BIOQUIMICAS Bacillus thuringiensis

1. CALDO ROJO DE METILO -VOGESPROSKAUER(RM-VP)

El Medio MR-VP e sutilizado como medio diferencial, para organismos coliformes en base
a las pruebas de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer.

Es particularmente til para la clasificacin de enterobacterias. Tambin conocido como

Rojo de Metilo Voges-Proskau.

Fundamento:

La composicin lo hace un medio de enriquecimiento para organismos no exigentes.

Pruebas:

Rojo de metilo: revela la presencia de productos cidos.

C6H12O6 C303H5(LACTATO) CH3COOH + CO2, HCOOH

Voges y Proskauer Alfa naftol e hidrxido de potasio: Evidencian la presencia de

productos finales neutros.

Voges y Proskauer describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar
hidrxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta
coloracin se debe a la oxidacin del acetilmetilcarbinol a diacetilo el cual reacciona con la
peptona del medio para dar un color rojo.

Revelado de pruebas bioqumicas

a) Prueba del rojo de metilo: Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al
0.04%, observar el color del medio.
b) Prueba del Voges Proskauer: Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico
absoluto y 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar
vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
Observar el color de la

2. PRUEBA DE CITRATO

Principio

Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para
el metabolismo, provocando alcalinidad.

Medios empleados
 A) Medio de citrato de Simmons, pH: 6,9

1. Ingredientes.

a) Sulfato de magnesio (MgSO4)----------------------------------------0,2g

b) Monofosfato de amonio dihidrogenado (NH4)H2PO4 --------------1g

c) Fosfato dipotasico K2HPO4---------------------------------------------1g

d) Citrato de sodio------------------------------------------------------------2g

e) Cloruro de sodio-----------------------------------------------------------5g

f) Agar Agar -----------------------------------------------------------------15g

g) Azul de bromotimol-------------------------------------------------------0,08g

h) Agua destilada------------------------------------------------------------1000ml

1. Indicador del pH: azul de bromotimol.

a) Acido: color amarillo (no se observa) pH: 6

b) Alcalino: color azul de Prusia intenso, pH: 7,6

c) Medio no inoculado: 1) pH: 6,9; 2) color verde

2. Mtodo de preparacin.

a) Pesar exactamente la cantidad de acuerdo con las indicaciones del prospecto.

b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.

c) Calentar suavemente hasta la disolucin.

d) Colocar aproximadamente 4 a 5ml en cada tubo (pico de flauta largo, con poca
profundidad).

3. Mtodo de esterilizacin.

a) Autoclave.

b) 121 C, libras, 15 min.

4. Dejar que el medio solidifique en posicin inclinada.

5. Enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacin (4 -10C).
7. Inoculacin.

a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h (cultivo en AHK u otro medio adecuado).

b) inoculo liviano.

c) nicamente en cola de pescado sobre un medio pico de flauta.

6. Incubacin.

a) 35C

b) 24 a 48 h. A veces es necesaria una incubacin ms prolongada (hasta 4 das)

Interpretacin de resultados

A) Medio de citrato de Simmons

1. Prueba positiva: crecimiento con un color azulen el pico de flauta.

2. Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde).

3. AGAR ALMIDON

Este medio se utiliza para identificar microorganismos que degradan el almidn. La

hidrlisis del almidn se evidencia cubriendo la placa con una solucin de Lugol (I2-KI). Se
forma un complejo color azul con el almidn, ausente en las zonas donde hubo hidrlisis.
Si las colonias son almidn positivas, aparece un halo transparente alrededor de las
mismas.

Preparacin

Extracto de carne ......................................... 3,0 g

Peptona ........................................................ 5,0 g

Almidn soluble .......................................... 2,0 g

Agar- agar ................................................... 15,0 g

Agua destilada ............................................. 1,0 Lt

Disolver los ingredientes en el agua destilada, llevar a ebullicin agitando regularmente,

calentar 3-4 minutos hasta disolucin. Enfriar a 50-60C. Esterilizar en autoclave.
4. PRUEBA DE LICUEFACCION DE GELATINA.

Principio

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteoltico

(gelatinasas) que licuan la gelatina).

Medios empleados

A) Medio de gelatina de Kohn, muy recomendado.

1. Ingredientes.

Peptona---------------------5,0 g

Extracto de carne-------- 3,0 g

Gelatina --------------------120 g

Agar -------------------------15,0 g

Agua destilada----------- 1000,0 mL

pH 6,8

2. Mtodo de preparacin

a) Ingredientes individuales.

1. Primero agregar solamente gelatina al agua destilada o desmineralizada y dejar

descansar de 15 a 30 min.

2. Calentar hasta que hierva (50C) para que se diluya la gelatina.

3. Agregar el extracto de carne y la peptona, y volver a calentar hasta ebullicin para

disolver todos los componentes.

4. No calentar en exceso.

5. Ajustar el pH de 6,8 a 7.

3. Mtodo de esterilizacin.

Autoclave. 121 C, 15libras, 15 min.

4. Enfriar en posicin vertical, ajustar las tapas, y refrigerar para su conservacin (4 10C)

5. Inoculacin.
a) Mantener en el refrigerador los tubos de gelatina hasta el momento de su inoculacin. El
medio debe estar solidificado.

b) Aguja de inoculacin.

1. Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h: en AHK u otro medio de cultivo conveniente.

2. Inoculo espeso.

3.Hacer una puncin en el medio hasta una profundidad de 1 1/1 a 2 cm.

6. preparar un tubo de control para hacer la prueba junto con los de la bacteria en estudio.
Rotular control.

7. Incubacin, simultneamente los tubos de prueba y de control 22 25 C o a 35 C. 24

h a 14 das.

5. PRUEBAS DE LA FERMENTACIN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO (Faddin,

1980)

Principio

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono

especifico incorporado a un medio bsico, produciendo acido, o acido con gas visible.

Medios empleados

1. Caldo bsico rojo de fenol, pH: 7.4

- Peptona (proteasa o digestivo)

- Pancretico de casena) ---------------- 10 g

- Extracto de carne (opcional) ---------- 1 g

- Cloruro de sodio(NaCl) ----------------- 5 g

- Rojo de fenol ----------------------------- 0.0018 g

- Agua destilada --------------------------- 1000 ml

Indicador del pH, rojo de fenol.

a) Acido: color amarillo, pH:6.8

b) Alcalino: Color rojo rosado, pH:8.4

c) Medio no inoculado: 1) pH: 7.4;2) Color anaranjado rojizo

Hidratos de carbono

Puede utilizarse una variedad de hidratos de carbono de acuerdo con las dificultades
encontradas en la identificacin de un microorganismo particular, por lo general deben
utilizarse 8 a 10 azucares; los utilizados con mayor frecuencia son

Glucosa

-Lactosa

-Sacarosas

-Manitol

-Dulcitol

-Salicina

-Adonitol

-Inositol

-Sorbitol

-Arabinosa

-Rafinosa

-Ramnosa

-Xilosa

-Trehalosa

-Celobiosa

-Galactosa

-Inulina

-Fructosa (azcar invertido)

-melobiosa

Agregar los hidratos de carbono individuales deseados a alcuota de caldo base preparado;
concentracin final
- Salicina, 0.5 %

- Todos los otros, 1 %

Mtodos para el agregado de hidratos de carbono al caldo base

a) Mtodo 1:agregar directamente al medio base en la concentracin deseada antes de la

esterilizacin.

- 0.5 %: 5 g/L

- 1.0% : 10 g/L

b) Mtodo 2 : Soluciones de azcar; preparar una concentracin del azcar deseado al 5

o 10 % en agua destilada

- Solucin al 5%: 5 g/100ml

- Solucin al 10%: 10 g/100ml

Agregar la solucin de azcar estril a la base estril para dar una concentracin final de
0.5 o 1 %; agregar 100 ml de una solucin al 0.5 % o 1% a un frasco graduado de 1 L y
llevar a 1000 ml con el caldo base con rojo fenol y mezclar completamente. Solo a los tubos
de glucosa, agregar un tubo de Durham invertido, antes de esterilizar en la autoclave.

Llevar a esterilizar todos los medios y llevara refrigeracin (4-10C)

Inoculacin

Crecimiento de inoculo puro de 18 a 24 h, u otro medio conveniente; Inoculo denso. Una

batera de hidratos de carbono puede inocularse con un nico inoculo.

Mtodos de inoculacin de los mtodos lquidos o solidos con hidratos de carbono

a) Hisopo

Pasar el hisopo sobre el crecimiento del cultivo. El hisopo se habr humedecido

previamente con solucin fisiolgica o caldo estril si el cultivo se ha efectuado en un medio
slido.

Aspticamente pasar el hisopo contra un costado de cada uno de los tubos con hidratos de
carbono, por encima del nivel del lquido.

Inclinar el tubo para que se incorpore el inculo. Agitar sin que salpique la tapa del tubo.
Cuando se utiliza un hisopo, se emplear uno nuevo cada recoleccin de cultivo

b) Con aguja o asa de inoculacin

Pasar la aguja o el asa sobre crecimiento de un cultivo, si se trata de un caldo nutritivo,

utilizar un asa de inoculacin.

Aspticamente, introducir la aguja o el asa en cada uno de los tubos de hidratos de carbono.
Agitar suavemente cada tubo, sin salpicar la tapa del tubo.

Interpretacin de resultados

Medio caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol

1. Positivo

- Acido (A), pH:6,8

- Color amarillo

- Produccin de gas (G)

a) Positivo para gas (G)

- Aerognico: se encuentra CO2+ H2

- Se observan burbujas de gas en el tubo de Durham, el medio se halla completamente

desplazado por el gas que deja una parte sin colorear en el tubo incluido. Una sola burbuja
en el tubo de Durham basta para registrar produccin de gas. Registrar produccin de gas
y acido (AG).

b) Negativa para gas

- Anaerogenica: No se observan burbujas de gas y el medio del tubo de Durham se

mantiene amarillo. Registrar produccin de cido solamente (A)

2. Retardada

- Color anaranjado. Si no se tiene seguridad, compara con el tubo no inoculado. Volver a

incubar.

3. Negativa

- Alcalina

- Color rosa-rojizo
PRUEBA DE CATALASA

Principio

Comprobar la presencia de enzima catalasa

Objetivo

Utilizada originariamente para diferencias entre generos

1. Streptococcus (-) del micrococcus (+)

2. Bacillus (+) del clostridum (-)

3. Listeria monocytogenes (+) y/o coryne bacterium (+) del Erysipelothrix (-)

REACTIVOS

Perxido de hidrogeno, 30%

1. conservar en frasco color mbar, evitar la innecesaria exposicin a la luz.

2. mantener continuamente refrigerado cuando no se usa.

PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO

Principio

Determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrgeno

libre.

MEDIOS EMPLEADOS: MEDIO DE NITRATO DE POTASIO, DOS VARIANTES

A. Caldo nitrato: pH 7

B. Agar con nitrato pH 6,8

C. Ingredientes: cualquiera de los dos medios

Extracto de carne---------------------3g

Peptona-----------------------------------5g

Nitrato de potasio 1g

Agar (para el medio solido) -------12g

Agua destilada---------------------------1L
Mtodo de preparacin

1. Pesar exactamente las cantidades, tal como se indica en el prospecto.

2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.

3. Calentar suavemente hasta disolucin.

4. Distribuir en tubos, aproximadamente.

- Agar nitrato: 5ml por tubo.

- caldo nitrato:1ml por tubo.

5. Autoclavar a 121C

Inoculacin

1. Crecimiento del cultivo puro de 18 a 24 h: AHK u otro medio adecuado.

2. Medio caldo: inoculo denso

3. Medio de agar en pico de flauta: cola de pescado en el pico de flauta y puncin en la

capa profunda.

4. Deben hacerse simultneamente dos controles

- Tubo control 1: inoculado con un organismo nitrato de positivo conocido.

- Tubo de control 2: no inoculado pero tratado con las mismas condiciones que el inoculado.
Controlar para determinar si hay nitrito en el medio.

Incubacin

1. 35C

2. De 12 a 24 h; raramente puede ser necesaria una incubacin prolongada de hasta 5 dias.

3. agregar reactivos de nitrato antes de hacer la interpretacin.

Interpretacin

A. Fase 1

- Prueba positiva

Color rosado a rojo intenso

-Prueba negativa

No se desarroll color
Bibliografa

Faddin, M. (1980). Pruebas Bioquimicas para la Identificacion Bacterias de Importancia Clinica.

Editorial medica Panamericana.