilidad. Son
elsticos al tacto y tienen un aroma similar al de las nueces. Los quesos que
pertenecen a esta variedad son: el Camembert, el Cuartirolo y el Fontina. En esta
categora entran los semiblandos como el Port Salut y el Mozzarella. Las
caractersticas de estos quesos los hacen ideales para ser usados en pizzas, budines,
terrinas, arroces, polentas y fondues.

Quesos duros y semiduros: son muy grasos pero con muy poca humedad. Son de
sabores suaves fuertes y texturas flexibles desmenuzadas. Algunos quesos de este
tipo tienen agujeros producidos por bacterias lcticas durante la maduracin. En esta
categora estn: el Emmenthal, el Parmesano, el Reggianito, el Sardo, el Provolone y
el Pecorino. En esta categora tambin se incluyen los quesos semiduros, como el
Cheddar, el Fontina y el Pategrs. Los quesos duros son apropiados para rallar,
preparar salsas y gratinar carnes, y los semiduros para fondue.

Quesos azules: son aquellos a los que se les introduce un cultivo fngico (p.e.
Penicillium roquefortii) para generar las caractersticas vetas azules. Son intensos.
No deben oler a amonaco ni tener sabor terroso ni muy salado. En esta variedad se
encuentran : el Azul y el Cabrales.

Quesos frescos: Estos quesos comprenden un proceso de elaboracin sin la etapa de

maduracin. Carecen de corteza. Su consistencia puede ser desde cremosa y
homognea hasta otra mucho ms densa. El queso fresco tiene que ser hmedo,
blando y sin moho. En esta variedad encontramos: el queso Crema, el Mascarpone, la

13
Ricota y el Fundido. Estos quesos son muy aptos para ser incorporados en ensaladas
y para elaborar salsas livianas y fras para acompaar carnes.

1.6. Clasificacin de quesos

Los criterios para la clasificacin de quesos son mltiples, ya que pueden basarse en
cuestiones documentales, jurdicas o tecnolgicas. Sin embargo, los criterios de
clasificacin ms utilizados son los siguientes:
:

- Contenido en materia grasa expresado en porcentaje de grasa / masa sobre el

extracto seco total ( % G/ES). De acuerdo a este criterio puede ser: Extra graso;
Graso; Semi graso; Bajo contenido de grasa y Magro.

- Consistencia de la pasta teniendo en cuenta el porcentaje del queso sin

considerar su grasa, lo que es igual, la humedad del queso desgrasado (
%HSMG o HQD, contenido de humedad sin extracto seco). De acuerdo a este
criterio puede ser: Extraduro; Duro; Semiduro; Semiblando y Blando.

- Perodo de maduracin atendiendo a su maduracin ausencia de ella. Pueden

ser frescos o madurados. Queso fresco es el que est dispuesto para el consumo al
finalizar el proceso de fabricacin. Queso madurado es el que, tras el proceso de
elaboracin, requiere mantenerse durante cierto tiempo a una temperatura y en
condiciones tales que se produzcan los cambios fsicos y qumicos caractersticos
del mismo.

- Tipo de leche utilizada. Aparte de su clasificacin por el origen de la leche del

animal, tambin se clasifica por los diferentes tratamientos que tiene la leche
antes de empezar el proceso de elaboracin del queso. Pueden utilizar leche
cruda (leche que no ha sido calentada a una temperatura superior a 40 C
trmicamente, ni sometida a un tratamiento de efecto equivalente); pasteurizada
(se obtiene al calentar la leche a una temperatura entre 71,3C - 73C durante 15
segundos o 61C - 63 C durante 30 minutos, seguido de un enfriamiento
inmediato); termizada (leche que ha tenido un tratamiento trmico consistente en
elevar la leche a una temperatura entre 57C - 62C durante 15 a 20 segundos,

14
 seguido de un enfriamiento inmediato microfiltrada (leche que ha sufrido una
micro-filtracin. Este proceso consiste inicialmente en separar la nata de la leche,
posteriormente se filtra la leche desnatada a travs de unas membranas muy
delgadas que retienen las bacterias y finalmente a esta leche filtrada se le
incorpora la nata en proporciones adecuadas).

- Tipo de Elaboracin atendiendo al mtodo de elaboracin de los mismos. Pueden

ser Quesos "Fermier" de Granja (son elaborados con mtodos tradicionales y en
la propia granja); Artesanales (elaborados siguiendo mtodos tradicionales y en
general mediante estructuras pequeas que suelen oscilar entre 1 y 5 personas);
Quesos "Latiere" (elaborados en forma semi-automatizada con leche de los
propios tambos de la cooperativa) y Quesos Industriales (producto industrial
obtenido a partir de leche adquirida a diferentes granjas, a veces muy distantes
unos de otras, con un proceso de fabricacin automatizado que se realiza a gran
escala. De ah su necesidad de estandarizar la materia prima, con el indispensable
uso de la pasteurizacin, termizacin o micro-filtracin).

- Intensidad del sabor o gusto. Es una clasificacin que se expresa en trminos de

intensidad: Fresca Dulce (quesos de Burgos, cuajadas, petit suisse, y quesos de
cabra lcticos); Poco Pronunciada (quesos cuya maduracin es corta; p.e.
Camembert, Brie, Coulommiers); Pronunciada (quesos donde su maduracin
est en su punto y predominan sabores a leche cocida, cereales, frutos secos,
vegetales; p.e. Gruyre o los Beaufort y los de pasta azul blandos como el Cashel
Blue y de cabra de pasta prensada semicurados); Fuerte (quesos con toque
picante adems de tener un punto de salado razonable; p.e. quesos de pasta
blanda y de corteza lavada- Livarot, Maroilles , Epoisses , Munster; quesos
azules - Fourme d'Ambert Montbrison); Muy Fuerte (quesos algo ms picantes
y salados que la intensidad fuerte; p.e. azules y de doble fermentacin).

15
1.7 El queso y la salud

Todos los tipos de queso aportan a nuestra dieta un gran valor nutritivo. El ser
humano puede vivir sin sufrir enfermedades causadas por carencias vitamnicas
consumiendo nicamente queso, pan y fruta, puesto que el conjunto de estas tres
llevan las vitaminas, sales minerales y protenas necesarias para vivir. Segn pasa el
tiempo el queso aumenta el aporte de caloras y mejora su calidad bacteriolgica. El
queso tambin contiene la proporcin adecuada de cidos grasos. Es un alimento
fcilmente digerible a su vez. El conjunto de moho, bacterias que confiere puede
actuar de forma favorable en nuestra flora intestinal.

El queso combinado con pan se convierte en una dieta equilibrada para

nuestra salud porque se complementan, el primero con las protenas y los lpidos y el
segundo con los hidratos de carbono. Los quesos frescos por su alto contenido en
agua son ms adecuados para una dieta con inferior nmero de caloras que uno
semicurado ya curado (Mahaut y col.,2003).

1.8 El queso como alimento nutritivo

Los alimentos lcteos a los cuales acudimos como fuente de calcio nos
aportan mucho ms a nuestra nutricin y salud. En una dieta, los productos lcteos
contribuyen aproximadamente slo con el 9% de las caloras disponibles. En cambio
proveen el 73% del calcio, el 31% de la riboflavina, el 33% del fsforo, el 19% de
las protenas, el 16% del magnesio, el 21% de la vitamina B12, el 17 % de la
vitamina A, el 10% de la vitamina B6, 6% tiamina, apreciables cantidades de
vitamina D y niacina equivalentes. De hecho los productos lcteos se reconocen
como ricos o fuentes de muchos nutrientes en s mismos sin tener que ser
modificados (Mahaut y col.,2003).

En la pirmide nutricional que especifica el Departamento de Agricultura de

los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en Ingls) (Figura 13), se reconocen a los
alimentos lcteos como uno de los grupos de mayor relevancia, recomendando un
consumo de los mismos de 2 a 3 porciones/da (leche, yogur, quesos). Las nuevas

16
recomendaciones previstas por el MERCOSUR, recogiendo los consejos mundiales,
establecen 1000 mg de calcio como Ingesta Diaria Recomendada o Ingesta Adecuada
para mayores de 18 aos. Teniendo en cuenta los hbitos locales, ese requerimiento
es alcanzable slo consumiendo no menos de 4 porciones/da de leche su
equivalente en derivados. Esta cantidad representa la cantidad que al menos el 97%
de la poblacin necesita (Portela, 2007) .

1.8.1 Aporte de macronutrientes

El contenido de los quesos sobresale ante otros productos ya que posee

protenas de alto valor biolgico y calcio de fcil asimilacin, fsforo, magnesio,
vitaminas del grupo B y liposolubles.

Protenas - A la protena de la leche se la califica de alta calidad, con alto valor

biolgico y alta digestibilidad, usada como estndar para evaluar el valor nutritivo de
las protenas de los alimentos.

Figura 13. Pirmide nutricional

Carbohidratos- La lactosa es el azcar principal en leche. En los nios se ha

comprobado que mejora la absorcin de calcio y una porcin pasa al colon y
funciona como prebitico en la flora intestinal.

17
Grasas- Aparte de ser fuente de energa (42% de la energa de la leche entera) aporta
a la textura, sabor y al poder de saciedad de este alimento. . Los lcteos son la fuente
natural ms rica en cido linoleico conjugado siendo identificado este producto como
potencial fuente benfica para la salud, teniendo propiedades antioxidantes habiendo
evidencias de tener propiedades anticarcinognicas (colon mama)
antiarteroesclerosis, estimular el sistema inmune.

1.8.2 Aporte de micronutrientes

Es bien sabido que el calcio y la vitamina D contribuyen de manera esencial a

mantener la buena salud y el bienestar nutricional en el curso de la vida. Sin
embargo, aunque gran parte del inters por estos nutrientes sigue centrndose en su
importancia para el buen estado de los huesos, recientes investigaciones han arrojado
interesantes resultados sobre una amplia variedad de cuestiones nutricionales y
sanitarias relacionadas con ellos.

Las variaciones en los procedimientos utilizadas en su lnea de produccin

tales como diferentes temperaturas y diferentes tcnicas de obtencin de la cuajada
juegan un papel decisivo en determinar las caractersticas organolpticas del
producto final, pero los microorganismos o bacterias cido lcticas (BAL) utilizadas
juegan un papel crtico en el desarrollo de sus caractersticas distintivas (Beresford y
col., 2001; Lars 2004). La primera funcin de las BAL es producir cido durante el
proceso fermentativo a partir de la lactosa, hidrato de carbono mayoritario de la
leche. Ellas tambin contribuyen en la protelisis y conversin de los aminocidos en
componentes responsables del flavour (aroma + sabor) del queso (Lars, 2004).Las
BAL producen suficiente cido lctico como para descender el pH a < 5.3 en 6 hs. a
30-37C. Estas bacterias, tambin llamadas starters pueden ser agregadas al
comienzo del proceso de produccin de quesos o pueden ser contaminantes naturales
de la leche como en el caso de muchos quesos artesanales fabricados con leche
cruda. Una vez presentes junto al resto de los ingredientes comienzan su proceso de
crecimiento y logran alcanzar recuentos aproximados de 1 x 108 UFC/gr. en pocas
horas. Segn su temperatura ptima de crecimiento se clasifican en mesflas 30C-
45C o termflas 55C-75C.

18
 Las BAL ms comnmente usadas desde el punto de vista de la tecnologa
alimentaria pertenecen a los gneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc , Enterococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Oenococcus,
Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Axelsson, L. 2004). Se
utilizan tambin cultivos mixtos como Lactococcus lactis ssp. cremoris y L. lactis
ssp. lactis (ambos mesfilos), Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus ,
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus,
Lb.delbrueckii ssp. lactis o Lb. helveticus.

Otro de los roles de las BAL es proveer un ambiente ptimo con respecto al
potencial redox, pH y contenido de humedad del queso (Wood, 1995).

1.9 El queso como alimento seguro

La principal causa de deterioro de los alimentos es causada por la presencia

de diferentes tipos de microorganismos. El deterioro microbiano de los alimentos
tiene prdidas econmicas sustanciales, tanto para los fabricantes (prdida de
materias primas y de productos elaborados antes de su comercializacin, deterioro de
la imagen de marca, etc.) como para distribuidores y consumidores (deterioro de
productos despus de su adquisicin y antes de su consumo).
La produccin de alimentos seguros est basada en la implementacin de
medidas generales de Buenas Prcticas de Higiene (BPH) y Buenas Prcticas de
Manufactura (BPM). Estos conocimientos son esenciales para contar con productos
alimenticios seguros, corregir errores y si fueran necesarias tomar medidas
preventivas. Es conocido que en la prctica la recontaminacin con patgenos es una
causa frecuente de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAS).

Se ha establecido que los riesgos microbiolgicos en quesos estn ms

vinculados con quesos blandos, de humedad superior al 46%. En cambio, los quesos
duros, de humedad menor al 36% pueden ser elaborados con leche termizada
(tratamiento trmico ms suave que la pasteurizacin), la larga maduracin requerida
para alcanzar esos niveles de humedad dificulta el desarrollo de los patgenos que

19
pudieran haber contaminado inicialmente, aunque de no haberse respetado las
Buenas Prcticas de Elaboracin podran presentar enterotoxina estafilocccica.

La demanda creciente del consumo de quesos y su consecuente elaboracin

ha incrementado el inters en obtener ms informacin acerca de su calidad y
estabilidad. Muchos de los estudios realizados sobre la calidad microbiolgica de los
quesos de pasta blanda y pasta semiblanda fueron ya publicados (Scott y col., 2002).
Diferentes microorganismos tales como Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes son microorganismos asociados
desde 1970 con brotes asociados a quesos (Roberts, 2002). Muchos de estos
microorganismos estn distribuidos en el ambiente y pueden ocasionar
contaminaciones naturales durante la produccin, maduracin y almacenamiento as
como contaminaciones cruzadas en restaurantes y hogares debido a un inapropiado
uso.
La distribucin ubicua de Salmonella spp,, su prevalencia, su virulencia y su
potencial impacto econmico en la industria alimentaria predice la necesidad de un
continuo control (Iurlina y Fritz, 2004).
La contaminacin de S.aureus, coco Gram positivo (Jablonsky, 1997), en
productos lcteos puede tener lugar en varias etapas del proceso.
E.coli, bacilo Gram negativo asporgeno, es usualmente considerada un
habitante no patgeno del tracto intestinal humano y es utilizada como indicador de
un inadecuado proceso de sanitizacin de agua y comidas. A pesar de sto en los
aos recientes algunas cepas de E.coli halladas han sido implicadas en enfermedades
trasmitidas al hombre por alimentos (Doyle,1997).
Salmonella spp. es un bacilo Gram negativo no formador de esporas, aerobio
facultativo, que puede sobrevivir en condiciones favorables. Hay mas de 2000
serotipos basados en la presencia de antgenos somticos (O) y flagelares (H)
(Daoust, 1997). A pesar de sto solo un pequeo nmero son patgenos para el
hombre .Su crecimiento est favorecido por la temperatura (20 a 45C ) y el pH (4.5
a 9.0). Su tolerancia al pH convierte a este microorganismo en sobreviviente en
comidas fermentadas como quesos y salsas Salmonella spp. crece tambin en
ambientes con aw 0.94 pero no puede tolerar altas concentraciones de sal o
temperaturas elevadas.

20
 La dosis infectiva depende del estado inmunolgico del individuo y ha sido
demostrado que alimentos ricos en grasa tienden a dar un ambiente protector al
microorganismo (Eley, 1996). Salmonella spp. se distingue de otros patgenos por su
frecuente presencia en alimentos, su habilidad para crecer en una gran variedad de
alimentos, su fcil diseminacin y contagio persona a persona y su prolongado
perodo de excrecin (10 semanas).
L.monocytogenes es un bacilo Gram positivo, asporgeno, anaerobio
facultativo y sobrevive a temperaturas de 0 a 45C. Su aw ptima de crecimiento es
de 0,97 con un mnimo de 0,93 y su pH ptimo de crecimiento est en el rango 5,6-
9,6 (Rocourt, 1997). La dosis infecciosa no est bien establecida pero
L.monocytogenes no representa un problema hasta tanto no alcance altos niveles de
contaminacin, en personas sanas. Este microorganismo es ubicuo y puede
contaminar diferentes alimentos y bebidas. Aunque la listeriosis humana es
espordica, se han reportado en algunos casos consecuencias severas a partir del
consumo de productos crudos, inadecuadamente calentados, y recontaminacin de
alimentos tratados (Yuste y col., 2002). Ha sido asociada con varios brotes en los
cuales estaban implicados los quesos y consecuentemente su ocurrencia ha sido
muy bien estudiada. L. monocytogenes es un importante microorganismo asociado a
enfermedades transmitidas por alimentos debido a la severidad de la infeccin
causada y a la mortalidad que produce (30%). La contaminacin de muchos
alimentos con L. monocytogenes es casi inevitable debido a su naturaleza ubicua en
el medio ambiente. Mas an su inusual habilidad por sobre otros patgenos de crecer
a temperaturas de refrigeracin la asocia con productos normalmente almacenados
en estas condiciones (Smith-Palmer y col., 2001). Ha sido detectada en numerosos
alimentos incluyendo pat( Mc Lauchlin ,1991), comida lista para consumo y
particularmente en quesos blandos ( Linnan y col., 1999). La supervivencia de este
patgeno a valores de pH muy bajos (3,0 a 4,5) ha recibido poca atencin,
probablemente debido a que se asume su rpida muerte bajo estas condiciones, pero
resultados obtenidos por Parish y col. (1989) indican que en productos de bajo pH
puede encontrarse Listeria y se puede producir una masiva contaminacin si estos
alimentos son consumidos en un perodo corto de tiempo. Su crecimiento a pH <4,4
est influenciado por la temperatura y el tipo de cido (McLauchlin, 1990).

21
1.10 Tecnologas combinadas de preservacin

La estabilidad microbiolgica y la calidad sensorial de la mayora de los

alimentos, estn basados en la combinacin de factores de preservacin. Esto es
cierto, tanto para alimentos tradicionales con factores empricos inherentes, como
para productos nuevos para los cuales se han seleccionado racionalmente los factores
de estrs y se han aplicado intencionalmente (Alzamora y col., 2000).
El objetivo de las tecnologas de obstculos es seleccionar y combinar
factores de preservacin o barreras de forma tal que la estabilidad y seguridad
microbiolgica puedan ser garantizadas, reteniendo las caractersticas nutritivas y la
aceptacin sensorial (Leistner, 1992). Este mtodo usa varias barreras que
separadamente pueden no dar una adecuada preservacin, pero que cuando se las
combina pueden brindar la proteccin necesaria. Las barreras pueden incluir la
disminucin de la temperatura, pH o actividad de agua (por adicin de por ejemplo
NaCl o azcares); el calentamiento mnimo; o la adicin de antimicrobianos
(Buchanan y Phillips, 1990; Leistner, 1992; Leistner, 1995). Para que este concepto
sea aplicado exitosamente, es necesario cuantificar la influencia de los distintos
factores sobre el crecimiento microbiano.

La aplicacin de este concepto ha sido muy exitosa en los ltimos aos,

dentro del conjunto de tecnologas de preservacin de mnimo procesamiento, y ello
ha sido posible debido a los grandes avances ocurridos en el conocimiento del modo
de accin de los distintos factores de preservacin y de su interaccin en los
microorganismos (Sajur, 1985; Alzamora y col., 1989; Guerrero y col., 1993; Rojas y
col., 1994).

La estabilidad u homeostasis del medio interno (composicin y volumen de

los fluidos) es vital para la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos.
En los alimentos preservados por factores combinados, la homeostasis activa de los
microorganismos vegetativos y la homeostasis refractaria pasiva de las esporas se
interfieren en un nmero de sitios o de manera cooperativa, utilizando una
combinacin de factores de conservacin, aplicando cada uno de ellos en forma no
letal, disminuyendo la severidad de los tratamientos. Por ejemplo, en el caso de
clulas vegetativas, se reduce la disponibilidad de energa (removiendo O2, limitando
nutrientes, reduciendo la temperatura) y/o se incrementa la demanda de energa

22
(reduciendo aw y pH, aadiendo compuestos activos a nivel de membrana). Para
esporas, la idea es daar estructuras claves (por ataque qumico, enzimtico o fsico
sobre el cortex) o provocar la germinacin de las mismas (con falsos disparadores,
por aplicacin de altas presiones, etc.) (Gould y col., 1983; Gould, 1995).

Este concepto de combinacin no slo se aplica a la estabilidad

microbiolgica, sino que se hace extensivo a la calidad total. Tambin desde el punto
de vista microbiolgico, el concepto se ha tornado ms abarcativo y se refiere no slo
a la interferencia de la homeostasis por barreras sinrgicas o aditivas sobre un mismo
microorganismo, sino a la aplicacin selectiva de factores de conservacin que
puedan ser efectivos contra un organismo especfico o un grupo de microorganismos
solamente. Es as, que en los ltimos aos, un gran nmero de publicaciones en la
literatura internacional se refiere a la utilizacin de este concepto con distintas
finalidades: optimizar tecnologas tradicionales; desarrollar nuevos productos y como
medida de seguridad o back-up para asegurar la calidad microbiolgica de
alimentos mnimamente procesados (Alzamora, 1997).

La adopcin de altos estndares en el control de calidad, buenas prcticas de

manufactura y el sistema HACCP son esenciales para asegurar la calidad
microbiolgica del producto. Ms an, debido a los reducidos mrgenes de
seguridad, los distintos organismos de contralor internacionales han recomendado el
uso de obstculos adicionales en el diseo de los sistemas de preservacin tal que
procesos, distribucin y almacenamiento no adecuados puedan todava garantizar
productos microbiolgicamente seguros. As, el uso de factores combinados juega un
importante rol en la seguridad microbiolgica de aquellos productos donde los
puntos crticos de control sean imposibles o difciles de controlar.

Los valores altos de aw en quesos blandos no son suficientes para garantizar la

seguridad microbiolgica de este tipo de alimentos, por lo que es necesaria la
combinacin con otros factores y/o formas tradicionales de preservacin.

Varios factores de preservacin, cuyos efectos se describen a continuacin, son

frecuentemente utilizados en estas tecnologas. Algunos de ellos han sido empleados
en este trabajo.

1.10.1 Efecto de la reduccin de la aw

23
 Cuando la aw del medio externo se reduce, los microorganismos tienden
rpidamente a alcanzar el equilibrio osmtico con el medio que los rodea,
principalmente a travs de la prdida de agua, producindose plasmlisis de la
clula con prdida de la turgencia de membrana. Inmediatamente se pone en
marcha un mecanismo osmoregulador que les permite recuperar el agua prdida y
mantener la homeostasis con respecto de su contenido de agua. Se produce la
acumulacin intracelular de solutos compatibles por sntesis y/o por transporte
activo desde el medio extracelular hasta balancear la osmolalidad externa (Gould,
1995).

El modo de accin de estos solutos compatibles no slo se explica por su

papel de osmolitos, sino que se cree, tienen una propiedad molecular fundamental:
estabilizar la estructura proteica (y por lo tanto sus funciones) preservando las
funciones de la capa de hidratacin (Leistner y Russell, 1991). En las bacterias,
los solutos compatibles de mayor importancia son los aminocidos (cido
glutmico, glicilbetana, cido -aminobutrico, prolina, etc.) y en las levaduras y
los hongos, los polioles (manitol, arabitol, sorbitol, glicerol, etc.).Las diferencias
en la capacidad de biosntesis o de mecanismos de transporte son responsables de
la diferencia en los valores de aw lmite de crecimiento de las varias especies y
gneros de microorganismos.

Tambin se puede producir una alteracin de la composicin de los lpidos

de la membrana, incrementndose la proporcin de lpidos aninicos de forma tal
de impedir el pasaje de la fase lamelar (o bicapa) a la fase no lamelar (hexagonal)
(Bygraves y Russel, 1988). La disrupcin de la conformacin lipdica normal de
la membrana, destruira sus propiedades de permeabilidad pasiva y alterara las
interacciones lpido-protena, influenciando las actividades proteno-mediadas de
la misma (por ej. metabolismo intermedio, bombeo de iones, sistemas de
transporte) (Leistner y Russell, 1991).

1.10.2 Efecto de la reduccin del pH

24
 El pH es otro factor bsico en la preservacin de alimentos, afectando la
conformacin de las protenas, el camino de sntesis enzimtica y los productos
finales del metabolismo. El crecimiento y la supervivencia de los
microorganismos estn fuertemente influenciados por el pH y el contenido de
cidos orgnicos del alimento. stos determinan, de acuerdo a su valor, floras
contaminantes diferentes y de distinta resistencia a los factores de conservacin.
Las bacterias, en general, requieren un rango de pH externo entre 4 y 9 para poder
crecer, mientras que los hongos y las levaduras exhiben mayor tolerancia,
pudiendo desarrollarse en los rangos de pH externo 1,5-11,0 y de 1,5-8,0,
respectivamente (Alzamora, 1997).

Los microorganismos necesitan mantener su pH intracelular (pHi) dentro

de cierto rango muy estrecho y cercano a la neutralidad para poder crecer. ste
valor ptimo de pH depende de la especie: las bacterias acidfilas tienen pHi
comprendidos entre 4,5-6,0, al igual que hongos y levaduras; las neutrfilas entre
7,5-8,0 y las alcalfilas, entre 8,4-9,0. Los organismos tienen distintas
capacidades para regular su pH, y por lo tanto, exhiben tambin diferente
tolerancia a la perturbacin del pH externo. Los microorganismos que son ms
resistentes a valores bajos de pH (hongos, levaduras y bacterias acidfilas),
poseen tambin valores menores de pHi, lo que indicara una adaptacin
especfica al medio cido (Booth y Kroll, 1989).

Existen tres formas en que puede actuar el pH como factor de

conservacin (Corlett y Brown, 1980; Brown y Booth, 1991), si bien todava no se
conoce totalmente el mecanismo por el cual los microorganismos interactan con
el pH:

Va cidos fuertes: stos disminuyen el pH externo, pero no permean a travs de

las membranas celulares y ejerceran su accin alterando la conformacin y la
actividad de una o ms enzimas esenciales presentes en las capas externas de la
clula, y por lo tanto disminuyendo la efectividad de los sistemas de transporte de
iones esenciales y nutrientes. Tales niveles de acidez son generalmente
inaceptables en los alimentos y slo permisibles en bebidas carbnicas, en las que
se emplea el cido fosfrico como acidulante.

Va cidos dbiles lipoflicos (cidos ctrico, srbico, benzoico, propinico, etc.):
las formas no disociadas de estos cidos dbiles, permean a travs de las

25
 membranas y actan como transportadores de protones, ionizndose en el
citoplasma y acidificando el medio interno. El efecto primario es disminuir el
pHi, pero adems, el anin del cido no disociado puede tener efectos inhibitorios
especficos en el metabolismo, incrementando el efecto del pH (ej: cido actico,
frmico, srbico).

Va iones cido-potenciados: el bajo pH potencia la actividad de compuestos

tales como bicarbonato, sulfito y nitrito, incrementando la accin de la especie
antimicrobiana; es decir, que el efecto del pH es indirecto.

1.10.3 Efecto del sorbato de potasio

El sorbato de potasio es principalmente efectivo contra mohos y

levaduras, aunque tiene cierta efectividad sobre algunas bacterias. El efecto sobre
los hongos, se debe a la inhibicin de los sistemas de enzimticos de
deshidrogenasas, las cuales intervienen en el mecanismo de oxidacin de los
cidos grasos (Jay, 1991) y enzimas sulfihidrlicas tan importantes como
aspartasas, succinodeshidrogenasas y fumarasas. Es altamente efectivo en la
inhibicin de la produccin de micotoxinas por algunas cepas (Ryu y col., 1993).

Su efectividad depende de muchos factores tales como pH, aw, presencia

de otros aditivos, procesamiento y envasado, temperatura y condiciones de
almacenamiento (Sofos y Busta, 1983). La cantidad a utilizar depende del tipo de
microorganismo, la aw del alimento y de la carga inicial considerados. En general,
concentraciones de sorbato aadidas en el orden de 0,05 0,10 %, inhiben el
desarrollo de hongos y levaduras en una amplia gama de alimentos.

1.10.4 Utilizacin de antimicrobianos naturales

La incidencia creciente de enfermedades transmitidas por alimentos, junto

con las implicancias socio-econmicas moviliza a una constante necesidad de
producir alimentos seguros y desarrollar nuevos agentes antimicrobianos.
Considerando la seguridad de ciertos conservantes qumicos y la reaccin negativa

26
de los consumidores quienes los perciben como artificiales, ha surgido un creciente
inters en alternativas ms naturales. Particular inters se ha planteado en la potencial
aplicacin de aceites esenciales de plantas. La propiedades antimicrobianas estn
bien establecidas contra un gran espectro de microorganismos incluyendo bacterias
(Smith-Palmer y col., 1998) ,levaduras ( Lachowicz y col.,1998; Mangena y
Muyima, 1999) y hongos (Paster y col., 1990; Mishra y Dubey 1994).

Diversos autores han estudiado el efecto de aceites esenciales como agentes

bactericidas (Smith-Palmer, 2001). Skandamis y col. (2001) testearon, por ejemplo,
la efectividad del aceite esencial del organo contra E.coli en caldo BHI hallando
resultados positivos en cuanto a su efecto inhibitorio. Azzous y Bullerman (1982)
encontraron que el clavo de olor era un eficiente antimictico contra Aspergillus
flavus, A. parasiticus y A. ochradeus y cuatro cepas de Penicillium demorando su
crecimiento por ms de 21 das. Cerrutti y col. (1997) evaluaron el potencial uso de
vainillina como antimicrobiano (en lugar de sorbato de potasio y bisulfito de sodio)
en la formulacin para obtener pur de frutillas mnimamente procesado. Vrinda
Menon y Garg (2001) estudiaron el efecto bactericida del aceite del clavo de olor
sobre Listeria monocytogenes en carnes y quesos. Wilkins y Board (1989) reportaron
que ms de 1389 plantas son potencialmente fuente de agentes antimicrobianos como
es el caso del timol obtenido del tomillo y organo, el aldehdo cinmico de la canela
y el eugenol de clavos de olor.
Sin embargo la actividad antimicrobiana de algunos aditivos, combinados o
no, en sistemas como agua o medios de cultivo reflejan pobremente, en general, su
comportamiento en sistemas ms complejos como los alimentos (Alzamora y col.,
2005).
En algunos casos, el responsable de la reduccin de su actividad
antimicrobiana es la interaccin con los diferentes nutrientes del alimento (protenas,
grasas, etc.) y otros factores de preservacin (Sofos y col., 1998). As y todo, los
mecanismos por los cuales se podra explicar cierta toxicidad o resistencia
antimicrobiana a determinados preservantes son menos conocidos.

1.10.4.1 Timol

27
 El aceite de tomillo es obtenido por destilacin por arrastre de vapor de las
hojas de Thymus vulgaris. Sus componentes mas importantes son los alcoholes
fenlicos los que expresados como timol se encuentran en una concentracin
superior al 35%. Otros componentes observados lo constituyen el p-cimeno y el
terpineno los que junto al timol le imparten su aroma y sabor caracterstico.
El timol es empleado para aromatizar todo tipo de alimentos. Dentro de la
industria farmacutica el timol es un conocido antisptico, su color es amarillo
intenso, olor agradable, densidad 0,91 - 0,94 e ndice de refraccin 1,492 - 1,499.
El mismo es reconocido tambin como conservante natural contra
Staphylococcus aureus y Salmonella Enteritidis (Juven y col. 1994; Lambert y col.,
2001). Algunos de los sinnimos con los que se lo puede encontrar en la bibliografa
son: cido tmico, alcohol timlico, fenol timlico, isopropilmetacresol, etc. Medina
y col. (2004) estudiaron la actividad bactericida in vitro, por el mtodo de difusin
en agar, frente a cultivos puros de cinco bacterias patgenas (Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis, Enterococcus sp. y
Escherichia coli) y seis cepas de bacterias lcticas que alteran alimentos. Los
resultados encontrados destacan la efectividad del aceite de tomillo frente a cultivos
puros de bacterias patgenas as como frente a bacterias lcticas (Alzamora y
col.,2003).

1.11 Calidad, vida til y seguridad

La falta de calidad en los alimentos puede ser la consecuencia de cambios

fsico-qumicos, enzimticos o microbiolgicos. Los microorganismos desempean
un papel clave en la prdida de calidad a travs de las actividades de bacterias,
hongos y levaduras pero tambin a travs del crecimiento o supervivencia de
especies patgenas. Por lo tanto, si se quieren obtener juicios confiables sobre la
calidad del alimento, su vida til y su seguridad, es necesario disponer de datos
cuantitativos sobre los efectos de los factores que afectan el crecimiento, la
supervivencia y/o la inactivacin. Recientemente, con el avance informtico, las
tcnicas para desarrollar modelos predictivos se han mejorado enormemente y es
posible pensar en una Base de Datos para Predicciones Microbiolgicas a ser usada
por la industria y otros organismos relacionados a esta temtica.

28
 Los quesos presentan problemas de vida til en heladera asociados al hbito
de consumo (alimentos de abre y cierre) que provocan un deterioro prematuro por
desarrollo de microorganismos. Estos productos pasteurizados poseen un pH
relativamente elevado (5,1- 6,2) y una actividad de agua (aw) ptima para el
desarrollo microbiano. Numerosos estudios han establecido que el deterioro de los
mismos depende de factores intrnsecos tales como variedad del queso, aw,
contenido de sal, contenido y tipo de emulsificante, pH y de factores extrnsecos, de
los cuales los ms importantes resultan la temperatura de almacenamiento y la
contaminacin post-pasteurizacin. Datos de bibliografa muestran que Listeria
monocytogenes, Salmonella spp, y Staphylococcus coagulasa positivo representan a
los patgenos de mayor incidencia en quesos (Ahmed y col.,1988; Abdalla y
col,1992; Altekrus y col.,1998; Larson y col.,1999; Jorgensen y col.,2005). Si se
quieren obtener juicios confiables sobre la calidad de este alimento, su vida til y su
seguridad, es necesario disponer de datos cuantitativos sobre los efectos de los
factores que afectan el crecimiento, la supervivencia y/o la inactivacin.

Los modelos matemticos son la mejor manera de hacer predicciones bajo

estas circunstancias.
Una herramienta para el desarrollo de tecnologas para poder estimar la
conducta microbiana, es la aplicacin de la microbiologa predictiva (Mc Meekin y
col., 1993).

1.12 Microbiologa Predictiva

1.12.1 Generalidades

La microbiologa predictiva consiste en el desarrollo de modelos matemticos

para predecir la velocidad de crecimiento o de declinacin de los microorganismos
bajo un dado conjunto de condiciones ambientales (Walls y Scott, 1997). El
conocimiento detallado de las respuestas de crecimiento de los microorganismos
frente a las condiciones ambientales, es decir, el conocimiento de la ecologa
microbiana, permite evaluar objetivamente el efecto del procesamiento, la
distribucin y el almacenamiento en la seguridad microbiolgica y la calidad de los
alimentos. Utilizando diseos experimentales adecuados y modelos matemticos

29
apropiados, la microbiologa predictiva permite la seleccin de los factores de
preservacin para alcanzar la vida til deseada de diversos alimentos.

Antes de ser usados estos modelos matemticos en la prctica deben ser

validados a los fines de demostrar que el comportamiento bacteriano es el mismo
tanto en el laboratorio como en el alimento real.
El testeo de todo modelo es su habilidad para predecir respuestas en nuevas
situaciones. En microbiologa de alimentos esto significa la habilidad del laboratorio
de generar modelos para predecir el comportamiento de los microorganismos
concernientes al alimento en preparaciones comerciales, almacenamiento y
distribucin. Claramente la validacin en este nivel debe ser realizada antes que los
modelos predictivos puedan ser usados en la prctica con cierto grado de certeza.
Existen potenciales consecuencias de un prematuro uso comercial de un modelo
predictivo. Desde el punto de vista de la seguridad de los consumidores y la
aceptacin de la industria de los conceptos de microbiologa predictiva un fracaso de
un modelo no validado puede ser serio (Mc Meekin y col., 1993).
Draper y Smith (1981) indicaron que una vez que el modelo fue validado en
la prctica es todava necesario realizar algn procedimiento para mantener el
modelo y reconocer cuando deviene en obsoleto. Ellos recomiendan que por rutina el
modelo debe ser peridicamente chequeado mediante anlisis estadsticos que deben
permitir discernir mas formas de desviaciones sutiles.
No es un problema cun bien un modelo puede ajustar una serie de datos, el
verdadero valor de un modelo recae en cun bien ese modelo puede predecir la
respuesta microbiana bajo nuevas condiciones que no son las que fueron
especficamente testeadas. Es decir, cun bien ese modelo funciona en el mundo real.
El modelado microbiano comenz aproximadamente en 1920 con los clculos
del tiempo de muerte trmica y el uso de los valores D (tiempo de reduccin
decimal) y z (grados de variacin en la temperatura, necesarios para reducir el valor
de D en un 90%), para describir la resistencia trmica bacteriana. En la dcada del
70, se profundiz principalmente en el modelado de la probabilidad de produccin
de toxinas de C. botulinum, principalmente en USA y en el Reino Unido (Roberts e
Ingram, 1973). En los aos 80 el marcado incremento en la incidencia de brotes de
enfermedades producidas por alimentos, llev a tomar conciencia pblica de la
necesidad de un abastecimiento seguro de alimentos. En ese momento, los

30
microbilogos de alimentos comenzaban a aceptar que los mtodos microbiolgicos
tradicionales para determinar la calidad y seguridad alimenticia, estaban limitados
por el tiempo requerido para obtener los resultados y que los mtodos indirectos
basados en cambios qumicos, fsicos o fisicoqumicos, no proporcionaban una
respuesta hasta que un gran nmero de clulas se encontraba presente. Lo mismo
ocurra con varios mtodos rpidos que necesitaban, o bien un alto nivel de
contaminacin para que la respuesta sea evidente, o dependan del uso de
equipamiento muy sofisticado y oneroso.
Antes del advenimiento de la microbiologa predictiva, la mayor parte de la
bibliografa defina las condiciones ambientales limitantes del crecimiento, cuando
los dems factores ambientales se encontraban en los valores ptimos. Adems, slo
ocasionalmente los efectos de dos o ms factores de conservacin se estudiaban de
tal forma que permitieran cuantificar la interaccin de los mismos. A consecuencia
de ello, muchos de estos datos no eran de utilidad o bien no permitan predecir la
respuesta microbiana.
Si bien el modelado no revela comportamientos microbianos extraos o poco
esperados, los modelos se pueden usar para predecir, por interpolacin, el
crecimiento bajo una combinacin de condiciones que no fueron especficamente
testeadas en el protocolo experimental (Whiting, 1995).
Se han propuesto varios esquemas para categorizar los modelos, uno de ellos
propone dividirlos en modelos de crecimiento y modelos de
inactivacin/supervivencia. Dentro de cada categora se subdividen en modelos
primarios, secundarios y terciarios (Whiting y Buchanan, 1994; Alzamora y col.,
1995; Lpez-Malo, 2000; Alzamora y col.,2010).
Los modelos primarios describen cambios en la respuesta microbiana con el
tiempo en un ambiente especfico. El modelo puede cuantificar unidades formadoras
de colonia por mililitro o por gramo (UFC/mL), formacin de toxinas, niveles de
sustrato o productos metablicos (que son medidas directas del crecimiento);
absorbancia e impedancia (medidas indirectas de la respuesta). Una vez generada la
curva de crecimiento o muerte microbiana, se utiliza una funcin o ecuacin
matemtica para describir el cambio de la respuesta en funcin del tiempo. Ejemplos
de modelos primarios son: la funcin de Gompertz para crecimiento exponencial; el
modelo de Gompertz modificado para describir la inactivacin microbiana; modelos
para describir la declinacin no lineal de esporas sobrevivientes con el tiempo; el

31
modelo logstico aplicado a destruccin trmica; el modelo de Stannard; el modelo
de Schnute; la ecuacin de Fermi; etc. (Mc Meekin y col., 1993). El valor D (tiempo
necesario a una determinada temperatura para reducir en un 90% la poblacin
microbiana ) es tambin ejemplo de un modelo primario (Whiting y Buchanan,1994).
Los modelos secundarios describen las respuestas de los parmetros de los
modelos primarios frente a cambios en uno o ms factores ambientales como
temperatura, pH o aw. Ejemplos de modelos secundarios son el modelo de Arrhenius
y el modelo de la raz cuadrada (Blehrdek), que describen la dependencia con la
temperatura, y el modelo polinmico. El valor z (C necesarios para disminuir el
valor D un ciclo logartmico) utilizado en procesos trmicos es tambin un ejemplo
de modelo secundario (Whiting y Buchanan, 1994). Los mismos no sern objeto de
estudio en el presente trabajo.
Los modelos terciarios son rutinas de software para computadora menos
difundidas que convierten a los modelos primarios y secundarios en programas
amigables. Estos programas pueden calcular las respuestas microbianas frente a
condiciones que no fueron evaluadas inicialmente, comparar el efecto de diferentes
condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos, por lo que
permiten elegir a el o los microorganismos blanco de ataque en situaciones
especficas de formulacin-procesamiento de alimentos. Ejemplos de modelos
terciarios son el programa USDA Pathogen Modeling Program realizado por el
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, disponible gratuitamente en
Internet (http://www.arserrc.gov) y el Food Micromodel avalado por el Ministerio
de Agricultura Pesca y Alimentacin del Reino Unido (Wilson y col., 2002).
Es necesario remarcar que llevando a cabo este modelado se puede describir
exitosamente el comportamiento microbiano en la mayora de los alimentos pero hay
ocasiones en las que se encuentran discrepancias entre el modelo y el crecimiento
observado . Estas discrepancias son descriptas como fallas. Un ejemplo sera que
el crecimiento observado es ms lento que el predicho por el modelo (Wilson y col.,
2002).

La validacin de los modelos matemticos es esencial para demostrar su

aplicabilidad en alimentos. Si bien buenas coincidencias son observadas tambin
suelen observarse algunas debilidades.

32
 Una de las debilidades mayormente encontradas est dada por la severidad
del medio que representa la matriz alimentaria con respecto a los medios de cultivos
que se utilizan en los ensayos de laboratorio. Otra debilidad observada est
relacionada con cuanto de rpido se adapte el microorganismo a su nuevo medio
ambiente. Si en los experimentos se utilizan los mismos microorganismos a los
utilizados en el programa PMP, medios similares y las mismas condiciones de
crecimiento es de esperar que el alimento en estudio provea condiciones ms
favorables an para el crecimiento bacteriano que el medio utilizado en Laboratorio
(Walls y Scott ,1997).

Otra consideracin a tener en cuenta es que muchos modelos utilizan una

mezcla de cepas es decir cepas de rpido crecimiento junto con cepas de lento
crecimiento .Idealmente la mezcla de cepas representaran lo que normalmente se
podra encontrar en los alimentos o al menos lo ms parecido. Existen cepas como
Salmonella senftenberg termoresistente que debera tener un modelo de inactivacin
separado del resto. Los microbilogos deben chequear ambos modelos y aplicar su
propio criterio (Whiting y Buchanan ,1997).

Recientes estudios han indicado que las condiciones bajo las cuales el inculo
utilizado debe crecer tienen un impacto importante en el crecimiento o inactivacin
bacteriana. Los datos utilizados para generar los modelos estn basados en el
crecimiento de cepas a su vez crecidas en ambientes favorables antes de ser usadas
en el medio de cultivo. Estas clulas pueden tener diferencias en sus tiempos de fase
lag , en sus caractersticas de crecimiento, etc., con respecto a clulas que no fueron
pre-adaptadas.

Los modelos matemticos microbianos proveen informacin sumamente til

para tomar decisiones en determinadas situaciones. Estas situaciones pueden
resumirse en (Whiting y Buchanan, 1994) :

Prediccin en seguridad y tiempo de vida til: Crecimiento y

supervivencia microbiana permiten estimar peligros potenciales
provocados por microorganismos patgenos en alimentos luego de un
normal o abusivo tiempo de almacenamiento.

33
 Control de Calidad: Los modelos pueden brindar ayuda en desarrollar
programas HACCP mostrando que condiciones permiten crecer o
sobrevivir y as identificar los puntos crticos de control. Esto es
particularmente importante en alimentos en donde pueden existir
interacciones de diferentes factores que influyen en el crecimiento
microbiano.

Desarrollo de nuevos productos; Cambios en la composicin del

alimento o una nueva formulacin pueden ser rpidamente evaluadas
en cuanto a posible crecimiento o supervivencia de microorganismos.
Los modelos muestran que factores tienen ms influencia en la
poblacin microbiana y permite comparar nuevas versus viejas
formulaciones.

Educacin: a travs de la generacin de grficos o estimando el

tiempo de generacin de una poblacin microbiana crtica, los
modelos permiten demostrar drsticamente la importancia de
mantener la correcta temperatura o los beneficios que representa
trabajar con materias primas de alta calidad con bajos contenidos
microbianos iniciales.

Planeamiento en Laboratorio y anlisis de bases de datos: Ahorra

recursos, tiempo y dinero permitiendo al laboratorio a concentrar sus
esfuerzos en los puntos crticos. El modelado representa cada vez ms
una tcnica de rutina para anlisis de datos de comportamientos
bacterianos. Estos datos pueden ser manipulados matemticamente y
estimas as los errores.

34
2. OBJETIVOS

35
2.1 Objetivo general

En microbiologa predictiva los modelos matemticos son utilizados para

predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.
Antes de ser utilizados en una situacin prctica, estos modelos matemticos deben
ser validados con el propsito de demostrar que las bacterias se comportan de igual
modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo (p.e. medio de
laboratorio) que se utilizaron para generar dichos modelos. La presente propuesta
tiene como objetivo general la aplicacin de una estrategia que integra el concepto de
factores combinados de preservacin y la microbiologa predictiva para contribuir al
aseguramiento de la calidad microbiolgica de un derivado lcteo mediante la
validacin de diferentes tipos de modelos matemticos.

2.2 Objetivos especficos

1) Obtener respuestas microbiolgicas de crecimiento, supervivencia y/o

inactivacin de microorganismos de inters a distintos factores de conservacin
utilizados y potenciales (temperatura: presencia de distintos aditivos; pH) y a sus
combinaciones en queso untable comercial.

2) Modelar y validar internamente la cintica de

crecimiento/supervivencia/inactivacin de un microorganismo clave utilizando como
herramienta fundamental a la microbiologa predictiva a fin de establece la matriz a
utilizar.

3) Realizar estudios de reto microbiano utilizando ptgenos

comnmente causantes de ETAS en este tipo de alimento. Modelar y validar
internamente la cintica de crecimiento/supervivencia/inactivacin utilizando como
herramienta fundamental a la microbiologa predictiva.

36
 4) Una vez validados los modelos, evaluar la influencia de los factores de
estrs aplicados de uso corriente o potenciales (p.e. uso de antimicrobianos naturales)
a travs del anlisis de los parmetros obtenidos para los distintos modelos.

5) Predecir la conducta microbiana y evaluar el riesgo ante situaciones de

abuso trmico.

6) Cuando sea posible, comparar la aplicabilidad y concordancia de los

diferentes modelos utilizados primarios y terciarios en la prediccin de la conducta
microbiana en queso untable.

37
3. MATERIALES Y MTODOS

38
3.1- Matriz utilizada

Para el presente estudio se han utilizado dos matrices que responden a la

denominacin de queso (Introduccin, seccin 1.1) con la nica diferencia de
poseer o no (1000 ppm) sorbato de potasio.

A los fines prcticos llamaremos queso untable base al queso untable sin
sorbato de potasio y queso untable al que posee sorbato de potasio (1000 ppm) y
que es el que se adquiere para consumo masivo.

3.1.1 Elaboracin del queso untable base

El queso untable base fue elaborado a escala piloto y provisto por la

empresa Danone S.A. El mismo fue fraccionado en potes comerciales flexibles
(capacidad 150 gramos), usualmente usados para el envasado de yogures.
El proceso de elaboracin del queso incluy como primer paso la
elaboracin de un producto intermedio: la masa magra descremada, a base de leche
descremada, fermento, cuajo y cloruro de calcio. En un segundo paso, se adicion a
la masa magra, crema, gelatina, cloruro de sodio y citrato de sodio en los siguientes
porcentajes:

Masa magra 54,3%

Crema 44,5%
Gelatina 0,7%
Cloruro de sodio 0,2%
Citrato de sodio 0,3%

La composicin porcentual del producto final result:

Leche seleccionada descremada pasteurizada 84%

39

Crema 15,98%

Gelatina (textura) 0,002%

Citrato de Sodio (estabilizante de protenas) 0,0008%

Cloruro de Sodio 0,0006%

Cloruro de Calcio 0,004%

Fermento(cultivo iniciador) 0,02%

Cuajo 0,0001%

El fermento mencionado anteriormente estaba compuesto por una

mezcla de cultivos de las siguientes bacterias lcticas: Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis biovar. diacetylactis y Leuconostoc mesenteroides ssp.
cremoris los cuales generan cido lctico hasta pH ~ 4,5. Estos cultivos lcticos
generan diacetilo a partir del citrato (Axelsson, L., 2004), producto que le confiere al
queso un sabor amargo caracterstico.
El pH del producto final se ajust a ~ 5,0. Una vez alcanzado este valor,
el porcentaje final de cido lctico en el queso untable base tuvo un valor
aproximado de 0,6-0,7%.

3.1.2 Medicin de pH

Para la medicin de pH se utiliz un equipo marca Orion, in selectivo,

modelo 710 (Orion, Inc, USA) calibrado con soluciones buffer (Hanna Instruments,
Italia) de pH 4,01 +/- 0,01 y pH 7,01 +/- 0,01. Las determinaciones se realizaron
por duplicado informndose el valor promedio.

3.1.3 Medicin de actividad de agua (aw )

La actividad de agua se midi con un higrmetro de punto de roco AquaLab CX-2

(Decagon Devices, Inc., Pullman, WA) calibrado con soluciones saturadas de NaCl,
(NH4)2SO4, KCl y BaCl2; como lo describen Roa y Tapia de Daza (1991). Las
determinaciones se realizaron por duplicado informndose el valor promedio.

40
3.2- Reactivos utilizados

Tanto para el enriquecimiento como para el aislamiento de las bacterias se

usaron medios selectivos y diferenciales entendindose por selectivo aquel medio
de cultivo que posee en su composicin algn ingrediente con capacidad de inhibir el
crecimiento de la flora acompaante permitiendo seleccionar el crecimiento de la
bacteria deseada. Bajo el trmino de diferencial se entiende aquel medio que posee
algn componente que acenta alguna caracterstica exclusiva de la bacteria en
estudio de tal forma de poder diferenciarla del resto de las bacterias que pueda
crecer.

3.2.1- Medios lquidos de enriquecimiento selectivos y no selectivos

Caldo BHI (Merck, Darmstadt, Alemania), composicin:

Extracto de cerebro, corazn y peptona 27,5 gr,
D-glucosa 2,0 gr
Cloruro sdico 5,0 gr
Hidrgenofosfato di sdico 2,5 gr
Agar-agar 15,0 gr

Caldo FDA (Merck, Darmstadt, Alemania), composicin:

Peptona de casena 17,0 gr
Peptona de harina de soja 3,0 gr
D-glucosa 2,5 gr
Cloruro sdico 5,0 gr
Hidrgenofosfato di potsico 2,5 gr
Extracto de levadura 6,0 gr,
Suplemento: acriflavina, cicloheximida, ac.nalidxico.

Agua peptonada ( Britania, Buenos Aires, Argentina), composicin:

Peptona 10,0 gr
Cloruro de sodio 5,0 gr
Fosfato disdico 3,5 gr

41
 Fosfato monopotsico 1,5 gr

3.2.2-Medios slidos de aislamiento diferenciales y selectivos

Agar Baird Parker (Merck, Darmstadt, Alemania), composicin:

Peptona de casena 10,0 gr
Extracto de carne 5,0 gr
Extracto de levadura 1,0 gr
Cloruro de litio 5,0 gr
Glicina 12,0 gr
Piruvato de sodio 10,0 gr
Agar 17,0 gr.
Aditivos : emulsin de yema de huevo con telurito.

Agar Oxford ( Difco, Detroit, USA),composicin:

Agar base Columbia 39,0 gr
Esculina 1,0 gr
Citrato de amonio frrico 0,5 gr
Cloruro de litio 15,0 gr
Agar 2,0 gr
Suplemento: cycloheximida, colistina, cefotetn, fosfomicina,acriflavina.

Agar BPL ( Merck, Darmstadt, Alemania), composicin:

Peptona de carne 5,0 gr
Peptona de casena 5,0 gr
Extracto de carne 5,0 gr
Cloruro de sodio 3,0 gr
Hidrgenofosfato disdico 2,0 gr
Lactosa 10,0 gr
Sacarosa 10,0 gr
Rojo de fenol 0,08 gr
Verde brillante 0,0125 gr
Agar-agar 12,0 gr

42

Agar Levine ( Difco, Detroit, USA), composicin:
Peptona 10,0 gr
Lactosa 10,0 gr
Fosfato dipotsico 2,0 gr
Eosina 0,4 gr
Azul de metileno 0,065 gr
Agar-agar 15,0 gr

3.2.3- Otros reactivos utilizados

Solucin fisiolgica (Rivero SRL, Buenos Aires, Argentina).

Timol en polvo (Firmenich, Buenos Aires, Argentina)

3.3- Microorganismos utilizados

Se utilizaron para este estudio cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Listeria monocytogenes ATCC 19114D, Salmonella Enteritidis obtenida de material
clnico y Escherichia coli de igual procedencia.
Las cepas fueron conservadas a 5C en pico de flauta de agar nutritivo y
repicadas peridicamente con el propsito de mantener su viabilidad .Los
aislamientos iniciales fueron realizados en un medio slido diferencial y selectivo
apropiado para cada microorganismo.

S. aureus fue aislado en agar Baird Parker (protocolo en estndar
internacionales: United States Pharmacopea XXI,1995;Internacional
Organization for Standarization-ISO, 1977/1978; Federacin Internacional de
Lechera,1978) .

L. monocytogenes fue aislada en agar Oxford (Protocolo 143 de IDF-FIL
para productos lcteos , 1990).

S. Enteritidis fue aislada en agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa (BPL)
(protocolo sugerido por Kauffmann-1935) .

E .coli fue aislada en agar Levine (Protocolo sugerido por Standard Methods
for the examination of Water and Wastewater-1975; United Status
Pharmacopoeia XXI-1985).

43
 El enriquecimiento de cada colonia pura fue realizado en los caldos o medios
lquidos correspondientes: S. aureus en caldo cerebro-corazn (BHI), L.
monocytogenes en caldo de enriquecimiento FDA (Food and Drug Administration) y,
S. Enteritidis y E. coli en agua peptonada.

Aislamiento de S.aureus ATCC 25923 utilizados en este estudio, medio agar Baird
Parker.

Aislamiento de L.monocytogenes ATCC 19114D utilizados en este estudio, medio

agar
Oxford.

44
Aislamiento de S.Enteritidis aislada de material clnico utilizada en este estudio,
medio agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa.

Aislamiento de E.coli aislada de material clnico utilizada en este estudio, medio

agar Levine.

3.3.1 Caracterizacin de los microorganismos utilizados en este estudio

Las cepas provenientes de material clnico (materia fecal humana) fueron

tipificadas por el Instituto Nacional de Microbiologa Carlos G. Malbran. All se
realizaron todas las pruebas microbiolgicas y serolgicas necesarias para su
clasificacin taxonmica.
Las cepas de coleccin S.aureus ATCC 25923 (ATCC) y L.monocytogenes
ATCC 19114D fueron adquiridas comercialmente (Medicatec SRL, Bs As,
Argentina ).

45
3.4-Metodologa

3.4.1- Preparacin de los inculos

Para cada una de las cepas, se aisl una colonia a partir del agar diferencial y
selectivo correspondientes (Figuras 2a, b, c y d). Dicha colonia se inocul en 10 ml
de caldo de enriquecimiento (Materiales y Mtodos, seccin 3.2), el cual se incub
durante 24 hs a 37C.
Para la elaboracin de un inculo madre, se tom 0,5ml del inculo de cada
microorganismo y se diluy en 500 ml de agua peptonada alcanzando en todos los
casos una solucin con un recuento aproximado de entre 105 y 107 UFC/ml .

3.4.2-Preparacin de la solucin de timol. Evaluacin sensorial

Se hizo una prueba piloto de aceptacin organolptica con un panel de 5

personas (provenientes del laboratorio de trabajo) para establecer la mxima
concentracin de timol aceptable desde el punto de vista sensorial. La preparacin de
la solucin de timol se realiz utilizando etanol como diluyente. Se evaluaron las
siguientes concentraciones en el queso untable base: 0,2; 0,3; 0,5 y 1 %.
Para cada concentracin de timol, se pesaron 100 gr de queso untable base en
bolsas estriles (Whirl-pack, Nasco, U.S.A). Posteriormente, se aadi la solucin
de timol necesaria para alcanzar la concentracin deseada en el queso untable base y
se homogeneiz en stomacher durante dos minutos a baja velocidad. La degustacin
de las muestras de queso untable base adicionadas con distintos niveles del
antimicrobiano se realiz en el sentido de concentraciones crecientes neutralizando
entre muestra y muestra con agua y en caso de ser necesario con grisines sin sal
(Lawless y Heymann, 1999). Se descartaron aquellas concentraciones que resultaban
inaceptables organolpticamente. Se seleccion, para la realizacin del estudio, la
mxima concentracin promedio aceptada por el panel de degustadores.

3.4.3- Inoculacin del queso untable base

Se pesaron 160 gr. de en bolsa estril (Whirl-Pack, Nasco, U.S.A) y se

agregaron 3,25 ml del inculo madre, se homogeneiz en stomacher durante 2

46
minutos a baja velocidad. Las bolsas, conteniendo los 160 gr de queso inoculado y
0,48 gr de timol, se cerraron manualmente sacando todo el oxgeno remanente y se
almacenaron a las distintas temperaturas correspondientes en cada ensayo (5C-
25C) para su posterior anlisis.

3.4.4- Recuento de microorganismos

De cada bolsa inoculada y almacenada a la temperatura correspondiente a la

experiencia se tomaron en los das de recuento10 gr de la muestra de queso, por
duplicado (duplicado de experiencia). Se agregaron 90 ml de agua peptonada a cada
bolsa y se homogeneizaron 2 minutos a baja velocidad en stomacher (Seward
Medical,Londres,UK) para asegurar un correcto mezclado.
A partir de dichos homogenatos se calcularon las diluciones correspondientes
como para lograr un recuento de no ms de 100 colonias por placa y minimizar el
error de conteo. Se inocularon las placas de Petri, por duplicado (duplicado de placa)
realizando la metodologa de recuento combinado.
Para la metodologa del recuento combinado se tom 1 ml del homogenato
presente en las bolsas agitadas en el stomacher, se distribuy homogneamente en 3
placas de Petri (0,33 ml en cada placa), se esparci con esptula de Drigalsky hasta
absorcin total y se puso a incubar. El medio utilizado para las placas fue el agar de
aislamiento especfico para cada microorganismo (Materiales y Mtodos, seccin
3.2.2). La incubacin se llevo a cabo en incubadoras (Velp, Italia) a 37C ,el tiempo
correspondiente a cada experiencia. Se realiz el recuento informando UFC/gr.

3.5 Estudios realizados

3. 5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento

Se estudi el comportamiento de S. aureus en el queso untable (conteniendo

1000 ppm de sorbato de potasio) a temperatura de refrigeracin: 5C y temperatura
de abuso trmico: 15C y se compar con el comportamiento a las mismas
temperaturas pero en caldo nutritivo (BHI) a modo de tener un parmetro mas de
referencia.

47
 La experiencia se llev a cabo tal como se indica en el siguiente cuadro:

Matriz Temperatura de Das de recuento

almacenamiento
Queso untable 5C 0,7,12,17 y 21
Queso untable 15C 0,3,5,7,10,12,14,17 y 19
BHI 5C 0,1,2,3,10,12 y 14
BHI 15C 0,2,5,9,12,13,y 14

3. 5.2 Estudio del efecto de la ausencia de sorbato de potasio (queso untable

base)

Matriz Temperatura de Das de recuento

almacenamiento
Queso untable 15C 0,3,5,7,10,12,14,17 y 19
Queso untable base 15C 2,4,6,8,10,12,14 y 16

3. 5.3 Estudio sobre el efecto del pH

El pH del queso untable base se ajust mediante la utilizacin de diferentes

volmenes de jugo de limn. Se realiz de modo complementario una prueba de
aceptacin organolptica con un panel de 5 personas evaluando muestras de queso
untable base con su pH original (5,0-5,1) y en el rango de pH 4,1- 5.
Segn el volmen de jugo de limn agregado a 10 gr de queso untable base
se lleg a los siguientes valores de pH:

48
 Volumen de jugo de limn agregado pH final medido
(ml)
0,1 5,0
0,3 4,6
0,5 4,5
0,7 4,4
0,9 4,3
1,1 4,2
1,3 4,1

El valor de pH seleccionado fue el de menor valor organolpticamente

aceptado. Una vez ajustado el pH se procedi a preparar la matriz sobre la cual se
desarrollara el estudio .Para dicho propsito se trabajo con el queso untable base a
dos pH: 5,0 y 4,3. Las condiciones de temperatura y pH y en las que se desarroll
el presente estudio se detallan en la siguiente tabla:

Temperatura/pH Das de recuento

10C/ 5,0 0,5,7,12,20,25,30 y 40

15C/ 5,0 0,2,4,6,8,11,13,15 y 17.

22C/5,0 0,2,5,7,12,16,19,26,28,30,33 y 38
10C/ 4,3 0,20,40,50,60 y 65.
15C/ 4,3 0,3,7,11,14,17 y 19.
22C/ 4,3 0,2,6 y 20

49
3. 5.4 Estudio de reto microbiano

De acuerdo a la informacin aportada por la microbiologa predictiva que

describe el comportamiento de los microorganismos en medio de cultivo en
determinadas condiciones de pH y temperatura, se intent estudiar el
comportamiento de cuatro bacterias seleccionadas. En base a esta informacin se
elaboraron programas de estudio a 6, 17 y 25C.
La matriz utilizada fue queso untable base y las bacterias fueron S.aureus,
E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes

Temperatura/pH Das de recuento

6C/ 5,0 0, 6, 13, 20, 27, 30, 33 y 36
17C/ 5,0 0, 2, 5, 8, 11, 12, 13 y 14

25C/ 5,0 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7

A cada da de recuento fueron removidas 2 bolsas de la cmara de

incubacin y cada una fue sometida al estudio microbiolgico descripto (Materiales
y Mtodos, seccin 3.4)

3. 5.5 Utilizacin de timol

Considerando el comportamiento observado en el apartado anterior se intent

estudiar el comportamiento de los mismos microorganismos adicionando al queso
untable base un antimicrobiano natural compatible con este tipo de productos, timol,
componente principal del aceite esencial de organo y observar as el efecto que el
mismo produce sobre su desarrollo.
El queso untable base fue adicionado con timol (0,3% p/p) y luego inoculado
con S.aureus S. Enteritidis (Materiales y Mtodos, seccin 3.4.3) y almacenados a
diferentes temperaturas. Los das de recuento (y temperaturas de almacenamiento)
fueron similares a los establecidos en el mismo ensayo pero en ausencia de timol a

50
los fines de poder realizar una comparacin del comportamiento del microorganismo
ensayado. Se realiz el siguiente esquema de muestreo:

Matriz Microorganismo Temperatura/pH Das de recuento

Queso untable S.aureus 6C/ 5,0 0,7,14,21,31,33 y 35
base + 0,3%timol 17C/ 5,0 0,4,7,11,12,18 y 21
25C/ 5,0 0,3,4,10,12,14 y 17

Queso untable S.Enteritidis 17 C/ 5,0 0,2,7,9,13,14,15 y 20

base + 0,3%timol

3. 6 Obtencin de curvas de crecimiento o supervivencia. Modelado matemtico

En los casos en donde experimentalmente se observ crecimiento bacteriano

se grafic Log N en funcin del tiempo y en donde se observ muerte bacteriana se
grafic Tiempo en funcin de declinacin logartmica (Log decline) con el objeto de
obtener una mejor comparacin con la informacin brindada por el programa
predictivo de modelado terciario Pathogen Modeling Program (Agricultural
Research Service, USDA; 2010).

3. 6. 1 Modelado primario

Se describe a continuacin los modelos primarios utilizados en esta tesis.

3.6.1.1 Modelo para caracterizar curvas de crecimiento

La ecuacin de Gompertz y su forma modificada fue usada primariamente en

el modelado de curvas asimtricas sigmoideas de crecimiento microbiano (Mc
Meekin y col. 1993). La ecuacin de Gompertz (Zwietering y col., 1990; Gibson y
col. , 1987; Gibson y col., 1994) para describir crecimiento bacteriano se describe
como:

Log N = A + C exp (-exp ( - B (t M ))) eq (1)

donde:

51
 Log N: Log. decimal del recuento bacteriano a tiempo t

Los parmetros matemticos estimados (A, B, C y M ) representan las

diferentes regiones de la curva pero no tienen un significado biolgico (Figura 14).
Con el propsito de un mejor entendimiento y caracterizacin de la curva de
crecimiento, dichos parmetros pueden manipularse con el propsito de recalcular a
partir de ellos los parmetros biolgicos tiempo de generacin (TG): tiempo en que
se duplica la

Figura 14. Parmetros matemticos de la ecuacin de Gompertz

Log N (UFC/g)

Tiempo (da)

poblacin; velocidad de crecimiento exponencial (VCE):velocidad en el punto de

inflexin de la curva y tiempo de fase lag (LAG): tiempo a partir del cual comienza
el crecimiento, segn:

Log10 (2 ) exp(1)
TG (da ) = eq(2 )
BC
VCE((Log10 UFC / g ) / da ) = eq(3)
BC
exp(1)

LAG(da ) = M
1
eq(4)
B

52
Los valores de los parmetros se pueden determinar por el ajuste de la funcin de
Gompertz a los datos experimentales por un procedimiento de estimacin iterativa
que determine el mejor ajuste de acuerdo al criterio de los cuadrados mnimos.

3.6.1.2. Modelo para caracterizar curvas de supervivencia

La ecuacin de Gompertz modificada para describir supervivencia o

inactivacin bacteriana se describe como:

Log [Nt/N0] = C exp (-exp(A + Bt)) C exp ( -exp(A)) eq (5)

donde

Log [Nt/N0]: fraccin logartmica de supervivencia

Los parmetros estimados (A, B y C) representan las diferentes regiones de

la curva de supervivencia inactivacin (Figura 15). A: hombro de la curva de
muerte (da); B: velocidad mxima de muerte (1/da) y C: cambio total en el nmero
de sobrevivientes (-).

Figura 15. Parmetros de la ecuacin de Gompertz modificada para muerte

53
3.6.2 Modelo terciario

El progreso logrado en el modelado microbiano ha sido importante y los

modelos presentados han logrado ser una herramienta de mucho valor para evaluar y
disear diferentes procesos en la industria alimentaria. Sin embargo no es posible an
contar nicamente con estos modelos para determinar la seguridad de los alimentos y
sistemas. Las validaciones en laboratorio son an necesarias para determinar
inequvocamente el crecimiento posible de microorganismos patgenos o su
supervivencia en los alimentos.

El Programa de modelado de patgenos su sinnimo en el habla inglesa,

Pathogen Modeling Program (PMP) fue desarrollado por los cientficos Whiting y
Buchanan del Departamento de Agricultura de USDA. El mismo es de acceso
gratuito y ofrece una serie de menes (Figuras 16 y 17) para la entrada del
microorganismo cuya conducta se desea evaluar; la seleccin de la atmsfera
(aerbica anaerbica); la poblacin bacteriana inicial; pH; el nivel de cloruro de
sodio; la temperatura y la concentracin de nitrito. Luego se puede elegir si se
quieren obtener los parmetros cinticos, el tiempo estimado para alcanzar una dada
poblacin un grfico mostrando la curva. Las variables pueden ser modificadas
fcilmente permitiendo al usuario estimar que sucedera si las condiciones variaran.

Este programa provee un formato amigable que permite disponer de

modelos de respuestas para Salmonella, S.aureus, L.monocytogenes, S.flexneri,
B.cereus, A.hydrophila y E.coli O157:H7 (Buchanan, 1993).

El Servicio de Inspeccin y Seguridad Alimentaria de USDA ha utilizado

este modelo para asesorar sobre el crecimiento de microorganismos patgenos en
formulaciones de alimentos a base de carne. Los modelos, sin embargo, no
reemplazan completamente el test microbiolgico experimental. Ellos permiten
realizar asesoramiento en cuanto a respuestas microbiolgicas esperadas, objetivas y
ms eficientes en cuanto a costos posibles.

54
Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano

Figura 17: Ejemplo de curva de supervivencia bacteriana

55
3. 7 Anlisis estadstico

Los ajustes del modelo de Gompertz y del modelo de Gompertz modificado

para muerte a los datos experimentales se validaron internamente mediante el
anlisis de varianza y la aplicacin de los siguientes tests (ver Apndice ).
Test F de significacin de la regresin
Clculo del coeficiente de determinacin corregido por grados de libertad
del sistema ( R2 aj.)
Anlisis de residuales

Todas las regresiones no lineales se analizaron utilizando el software

Statgraphics plus para Windows, versin 5.1 (Statistical Graphics corp., USA)

56
4. RESULTADOS

57
4.1 Estudios de microbiologa predictiva en queso untable. Efecto de la
temperatura de almacenamiento

En el presente estudio se evalu mediante modelado primario la respuesta de

S.aureus en funcin del tiempo a 2 temperaturas 5 y 15C, tal como se detalla en
Materiales y Mtodos, seccin 3.5.1. Una vez realizada la inoculacin del queso
untable se almacen a temperatura de refrigeracin (5C ) y temperatura de abuso
trmico (15C ) durante 20 das. Cabe aclarar que en este primer estudio no se
evalu la utilizacin del programa terciario de modelado de patgenos, PMP dado
que la matriz contena sorbato de potasio, hecho que no es contemplado por dicho
programa. La Figura 1b muestra los resultados obtenidos. Adicionalmente, con el
propsito de disponer de un control se obtuvieron las curvas de respuesta de S.aureus
en caldo nutritivo (BHI) (Figura 1a).
El desarrollo de S. aureus en caldo BHI a 5C y 15 C durante 15 das de
almacenamiento (Figura 1a) result predecible dado que dichas temperaturas no son
ptimas para el desarrollo de este microorganismo. Pudo observarse que la
poblacin se mantuvo aproximadamente constante a 5C durante el almacenamiento,
con leve crecimiento a 15C durante los primeros das para luego mantenerse
constante.
7
La poblacin de S.aureus en queso untable (valor inicial ~ 1 x 10 UFC/g)
decreci conforme aument el tiempo de almacenamiento a las dos temperaturas
ensayadas (Figura 1b). En el caso de almacenamiento del producto a temperatura de
refrigeracin (5C), la inactivacin alcanz 2,0 ciclos logartmicos en 19 das. En el
caso de almacenamiento del producto inoculado a temperatura de abuso trmico
(15C), la inactivacin fue menos pronunciada, alcanzando solo 1,5 ciclos
logartmicos en aproximadamente 19 das.
Las curvas de supervivencia fueron modeladas con la versin modificada de
la ecuacin de Gompertz para muerte microbiana (Linton y col., 1995) donde los
parmetros obtenidos A, B y C representan las diferentes partes de la curva: hombro
de la curva de muerte ( A), mxima velocidad de muerte (B) y cambio total en el
nmero de sobrevivientes (C) (Materiales y Mtodo, seccin 3.6.1.2).

58
Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5C (-- ) y 15C ( -- ) en
el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en queso untable (b); (I)
desvo estndar.

59
 Este modelo se ha venido aplicando con xito para caracterizar el
comportamiento de una variada gama de microorganismos y alimentos. Bhaduri y
col. (1991) fueron los primeros en demostrar que la curva descripta por la ecuacin
de Gompertz modificada poda describir el comportamiento no lineal de curvas de
supervivencia en el caso de L.monocytogenes en pasta de salchichas.
Posteriormente, Linton y col. (1995) utilizaron exitosamente esta ecuacin para
describir el comportamiento no lineal de L.monocytogenes y encontraron que esta
ecuacin era efectiva para modelar curvas de supervivencia lineales y curvas de
supervivencia con regin de hombro y cola.
Char (2006) estudi la respuesta de L.innocua en jugo de naranja combinando
tratamientos trmicos a diferentes temperaturas (57 a 61C) y adicionando diferentes
niveles de vainillina (0 a 1100 ppm). La ecuacin de Gompertz modificada explicaba
ms del 98% de las variaciones observadas .En general altas concentraciones de
vainillina combinada con tratamientos trmicos se traducan en curvas cercanas a la
linealidad con pequeos o ausentes hombros (con consecuentes bajos valores del
parmetro A) y altas tasa de muerte caracterizadas a travs del parmetro B. Un
descenso en el parmetro B refleja una disminucin en la resistencia microbiana.
Chhabra y col. (2002) obtuvieron similares respuestas cuando estudiaron la
respuesta de L.monocytogenes en cuanto a resistencia trmica (50, 60 y 65C) en
diferentes condiciones de pH y niveles de grasa en leche. Ellos tambin encontraron
que este modelo era muy verstil describiendo diferentes tipos de curvas de
inactivacin (curvas cercanas a la linealidad, curvas con regin de hombro y curvas
sigmoideas) con altos niveles de correlacin.
Como puede observarse en la Figura 2, en el caso de S.aureus inoculado en
queso untable almacenado a 5C, el modelo ajust correctamente con valores
predichos muy cercanos a los obtenidos experimentalmente. El anlisis de la
varianza (Tabla 1) arroj un coeficiente de determinacin ajustado por grados de
libertad elevado, con lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un 73% de las
variaciones observadas en las repuesta con un valor del estadstico F significativo (
< 0,05%). El anlisis de valores observados vs. valores predichos mostr una
distribucin homognea alrededor

60
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable almacenado a 5C, (
) valores experimentales; ()
prediccin .

0
-0,4
LogN/N0

-0,8
-1,2
-1,6
-2
-2,4
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (da)

Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros

caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
almacenado a 5 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,21 0,08
B -0,35 0,03
C -8,6 8,1

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 10,12 3 1348*
RESIDUAL 0,005 2
R2 ajustado 99,70
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

de la diagonal mientras que la distribucin de los residuales no mostr anomalas de

conos o herraduras (Apndice)(Figura 3a y b).

61
 Este modelo predijo un hombro inicial (A) de ~ 1 da; una velocidad de
muerte (B ) de 0,35 da-1 y un cambio global en el nmero de sobrevivientes que
cuadriplica al observado (C= 8,6), hecho que probablemente se deba a la ausencia de
una cola marcada en la curva de muerte (Alzamora y col,2010).
Ferrante y col. (2007) utiliz el modelo de Gompertz modificado para
modelar supervivencia de L.monocytogenes en jugo de naranja fresco (pH 3.5)
ultrasonicado (600 W,2 0 KHz, 95.2 m de amplitud de onda; 45C). Este modelo
represent exitosamente las curvas de supervivencia de L.monocytogenes que
resultaron completamente sigmoideas y semi-sigmoideas dependiendo del
tratamiento. Estos autores tambin describieron la sobreestimacin del parmetro C
para las condiciones ms severas en donde combinaban 1000 y 1500 ppm de
vainillina mas tratamiento con ultrasonido dado que la poblacin microbiana
disminua muy rpidamente describiendo una curva sin cola.

Figura 3 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus

en queso untable almacenado a 5C: a) Valores observados vs valores predichos; b)
Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; () prediccin.

(b)
valores observados

0 (a) 0,06
-0,4
0,04
residuales

-0,8
0,02
-1,2
0
-1,6
-0,02
-2
-0,04
-2,4
-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0 -0,06
-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0
valores predichos
valores predichos

Cuando este modelo se utiliz para caracterizar la curva de supervivencia de

S. aureus en queso untable almacenado a 15C, se observ que el mismo ajust
correctamente con valores predichos muy cercanos a los obtenidos
experimentalmente (Figura 4). El anlisis de la varianza (Tabla 2) arroj un
coeficiente de determinacin ajustado por grados de libertad elevado (98,6 %) , con
lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un importante % de las variaciones
observadas en las repuesta con un valor del estadstico F significativo ( < 0,05%).
El anlisis de valores observados vs. valores predichos mostr una

62
distribucin homognea alrededor de la diagonal mientras que la distribucin de los
residuales no mostr anomalas de conos o herraduras (Figura 5 a y b). Este
modelo predijo para S. aureus inoculado en queso untable base almacenado a 15C
un hombro inicial (A) de 4,55 das; una velocidad de muerte (B) de 0,39 da-1 y un
cambio global (C) de 1,55 ciclos, el cual es muy cercano al valor observado
experimentalmente.

Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de

S.aureus en queso untable almacenado a 15C, (
) valores experimentales; ()
prediccin.

0
-0,3
LogN/N0

-0,6
-0,9
-1,2
-1,5
-1,8
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)

63
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
almacenado a 15 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A 4,55 0,17
B -0,39 0,04
C -1,65 2,97

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 6,49 3 432
RESIDUAL 0,03 6
R2 ajustado 98,59
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

Figura 5: Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus

en queso untable almacenado a 15 C: a) Valores observados vs valores predichos; b)
Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; () prediccin.

0,16
Valores observados

0 (b)
(a) 0,11
Residuales

-0,3
-0,6 0,06

-0,9 0,01

-1,2 -0,04
-1,5 -0,09
-1,8 -0,14
-1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0 -1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0
valores predichos Valores predichos

4.2 Estudio en queso untable base

Con el propsito de estudiar si la presencia de sorbato de potasio en el queso

untable afectaba el crecimiento de S. aureus, se trabaj con la misma matriz
alimentaria pero sin la presencia de este aditivo. La experiencia se realiz tal como se

64
detalla en Materiales y Mtodos, seccin 3.5.2. Para ello se trabaj con la misma
cepa de S.aureus y una vez inoculado el queso untable base (sin agregado de 1000
ppm de sorbato de potasio) se procedi a incubarlo a 15C.
En este caso se observ un leve decaimiento de la poblacin (1 ciclo
logartmico en ~ 18 das). Este comportamiento fue similar al observado en queso
untable con la presencia de sorbato de potasio a igual temperatura de
almacenamiento (Figura 6).
Estos datos experimentales podran estar indicando la falta de relacin entre
el comportamiento observado de S. aureus en el queso untable y la presencia del
sorbato de potasio ya que en ausencia del mismo el perfil de supervivencia de la
poblacin se mantuvo.

Figura 6: Comportamiento de S.aureus a 15C en queso untable sin (base, --) y

con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (--); (I) desvo estndar.

Con el propsito de caracterizar dichas curvas y de realizar una comparacin

ms cuantitativa, se aplic el modelo de Gompertz modificado a las curvas de
inactivacin de S. aureus en queso untable base (sin agregado de sorbato de potasio)
almacenado a 15C, obteniendo los parmetros caractersticos del mismo, segn la
metodologa descripta en Materiales y Mtodos, seccin 3.6.1.2. La Figura 7
presenta las curvas de supervivencia predichas por el modelo, junto a los respectivos
datos experimentales. La Tabla 3 exhibe los parmetros estimados que representan

65
las diferentes regiones de la curva de supervivencia: el hombro inicial (A~ 5,9 das),
la mxima velocidad de muerte (B~ 0,5 da-1) y el cambio global en el nmero de
sobrevivientes (C~ 1,4 ciclos), junto a los estadsticos de ajuste del modelo. Se
obtuvo un R2 ajustado por grados de libertad 99%. El valor de F muy significativo
(<0,01), demostr que el modelo fue apropiado para describir el comportamiento
observado. La validacin interna determin concordancia entre los valores
observados y predichos y una adecuada distribucin de residuales (Figura 8 a y b).

Figura 7 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin

de S.aureus en queso untable base almacenado a 15C, (
) valores experimentales;
() prediccin .

0,1
-0,1
Log N/N0

-0,3
-0,5
-0,7
-0,9
-1,1
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (da)

Tabla 3 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros

caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 15 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A 5,88 1,84
B -0,43 0,15
C -1,35 0,22

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 1,95 3 325**
RESIDUAL 0,006 3
R2 ajustado 99,08
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

66
Figura 8 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus
en queso untable base almacenado a 15 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin.

(b)
(a) (X 0,001)
55
Valores observados

0,1
-0,1 35

Residuales
-0,3
15
-0,5
-5
-0,7
-25
-0,9
-1,1 -45
-1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1

Valores predichos Valores predichos

El modelo de Gompertz modificado permiti mediante la adecuada

caracterizacin de las curvas de supervivencia establecer que la presencia de sorbato
de potasio no tuvo una influencia notoria en modificacin de los parmetros A, B y
C que caracterizan a las curvas de supervivencia (Tablas 2 y 3).
Un estudio realizado utilizando diferentes bacterias patgenas tales como
E.coli O157:H7,Salmonella , L .monocytogenes y S. aureus (Roberts y col.,2002)
inoculadas en diferentes tipos de queso (mozzarella y cheddar) durante un perodo de
almacenamiento que rond entre los 14 y los 50 das demostr que, en general, se
observ un decaimiento significativo de recuento bacteriano en el producto lcteo
(queso) con respecto al control que se puso de manifiesto a partir del da 14.
Roberts y col. (2002) describen que el sorbato (aditivo generalmente
reconocido como seguro) es uno de los ms usados en la industria lctea como
preservante debido a su poder inhibitorio sobre microorganismos patgenos, no as
sobre flora fermentativa. Tambin hace mencin a situaciones en donde se observ
una ineficiente proteccin del mismo.
Si bien no se observaron diferencias notorias en la respuesta del
microorganismo de prueba (S. aureus) inoculado en ambas matrices, se decidi
evaluar los resultados posteriores de este trabajo utilizando como matriz, queso
untable base con el propsito de evitar introducir un agente de stress microbiano (tal
como es el uso de sorbato de potasio) y as poder estudiar la influencia de distintos
factores evaluados.

67
4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento

Con el objeto de evaluar la influencia que el pH ejerce sobre el crecimiento

de S.aureus en el queso untable base se estudi su comportamiento a pH original
del queso (5,0) y un pH ms bajo (4,3) pero organolpticamente aceptable tal como
se detalla en Materiales y Mtodos, seccin 3.5.3. Esta experiencia se llev a cabo a
10, 15 y 22 C.
En la Figura 9a se puede observar que hubo un decaimiento de la poblacin
de S. aureus en queso untable base con pH 5,0 durante el almacenamiento a 10 y
15C pero se observ crecimiento de la misma a 22C. Puede observarse que la
reduccin de pH a 4,3 (Figura 9b) provoca la muerte del microorganismo a las tres
temperaturas estudiadas siendo este descenso ms pronunciado conforme aumenta la
temperatura.
Los resultados obtenidos muestran que el efecto a pH 4,3 result
desfavorable para el normal crecimiento de S. aureus coincidiendo con lo descripto
por Freitas y Malcata (2000), tanto a 10C ,como a 15C y 22C, quienes
observaron que tanto en quesos semi-duros como en quesos blandos elaborados con
leche de oveja la flora microbiana contaminante compuesta por diferentes gneros
de la familia Enterobacteriaceae y el gnero Staphylococcus disminua lentamente.
La nica flora constitutiva que se encontraba presente era la correspondiente a
Bacterias cido Lcticas (BAL) (predominantemente los gneros Lactococcus,
Lactobacillus y Leuconostoc) la cual, aumentaba su concentracin desde un
recuento inicial aproximado de 106-107 UFC/g en el da 0 hasta aproximadamente
108 UFC/g luego de 20 das de maduracin. Estos autores observaron tambin que
las BAL aumentaron su concentracin desde el da 7 al 21 aproximadamente y luego
se estabilizaron a los 35 das de almacenamiento. Por el contrario, el gnero
Staphylococcus disminua 2 ciclos logartmicos a los 140 das.
Con un propsito predictivo y de comparacin con los resultados
experimentales, se utiliz el programa de modelado de patgenos Pathogen
Modeling Program (PMP), tal como se describe en Materiales y Mtodos, seccin
3.6.2. En el queso untable base (pH 5,0) y almacenado a 10C se observ una
disminucin de aproximadamente 4,5 ciclos logartmicos en 40 das (Figura 9a).
Esta situacin se contradice con lo predicho por el programa PMP, el cual

68
Figura 9 : Comportamiento de S. aureus en el queso untable base almacenado a
10C (-- ), 15C ( -- ) y 22C ( --). (a) pH 5,0; (b) pH 4,3; (I): desvo estndar.

69
establece crecimiento de S. aureus (en un caldo de cultivo) con una fase de latencia
de 10 das, aumento exponencial de la poblacin hasta el da 35 y fase estacionaria a
partir de all (Figura 10a).
En queso untable base almacenado a 15C, la respuesta de S.aureus fue
nuevamente de muerte a lo largo del tiempo de almacenamiento pero con una
reduccin de 1 ciclo logartmico en 22 das contradicindose nuevamente con lo
predicho por el programa PMP (Figura 10 b).
La Figura 10c muestra la curva de crecimiento de S. aureus en queso untable
base (pH 5,0) a 22C junto a los datos predichos mediante la aplicacin del
programa predictivo PMP. En la misma se observa que el comportamiento de S.
aureus a 22C, predicho por el programa PMP determina que la fase de crecimiento
exponencial comienza inmediatamente (sin perodo de fase lag) y termina en el da 5,
mientras que experimentalmente se observ que el crecimiento exponencial
comienza a partir del da 12 (tiempo de fase lag) y termina aproximadamente el da
28. Es decir que, si bien hay coincidencia en los valores observados y predichos para
este microorganismo en las condiciones estudiadas, se produce un corrimiento en el
tiempo ya que el comportamiento en la matriz alimentaria presenta un perodo de
adaptacin inicial que retrasa el crecimiento exponencial.
Si bien este software predictivo es de muchsima utilidad en sistemas simples
(como los sistemas modelo y medios de cultivo), en alimentos reales podra fallar
dado que los factores intrnsecos propios del alimento as como tambin las
interacciones que pudieran derivar entre ellos y los microorganismos (se trate de
sinergismos o antagonismos) alteran la respuesta observada y la alejan de la
prediccin. En todo modelo predicho el comportamiento bacteriano est descripto
para un medio de cultivo con los nutrientes ptimos para permitir, si fuera factible, el
crecimiento bacteriano. Esta es posiblemente la causa por la que no se observ
concordancia con la prediccin (Whiting, 1997).

70
Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH 5,0 y
diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10 C, (b): 15C y (c): 22C . ( )
prediccin , ( --- ) limite de confianza superior predicho, ( --- ) limite de confianza
inferior predicho, (-- ) datos experimentales; (I) desvo estndar.

71
 Los modelos matemticos usualmente se realizan con una mezcla de 3 a 5
cepas tpicas (Whiting, 1997). De esta forma estos modelos predichos se traducen
muchas veces en rpido crecimiento o por decirlo de otra forma en cepas de fcil
desarrollo. Este mecanismo tiene la ventaja de que el modelo se convierta en un
sistema seguro. Pero existe una diversidad natural en los tiempos de crecimiento o
supervivencia de cepas de microorganismos patgenos. La otra fuente de variacin
no includa en los modelos existentes es el estado fisiolgico de la cepa y su historia
previa. Hudson (1993) ha demostrado que la duracin de la fase lag de Aeromonas
hydrofila depende de la temperatura a la cual la cepa estaba sometida o mantenida en
su estado previo y de la nueva temperatura en la cual la cepa se encuentra en el
alimento que ha contaminado. En cambio la fase de crecimiento exponencial
posterior a la finalizacin de la fase lag no es afectada por la temperatura previa. Un
patgeno en un determinado alimento adaptado a temperatura de refrigeracin en una
planta de procesamiento a 10C presentar una fase lag ms corta y un comienzo ms
temprano del crecimiento exponencial ,si accidentalmente contamina ese mismo
alimento refrigerado, que la que debera observarse en un modelo corriente. Baranyi
y Roberts (1994) consideraron que la fase lag es una consecuencia de dos procesos,
el primero reflejado por el estado previo en el que se encontraba la bacteria (por
ejemplo temperatura) y el segundo dependiente del grado de ajuste de un ambiente
(fisiolgica y bioqumicamente) al siguiente ambiente o medio intrnseco.

Con el propsito de determinar estadsticamente la influencia de la variable

temperatura se realiz un anlisis cuantitativo. Dado que a pH 5,0 se observ
decaimiento de la poblacin durante el almacenamiento a 10 y 15 C se
caracterizaron dichas curvas mediante la utilizacin del modelo primario antes
descripto: Gompertz modificado.

En el caso en donde se trabaj con queso untable base (pH 5,0) inoculado y
almacenado a una temperatura de almacenamiento de 10C se observ que el modelo
ajust adecuadamente a los datos experimentales (Figura 11) con un coeficiente de
determinacin R2 de 99%. La Tabla 4 muestra los parmetros A, B y C que
caracterizan a la curva as como tambin la significacin del modelo (F = 927 muy
significativo, <0,01). La validacin interna (Figura 12a y b) del modelo propuesto
mostr concordancia entre los datos experimentales y predichos as como tambin

72
una distribucin homognea de los residuales. Como puede analizarse el modelo
predijo la ausencia de hombro inicial (A= - 0,16 das); una velocidad de muerte de
0,05 da-1 y un cambio global (C) de 9,4 ciclos. Al parecer este modelo fall en la
prediccin de la cada total observada y esto pudiera deberse a la ausencia de una
cola marcada en los datos experimentales, hecho que ya ha sido comentado.

Figura 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de

S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 10C, (
) valores
experimentales; () prediccin .

0,6

-0,4
Log N/N0

-1,4

-2,4

-3,4

-4,4
0 10 20 30 40
Tiempo (da)

Tabla 4: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros

caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 10 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A -0,16 1,17
B -0,05 0,03
C -9,38 8,64

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl

MODELO 55,61 3 927**

RESIDUAL 0,12 5
R2 ajustado 99,01
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

73
Figura 12 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin de
S.aureus en queso untable base almacenado a 10 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales;
() prediccin.

(b)
(a)
Valores observados

0,6 0,32

-0,4 0,22

Residuales
0,12
-1,4
0,02
-2,4
-0,08
-3,4 -0,18

-4,4 -0,28
-4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6 -4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6

Valores predichos Valores predichos

El anlisis correspondiente a queso untable base (pH 5,0) inoculado y

almacenado a 15C fue efectuado en el tem anterior (seccin 4.2, Tabla 3) en donde
se obtuvo en comparacin con la temperatura anterior evaluada, 10 C, un hombro
inicial mayor (A= 5,9 das), una velocidad de muerte similar (B = - 0,43 d-1) y un
cambio global en el numero de sobrevivientes significativamente menor (C = 1,4),
hecho que est de acuerdo con el establecimiento de una temperatura ms propicia
para el desarrollo del microorganismo.
A 22C se observ crecimiento de S. aureus en queso untable base (pH 5,0).
Dado que el comportamiento observado no fue lineal, se caracteriz la curva
mediante el modelo de Gompertz (Figura 13), obteniendo los parmetros
matemticos caractersticos del mismo: A, B, C y M.
Tal como se describi en Materiales y Mtodos, seccin 3.6.1.1 con los
valores matemticos de los parmetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parmetros biolgicos tiempo de generacin (TG); velocidad de crecimiento
exponencial (VCE) y tiempo de fase lag (LAG). La Figura 13 muestra una adecuada
correlacin entre los datos experimentales y los predichos por este modelo primario.

74
Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22C, (
) valores
experimentales; () prediccin

9,1
Log N 8,1

7,1

6,1

5,1

4,1
0 10 20 30 40
Tiempo (dia)

La Tabla 5 resume el anlisis de la varianza para el modelo propuesto. El

valor de F para la regresin completa result muy significativo (< 0,01) indicando
que existe una relacin estadsticamente significativa entre la respuesta observada y
el modelo. El valor del coeficiente de determinacin (R2) ajustado por grados de
libertad indica que casi el 95,8 % de la variacin de la respuesta ha sido explicada
por el modelo propuesto. La Tabla 5 tambin presenta a los fines comparativos los
valores de TG; VCE y LAG predichos por el programa terciario PMP para el
microorganismo y condiciones estudiadas.
Se realiz tambin validacin interna del modelo mediante mtodos grficos,
los cuales se presentan en la Figura 14. El grfico de valores observados versus los
valores predichos (Figura 14 a) presenta una distribucin homognea alrededor de
la diagonal, con puntos muy cercanos a la misma, indicando alta correlacin entre los
mismos. Cuando se graficaron los residuales en funcin de los valores predichos
(Figura 14b) se observ una distribucin homognea de los mismos en una banda
horizontal alrededor de la prediccin sin detectar conos o herraduras. Por todo lo
expuesto, se concluy que no existe razn para dudar que el modelo propuesto sea
adecuado para describir la respuesta observada.

75
Figura 14 : Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin
0,6
9,1 0,4 (b)
Valores observados

(a)

Residuales
8,1 0,2
7,1 0

6,1 -0,2

5,1 -0,4

4,1
-0,6
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 9,1
Valores predichos Valores predichos

Tabla 5: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y

sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 22 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 4,54 0,18
B 0,14 0,05
C 4,43 0,73
M 18,60 1,70
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER3
Fuente SS gl
MODELO 510,35 4 981**
RESIDUAL 1,02 8
R2 ajustado 95,85

PARAMETROS BIOLGICOS2

Gompertz PMP
TG (da) 1,17 0,10

VCE (Log UFC/g/da) 0,26 1,35

LAG (da) 18 0,67

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.

76
 El anlisis de la Tabla 5 determina que comparando los parmetros
biolgicos caractersticos de la curva de crecimiento de S. aureus en queso base (pH
5,0; 22 C) adecuadamente estimados por el modelo de Gompertz con la estimacin
del programa PMP puede verse que, este programa predice escaso tiempo de latencia
(0,7 das vs. 18 das); triplica la velocidad de crecimiento exponencial respecto de la
observada (1,4 Log UFC/g/da vs 0,3 Log UFC/g/da) y disminuye notoriamente el
tiempo de generacin respecto del observado (0,1 da vs 1,2 das). Si bien la
temperatura favorece el crecimiento del microorganismo el alimento real no ofrece
en este caso condiciones tan favorables como el medio de cultivo probablemente
debido a la presencia de flora competitiva y/o posibles inhibidores.

El anlisis del comportamiento predicho por el programa PMP para la

supervivencia de S. aureus en queso untable base con pH reducido (4,3) a 10, 15 y 22
C se exhibe en la Figura 15 junto a los datos experimentales observados.
Se observa que a 10C los datos experimentales siguen un comportamiento
similar que el predicho por el programa PMP considerando los lmites de confianza
superior e inferior (Figura 15a). Hasta el da 20, la cada en ciclos logartmicos en
funcin del tiempo es perfectamente coincidente con el modelo. A partir de all y
hasta el da 40 se observa que experimentalmente el decrecimiento de la poblacin se
detiene registrndose una mayor pendiente lo que significa que la muerte del
microorganismo se desacelera. An as el comportamiento bacteriano experimental
entra dentro del rango predicho por el modelo. Para el tiempo de almacenamiento
evaluado (~ 40 das) el programa PMP predice, en promedio, una declinacin de 4
ciclos logartmicos.
A 15C (Figura 15 b) se observa que el programa PMP no predice
decaimiento hasta el da 10 (1 ciclo logartmico). Los datos experimentales
demostraron que hubo un decaimiento de 3 ciclos logartmicos en 14 das mientras
que el programa PMP predice un decaimiento igual en 29 das. Esta tendencia se
mantuvo conforme fue transcurriendo el tiempo de almacenamiento.
Algo similar se observ a 22C (Figura 15 c) en donde los datos
experimentales demostraron una cada de 4 ciclos logartmicos en 18 das mientras
que el programa PMP predice la misma cada en 30 das.

77
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10 C(a), 15C (b) y 22C (c):
() prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite de
confianza inferior predicho ,(-- ) datos experimentales.

78
 Si bien en las experiencias de reto microbiano realizadas en queso untable
base con pH reducido (pH 4,3) se dispuso de escasos puntos experimentales se
realiz un modelado primario solo con el fin de orientar sobre los parmetros
caractersticos de las curvas obtenidas a 10, 15 y 22 C y comparar con la prediccin
del programa PMP.
A 10C se observ que el modelo de Gompertz modificado para
supervivencia ajust adecuadamente los datos experimentales (Figura 16). El
anlisis de la varianza (Tabla 6) estim un valor de coeficiente de determinacin R2
de 99,99% con un valor de F muy significativo (F = 8,4x108; <0,001). El modelo
fue validado internamente observando una distribucin homognea en torno a la
lnea diagonal de valores experimentales vs. valores predichos y desestimando
anomalas en la distribucin de residuales (Figura 17 a y b). En estas condiciones, el
modelo estim un hombro inicial de 3 das (A); una velocidad de muerte (B) de 0,17
da-1 y un cambio global en el nmero de sobrevivientes al final del almacenamiento
de 3,6 ciclos logartmicos (C), siendo este valor algo inferior a la cada predicha por
el PMP (~ 4 ciclos logartmicos, Figura 15a).

Figura 16 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin

de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 10C, (
) valores
experimentales; () prediccin .

0,5

-0,5
Log N/N0

-1,5

-2,5

-3,5
0 10 20 30 40
Tiempo (da)

79
Tabla 6: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 2,91 1,0x104
B -0,17 0,9x103
C -3,56 0,5x104

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl

MODELO 25,25 3 8,4x108**

RESIDUAL 1,0x10-8 1
R2 ajustado 99,99
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -)

Figura 17: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
)
valores experimentales; () prediccin

(X 0,00001)
8
(b)
(a)
Valores observados

0,5
Residuales

-0,5 4

-1,5 0

-2,5 -4

-3,5 -8
-3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5
Valores predichos Valores predichos

A 15C el modelo primario de Gompertz modificado ajust adecuadamente

con un valor de R2 de 94% con un F muy significativo (Figura 18 y Tabla 7) .Esto
indicara que el modelo explica el 94% de las diferencias encontradas.

80
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 15C, (
) valores
experimentales; () prediccin .

0
-0,5
Log N/N0

-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0 3 6 9 12 15
Tiempo (da)

El anlisis de validacin interna (Figura 19 a y b), mostr una distribucin

homognea de los datos experimentales alrededor de los datos predichos y una
distribucin sin alteraciones de los residuales en torno a una banda horizontal.

Este modelo predijo un hombro inicial (A) cercano a los 2 das mientras que
en la prctica ste resulto de aproximadamente 3 das. El parmetro C en ambos
casos rond los 3 ciclos logartmicos en 15 das de almacenamiento y no se observ
cola ya que la prediccin es que la cada en ciclos logartmicos contina conforme
transcurre el tiempo.

81
Tabla 7: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,60 0,90
B -0,20 0,17
C -3,89 2,14

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 14,76 3 49**
RESIDUAL 0,20 2
R2 ajustado 94,12

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

Figura 19: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales;
() prediccin.
(b)
Valores observados

0 0,34
(a)
-0,5 0,24
Residuales

-1 0,14
-1,5 0,04
-2 -0,06
-2,5 -0,16
-3 -0,26
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos

El anlisis de la aplicacin del modelo de Gompertz modificado a la curva de

supervivencia de S. aureus en queso untable base con pH reducido (pH 4,3) y 22C
mostr que el mismo ajust adecuadamente a los datos experimentales (Figura 20 y
Tabla 8). El modelo represent en un 99,9 % la variacin en la respuesta observada
con la obtencin del estadstico F muy significativo (<0,01). La validacin interna

82
realizada no mostr anomalas (Figuras 21 y 22). El modelo no predijo, tal como se
observ experimentalmente, un hombro inicial (A); predijo una velocidad de muerte
de 0,3 da-1 y un cambio global en el nmero de sobrevivientes (C) en 18 das de
almacenamiento muy superior al observado experimentalmente (9 vs 4). Ya se ha
comentado la debilidad de este modelo para predecir un salto en el nmero de
sobrevivientes cuando la curva de supervivencia carece de cola marcada. Otros
autores han observado igual desenvolvimiento del modelo en otros sistemas
alimenticios estudiados.

Figura 20 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin

de S.aureus en queso untable base ( pH 4.3) almacenado a 22C, (
) valores
experimentales; () prediccin .

0
Log (N/N0)

-1

-2

-3

-4
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)

83
Tabla 8: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A -0,49 0,25
B -0,27 0,01
C -8,80 1,62

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl

MODELO 26,95 3 22458**

RESIDUAL 0,0004 1
R2 ajustado 99,98%
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

Figura 21: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C: Valores observados vs valores
predichos;
Valores observados

-1

-2

-3

-4
-4 -3 -2 -1 0
Valores predichos

84
Figura 22: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C:Residuales vs. valores predichos
. (
) valores experimentales; () prediccin

(X 0,001)
23

Residuales
13

-7

-17
-4 -3 -2 -1 0
Valores predichos

Ferrante y col. (2007) observaron que el valor del parmetro C estaba

sobreestimado para las condiciones ms severas de su experiencia en jugo de naranja
tratado con ultrasonido y crecientes concentraciones de vainillina a modo de inhibir
el crecimiento de L.monocytogenes.
Linton y col. (1995) evaluaron la resistencia trmica de L.monocytogenes en
frmulas de alimentos infantiles tratadas a 50, 55 y 60C, pH cuyos valores
ascendan de 5 a 7 y a concentraciones crecientes de NaCl (0,2 a 4 %).Estos autores
observaron que conforme al aumento de temperatura se produca aceleracin de la
muerte bacteriana describiendo curvas con escasa o nula regin de hombro y cola. El
modelo sobreestim el parmetro C.

85
4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas
responsables de ETA.

4.4.1 S.aureus
Una vez evaluado el comportamiento de S.aureus en queso untable base
frente a las diferentes variables estudiadas (temperatura, presencia de conservante y
pH) se procedi a estudiar de manera anloga el comportamiento de cuatro
bacterias distribuidas en el medio ambiente, fuertemente relacionadas con
enfermedades transmitidas por alimentos y frecuentemente encontradas en productos
lcteos: S.aureus, E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes (Araujo y col., 2002). La
experiencia se llev a cabo tal como se describe en Materiales y Mtodos, seccin
3.5.4, en primer lugar, inoculando S.aureus en queso untable base y almacenando
dicho producto a 6, 17 y 25C para su posterior anlisis.
Se observ un decrecimiento no lineal de la poblacin de S. aureus a 6C y
17C (Figura 23). A 25C, el comportamiento del mismo fue de neto crecimiento
describiendo una curva algo sigmoidea. Todos estos datos resultaron coincidentes
con los ensayos anteriormente descriptos a temperaturas similares (10C; 15C y
22C) (Figura 9a ).
La Figura 24a muestra la prediccin por modelado terciario (programa PMP)
del comportamiento de este microorganismo en un medio de cultivo pH 5,0
almacenado a 6C, junto a los datos experimentales. El programa predice, en
coincidencia con lo observado, un decrecimiento de la poblacin. La muerte de este
microorganismo en el queso untable base fue ms rpida que la prediccin promedio
en un medio de cultivo a un dado tiempo de almacenamiento, ms cercana al lmite
inferior predicho.
De la misma manera la Figura 24b muestra que en queso untable base
almacenado a 17C y pH 5.0, mientras experimentalmente se observ muerte de este
microorganismo, el programa de modelado de patgenos, PMP predice el
crecimiento del mismo. Las bacterias cido-lcticas presentes en quesos son
generalmente inhibitorias del crecimiento de S.aureus (Jorgensen y col., 2005). El
pH y la presencia de flora lctica competitiva son factores importantes que
probablemente afecten la presencia del patgeno ensayado (Ercolini y col., 2005).

86
Figura 23: Evaluacin del comportamiento de S.aureus en queso untable base, pH
5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ), 17C ( -- ) y 25C ( -
-); (I) desvo estndar.

La eficacia de los organismos competidores para controlar el crecimiento

depende de la proporcin del competidor con respecto a las clulas de
microorganismo en cuestin (en este caso, S.aureus), del tipo de competidor, de la
temperatura y del sustrato de crecimiento. El efecto de los competidores en la
inhibicin del crecimiento de S.aureus es muy variable, dependiendo del organismo
y de la cepa. Las interacciones de los factores extrnsecos e intrnsecos sobre el
crecimiento, sobre la supervivencia y sobre la muerte de S.aureus limitan el
crecimiento a temperaturas sub-ptimas y retardan el crecimiento a temperaturas
ptimas (ICMSF, 1996)
A 25C, se observ que los datos experimentales describan un
comportamiento similar al predicho por el programa PMP pero con una fase de
latencia mayor, dato concordante con la necesidad de las clulas de S.aureus de
llegar a una situacin de equilibrio o situacin amigable con los factores intrnsecos
de la matriz alimentaria (Figura 24c).

87
Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b) y
25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite
de confianza inferior predicho, (--) datos experimentales.

88
 Dado que las curvas cinticas obtenidas exhibieron un comportamiento no
lineal, se realiz una evaluacin cuantitativa de las mismas mediante la aplicacin
de modelado primario (Materiales y Mtodos 3.6.1). Se aplic los modelos de
Gompertz en el caso en donde se observ crecimiento (25C) y de Gompertz
modificado en los casos de muerte (6 C y 17C).

En las Figuras 25 y 27 se observa que la aplicacin del modelo de Gompertz

modificado represent adecuadamente el comportamiento de S.aureus en queso
untable base almacenado a 6C y 17C, respectivamente. Las Tabla 9 y 10
exhiben los parmetros A, B y C caractersticos del modelo junto a los estadsticos
relacionados. Los ajustes logrados fue satisfactorios, obtenindose valores de R2
ajustado entre 93% y 96 % con valores de F significativos (<0.05). El anlisis de
los valores observados vs valores predichos (Figuras 26a y 28a) demostr que hubo
una adecuada correlacin entre los mismos. La distribucin de residuales en torno a
los valores predichos (Figuras 26b y 28b) fue homognea no detectando
esparcimiento en forma de herradura cono.

Figura 25: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de

S.aureus en queso untable base almacenado a 6C, (
) valores experimentales; ()
prediccin

0,6
Log(N/N0)

-0,4

-1,4

-2,4

-3,4
0 10 20 30 40
Tiempo (da)

89
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A -1,17 0,43
B -0,06 0,006
C -14,43 1,27

ANLISIS DE LA DESVIACIN1

FISHER2
Fuente SS gl

MODELO 39,38 3 146*

RESIDUAL 0,38 4

R2 ajustado 93,00
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad. 2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

Figura 26: Validacin del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus en

queso untable base almacenado a 6 C: a) Valores observados vs valores predichos;
b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; () prediccin

(b)
(a) 0,51
Valores observados

0,6

0,31
Residuales

-0,4
0,11
-1,4
-0,09
-2,4
-0,29
-3,4 -0,49
-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
Valores predichos Valores predichos

90
Figura 27: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17C, (
) valores experimentales; ()
prediccin.
0,1

-0,3
Log(N/N0)

-0,7

-1,1

-1,5

-1,9
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)

Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 17 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A -0,39 0,096
B -0,46 0,073
C -3,44 0,74

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 15,65 3 261**
RESIDUAL 0,07 4
R2 ajustado 96,00%
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

91
Figura 28 : Validacin del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus en
queso untable base almacenado a 17 C: a) Valores observados vs valores predichos;
b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; () prediccin.

(a) 0,28 (b)

Valores observados

0,1
0,18

Residuales
-0,3

-0,7 0,08

-1,1 -0,02

-1,5 -0,12

-1,9 -0,22
-1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1 -1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1
Valores predichos Valores predichos

Nuevamente el modelo de Gompertz modificado fall en predecir la cada

global del numero de sobrevivientes a 6 C (C=14,4 ciclos) donde la curva
experimental no presenta cola marcada con un descenso final a 34 das de
almacenamiento de ~3,4 ciclos logartmicos. Esto no ocurri a 17C donde la
prediccin de la cada global (C=3,4) fue ms cercana a la observada
experimentalmente (~ 2 ciclos) debido a la presencia de una fraccin importante de
microorganismos resistentes. Roberts (2002) observ cadas similares de la
poblacin de S. aureus en queso cheddar (pH 5,4) y en mozzarella (pH 5,3) sin
agregado de sorbato de potasio y almacenados a 10C, de entre 2,4 y 4 ciclos
logartmicos, respectivamente.

Ambas condiciones de almacenamiento provocaron que la curva de muerte de

este microorganismo no presentara hombro inicial (valores negativos de A). La
velocidad de muerte fue algo mayor a 17C (B = - 0,46 da-1) , hecho que
probablemente se atribuya a que a esta temperatura se observ un descenso constante
de la poblacin durante todo el perodo de almacenamiento ensayado, hecho que
podra atribuirse a una mayor proliferacin a esta temperatura de flora competitiva.

En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base

almacenado a 25C se observ crecimiento. Se aplic el modelo de Gompertz
modificado (Figura 29) obteniendo los parmetros caractersticos del mismo,

92
encontrndose que la aplicacin de este modelo represent adecuadamente su
comportamiento.
Tal como se describi en Materiales y Mtodos, seccin 3.6.1.1 con los
valores matemticos de los parmetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parmetros biolgicos. Se determinaron por el ajuste de datos a la funcin de
Gompertz por un procedimiento de estimacin iterativa que determin el mejor
ajuste (Tabla 11). Al observarse una correcta representacin del modelo se
asimilaron dichos parmetros biolgicos como los caractersticos de la curva
experimental. El elevado valor de R2 ajustado, indica que el modelo ajust
adecuadamente a los datos experimentales, pudiendo explicar el 98,5 % de las
variaciones en la respuesta observada. Asimismo, el estadstico F result muy
significativo (0,01) lo que confirma que las variaciones de la informacin
explicada por el modelo es significativamente mayor que la variacin debida a
causas no identificables y que el efecto observado no se debi al azar. En el grfico
de valores observados vs valores predichos (Figura 30a) se observa que hubo una
adecuada correlacin .Los distribucin de residuales (Figura 30 b) tambin fue
homognea entorno a los valores predichos.
Se realiz finalmente el estudio comparativo de los datos biolgicos tiempo
de generacin (TG), fase de latencia (LAG) y crecimiento exponencial (VCE),
calculados a partir de los parmetros extrados de la ecuacin de Gompertz con los
valores predichos por el programa de modelado terciario, PMP.
En el caso de S.aureus inoculado en queso crema base almacenado a 25C, se
observa que el tiempo de generacin, predicho por PMP fue 0,07 das mientras que
el predicho por el modelo primario fue 0,54 das. Ambos modelos, en concordancia,
predijeron TG inferiores a 1 da aunque, como es de esperar algo menor en el caso de
la prediccin medio de cultivo donde no se considera la presencia de flora
competitiva y/o inhibidores (Tabla 11). Ambos modelos coincidieron en la
prediccin de la velocidad de crecimiento. La fase de latencia predicha por el modelo
primario fue superior (5das) a la estimacin del programa PMP (0,42 das). La fase
de latencia representa el tiempo de ajuste que necesita el inculo desde la fase de pre-
incubacin en su medio de cultivo

93
Figura 29: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C, (
) valores
experimentales; () prediccin

Log N
7

5
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (dia)

Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 5,11 0,12
B 1,41 0,30
C 2,79 0,18
M 6,42 3,29
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER3
Fuente SS gl
MODELO 313,63 4 2613**
RESIDUAL 0,09 3
R2 ajustado 98,46
PARAMETROS BIOLGICOS2
Gompertz PMP
TG (da) 0,54 0,07
VCE (Log UFC/g/da) 0,55 0,59
LAG (da) 5,0 0,42

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.

94
Figura 30: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. (
) valores experimentales;
() prediccin

(a) 0,21 (b)

9
Valores observados

0,11

Residuales
8

7 0,01

6 -0,09

5 -0,19
5,1 5,6 6,1 6,6 7,1 7,6 8,1 5 6 7 8 9
Valores predichos Valores predichos

ptimo y la nueva fase, probablemente menos favorable, con otras condiciones

intrnsecas (pH, nutrientes, flora extra, etc) .La duracin de la fase de latencia
depende de ambas situaciones : la primera situacin de crecimiento en el medio de
cultivo y la nueva situacin de crecimiento en el queso (Hudson,1993).

95
4.4.2 E. coli

Los datos experimentales correspondientes al desarrollo de E. coli en queso

unatble base a 6C; 17C y a 25C mostraron un comportamiento similar al
observado con S.aureus (Figura 31).
Utilizando el programa de modelado terciario PMP se observ que, en el caso
de temperatura de almacenamiento 6C, el mismo predice una disminucin de la
poblacin de E. coli en medio de cultivo, de forma coincidente con los datos
experimentales observados pero con un perfil muy diferente (Figura 32a). Mientras
el programa PMP predice un hombro inicial de aproximadamente 7 das, para luego
inmediatamente caer 3 ciclos logartmicos y a partir de all un descenso progresivo,
la curva experimental no presenta hombro y exhibe una declinacin muy escasa de la
poblacin.
A 17C, la poblacin de E.coli disminuy conforme aument el tiempo de
almacenamiento, resultados que no condicen con la prediccin del programa PMP,
el cual, propone crecimiento para dichas condiciones y en medio de cultivo (Figura
32b). Las diferencias observadas se deben posiblemente a que se trata de una
temperatura sub-ptima y que E.coli patgena no desarrolla en los quesos
fermentados a pH <5,4 (ICMSF,1996). Ya se ha comentado que tambin podra
deberse a la presencia de algn componente inhibidor de crecimiento en el queso.
Montville (1997) describi que el crecimiento bacteriano est gobernado al
menos por tres factores (pH, aw y temperatura) y en muchos casos existen
interacciones entre ellos. Estos autores mencionaron tambin que estas interacciones
o sinergismos describen como diferentes factores extrnsecos e intrnsecos del
alimento afectan la habilidad del microorganismo de sobrevivir o iniciar su fase de
crecimiento. Ciertas investigaciones (Roberts e Ingram, 1973) observaron la
necesidad de estudiar los efectos interactivos de varios parmetros influyentes en el
crecimiento bacteriano sumado a la produccin de metabolitos txicos. Esto podra
explicar la no coincidencia con lo predicho por el programa PMP.
A 25C, temperatura cercana a la temperatura ptima de crecimiento (35C-
40C) definida en la bibliografa (ICMSF,1996), se observ que los datos
experimentales son coincidentes con lo predicho por el programa de modelado de
patgenos, PMP con la diferencia de una fase de latencia de mayor duracin (3 das

96
aproximadamente), una fase de crecimiento exponencial que va desde el da 3 al da
8 (con una pendiente velocidad de crecimiento menos pronunciada que la predicha)
,para finalmente, a partir del da 8, llegar al perodo de crecimiento estacionario,
perfil que es coincidente con lo comentado en los prrafos anteriores (Figura 32c ).

Figura 31: Evaluacin del comportamiento de E.coli en queso untable base, pH 5,0
a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ),17C ( -- ) y 25C (-- );
(I):desvo estndar.

Dado que las curvas de inactivacin presentaron desviaciones significativas

de la linealidad, se consider apropiado aplicar regresin no lineal, teniendo en
cuenta todas las partes de la curva de inactivacin (Linton y col., 1995).
Se aplic el modelo de Gompertz modificado a las curvas de inactivacin de E. coli
obtenidas a 6C y 17C, calculando los parmetros caractersticos del mismo, segn
la metodologa descripta en Materiales y Mtodos, 3.6.1.2 Las Figuras 33 y 35
muestran un correcto ajuste del modelo a los datos experimentales. Las tablas 12 y
13 exhiben los parmetros caractersticos A; B y C junto a los estadsticos
relacionados. El modelo ajust correctamente en ambos casos, tal como se evidencia
por los elevados coeficientes de determinacin obtenidos (R2 = 99,9 y 98,1%,
respectivamente); la adecuada correlacin entre valores observados y predichos y
una homognea distribucin de residuales (Figuras 34 y 36).

97
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b) y 25C
(c): ( ) prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite de
confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales

98
Figura 33: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
E.coli en queso untable base almacenado a 6C, (
) valores experimentales; ()
prediccin

0,07

-0,03
Log(N/N0)

-0,13

-0,23

-0,33

-0,43
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)

Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 6 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 2,39 0,06
B -0,10 0,01
C -1,84 0,37

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl

MODELO 0,28 3 13283**

RESIDUAL 0,00002 3

R2 ajustado 99,98

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

99
Figura 34: Validacin interna del modelo propuesto para la supervivencia de E.coli
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin.

(a) (X 0,0001) (b)

48
Valores observados

0,07

-0,03

Residuales
28
-0,13
8
-0,23
-12
-0,33

-0,43 -32
-0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07 -0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07
Valores predichos Valores predichos

Figura 35: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de

E.coli en queso untable base almacenado a 17C, (
) valores experimentales; ()
prediccin.
0,6
0,1
Log(N/N0)

-0,4
-0,9
-1,4
-1,9
-2,4
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (da)

100
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 17 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A 2,88 2,00
B -0,25 0,20
C -2,80 0,89

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 8,02 3 133**
RESIDUAL 0,04 2

R2 ajustado 98,12
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da); B: mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

Figura 36: Validacin interna del modelo propuesto para el comportamiento de

E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales;
() prediccin

(a) (b)
Valores observados

0,6 0,2
0,1
Residuales

0,1
-0,4
-0,9 0
-1,4
-0,1
-1,9
-2,4 -0,2
-2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6 -2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6
Valores predichos Valores predichos

El anlisis del comportamiento de E.coli que permite el modelo de Gompertz

modificado define a 17 C una curva sigmoidea con un hombro extenso en funcin
del tiempo (~ 3 das) para luego exhibir una cada mayor que la estimada a 6C.

101
Esto sugiere la presencia de otros factores influyentes en el comportamiento
adaptacin de las clulas bacterianas al alimento.
Roberts y col. (2002) describieron que no hubo diferencias significativas en
el recuento bacteriano de E. coli O157:H7 entre el sistema control (0% sorbato de
potasio) y sistemas con concentraciones crecientes de sorbato de potasio (0.1, 0.15,
0,20 y 0.30 %) en queso cheddar y mozzarella, durante 70 das de almacenamiento a
10C. Esto podra ser una evidencia de que la muerte observada de E.coli en queso
con humedad media y alta no estara relacionada al poder inhibitorio de un
conservante qumico.

Se ajust con xito el modelo de Gompertz a la curva de crecimiento de

E.coli en queso crema base a 25C (Figura 37). La Tabla 14 exhibe los parmetros
caractersticos del modelo junto a los estadsticos relacionados evidenciando que el
ajuste logrado fue muy satisfactorio (< 0,01) obtenindose un R2 ajustado de
94,5%; adecuada distribucin de valores observados en torno a los predichos y de
residuales vs. valores predichos (Figura 38 a y b).

Figura 37: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de

E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C, (
) valores
experimentales; () prediccin

8,4

7,4
Log N

6,4

5,4

4,4

3,4
0 2 4 6 8 10
Tiempo (dia)

102
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 25 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 3,93 0,19
B 0,56 0,05
C 5,33 1,63
M 6,77 1,00
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER3
Fuente SS gl
MODELO 239,77 4 399 **
RESIDUAL 0,60 4
R2 ajustado 94,51

PARAMETROS BIOLGICOS2

Gompertz PMP

TG (da) 0,26 0,04

VCE (Log UFC/g/da) 1,18 5,9

LAG (da) 5,75 0,22

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *: significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.

El estudio comparativo entre los parmetros biolgicos que caracterizan el

crecimiento de E.coli almacenado a 25C entre y los valores predichos por PMP
evidencian que el PMP predice LAG y TG menores, concordantes con una VCE
mayor que los correspondientes estimados por Gompertz (Tabla 14).

103
Figura 38: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de E.coli en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin.

8,4
Valores observados

0,55 (b)
(a)
7,4
0,35

Residuales
6,4
0,15
5,4
-0,05
4,4
-0,25
3,4
-0,45
3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9
3,4 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4
Valores predichos Valores predichos

Con lo anteriormente observado se puede deducir que el microorganismo en

queso precis mayor adaptacin al medio y asimismo creci a menor velocidad que
la predicha en un sistema ideal.
Datos bibliogrficos (Lars, 2004) indican que ciertas especies de los gneros
ms usados en la industria lctea, Lactococcus y Leuconostoc, desarrollan a
temperatura de refrigeracin (~ 10C) y no desarrollan a mayores temperaturas (~
40C) hecho que podra relacionarse con su mayor y menor poder inhibitorio,
respectivamente.
Si bien en el presente estudio se utilizaron 2 temperaturas cercanas a 10C (6
y 17 C) y una temperatura mayor (25C) el comportamiento observado no se
contradice con lo anteriormente explicado ya que E.coli present muerte conforme
transcurri el tiempo (6 y 17C) y neto crecimiento a mayor temperatura (25C). Su
comportamiento frente a las temperaturas estudiadas es justamente inverso al
comportamiento de las bacterias lcticas; dicho de otra manera mientras a bajas
temperaturas algunas bacterias lcticas desarrollan el patgeno E.coli muere. Lars
(2004) afirma que las bacterias lcticas tienen un importante rol en la preservacin de
alimentos. Sera causa de otros estudios para explicar la mayor cada (aunque leve)
en ciclos log observada a 17C con respecto a lo observado a 6C.

104
4.4.3. S. Enteritidis

En la Figura 39 puede observarse el desarrollo de S.Enteritidis en queso

untable base almacenado a 6C, 17C y 25C. Al igual que con S. aureus y E. coli; la
poblacin de S.Enteritidis decreci en funcin del tiempo a 6C y 17C pero mostr
crecimiento neto a 25C.
El programa PMP predijo a 6C y 17C muerte bacteriana coincidente con los
resultados obtenidos, pero si se observan los grficos superpuestos (Figura 40 a y b)
se evidencia la curva de muerte de S.Enteritidis en el queso untable base a una
velocidad muy inferior (2 ciclos logartmicos en 37 das) a la predicha por el
programa PMP, el cual estim una cada de 5 ciclos logartmicos en 2,5 das.
A 25C experimentalmente se comprob crecimiento a pesar que la
prediccin por el PMP es de muerte bacteriana Figura 39 c) ; PMP predice
crecimiento de S.Enteritidis a 25C a un pH > 5.4 (en caldo nutritivo).

Figura 39: Evaluacin del comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base,

pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ),17C ( -- ) y 25C
( -- ); (I):desvo estndar.

105
Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b)
, 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- )
lmite de confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales.

c*

*en este caso no se superpuso la respuesta observada ya que se registr crecimiento (ver figura 39)

106
 Datos bibliogrficos indican que Salmonella spp. en medios ligeramente cidos
(pH 5.5) (prechoque) seguida de la exposicin de las clulas adaptadas al valor
de pH menor (choque cido) desencadenan una compleja respuesta de
cidotolerancia que potencia la supervivencia del microorganismo en medios
cidos (pH< 5,4). La respuesta se traduce en una sntesis de de 43 protenas de
choque cido en la fase logartmica de crecimiento y de 15 protenas de choque
cido en la fase estacionaria. Probablemente estos sistemas actan en los medios
cidos que predominan en los alimentos fermentados y acidificados. El estrs
cido tambin puede desencadenar resistencia bacteriana aumentada frente a
otras condiciones ambientales adversas (Daoust, 1997).
Las curvas de supervivencia obtenidas a 6 y 17C se caracterizaron utilizando
el modelo de Gompertz modificado. Las Figura 41 y 43 muestra un adecuado ajuste
del modelo a los datos experimentales. El anlisis de la varianza (Tablas 15 y 16)
arroj valores de R2 entre 99,2% y 97,3% con F muy significativo ( < 0,01). La
validacin interna realizada (Figuras 42 y 44) mostr que en los grficos de valores
observados vs predichos as como en el grfico de residuales vs. valores observados
los datos experimentales y los predichos presentaron distribucin homognea.

Figura 41 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin

de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6C, (
) valores
experimentales; () prediccin

-0,4
Log(N/N0)

-0,8

-1,2

-1,6

-2
0 10 20 30 40
Tiempo (da)

107
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,12 0,28
B -0,12 0,02
C -2,17 0,16

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 15,23 3 1016**
RESIDUAL 0,02 4
2
R ajustado 99,23
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

Figura 42: Validacin interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en queso
untable base (pH 5,0) almacenado a 6 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin

(b)
(a)
Valores observados

0,3 0,1
-0,1
0,06
Residuales

-0,5
0,02
-0,9
-1,3 -0,02

-1,7 -0,06
-2,1
-0,1
-2,1 -1,7 -1,3 -0,9 -0,5 -0,1 0,3
-2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0
Valores predichos
Valores predichos

108
Figura 43: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17C, (
) valores
experimentales; () prediccin

0,9
Log(N/N0)
-0,1

-1,1

-2,1

-3,1
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (da)

Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 17 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 0,94 0,03
B -0,16 0,06
C -3,65 0,07

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 29,90 3 249**
RESIDUAL 0,15 4

R2 ajustado 97,29
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

109
Figura 44: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin

(a) (b)
0,33
Valores observados

0,9
0,23

Residuales
-0,1 0,13

-1,1 0,03
-0,07
-2,1
-0,17

-3,1 -0,27
-3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9 -3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9
Valores predichos Valores predichos

De acuerdo a los parmetros estimados, S. Enteritidis en queso untable base

almacenado present perfiles de supervivencia similar a 6 C y 17C con valores de
hombro inicial (A) cercanos a 1 da; velocidades de muerte similares (B) entre 0,12 y
0,16 da-1 y una cada global algo mayor a 17C que a 6C, tal como se observ con
los otros microorganismos estudiados.

Dado que S. Enteritidis creci en el queso untable base almacenado a 25C,

se caracteriz dicha curva mediante el modelo de Gompertz. En la Figura 45, puede
observarse que hubo un buen ajuste con el modelo propuesto ya que la prediccin es
coincidente con los valores experimentales. El anlisis de la varianza (Tabla 17)
arroj un R2 de 96,5% con F significativo ( < 0,05). La validacin interna del
modelo no mostr tampoco en este caso anomalas (Figura 46 a y b).

110
Figura 45: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C, (
) valores
experimentales; () prediccin
8,7

7,7

Log N
6,7

5,7

4,7

3,7
0 2 4 6 8 10
Tiempo (dia)

Varios estudios han subrayado la capacidad aumentada de los

microorganismos que crecen en condiciones cidas (pH~5) o en medios de salinidad
elevada (>2% NaCl) a temperaturas ptimas para su crecimiento o cercanas
(Ferreira, 1987;Thomas, 1992). El gnero Salmonella est integrado por
microorganismos resistentes que se adaptan fcilmente a las condiciones extremas
del medio. Adems, la capacidad de adaptacin fisiolgica de Salmonella spp. se
demuestra por su capacidad de multiplicarse a valores de pH desde 4.5 a 9.5 con un
pH ptimo de crecimiento de 6.5 hasta 7.5 al igual a lo observado con respecto a la
temperatura de almacenamiento (temperatura ptima de crecimiento 37C con un
rango que va desde 2C a 54C), tal como se ha observado en el presente estudio.

111
Tabla 17 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 4,14 0,16
B 0,82 0,16
C 4,42 0,71
M 7,04 0,40
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER3
Fuente SS gl
MODELO 213,98 4 668**
RESIDUAL 0,24 3
R2 ajustado 96,50

PARAMETROS BIOLGICOS2

Gompertz PMP

TG (da) 0,27 ---

VCE (Log UFC/g/da) 1,10 ---

LAG (da) 5,33 ---

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.

Figura 46: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
)
valores experimentales; () prediccin

8,7 0,06
Valores observados

7,7 (a) 0,04 (b)

Residuales

0,02
6,7
0
5,7
-0,02
4,7
-0,04
3,7 -0,06
4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4
Valores predichos Valores predichos

112
4.4.4. L.monocytogenes

La Figura 47 exhibe el comportamiento de L.monocytogenes inoculada en el

queso untable base a pH 5,0 y almacenado a 6C, 17C y 25C. Esta experiencia se
llev a cabo tal como se describe en Materiales y Mtodos, seccin 3.4.5.4. Puede
observarse una disminucin de la poblacin, con similar perfil de inactivacin en
todos los casos aunque a 6C, se observ una leve recuperacin parcial de la
poblacin a partir de los 23 das de almacenamiento.

Figura 47: Evaluacin del comportamiento de L.monocytogenes en queso untable

base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ),17C ( -- ) y
25C ( -- ); (I): desvo estandar.

Haciendo un estudio comparativo entre los datos experimentales y los

predichos por el programa de modelado de patgenos PMP se observ (Figura 48)
que mientras a las tres temperaturas estudiadas el programa PMP predice crecimiento
en caldo de cultivo, los datos experimentales confirmaron muerte de la poblacin
bacteriana. Debe considerarse una vez ms, que la inhibicin del crecimiento
encontrada experimentalmente en el queso untable base no es contemplada por el
programa de modelado terciario PMP ya que estn presentes ciertas variables
propias del queso untable que no son consideradas en el modelo predicho.

113
 Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6 C
(a), 17C (b) y 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior
predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales.

114
 Una de las bacterias lcticas utilizadas en la elaboracin del queso es
Lactococcus lactis subsp.lactis, productor de nisina. La nisina, fue la primer
bacteriocina aislada a partir de la bacteria cido lctica Lactococcus lactis subsp
lactis. Es la bacteriocina mejor caracterizada y es utilizada como conservador de
alimentos .Es la nica reconocida por la FDA con categora GRAS (Generally
Recognized as Safe). Se produce de forma natural en algunos productos lcteos y se
utiliza en la produccin de alimentos como un aditivo en dichos productos para
prevenir la descomposicin ocasionada por bacterias Gram positivas, especialmente
de los gneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria ( Delves-Broughton,
1990 ; Gonzalez y col.,2003). Esta podra ser la razn de la diferencia observada
entre los datos experimentales y los predichos por el programa de modelado de
patgenos PMP.
Con el propsito de caracterizar las curvas de muerte obtenidas se aplic el
modelo de Gompertz modificado a las tres temperaturas estudiadas. Las Tablas 18;
19 y 20 exhiben los parmetros estimados que representan las diferentes regiones de
la curva de supervivencia junto a los estadsticos de ajuste del modelo. El ajuste del
modelo result altamente satisfactorio a las 3 temperaturas de almacenamiento,
obtenindose valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 94 y 98%.El mismo
describi a las 3 temperaturas curvas sigmoideas donde la temperatura pareci no
tener influencia en el cambio global de numer de sobrevivientes. Los valores de F
muy significativos (<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tal como se observa en la Figura 49. La validacin del
modelo fue correcta tal como puede observarse en los grficos de valores observados
y predichos (Figuras 50).

115
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6C (a),17C (b) y
25C (c) (
) valores experimentales; () prediccin

0,7 0,8

(a) -0,2 (b)

-0,3

LogNN0
LogNN0

-1,3 -1,2

-2,3 -2,2

-3,3 -3,2
0 10 20 30 40 50 0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (da) Tiempo (da)

0,7

-0,3 (c)
LogNN0

-1,3

-2,3

-3,3
0 10 20 30 40
Tiempo (da)

A 6C y 25C el modelo primario de Gompertz modificado estim valores

de los parmetros caractersticos similares: una regin de hombro (A) muy poco
marcada coincidiendo con los datos experimentales observados. El cambio global en
el nmero de sobrevivientes (C) en los 3 ciclos logartmicos observando una cola
larga (Figura 49 a). El modelo, como ocurre generalmente, no pudo caracterizar la
leve recuperacin observada luego de 27 das de almacenamiento.
A 17C el modelo estim un mayor tiempo de latencia antes de comenzar la
inactivacin del microorganismo (hombro). Tal como ocurri en los apartados
anteriores, el mismo sobrestim el cambio global en el nmero de sobrevivientes (C)
en comparacin con los valores observados.
El parmetro B, el cual indica la velocidad de muerte mxima, fue similar a
las 3 temperaturas estudiadas, demostrando que la temperatura no tuvo influencia en
al inactivacin observada. Este hecho confirma, junto con la prediccin de
crecimiento a estas temperaturas del programa PMP la posible presencia de un
agente inhibidor en el queso untable base.

116
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,64 0,27
B -0,25 0,10
C -3,02 0,18

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
Fuente SS gl FISHER2
MODELO 51,77 3 215**
RESIDUAL 0,41 5
R2 ajustado 94,26

Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,78 0,50
B -0,11 0,05
C -4,76 1,65

ANLISIS DE LA DESVIACIN1

FISHER2
Fuente SS gl

MODELO 21,18 3 235**

RESIDUAL 0,12 4

R2 ajustado 98,14
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -)

117
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,34 0,65
B -0,22 0,08
C -3,36 0,37

ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl

MODELO 18,83 3 76**

RESIDUAL 0,33 4

R2 ajustado 94,23
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

118
Figura 50: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0). a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores
experimentales; () prediccin
- 6C
(a) (b)
Valores observados

0,7
3
-0,3 2

Residuales
1
-1,3
0
-2,3 -1
-2
-3,3
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7 -3
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos
Valores predichos
- 17C
Valores observados

0,8
0,4
-0,2
Residuales

0,2
-1,2
0
-2,2
-0,2

-3,2
-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8 -0,4
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos
Valores predichos

- 25C
Valores observados

0,7 6
4
Residuales

-0,3
2
-1,3 0
-2
-2,3
-4
-3,3
-6
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos Valores predichos

La bibliografa reporta resultados contradictorios en cuanto al desarrollo de L.

monocytogenes en quesos.

119
 Roberts (2002) encontr que este microorganismo no se desarrollaba cuando
se lo inoculaba en queso mozzarella (pH 5,3) y cheddar (pH 5,0) almacenado a 10C
y sin la presencia de sorbato de potasio siguiendo, en concordancia con este trabajo,
una cintica no lineal. Por otro lado, Urlich y col. (2006) estudiaron el
comportamiento de L.monocytogenes en queso Blanco (queso blanco, semi-blando
elaborado con leche pasteurizada ,sal, enzimas y cultivos lcticos, sin aditivos) y
observaron que a las diferentes temperaturas de almacenamiento (5C, 10C, 15C,
20C y 25C) el microorganismo describa una marcada curva de crecimiento de
forma tpicamente sigmoidea.
La leche y los quesos fueron los alimentos investigados primero y se
encuentran entre los alimentos estudiados ms extensamente. Pueden estar
contaminada una gran variedad de quesos, pero son de inters mximo los quesos
blandos con una frecuencia de contaminacin con L.monocytogenes del 2 al 10%.
Rocourt (1997) vi que existe una correlacin significativa del crecimiento
de L.monocytogenes con los valores de pH (>5.5) y con la ausencia de cultivos
iniciadores durante la fabricacin del queso. El yogur (los cultivos lcticos termfilos
inhiben el crecimiento de Listeria) rara vez est contaminado

Queda por evaluar si la nica recuperacin observada experimentalmente

luego de los 35 das de almacenamiento a 6C no responde al patrn descripto por
Urlich y col. (2002) luego de superado un perodo de stress traducido en muerte
bacteriana.
Los resultados de reto microbiano con patgenos relevantes obtenidos en esta
tesis estn en concordancia con otros resultados reportados en bibliografa. Smittle y
Flowers (1994) observaron que el programa PMP fall en predecir el
comportamiento de Salmonella spp. y L. monocytogenes en una ensalada con jamn.
Hudson y Mott (1993) observaron que L. monocytogenes, Aeromonas hydrophila; y
Yersinia entercoltica creci ms lentamente a 4C y 10C en pat que lo que predijo
el programa PMP. Estudios realizados por Buchanan y Bagi (1994) han demostrado
que este programa puede proveer una buena primera estimacin del comportamiento
de E. coli O157:H7 en alimentos. Walls y Scott (1997) encontraron discrepancias
entre la prediccin del tiempo de fase lag en este programa y el crecimiento de
Listeria spp en un alimento infantil estril evaluado a diferentes temperaturas (12-
35C), pH (5,3-6,8) y niveles de sal agregada (2,9%-4,1% NaCl).

120
4.5 Uso de antimicrobianos naturales: timol

Con el objetivo de evaluar la posible capacidad antimicrobiana del timol se

estudi el comportamiento a lo largo del tiempo de S.aureus en queso untable base
con el agregado de (0,3% p/p) timol y almacenado a 6C, 17C y 25C y de
S.Enteritidis en la misma matriz alimenticia, almacenada a 17C. La experiencia se
llev a cabo tal como se describi en Materiales y Mtodos, seccin 3.4.5.5. La
concentracin de timol utilizada result ser la ms apropiada desde el punto de vista
organolptico (Materiales y Mtodos, seccin 3.4.2).
Los datos experimentales muestran que a 6 y 17C (Figura 51 a y b) S.aureus
y a 17C S.Enteritidis (Figura 52) respectivamente la pendiente de la curva de
inactivacin descripta fue mayor en ausencia de timol.
La experiencia observada fue diferente conforme aument la temperatura de
almacenamiento (Figura 51 c). Tal es as, que a 25C la curva descripta por S.aureus
demostr crecimiento pero llamativamente el crecimiento observado fue mayor en
ausencia de timol.
En muchos estudios se ha observado una rpida accin germicida del timol.
Zhou y col. (2006), Viuda-Martos y col.(2006) investigaron la actividad
antimicrobiana de cinamaldehido, timol y carvacrol contra S. typhimurium en un
medio de cultivo. Ellos encontraron que concentraciones de estos compuestos entre
0,02 y 0,04% p/p fueron suficientes para inhibir a este microorganismo. Sokmeny
col. (2004) demostraron la capacidad del aceite esencial de tomillo en para inhibir el
crecimiento de hongos como Alternaria spp, A. flavus, Fusarium spp. y Penicillium
spp. Esta capacidad antifngica del aceite esencial de tomillo tambin ha sido
demostrada por Montes y Carvajal (1998) y Basilico y Basilico (1999) sobre los
hongos, tales como A. flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus,
Aspergillus fumigatus y Fusarium spp. Segn Soliman y Badeea (2002), este efecto
antifngico podra ser causada por el contenido de b-pineno de aceite esencial de
tomillo, ya que puede alcanzan valores de 30 a 37.6%.
En el presente estudio el tratamiento con timol en una concentracin superior
(0,3% p/p) no result en una mayor inactivacin bacteriana sino que por el contrario,
el mismo ejerci una accin protectora.

121
Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (--) y sin
agregado de (--) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres temperaturas: (a)
6C, (b) 17C, (c) 25C ; (I):desvo estndar.

122
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con (--) y sin
agregado de (--) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a 17C; (I): desvo estandar.

Juven y col. (1994) sugirieron que los alimentos con cierto tenor de grasa
(Materiales y Mtodos, seccin 3.1.1) podran formar una barrera protectora
alrededor de las bacterias protegindolas de los agentes antimicrobianos. Estos
estudios sugirieron tambin que la fraccin lipdica del alimento absorbe el agente
antimicrobiano, reduce su concentracin en la fase acuosa y por ende su accin
bactericida. El contenido proteico del alimento podra tambin ser un factor
influyente en la inefectividad del timol ya que la albmina de suero bovino
neutralizaba la accin antimicrobiana del timol sugiriendo formacin de complejos
entre los componentes fenlicos del timol y las protenas del alimento. Estas
reacciones podran haber prevenido toda otra formacin de complejos similares entre
compuestos fenlicos y protenas u otros componentes de la membrana celular
bacteriana que es considerada el sitio de accin blanco de los aceites esenciales
(Peter, 2004).
Es necesario evaluar tambin el comportamiento de la flora lctica frente al
timol. Nuevos estudios seran necesarios para evaluar si el timol tiene algn tipo de
efecto sobre su crecimiento lo que provocara que el accionar metablico de las BAL
se vea alterado as como tambin su capacidad competitiva. Esto, de comprobarse,
podra explicar la causa por la cual la muerte bacteriana observada tanto en S. aureus

123
como en S. Enteritidis a las temperaturas ensayadas es menor con timol que sin la
presencia del mismo. Es decir, el timol en cierta forma altera la capacidad
biopreservativa y competitiva de las BAL permitiendo mayor desarrollo de otra flora
acompaante.

El anlisis de modelado terciario no se pudo incluir en el estudio del

comportamiento microbiano en queso con y sin timol ya que el programa PMP no
contempla, dentro de las variables que ofrece, el agregado de este producto. Esta es
la razn por la cual no fue posible comparar las respuestas observadas y las
predichas.

Con el propsito de caracterizar las curvas de supervivencia de los

microorganismos estudiados en queso untable base adicionado con aceite esencial de
timol se aplic el modelado primario utilizando la ecuacin de Gompertz
modificado.(Materiales y Mtodos,3.6.1.2).
Las Tablas 21; 22 y 23 exhiben los parmetros estimados que representan
las diferentes regiones de la curva de supervivencia junto a los estadsticos de ajuste
del modelo. El ajuste del modelo result altamente satisfactorio, obtenindose
valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 89,3% y 99,1%. Los valores de F
muy significativos (<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tanto para S. aureus a 6C y 17C como para S.
Enteritidis a 17C tal como se observa en la Figura 53. La validacin del modelo fue
correcta tal como puede observarse en los grficos de valores observados y predichos
y la distribucin de residuales (Figuras 54).
En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base
almacenado a 6C, el perfil de las curvas de supervivencia difiere escasamente, sobre
todo en los primeros das de almacenamiento donde la cada de la poblacin es ms
acelerada en el caso del queso sin adicin de timol (Figura 51a). El modelo de
Gompertz modificado caracteriz correctamente el cambio global observado dada la
presencia de una cola marcada (C= 4,2 ciclos; Tabla 21), mientras que en ausencia
de timol, la falta de cola marcada hizo que el modelo sobrestimara dicho valor(C=
14,4 ciclos; Tabla 9); cuando en realidad el cambio observado experimentalmente
fue de 3,4 ciclos logartmicos (Figura 51a). Aunque finalmente este
microorganismo termina muriendo en un nivel similar al observado en queso base sin

124
timol, la presencia de timol aumentara levemente su resistencia a esta temperatura o
bien, actuara indirectamente, inhibiendo la flora competitiva.
A 17C, se observ que las curvas de supervivencia de S. aureus en queso
untable base con timol presentaron un perfil de curva quebrada similar al observado
para la curva de supervivencia en igual sistema sin agregado de timol, aunque la
inactivacin fue mucho menor. Ello queda evidenciado en los parmetros
caractersticos de ambas curvas. En el caso de la presencia de timol (Tabla 22), la
curva no present hombro inicial (A ~ - 4 das) al igual que en ausencia de timol
(Tabla 10). La velocidad de muerte y el cambio global en el numero de
sobrevivientes fueron significativamente mayores (Bc/ timol=1,3 da-1 ; Bs/ timol= 0,5
-1
da ; Cc/ timol= 3,4 ciclos; Cs/ timol =0,07 ciclos). Tal como se coment anteriormente,
son varios los factores que en combinacin podran estar generando este efecto
protector observado. Estos estudios debieran intensificarse evaluando varias
concentraciones de este antimicrobiano con el propsito de arribar a una conclusin
ms definitiva.

En el caso de S. Enteritidis en queso untable base con agregado de timol

almacenado a 17C, la misma fue ms indiferente a la presencia de este
antimicrobiano natural generando una curva de inactivacin de perfil similar a la
obtenida en ausencia del mismo. Ello se evidencia tambin en la concordancia de los
parametros caractersticos de las mismas. En presencia de timol (Tabla 23), el
parmetro A (hombro inicial) indica un valor predicho de 1,76 das. El cambio global
en el numero de sobrevivientes (C) en 20 das de almacenamiento fue de 3,3 ciclos
logartmicos y la velocidad de muerte (B), 0,20 da-1. Cuando se caracteriz la
respuesta de este microorganismo en iguales condiciones pero en ausencia de timol
(Tabla 16) se obtuvieron similares valores de hombro inicial (A~ 1 da); de
velocidad de muerte (B= 0,16 da-1) y de cada global predicha en 20 das (C=3,7
ciclos).

125
Figura 53: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 6C (a); 17C (b); y
de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17C (c) (
) valores experimentales;
() prediccin

(a) (b)
0 0,19

-0,5 -0,01

Log (N/N0)
Log (N/N0)

-1 -0,21
-1,5
-0,41
-2
-0,61
-2,5
-3 -0,81
0 10 20 30 40 0 4 8 12 16 20 24

Tiempo (da) Tiempo (da)

0 (c)
-0,5
Log (N/N0)

-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)

126
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,43 0,30
B 0,08 0,02
C -4,19 0,82

ANLISIS DE LA DESVIACIN

FISHER
Fuente SS gl

MODELO 30,97 3 516**

RESIDUAL 0,06 4

R2 ajustado 99,07

Tabla 22 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros

caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A -4,17 102,50
B -1,33 27,11
C -0,07 0,31

ANLISIS DE LA DESVIACIN

FISHER
Fuente SS gl

MODELO 1,67 3 55**

RESIDUAL 0,03 4

R2 ajustado 89,29
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

127
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 C.

Parmetro Estimador Error Estndar

A 1,76 0,47
B -0,20 0,06
C -3,28 0,34

ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl

MODELO 26,44 3 367**

RESIDUAL 0,12 5

R2 ajustado 98,27
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).

En el caso de S. aureus inoculado en queso untable base con sin agregado

de timol y almacenado a 25C se observ crecimiento por lo que las curvas se
caracterizaron mediante el modelo de Gompertz, obteniendo los parmetros
matemticos (A;B;C y M) a partir de los cuales se calcularon los parmetros
biolgicos TG;VCE y LAG. En la Figura 54, puede observarse que hubo un buen
ajuste con el modelo propuesto ya que la prediccin es coincidente con los valores
experimentales. El anlisis de la varianza (Tabla 24) arroj un R2 de 99,1% con F
muy significativo ( < 0,01). La validacin interna del modelo no mostr tampoco
en este caso anomalas (Figura 55 a y b). Los perfiles de las curvas de supervivencia
predichas en este caso fueron similares , del tipo sigmoideo con valores semejantes
(Tablas 11 y 24) de tiempo de generacin (TGc/timol=0,51das;TGs/timol=0,54 das);
velocidad de crecimiento (VCEc/timol=0,59 LogUFC/gr /da ; VCEs/timol= 0,55
LogUFC/gr/da) y tiempo de fase lag (LAGc/timol=5,5 das; LAGs/timol=5,0 das)
aunque con una tendencia a mayor crecimiento en el caso del sistema con timol. La
observacin de las curvas experimentales de crecimiento (Figura 51c) evidencian que
S. aureus en queso untable

128
Figura 54: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6C ; 17C; y de S.
Enteritidis en igual matriz almacenada a 17C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (
) valores experimentales; ()
prediccin.

S.aureus- 6C
Valores observados

0,8 0,22

Residuales
-0,2 0,12

-1,2 0,02

-2,2 -0,08

-3,2 -0,18
-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos

S.aureus- 17C

0,12
Valores observados

0,19
0,08
Residuales

-0,01
0,04
-0,21
0
-0,41
-0,04
-0,61 -0,08
-0,81 -0,12
-0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19 -0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19
Valores predichos Valores predichos

S.Enteritidis- 17C

0,21
Valores observados

0
-0,5
Residuales

0,11
-1
-1,5 0,01

-2
-0,09
-2,5
-3 -0,19
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos

129
Figura 55: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base con timol almacenado a 25C, (
) valores
experimentales; () prediccin

8,9

7,9

Log N
6,9

5,9

4,9

3,9
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (dia)

Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 C

Parmetro Estimador Error Estndar

A 4,01 0,20
B 0,26 0,46
C 5,24 0,05
M 7,49 0,61
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER3
Fuente SS gl
MODELO 314,25 4 1964**
RESIDUAL 0,12 3
2
R ajustado 99,14
PARAMETROS BIOLGICOS2
Gompertz PMP
TG (da) 0,51 ---

VCE (Log UFC/g/da) 0,59 ---

LAG (da) 5,5 ---

1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%

130
Figura 56: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. (
) valores
experimentales; () prediccin

(a) (b)
8,9
Valores observados

0,33
7,9 0,23

Residuales
6,9 0,13

5,9 0,03
-0,07
4,9
-0,17
3,9
4 5 6 7 8 9 -0,27
3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9
Valores predichos
Valores predichos

con agregado de timol creci aproximadamente 2 ciclos logartmicos ms que en

queso untable sin agregado de (0,3%p/p) timol y con una tendencia hacia el final del
almacenamiento estudiado de seguir incrementndose la poblacin mientras que, en
el caso de la ausencia de timol, la poblacin alcanz un estado estacionario a los 11
das de almacenamiento, el cul mantuvo hasta el final del mismo (17 das).

Estos estudios coincidentes, si bien deben profundizarse con ms condiciones

de prueba y ensayando ms microorganismos, permiten inferir una posible accin
protectora de este antimicrobiano natural presente en la esencia de organo y pone
atencin en la necesidad de tener en cuenta este hecho al momento de elaborar
quesos untables saborizados.

131
5. CONCLUSIONES

132
 La microbiologa predictiva se ha convertido en los ltimos aos en una
herramienta muy valorable y necesaria para un correcto diseo de los procesos de
preservacin de alimentos. Los modelos matemticos generales que se utilizan para
describir el crecimiento la inactivacin microbiana generalmente se derivan de
estudios en sistemas modelo con factores ambientales controlados tales como el pH;
el nivel de sal; la temperatura; etc. La comparacin de las predicciones brindadas
por estos modelos con el comportamiento de los microorganismos en un alimento
real puso en evidencia en este estudio las limitaciones de los mismos. En particular,
cuando no todas las condiciones ensayadas quedaron bien descriptas este anlisis
permiti determinar qu factores adicionales ( consideraciones del microambiente)
se necesitan incluir en el modelo o considerar para aumentar su aplicabilidad. En
particular este estudio permiti arribar a las siguientes conclusiones:

La aplicacin de modelos matemticos no lineales conceptualmente diferentes

como modelos primarios y terciarios , result muy til para explicar de forma ms
completa el crecimiento lasupervivencia/ inactivacin microbiana en queso
untable, brindando informacin complementaria para la industria para la seleccin de
las combinaciones ms efectivas y seguras desde el punto de vista microbiolgico.

La observacin de una respuesta de crecimiento/supervivencia no lineal y su

caracterizacin mediante modelos primarios (Gompertz y Gompertz modificado),
especialmente en los niveles de factores de estrs ms crticos, result de destacada
importancia.

El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no

present limitaciones estadsticas. No ocurri lo mismo con el modelo de Gompertz
modificado para muerte, el cul sobreestim la cada global al final del
almacenamiento debido a la ausencia en esos casos de una verdadera curva
sigmoidea con cola marcada.

La presencia de sorbato de potasio (1000 ppm) no gener diferencias en las

curvas de supervivencia obtenidas con el microorganismo de prueba (S. aureus) en el
queso, hecho por el cul no se lo consider responsable de la diferencia de respuesta

133
observada entre el medio de cultivo (crecimiento) y el alimento real (supervivencia
/inactivacin)

La reduccin del pH del queso untable base (pH 5,0) hasta un valor
organolpticamente aceptable (pH 4,3) gener una alternativa interesante ya que
aument notoriamente la inactivacin observada del microorganismo de prueba (S.
aureus) sobretodo en situaciones de abuso trmico (15 y 22C), donde este efecto se
ve incrementado. Es posible que al aumentar la temperatura, la flora acidolctica, que
no se ve afectada por el descenso de pH, incremente su poblacin por tener una
temperatura ms propicia y por lo tanto aumente su poder biopreservante eliminando
al microorganismo de prueba que es ms sensible al microambiente imperante.

El programa de simulacin modelado de patgenos mostr debilidades al

momento de predecir la conducta microbiana en el queso untable debido
seguramente a las limitaciones biolgicas imperantes en el queso. En algunos casos
(p.e S.aureus ; pH 5,0 y T: 6, 10; 15;17; 22 y 25C; E. coli pH 5,0 T: 17 y 25C
L.monocytogenes; pH 5,0 T: 6,17 y 25C) realiz una prediccin errada pero
conservativa ya que predijo un crecimiento ms acelerado del realmente observado o
de modo ms extremo predijo crecimiento y se observ muerte bacteriana. En otros
casos su prediccin fue de riesgo (p.e. E.coli pH 5,0 T: 6C; S.Enteritidis pH 5,0 T:
6 y 17 C) pues predijo muerte a velocidades ms rpidas que las observadas y en el
peor de los casos predijo muerte y se observ crecimiento (S.Enteritidis pH 5,0
T:25C). La posible presencia de inhibidores en el queso as como tambin el
establecimiento de flora competitiva, factores no considerados en la prediccin de
este programa, podran ser los causantes de las diferencias observadas y ponen en
alerta sobre una cautelosa utilizacin de este programa.

La inclusin de timol (0,3%) con el posible propsito de su utilizacin como

agente antimicrobiano y a su vez saborizante no condujo a los resultados esperados.
No se observ actividad antimicrobiana adicional contra S.aureus y S. Enteritidis
presentes en queso untable, sino que por el contrario se increment la resistencia de
los mismos en presencia de este compuesto en todas las condiciones ensayadas. Este

134
resultado fue relevante pues seala un punto de inicio para futuras investigaciones y
aspectos a tener en cuenta al momento de desarrollar quesos untables saborizados.

Actualmente y por ahora, no es posible basarse solamente en la prediccin de los

modelos matemticos para determinar la seguridad de los alimentos y los procesos.
Los estudios de reto microbiano en el alimento son aun inequvocamente necesarios
para determinar la propensin al crecimiento de patgenos en el alimento.

135
6. APNDICE

136
Este captulo incluye informacin con respecto a los mtodos estadsticos que se
utilizaron para el anlisis de los resultados, definiciones y frmulas.

6.1 Definiciones y Frmulas

6.1.1- Poblacin estadstica

Una poblacin estadstica se define como un conjunto completo de elementos

de inters. La medidas tomadas sobre los elementos de una poblacin estn
gobernadas por una distribucin de probabilidad, usualmente expresada en forma de
ecuacin matemtica, la cual relaciona la ocurrencia de un valor especfico con la
probabilidad de dicha ocurrencia.

6.1.2-Distribucin normal

Distribucin normal es el tipo de distribucin que ms comunmente se

encuentra. En general cuando se procesan los datos estadsticamente se asume que su
distribucin es normal. La siguiente frmula es la funcin de la distribucin normal y
se puede usar para verificar si realmente una serie de mediciones sigue tal
distribucin

(
f ( x) = 1 / 2 ) exp[ (Y Y ) 2 / 2 2 ] (6.1)

Donde:
exp = funcin exponencial con base e
Y= medicin realizada
Y = media del total de las mediciones
= desviacin estndar
= varianza

137
 6.1.3- Parmetros y estimadores

Un parmetro estadstico es una funcin definida sobre los valores numricos

de la poblacin. Es un valor representativo de una poblacin que provee
informacin sobre su distribucin como la media aritmtica o su desviacin tpica.
En estadstica aplicada se asume que la forma de la distribucin aplicada es
conocida pero no as los parmetros que la representan. Los mismos deben ser
estimados mediante la aplicacin de funciones matemticas a las mediciones
obtenidas. Los datos estadsticos extrados de dichas funciones se denominan
estimadores.

Media de la distribucin ( Y ); es el promedio aritmtico de las mediciones

realizadas:

Y i
Y= i=1
(6.2)
N
donde Yi : valor individual del sistema i
N: nmero total de datos

Desviacin estndar () o desviacin tpica; es una medida de dispersin de

las variables con respecto a su media y es de gran utilidad en la estadstica
descriptiva. Es en realidad la raz cuadrada de la varianza:

(Y Y )
i=1
i
2

= (6.3)
(N 1)

Varianza ( 2 ); la varianza de una variable es una medida de la dispersin.

Corresponde al promedio del cuadrado de la distancia de los distintos valores de la
variable con respecto a su media .

138
 N 2

(Y Y )
i
=
2 i =1
(6.4)
N 1

Error estndar de la media (SE); est relacionado a la desviacin estndar y

el nmero de los casos con los cuales se trabaja. Su frmula es:

SE = (6.5)
N

Intervalos de confianza; es siempre aconsejable que un analista determine los

intervalos de confianza de los parmetros que dermina. Los intervalos de confianza
dan informacin sobre la precisin de los clculos realizados. Habitualmente se
utiliza el intervalo de confianza a dos colas, es decir el que precisa el lmite superior
e inferior. Se calcula con la siguiente formula utilizando la media Y :

2
Y t 2,n1 (6.6)
N

Donde
t/2,n-1 = el estadstico t de Student de nivel de confianza /2 y de n-1 grados

de libertad del sistema.

Grados de libertad (gl) ;se usan para estimar el nmero de categoras

independientes en un test o experimento.

gl=n-r (6.7)
donde:
n= el nmero de sujetos en la muestra
r=el nmero de sujetos estadisticamente dependientes.

Cuando se trata de ajustar modelos estadsticos a un conjunto de datos, los

residuos se encuentran habitualmente en un espacio de menor dimensin que aqul

139
en el que se encontraban los datos originales. Los grados de libertad del error los
determina, precisamente, el valor de esta menor dimensin.

6.1.4 - Significancia estadstica

Un resultado se denomina estadsticamente significativo cuando no es probable

que haya sido debido al azar. Una "diferencia estadsticamente significativa"
significa que hay evidencias estadsticas de que hay una diferencia. El nivel de
significacin muchas veces se asocia con los test a los cuales se someten los datos
con fin de verificar una hiptesis. En cuanto al test de la hipotesis nula, el nivel de
significacin es nada ms que la probabilidad de tomar la decision de rechazar la
hipotesis nula cuando ella es verdad (cometiendo el error tipo I o ) o de aceptar la
hiptesis nula cuando la ltima no es cierta (cometiendo el error tipo II o ). En la
toma de la esa decisin muchas veces se usa el valor P donde P= 1- . Entonces el
valor experimental se compara con el valor correspondiente a la tabla (para dado
nivel de significacin y dados grados de libertad). Si el valor experimental es
superior al nmero de la tabla la hiptesis nula se rechaza mientras que al ser
superior el nmero de la tabla la hiptesis nula se tiene que aceptar para dado nivel
de significacin. Cuanto mayor sea el valor experimental , ms significativo ser el
resultado y ms fuerte ser la evidencia de que el resultado no se debe a una mera
coincidencia. El nivel de significacin es comunmente representado por el smbolo
griego (alpha). Cuando se hacen este tipo de comparaciones es importante tomar en
cuenta si el ensayo es unilateral o bilateral. Por ejemplo si el ensayo es unilateral y
se trabaja en un nivel de significacin = 0,05 en realidad 5 valores en cada cien se
pueden dar por azar y entonces la probabilidad de que sean no debidos al azar es P=
1-0,05=0,95. Si, en cambio, el ensayo es bilateral en el mismo caso P= 1-2 = 0,90.

En muchos trabajos el nivel de significacin se denota con una , dos o tres

estrellitas. Existen tres niveles; cuando P 0,95 ( 0,05); P 0,99 ( 0,01 ) y P
0,999 ( 0,001 ) cuya mencin indica la significacin de las conclusiones que se
formulan. Cuando el valor experimental obtenido es inferior al tabulado se concluye
que "no hay significacin" y se indica con (-) (NS); cuando dicho valor supera al
valor tabulado para P 0,95 y no al tabulado para P 0,99 se indica con (*); si el

140
valor experimental es mayor que el tabulado para P 0,99 la conclusin es (**) y
para P 0,999 (***). Cuando :

VE < VT (NS)/(-)

VE> VT(P 0,95) *

VE > VT(P O,99) **

VE > VT(P 0,999) ***

Siendo VE=valor experimental; VT=valor tabulado

Generalmente, en el caso de los alimentos lod niveles (*) y (**) se consideran

suficientes.

6.2 - Anlisis de varianza (ANOVA )

Anlisis de varianza (ANOVA )es un mtodo general con aplicaciones muy

variadas y que puede llegar a ser complejo de acuerdo a las derivaciones que tome.
Se utiliza en reemplazo del uso de una batera de test t-Student cuando se poseen
varias muestras. Cuanto mayor es el nmero de sistemas de anlisis, realizar una
batera de test t no solo resulta dificultoso sino que ofrece pocas ventajas. Esta
tcnica compara las medias de varias muestras y verifica si todas ellas pertenecen a
la misma poblacin o si, unao ms son significativamente diferentes y provienen de
poblaciones diferentes. El ANOVA debe ser considerado en la prctica un test de
diferencias de medias a dos colas (ya que las medias en s mismas pueden aumentar o
decrecer) que opera va un test de cambio de varianza a una cola, el cual se describir
ms adelante (test F).
La variacin total que existe en una distribucin global de valores o medidas
puede ser segregada en categoras representando por un lado los efectos
identificables y por otro lado la variacin debida a causas no identificables. La
variacin total del conjunto de datos es llamada Suma de Cuadrados Totales (SST).
Dicha suma puede dividirse en dos contribuciones: una Suma de Cuadrados debida
a la Regresin (SSR) y una Suma de Cuadrados Residual (SSE).

141
 Suma de Cuadrados Totales (SST) se obtiene sumando los cuadrados de las
desviaciones del valor observado en cada sistema Yi respecto de la media Y .

( )
N 2

SST = Yi Y (6.9)
i =1

La Suma de cuadrados Totales tiene asociados N-1 grados de libertad ya que

existe la restriccin

Y Y = 0
i =1
i (6.10)

Suma de Cuadrados debida a la Regresin (SSR) es una expresin de la

variacin que resulta tomando en cuenta por un lado la relacin de la variable
independiente con la dependiente a partir del modelo de regresin aplicado y por
otro lado la medicin de la variable dependiente que se obtiene experimentalmente.
En otras palabras es la suma para N elementos de la poblacin de los cuadrados de
la diferencia entre la media Y muestreal y el valor predicho del modelo Yi para una
corrida i.

( )
2

SSR = Yi Y (6.11)

Los grados de libertad en este caso se definen a partir del nmero de

parmetros p que usa el modelo para relacionar la variable medida y la variables
independientes del experimento. Esta suma de cuadrados tiene asociados p-1 grados
de libertad.
Dividiendo la SSR por p-1 obtenemos la Media de Cuadrados debida a la
Regresin (MSR):

SSR
MSR = (6.12)
p 1

Suma de Cuadrados Residual(SSE) es la variacin debida a causas no

identificables y representa el error observado de las variables medidas (dado que el
modelo es correcto). Se define como la suma de los cuadrados de las diferencias

142
entre los valores medidos de N elementos de la poblacin y los valores de los
mismos elementos tal como son predichos por el modelo.

( ) = r
N 2 N
SSE = Yi Yi i
2
(6.13)
i=1 i=1

En el caso de la Suma de Cuadrados Residual se asocian N-p grados de

libertad
La SSE se usa para calcular la Media de Cuadrados Residual(MSE) al
dividirla por los grados de libertad asociados a ella, segn la siguiente frmula:

SSE
MSE = (6.14)
Np

Los residuales se usan para evaluar el ajuste del modelo a los valores
experimentales. La suma de los residuales de cada corrida tericamente es siempre
cero, sin embargo, en la prctica puede no serlo exactamente pero debera
aproximarse.

Modelo de los parmetros de un ANOVA

Fuente gl Suma de Cuadrados Media de cuadrados

SSR
DEBIDO A p-1 SSR MSR =
LA REGRESION p-1

SSE
RESIDUAL N-p SSE MSE =
N-p

TOTAL N-1 SST

6.2.1- Test F de significacin de la regresin

Un test que comunmente se realiza para verificar la significancia de la

regresin es el test F. Si el valor calculado de F > F tablas nos permite inferir que

143
la variacin de la informacin explicada por el modelo o relacin propuestos es
significativamente mayor que la variacin debida a causas no identificables
(residuales) y que el efecto observado no se debi al azar . Es de destacar que los
test t-Student y F son esencialmente los mismos . Para un diseo completamente
aleatorio donde se estudian slo dos tratamientos y dos test t a dos colas para
muestras independientes se verifica que:

F = t (6.15)

MSR SSR (p 1)
F= = (6.16)
MSE SSE (N p )

Una vez calculado el F se busca en las correspondientes tablas el valor de F

para el nivel de significacin con el cual se trabaja para grados de libertad p-1 y N-
1.
El F de las tablas se compara con el F calculado. Si el valor del F calculado es
mayor que el de las tablas la hiptesis nula se rechaza para nivel de significacin,
y significa que por lo menos un parmetro de los que describen la regresin tiene
efecto sobre la respuesta. Cuanto ms grande sea el F calculado mejor describir la
regresin el modelo propuesto ya que tambin significa que aumenta la razn de la
varianza debida a la regresin sobre la viarianza debida a causas no identificables.

6.2.2 -Coeficiente de determinacin (R2)

El coeficiente de determinacin nos informa sobre la proporcin de la

variacin que existe entre los valores experimentales y lo propuesto por el modelo.
Es un estadstico que evala cun bien se ajusta el modelo estadstico aplicado. En
la regresin, en particular, el coeficiente de determinacin es una medida de cunto
la linea de regresin se aproxima a los datos experimenteles. Su expresin
porcentual se da por la frmula:

SSR
R2 = 100 (6.17)
SST

144
 Tambin se usa el coeficiente de determinacin ajustado por los grados de
libertad del modelo:
SSE (N p )
Raj2 = 1 (6.18)
SST (N 1)

Siempre se busca que tanto R2 como R2aj se acercan a lo posible al 100 ya

que es una medida del ajuste del modelo. Cabe aadir que por mucho que se
acerque el coeficiente de deteriminacin al cien nunca lo ser, ya que en este caso
se trabajara sin error.

6.2.3 - Anlisis de residuales

En el anlisis de los residuales siempre se asume que los errores:

son normalmente distribudos con media igual a cero
tienen varianza constante
son independientes entre ellos
Existen herramientas grficas y pruebas estadsticas se usan con fin de
comprobar la validez de las suposiciones recin mencionadas.

6.2.3.1- Versus valores predichos, Yi

Se grafican los valores de los residuales (ri) versus los valores predichos por
el modelo. Dichos residuales no se grafican en funcin de los valores observados
(Yi) debido a que ambos grupos de valores estn correlacionados. Debe observarse
una distribucin uniforme horizontal de los residuales en torno a los valores

predichos, Yi (homocedasticidad). Pueden manifestarse algunos comportamientos
anormales tales como los que se describen a continuacin.

Si la varianza del modelo no es constante y se incrementa, es necesario

realizar un anlisis de cuadrados mnimos especial o bien una

transformacin (Ln (Y); Y ; 1/Y; etc.) en la respuesta de inters :

145
 ri

Yi

Si el trmino independiente 0 no fue incluido en el anlisis, la banda se

desplaza:

ri

Yi

Si falta incluir algunos trminos lineales y/o cuadrticos en el modelo

postulado la banda se curva:

ri

Yi

Estas desviaciones, adems de detectarse visualmente, pueden medirse

mediante parmetros definidos, los cuales no se detallarn en este apndice.

146
 7. BIBLIOGRAFA
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BIOQ. MIRYAM SICILIANO DRA. SANDRA GUERRERO
TESISTA DIRECTORA

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