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ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO
LIMA PER
2013
Mira que te mando que te esfuerces y seas valiente; no temas ni desmayes,
(Josu 1: 9)
AGRADECIMIENTOS
PAG
RESUMEN I
ABSTRACT II
LISTA DE FIGURAS IV
LISTA DE ABREVIATURAS V
1. INTRODUCCIN 1
2. ANTECEDENTES
2.3 CICLOFOSFAMIDA 9
3. HIPTESIS Y OBJETIVOS 13
4. MATERIALES Y MTODOS
5. RESULTADOS
6. DISCUSIN 67
7. CONCLUSIONES 78
8. RECOMENDACIONES 79
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 80
10. ANEXOS 92
RESUMEN
In the present study, Balb/c mice were orally treated with aqueous extract
(EAc) of maca at the doses of 200 mg/kg for two months prior to
immunosuppression (IS) with a single doses of cyclophosphamide (CF) (130
mg/kg) to evaluate the mRNA production of hematopoietic cytokines:
interleukin 3 (IL-3), granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF)
and interleukin-7 (IL-7) in spleen and bone marrow, both in treated and controls
mice. Murine bone marrow cells were isolated and co-incubated with aqueous
extract (EAc) of yellow maca to evaluate its effects on the cells proliferation
and mRNA production of the three hematopoietic cytokines.
The aqueous extract of maca stimulates the mRNA production for three
hematopoietic cytokines. The administration of EAc to immunocompromised
mice can reverse the suppressive effects of cyclophosphamide.
1
Lepidium meyenii Walpers (maca) es una especie nativa adaptada a las
condiciones extremas existentes en los pisos ecolgicos ms altos de la
cordillera de los Andes Centrales del Per. Es apreciada por su alto valor
nutritivo y energtico, por lo que su importancia econmica est vinculada
principalmente a sus propiedades revitalizantes, vigorizantes y estimulantes de
la reproduccin (Obregn, 1998).
2
2. ANTECEDENTES
3
las caractersticas de Lepidium meyenii Walpers, razn por la cual plante la
necesidad del cambio del nombre a Lepidium peruvianum Chacn (Chacn,
1990), por lo que el nombre cientfico de la maca fue cuestionado a partir de
ese momento. Sin embargo en el 2011, el Doctor Destfano y colaboradores,
determinaron mediante el anlisis de cdigo de barras de DNA del cloroplasto,
que ambos "especmenes" cultivado y silvestre, eran prcticamente lo mismo,
por lo que sealaron que no habra necesidad de cambiar el nombre
designado por el doctor Walpers (Destfano, 2011).
5
antioxidantes del cerebro en ratas recin destetadas, proponiendo a la maca
como un adaptgeno (Or et al., 2011).
Las clulas progenitoras son las que proliferan a gran escala, proveyendo
billones de clulas sanguneas por da que son necesarias para mantener la
homeostasis en el individuo; pero cuando el nmero de estas clulas
disminuyen, por ejemplo a causa de una terapia mieloablativa, las clulas
madre hematopoyticas son liberadas de su inhibicin y comienzan a dividirse
y diferenciarse segn los requerimientos del organismo (Mera et al., 2007;
Welsch, 2010).
8
El Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-
CSF) induce la diferenciacin y proliferacin de las clulas progenitoras
hematopoyticas de granulocitos/macrfagos. Adems, regula la
supervivencia y funcin de varias lneas celulares maduras (granulocitos,
neutrfilos y clulas dendrticas) y funciona como un mediador inflamatorio,
actuando sobre un nmero de diferentes tipos celulares y modulando su
funcin celular como presentadora de antgeno. Un amplio rango de tipos
celulares puede producir GM-CSF, pero a menudo requieren de estmulos.
Clulas T, macrfagos, clulas endoteliales, fibroblastos y mastocitos son
ejemplos de clulas que secretan GM-CSF luego de una estimulacin. En el
ratn, el gen para GM-CSF est ubicado en el cromosoma 11, con 4 exones y
su mRNA posee un tamao de 1,033 bp. Pertenece a la misma familia de la
IL-3 (Guthridge et al., 1998; Shi et al., 2006; Hercus et al., 2009).
2.3 CICLOFOSFAMIDA
11
inmunosuprimidos con 50 mg/kg de CF redujo la hipocelularidad inducida por
CF en el bazo, mdula sea y sangre perifrica, lo que se correlaciona con la
reduccin de clulas hiploides e incremento de los niveles de enzimas anti-
oxidantes, reduciendo el estrs oxidativo heptico y medular producto del
metabolismo de la CF. Otro estudio seal que el extracto acuoso de Polygoni
multiflori rico en polisacridos, es capaz de incrementar significativamente los
niveles de IL-2, parmetros hematolgicos, perfil anti-oxidante y promover la
hematopoyesis esplnica mediante la sobreexpresin del receptor de la
eritropoyetina y el factor de transcripcin GATA-1 en animales
inmunosuprimidos por aplicacin de 40 mg/kg/da de CF durante 5 das
consecutivos (Chen et al., 2012).
12
3. HIPTESIS Y OBJETIVOS
3.1 Hiptesis
13
4. MATERIALES Y MTODOS
14
Figura 2. Elaboracin del EAc de maca.
A. Sobrenadante proveniente del hervido de la harina de maca.
B. Residuo seco de maca, despus de la evaporacin total del agua.
15
mediante el mtodo colorimtrico fenol/H2SO4. Para ello se diluy 10 l de la
solucin de trabajo con 990 l de H2Odd, a la dilucin se le adicion 500 l del
reactivo fenol (fenol al 5% en H20dd) y 2,5 ml de H2SO4, despus de mezclar se
dej reposar por 10 minutos en oscuridad, para luego llevar los tubos a bao
mara por 30 minutos a 30C. Cumplido el tiempo se realiz la lectura a 492
nm. La concentracin de carbohidratos en mg/ml se determin usando como
estndar una curva de glucosa.
Donde:
A = Absorbancia
V = Volumen total del extracto en ml
W = Peso de la muestra en gramos
16
Alcaloides. Se disolvieron 0,5 gramos del extracto acuoso deshidratado en 10
ml de HCl 10% y se calent la mezcla por 10 minutos a 60 C. Despus de
dejar enfriar, se filtr la mezcla con papel Whatman N1 y se procedi a lavar
el papel filtro con 10 ml de HCl 10%. El filtrado resultante se utiliz para las
pruebas de alcaloides, en donde a cada 2 ml del filtrado se aadi 3 gotas del
reactivo de Hager (cido pcrico saturado) o Mayer (MgCl2 al 1.4% y KI al 5%
en H2Odd). Se consideran como positivas, las pruebas en las que aparece una
turbidez definida (Mayer) o precipitado blanquecino (Hager y Mayer).
17
4.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA
20
Dosis Extracto
MES SEMANA
(200 mg/kg p.c.)
1 Si
2 Si
1
3 Si
4 Si
5 Si
6 Si
7 Si
1 Si
Si / Inmunosupresin con CF
2
(130 mg/kg pc)
2
3 Si
Si / Evaluacin de grupos
8 DA 4
IS2d EAc e IS2d Sin EAc
5 Si
6 Si
Si / Evaluacin de grupos
7
IS5d EAc e IS5d Sin EAc
21
Las transaminasas son enzimas que catalizan la transferencia reversible de
un grupo amino entre un aminocido y un cetocido. La transaminasa
glutmico pirvica (TGP) es una enzima citoslica que se encuentra en altas
concentraciones en el hgado. La lesin hepatocelular desencadena la
liberacin de esta enzima en la circulacin, por lo que constituye un excelente
marcador de la lesin hepatocelular (Alvarez, 2005).
Las suspensiones del bazo fueron obtenidos por presin del rgano con
ayuda de un mbolo para disgregar el tejido y liberar las clulas, dentro de una
placa petri con 5 ml de medio RPMI. Se juntaron las suspensiones celulares
de 3 ratones por grupo (se tomaron 500 l de suspensin del bazo de cada
ratn), para proceder a extraer el RNA con Trizol, determinar su integridad por
22
electroforesis, su pureza y concentracin por espectrofotometra y realizar la
transcripcin reversa para la sntesis de DNA complementario.
24
Pureza de RNA = A260 / A280
Valores entre 1,8 - 2 considera que el RNA extrado est libre de
contaminantes (protena, sales)
25
transcritos de los genes murinos de IL-3, IL-7, GM-CSF y Gliceraldehdo 3
fosfato deshidrogenasa (GAPDH), donde el ltimo fue considerado como
control de expresin constitutiva (housekeeping) para normalizar los
resultados del PCR en tiempo real (Ullmannovi y Haakovec, 2003; Willems et
al., 2006).
26
Figura 5. Resultado del anlisis de los primers para IL-3 mediante el
Software Primer-Blast.
Tamao del
Nombre N de acceso
Secuencias de los primers (5 - 3) amplicn esperado
del Gen Gen Bank
(pares de bases)
FW: TGCACCACCAACTGCTTAGC
GAPDH 258 NM_008084
RV: GGCATGGACTGTGGTCATGAG
27
Con el fin de evaluar la especificidad de los primers sintetizados, se
realizaron amplificaciones por PCR convencional de los genes evaluados, esto
adems permiti corroborar la calidad de los RNA totales obtenidos, as como
analizar la eficiencia de la transcripcin reversa. Las amplificaciones
obtenidas se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa 2%, teido
con bromuro de etidio. Las condiciones de amplificacin por PCR convencional
se explican ms adelante.
28
4.3.1.5 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
29
Nivel de gris Gen de estudio
% cambio en la expresin = x 100
Nivel de gris Gen de referencia
30
4.3.2.1 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
IL 3 : 75,5 C
GM CSF : 80,3 C
IL 7 : 75,6 C
GAPDH : 84,4 C
32
La recoleccin y anlisis de los datos generados fueron realizados
mediante el Rotor Gene Software (versin 1.7) y se utiliz el Mtodo de
Cuantificacin Comparativa incluido en el software. Utilizando ste mtodo ya
no es necesario escoger arbitrariamente el nivel del umbral para generar los Ct
(valor umbral de ciclo) y tampoco realizar una curva estndar de eficiencia por
cada gen analizado, requeridos para calcular la expresin gnica. Este
programa utiliza el criterio del mximo de la segunda derivada, para calcular el
punto inicial y final de la fase exponencial de la amplificacin de cada reaccin,
y obtener matemticamente la eficiencia de amplificacin (AE) y el Take Off
Point (TOP) por cada muestra, ste ltimo equivalente al Ct otra ventaja es
que ambos valores son calculados dentro de la fase exponencial de cada
reaccin. TOP es definido como el ciclo en el que la segunda derivada de la
fluorescencia est al 80% del valor mximo de la curva, y AE es el incremento
promedio de cuatro ciclos de amplificacin despus del TOP, es determinado
a partir de la pendiente de la curva entre TOP y el valor mximo (Figura 9)
(McCurdy et al., 2008).
33
Los valores AE y TOP generados, fueron usados en el modelo matemtico
descrito por Pfaffl, M. (2001) para calcular la cuantificacin relativa de la
expresin gnica, segn la frmula:
Donde:
34
Figura 10. Grfico de la segunda derivada generado por el software Rotor
Gene, para los fragmentos amplificados del transcrito del gen IL-7.
35
4.4.1.2 Obtencin de clulas mononucleares de mdula sea
36
4.4.1.3 Cultivo de clulas mononucleares de mdula sea
37
Al cabo del periodo de incubacin, se aadi a cada pocillo 50 l de MTT
(Sigma Chemical Co., St Luis, Mo) a la concentracin de 5 g/ml, y las placas
volvieron a la incubadora toda la noche en las mismas condiciones de cultivo.
Al da siguiente se retir cuidadosamente todo el medio de cultivo de cada
pocillo, se aadi 1 ml de alcohol isoproplico y se mezcl hasta disolver los
precipitados formados (formazn), producto del metabolismo de MTT.
Despus de 4 horas de incubacin a oscuridad, se realizaron las lecturas a
540 nm para determinar sus absorbancias (Abs). El porcentaje de proliferacin
se obtuvo con la siguiente frmula:
Se volvieron a realizar los cultivos con la dosis de EAc que mejor estimul
la proliferacin y en las mismas condiciones sealadas, para la obtencin de
los RNA totales en tres periodos de tiempo: 2 horas, 18 horas y 48 horas de
cultivo. Se consideraron estos tiempos con el fin de observar el curso del nivel
de expresin gnica: 0 horas es el nivel basal donde an no se registra una
expresin significativa, 18 horas es donde se da el mayor porcentaje de
expresin gnica (70%) y 48 horas donde no se registrara una expresin
significativa, porque los mRNA fueron traducidos a protenas (Denzler et al.,
2010).
38
por espectrofotometra y realizar la transcripcin reversa para la sntesis de
DNA complementario, utilizando la metodologa anteriormente sealada.
40
Figura 13. Colonias macroscpicas formadas en la superficie del bazo de
ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
41
estreptomicina 100 g/ml), se realiz el recuento de clulas vivas de la
suspensin obtenida mediante el colorante vital azul de Tripn en una cmara
de Neubauer y se diluy la suspensin celular a la concentracin de 1 x 10 6
clulas /ml.
42
4.6 ANLISIS ESTADSTICO
43
5. RESULTADOS
44
La cantidad de carbohidratos totales y protenas por gramo de extracto
acuoso, result ser 636.7 mg y 8.4 mg respectivamente. Adems se
registraron 0,108 mg de antocianinas y 1,47 mg de flavonoles por cada gramo
del extracto acuoso de maca.
45
Figura 14. Efecto de diferentes dosis de ciclofosfamida sobre el porcentaje de
clulas nucleadas de la mdula sea. Los ratones fueron inmunosuprimidos con 2
dosis diferentes de ciclofosfamida (65 y 130 mg/kg pc) y las evaluaciones se realizaron a los 2
y 5 das despus de la inmunosupresin. Los valores del da 0 corresponden a los ratones no
inmunosuprimidos y representan el 100% de normalidad. Los datos estn expresados en
porcentajes respecto al da 0, y fueron obtenidos de 3 ratones por grupo.
CF: Ciclofosfamida
Los ratones del grupo IS2d-Sin EAc mostraron los mayores promedios de
TGP que fue superior a los dems grupos experimentales (p<0,05). A 5 das
post-IS el grupo IS5d-Sin EAc mostr mayor promedio respecto a los grupos
IS2d-EAc, IS5d-EAc y los no inmunosuprimidos. No hubo diferencia
significativa entre los niveles de TGP de los grupos IS2d-EAc e IS5d-EAc, ni
tampoco de los grupos no inmunosuprimidos (Tabla 4).
46
TGP
GRUPOS DE TRATAMIENTO
(UI/L)
Tabla 4. Efecto del extracto acuoso de maca sobre los niveles sricos de la
enzima transaminasa glutmico pirvica en los ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. El experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la
media SD de dos experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos fueron determinados con la prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
47
5.3 EFECTO DEL EAc DE MACA SOBRE LA PRODUCCIN DE mRNA
PARA IL-3, GM-SCF e IL-7 EN CLULAS DEL BAZO Y LA MDULA
SEA DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
49
Figura 16. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA
de GM-CSF por esplenocitos de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
A. Imagen de un gel representativo de los productos obtenidos por RT-PCR.
B. Representacin grfica de las intensidades relativas de cada una de las bandas
cuantificadas por anlisis de imagen. Los datos fueron normalizados con los valores de
GAPDH y representan la media SD de dos experimentos independientes. Prueba t
Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
50
Figura 17. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA
de IL-7 en el bazo de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
A. Imagen de un gel representativo de los productos obtenidos por RT-PCR.
B. Representacin grfica de las intensidades relativas de cada una de las bandas
cuantificadas por anlisis de imagen. Los datos fueron normalizados con los valores de
GAPDH y representan la media SD de dos experimentos independientes. Prueba t
Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
51
5.3.2 Niveles de expresin de los genes IL-3, GM-SCF e IL-7 de la mdula
sea
La Figura 19 muestra que los ratones del grupo IS5d-EAc presentan mayor
expresin de GM-CSF con respecto al grupo IS5d-Sin EAc (aunque solo fue
1,2 veces ms). No se encontraron diferencias de expresin entre los grupos
IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc, ni tampoco entre los grupos no inmunosuprimidos
(EAc y control).
Los ratones tratados con el extracto y evaluados dos das post-IS (grupo
IS2d-EAc) tuvieron mayor expresin de IL-7 con respecto al grupo IS2d-Sin
EAc (aunque solo fue 1,2 veces ms). No se observaron diferencias de
expresin para IL-7 entre los grupos IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc. Entre los
grupos no inmunosuprimidos, los ratones tratados con EAc mostraron mayor
expresin gnica de IL-7 (2,5 veces ms), al compararlo con el grupo Sin EAc.
El grupo EAc tambin registr mayor expresin de IL-7 que los ratones
evaluados 5 das post-IS (grupos IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc) (Figura 20).
52
Figura 18. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA
de IL-3 en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Los niveles de expresin se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real. Los datos fueron
normalizados con los valores de GAPDH y representan la media SD de dos experimentos
independientes. Prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
53
Figura 19. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA
de GM-CSF en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. Los niveles de expresin se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real.
Los datos fueron normalizados con los valores de GAPDH y representan la media SD de dos
experimentos independientes. Prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
54
Figura 20. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA
de IL-7 en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Los niveles de expresin se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real. Los datos fueron
normalizados con los valores de GAPDH y representan la media SD de dos experimentos
independientes. Prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
55
5.4 EFECTO MODULADOR DEL EAc SOBRE LA PROLIFERACIN
CELULAR Y PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3, GM-CSF E IL-7 EN
CULTIVOS DE CLULAS MONONUCLEARES DE LA MDULA SEA
Figura 21. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la proliferacin de las
clulas mononucleares de la mdula sea. Las clulas (1 x 106 cells/ml) fueron
cultivadas con diferentes dosis del extracto (0, 50, 100 y 200 g/ml) durante 48 horas y por
triplicado. Los valores representan la media SD de 2 experimentos independientes. Todos
los grupos mostraron diferencias significativas entre ellos (p<0,05). ANOVA y prueba TUKEY
post hoc.
Los niveles de mRNA para los genes de IL-3, IL-7 y GM-SCF, se realizaron
en cultivos de 0, 18 y 48 horas y con 100 g/ml del extracto acuoso, dosis que
result ms efectiva en la prueba de proliferacin. Los resultados de expresin
gnica relativa se presentan en la Tabla 5; se observa que a 18 horas de
56
cultivo, el extracto a la dosis de 100 g/ml provoc un aumento significativo en
los niveles de expresin de IL-7 respecto a su nivel basal (0 horas) (p<0.05), el
incremento observado en los otros genes (IL-3 y GM-CSF) no fue significativo.
Los cultivos que no recibieron el extracto, por el contrario registraron, una
disminucin en la expresin de los 3 genes evaluados, que fue significativa
para IL-3 e IL-7 con respecto a su nivel basal. A 48 horas de cultivo con/sin el
EAc de maca se observa una disminucin significativa en la expresin de los 3
genes evaluados.
Citoquinas hematopoyticas
Tratamiento EAc (g/ml)
IL - 3 GM - CSF IL - 7
57
5.5 INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA SOBRE LA
PROLIFERACIN DE LAS CLULAS HEMATOPOYTICAS DE
RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
59
Figura 23. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento de clulas
nucleadas de sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. El experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la
media SD de dos experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos fueron determinados con la prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
60
Tabla 6. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento diferencial de
sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida. El
experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la media SD de dos
experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos fueron
determinados con la prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
61
5.5.2 Hematopoyesis en el bazo
62
Figura 25. Efecto del extracto de maca sobre el recuento de las unidades
formadoras de colonia esplnica (CFU-S) de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. El experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la
media SD de dos experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos fueron determinados con la prueba t Student.
63
5.5.3 Respuesta proliferativa de los linfocitos del bazo a mitgenos
policlonales
64
Figura 26. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la respuesta proliferativa
a concanavalina A de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. Las clulas (1x106 cells/ml) fueron cultivadas en presencia y ausencia de
Concanavalina (5 g/ml) por 48 horas. La proliferacin celular fue medida con el ensayo del
MTT. Los resultados se expresaron como % de proliferacin con respecto al cultivo control (sin
mitgeno). Los valores representan la media SD de dos experimentos independientes.
Prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
65
Figura 27. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la respuesta proliferativa
a Lipopolisacrido de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. Las clulas (1x106 cells/ml) fueron cultivadas en presencia y ausencia de
Lipopolisacrido (0,5g/ml) por 48 horas. La proliferacin celular fue medida con el ensayo del
MTT. Los resultados se expresaron como % de proliferacin con respecto al cultivo control (sin
mitgeno). Los valores representan la media SD de dos experimentos independientes.
Prueba t Student.
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
66
6. DISCUSIN
67
mayora de ellas se quedaron en el pellet no utilizado despus de la
centrifugacin. Los flavonoides son compuestos fenlicos con demostrada
accin antioxidante y eliminadora de radicales libres, entre ellos destacan los
flavonoles y las antocianinas; el extracto acuoso present antocianinas y
flavonoles en concentraciones reportadas por otros investigadores (Sandoval
et al., 2002). Tambin result positiva para triterpenos/esteroles, taninos y
saponinas, metabolitos que estaran relacionados al efecto antioxidante de la
maca (Castao, 2008). Es importante mencionar que algunos investigadores
recomiendan para la deteccin de saponinas, esperar la persistencia de la
espuma por 30 minutos; como en este trabajo slo se consider 3 minutos, es
necesario repetir el ensayo para confirmar su presencia en el extracto acuoso.
No se pudo confirmar la presencia de alcaloides con las dos reacciones
empleadas, ya que slo reaccion frente al reactivo de Hager, pero no sucedi
con el reactivo de Mayer. La deteccin de alcaloides mediante reacciones de
precipitacin pueden dar falsos positivos y negativos, por lo que se conviene
realizar varias reacciones de deteccin para confirmar los resultados (Lpez-
Casamayor, 2007).
70
descendencia, el hemograma y los niveles de enzimas hepticas de los
roedores (Canales et al., 2000; D'Arriago et al., 2004; Castaeda et al., 2007).
73
cultivos in vitro de mdula sea, demuestran que la maca estimula la actividad
hematopoytica.
74
Existen muchos reportes que sealan que las clulas de sangre perifrica
siguen un ritmo circadiano. En los ratones, animales nocturnos por naturaleza,
los leucocitos alcanzan su punto mximo en las primeras horas de la maana
y van decreciendo a lo largo del da (Pelegri et al., 2003). Esto podra explicar
la gran magnitud de desviacin estndar observada en el recuento total de
leucocitos (Figura 26, grupos No IS) y que se vio reflejada en el recuento
diferencial de sangre perifrica (Tabla 6), por lo que se midi su coeficiente de
variacin y result menor del 50% (datos no mostrados). Una forma de medir
el error muestral es a travs del coeficiente de variacin, que permite evaluar
la calidad estadstica de las estimaciones, un coeficiente menor del 50% indica
que la media aritmtica es representativa (Mitacc, 1996).
75
parmetros hematolgicos y el contaje de progenitores hematopoyticos en
ensayos clonognicos.
77
7. CONCLUSIONES
78
8. RECOMENDACIONES
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9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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10. ANEXOS
92
Figura 28. Posible mecanismo de accin del extracto acuoso de maca sobre
las clulas hematopoyticas. El EAc de maca tendra un efecto (directo o
indirecto) sobre las clulas hematopoyticas (E, SC, P, T) estimulando la
produccin de citoquinas hematopoyticas como IL-3, GM-CSF e IL-7 que a su
vez actuaran sobre ellas mismas u otras clulas, induciendo la hematopoyesis
(Linaje linfoide y mieloide) y ofreciendo proteccin frente a CF.
EAc: Extracto acuoso de maca
CF: Ciclofosfamida
E: Clulas estromales
SC: Clula madre
P: Clula progenitora,
T: Linfocitos T
L: Clulas del linaje linfoide
M: Clulas del linaje mieloide
IL-3: Interleuquina 3
IL-7: Interleuquina 7
GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos
93