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Electroforesis
David Alejandro Lpez de la Mora Ana Soledad Sandoval Rodrguez 13
Introduccin Gel
En biologa molecular, una gran cantidad de tcni La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con
cas que se realizan comnmente requiere el uso de la la finalidad de evitar perturbaciones mecnicas durante la
electroforesis, lo que supone una parte importante del separacin. El soporte idneo es un gel semislido o gela-
procedimiento sistemtico del anlisis (separacin, puri tinoso, compuesto por polmeros que forman una especie
ficacin, preparacin) de los cidos nucleicos y las pro de malla o microporos tridimensionales a travs de los cua-
tenas. La mayora de las biomolculas poseen una carga les las molculas avanzan, segn el peso molecular, lo que
elctrica cuya magnitud depende del pH del medio en permite la separacin por tamao de los diferentes com-
el que se encuentran; como consecuencia, pueden des
ponentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa
plazarse cuando se someten a un campo elctrico hacia
el polo de carga opuesta al de la molcula. A diferencia
o poliacrilamida. Para la separacin de cidos nucleicos se
de las protenas, que pueden tener una carga positiva o usan geles de agarosa o acrilamida y para protenas, slo
negativa, los cidos nucleicos slo poseen carga negati de acrilamida.
va, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en
una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia Geles de agarosa
el polo positivo, es decir, el nodo. En el caso de las
protenas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pre La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que
tratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a tem-
sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se peratura ambiente, que se disuelve con facilidad en tempe-
homogeneizan las protenas de la muestra y todas migra ratura de 50 a 60C, se torna lquida y se solidifica cuando
rn hacia el polo positivo; slo se separarn por tamao. se enfra formando un gel altamente poroso. El gel de aga-
El principio de la electroforesis consiste en la mi rosa es la manera ms efectiva de separar fragmentos de
gracin proporcional de las molculas a travs de un gel cido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)
u otro tipo de matriz porosa, segn su peso molecular o
que van de 100 pb a 25 kb. Para elaborar el gel se pesa la
tamao; movimiento generado por el campo elctrico.
cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solucin
amortiguadora adecuada de la misma composicin y con-
centracin que el buffer de corrimiento y se calienta hasta
Elementos necesarios para una formar una solucin. Sin dejar enfriar, se vaca de forma
inmediata sobre un molde de forma rectangular y en uno
electroforesis de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine
Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de con la finalidad de generar los pocillos u orificios en los que
elementos descritos a continuacin y enlistados en la fi- se colocarn las muestras (figura 13-3). La agarosa posee
gura 13-1. ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto
txico y permite realizar el anlisis de cidos nucleicos con
pesos moleculares variados, segn la concentracin de
Cmara de electroforesis agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolu-
La cmara de electroforesis es un dispositivo que permite la cin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La con-
generacin de un campo elctrico alrededor de un gel en el centracin de agarosa se escoge segn el tamao del cido
que se depositan las muestras. Este campo se genera dentro nucleico que se vaya a analizar (cuadro 13-1). El tamao de
de una solucin amortiguadora en la que se encuentra su- los poros de la matriz del gel depende de la concentracin
mergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido de agarosa utilizada y la concentracin de agarosa es inver-
de electrolitos permite la transmisin de la corriente elc- samente proporcional al tamao del poro obtenido; esto
trica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La es, a mayor concentracin, menor tamao de los poros, y
cmara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente viceversa, si los poros son pequeos la migracin del cido
de energa. En las cmaras de electroforesis vertical el polo nucleico es ms lenta. La figura 13-4 representa la migra-
positivo se encuentra en la parte inferior de la cmara (fi- cin de las molculas de DNA en un gel de agarosa. Du-
gura 13-2A) y en las horizontales, en uno de los extremos rante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un
(figura 13-2B). En ambos tipos de cmaras el polo positivo peso molecular alto migran al nodo con ms lentitud que
se identifica con color rojo y el negativo con negro. los de menor peso molecular. Esto se debe a que los cidos
118 Metodologa del DNA recombinante
Cmara de A)
electroforesis Peine para pocillos
MIGRACIN DE LA MUESTRA
Gel
100
MIGRACIN DE LA MUESTRA
Marcador de peso
BUFFER
Buffer de carga
1KB
Migracin
Patrn o 0.5 700 pb a 25 kb
Ladder
0.8 500 pb a 15 kb
Banda de DNA
1.0 250 pb a 12 kb
1.2 150 pb a 6 kb
1.5 80 pb a 4 kb
Gel
2.0 100 pb a 3 kb
de 19:1. Regulando la concentracin de ambas y su propor- cadena larga. El polmero en disolucin no forma un gel,
cin se consiguen distintas porosidades, siempre menores sino que se encuentra en estado viscoso debido a que las
que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se en- cadenas pueden deslizarse unas sobre otras; la formacin
cuentra en disolucin acuosa experimenta autopolimeri- del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo
zacin de forma espontnea y lenta, con el resultado de que se consigue con la bisacrilamida). La acrilamida es una
que las molculas de acrilamida se unen cabeza con cola. neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaucin.
En presencia de un sistema generador de radicales libres Tambin es esencial almacenarla en un lugar refrigerado,
se da una polimerizacin vinlica en la cual se activan los seco y oscuro para reducir la autopolimerizacin y la hi-
monmeros de acrilamida, quedan en estado de radical drlisis. La bisacrilamida, o N,N-metilenbisacrilamida,
libre y reaccionan rpidamente para formar polmeros de est compuesta por dos molculas de poliacrilamida enla-
zadas por sus grupos amino, no reactivos. Este compuesto
se polimeriza junto con la acrilamida y establece puentes
entre las cadenas lineales de poliacrilamida, con lo que se
evita su deslizamiento y conduce a la formacin del gel. El
gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que
A
la agarosa y es susceptible de teirse por varios procedi
mientos; tambin puede desteirse en caso necesario. Los
geles de acrilamida pueden digerirse para extraer fraccio-
nes separadas (bandas) o desecados para su exposicin ra-
B diogrfica y registro permanente. La electroforesis con geles
de acrilamida siempre se realiza en cmaras verticales. La
electroforesis de protenas emplea geles de acrilamida de
dos capas a diferente concentracin de acrilamida, un gel
C superior o concentrador y un gel inferior de separacin o
de resolucin. El gel de concentracin tiene un tamao de
Figura 13-5. Perfil electrofortico de un plsmido. Aunque
la molcula de DNA (en este caso un plsmido) tenga la
poro grande y se prepara con un amortiguador de Tris/HCl
misma longitud en pb, puede demostrar diversos patrones con pH de 6.8, dos unidades de pH menor que el buffer
de corrimiento electrofortico segn la conformacin de la de corrimiento hecho de Tris/SDS/glicina. Estas condi-
estructura. A) Plsmido superenrrollado. B) Plsmido circular. ciones proporcionan un ambiente para que las protenas
C) Plsmido linearizado. recubiertas con SDS se concentren. El tamao del gel de
120 Metodologa del DNA recombinante
Migracin
empacamiento
movilidad dependa exclusivamente de su masa molecular.
En la figura 13-6 se representa la electroforesis de prote- Patrn o
Ladder
nas en gel de acrilamida. Banda de
protenas
Buffer de corrimiento
El buffer de corrimiento es de la misma composicin y pH Gel de
que el buffer con el que se prepara el gel de resolucin, ya resolucin
sea de agarosa o de acrilamida. ste proporciona el medio
para la transmisin de la corriente elctrica y mantiene el
pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En Figura 13-6. Electroforesis de protenas. Las protenas se
el caso de los cidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE corren en geles de acrilamida formados por dos fases.
como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris Una fase superior donde las molculas se concentran y una
base, cido brico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El inferior donde la muestra se separa en sus componentes
buffer TAE contiene Tris base, cido actico y EDTA, ajus- segn su peso molecular. Al estar pretratadas con SDS, las
tado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de protenas se rodean de cargas negativas, lo que les permite
protenas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, migrar hacia el polo positivo con independencia de su carga
inicial.
a un pH 8.3.
Buffer interno
Buffer externo
Figura 13-9. Electroforesis vertical. En esta cmara se aprecia cmo el gel de acrilamida ha quedado embebido en el buffer de
corrimiento en su extremo superior gracias a la colocacin de amortiguador en la parte interna de la cmara. El buffer de la parte
externa permite que el polo positivo cuente con la misma solucin buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.
Electroforesis 123
Mayor intensidad
V
mA
Menor intensidad
Figura 13-10. Movilidad de fragmentos de DNA. La imagen de 0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar
muestra fragmentos de DNA de mayor a menor tamao a un fragmento de DNA de 4 kb, mientras que el azul de
(parte superior hacia parte inferior) visualizados con un agente bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb.
intercalante. Se aprecia cmo la intensidad de la banda obser- La electroforesis se detiene cuando se considera que la
vada es variable, lo que indica groso modo cul fragmento se muestra se localiza en la posicin deseada, o bien cuando
encuentra en mayor cantidad y cul en menor. la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes
del gel.
Hay mltiples factores que pueden afectar la migra-
mezclan con el buffer de carga y se depositan de forma cui-
cin del DNA, como la concentracin del gel utilizado, el
dadosa en los pocillos, con lo que se evita que se salgan y
tamao de la molcula de DNA muestra, el empaqueta-
puedan contaminar el pocillo contiguo. Debe considerarse
miento del DNA, el voltaje, la temperatura del buffer de
el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos,
corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje
uno de los carriles, para la determinacin del peso molecu-
es muy alto), la contaminacin con agentes intercalantes
lar de la muestra. Este marcador tambin debe mezclarse
en la muestra, la composicin del buffer de corrimiento,
con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado
etctera.
para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos, se
procede a la transmisin de la corriente elctrica. Se co-
Visualizacin de las muestras
nectan los cables de la fuente de energa de cada polo elc- Para la visualizacin de los cidos nucleicos se utiliza un
trico a la cmara de electroforesis en el electrodo que le colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que tiene la
corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del
molecular de las molculas de DNA que se va a separar. DNA y el RNA. Debido a esta propiedad es un agente mu-
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb) tagnico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de
se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 etidio, por lo general, se incorpora a la agarosa (0.5 mg/
V. Para muestras de DNA genmico y plasmdico (> 2 kb) ml) antes de permitir la solidificacin, o puede incorporar-
se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V. En la figu- se luego del corrimiento, incubando el gel en una solucin
ra 13-11 se aprecia una fuente de energa, con su pantalla, que lo contenga a 0.5 mg/ml. El bromuro de etidio emite
que indica el amperaje. Es importante que se estandarice el fluorescencia de color naranja cuando se expone a la luz ul-
tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor reso- travioleta con longitud de absorcin de 254 nm, y longitud
lucin posible. de emisin de 366 nm. La seal fluorescente es proporcio-
Durante el corrimiento se monitorea la migracin de nal a la cantidad de producto, como puede observarse en
la muestra con colores que contiene el buffer de carga, en la figura 13-12. Su sensibilidad permite detectar cerca de
que se observa el color azul y el verde correspondientes 30 pg de cido nucleico por banda (segn el grosor del gel).
a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, de El bromuro de etidio es teratognico, mutagnico y cance-
forma respectiva. En geles de agarosa, dentro del rango rgeno, por lo que para este procedimiento se recomienda
124 Metodologa del DNA recombinante
el uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio rando la polimerizacin total del primero, para continuar
se ha sustituido por un compuesto comercial, SYBR Safe, con la del segundo; de lo contrario, en estado lquido, se
que se une de manera no covalente a los cidos nucleicos. mezclaran.
Este colorante tiene una fluorescencia a 280, una excita- Para el caso de los geles de acrilamida para cidos
cin mxima a 502 nm y una emisin mxima a 530 nm. nucleicos slo se tiene una fase, conformada por el gel de
Con este colorante, el DNA puede visualizarse con una luz resolucin, en el que las molculas de DNA migrarn, ge-
ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm. Por otro lado, nerando un patrn electrofortico, segn su tamao.
el colorante de cianina asimtrico el SYBR-Green es un Para electroforesis de protenas, la acrilamida se pre-
fluorforo que se une con gran afinidad al surco menor del para a partir de una solucin al 30% de acrilamida-bisacri-
DNA bicatenario, y es unas 25 veces ms fluorescente que lamida 19:1. sta se mezcla con el buffer correspondiente y
el bromuro de etidio. Este colorante con epiiluminacin de una solucin de SDS; adems, se aade persulfato de amo-
254 nm puede detectar 60 pg de dsDNA/banda; 1 a 2 ng nio (APS) y N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina (TEMED)
de oligonucletidos, y 100 a 300 pg de RNA o ssDNA/banda. como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a
Para los geles de acrilamida una alternativa al bromuro de 10 mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un ini-
etidio es el nitrato de plata; sin embargo, ste utiliza reac- ciador de la reaccin de polimerizacin que al final forma
tivos peligrosos, como el formaldehdo. Por otro lado, la el gel. El TEMED funciona como otro iniciador de polime-
tincin con plata es ms sensible que el bromuro de etidio, rizacin. Las propiedades del gel resultante dependen de la
ms barata a largo plazo y menos txica. En la figura 13-12 concentracin de APS y TEMED, ya que un aumento en
se aprecia una muestra visualizada por bromuro de etidio su concentracin disminuye la longitud media de la cadena
y otra por SYBR Safe. de polmero y, por lo tanto, disminuye su elasticidad y le
resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la menor
concentracin posible de catalizadores que permita la po-
Electroforesis de protenas limerizacin en un tiempo ptimo.
El mtodo ms empleado para electroforesis de protenas El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el
se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento
gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de dentro de la cmara vertical de electroforesis. En el mo-
resolucin y otro de compactamiento), que difieren en su mento de sumergir los geles en el tanque, se debe asegurar
concentracin, composicin y pH. Los geles estn unidos que los pocillos del gel estn totalmente cubiertos por el
pero limitados por una fase de separacin visible a contra buffer. Es comn en los geles de acrilamida realizar un pre-
luz; para lograrlo, deben prepararse por separado, espe- corrimiento de unos 10 a 30 min a voltajes bajos, con el
A) B)
Figura 13-12. Visualizacin de fragmentos de DNA. Estas imgenes son de un gel de agarosa donde la muestra fue visualizada por
A) bromuro de etidio y B) colorante de cianina asimtrico (SyberR-Green).
Electroforesis 125
cual se asegura que los pocillos se limpien antes de cargar Muchas variables pueden influir en la intensidad del
las muestras. color y todas las protenas tienen caractersticas distintas
Para la preparacin de la muestra de protena se reali- de tincin.
za una reaccin fisicoqumica, en la que se rompen enlaces Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para
peptdicos y puentes disulfuro por accin de detergentes ello, primero se deshidrata en glicerol-metanol y, poste-
inicos (SDS), reactivos reductores (betamercaptoetanol) riormente, se coloca en una lmina de celofn hidrof li-
y temperaturas elevadas (95C), que al final consigue des- co y no plastificado que cubra totalmente el gel. Se cubre
naturalizar la protena hasta su estructura primaria. La el gel con un segundo celofn previamente remojado en
muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con agua y se sella con calor. Aqu se deja secar en condiciones
cuidado en los pocillos, evitando la contaminacin del po- ambientales por aproximadamente dos das o se acelera el
cillo contiguo. Hay que considerar el uso de un marcador proceso con el uso de desecadores de geles.
estndar de protenas para la medicin del peso molecular Algunas protenas pueden migrar de forma irregular
de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamien- y aparecer con un peso molecular mayor que el esperado;
tos que la protena. esto puede deberse a que presentan modificaciones pos-
Una vez colocadas las muestras de protenas en cada traduccionales en su estructura, como residuos de gluco-
pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes silacin, fosforilacin y acetilacin, que podran retardar
de los electrodos a la fuente de energa, con la seleccin de la migracin de las muestras. Asimismo, si existe desna-
voltaje o amperaje adecuados. Para el clculo del voltaje turalizacin de las protenas, se considera que la protena
es importante conocer la distancia en centmetros del gel est degradada y suelen aparecer manchas difusas en todo
desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia el carril.
multiplicada por 8-15 V permitir determinar el voltaje del
corrimiento. El voltaje ptimo depender de la molcula
que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda es- Aplicaciones de la electroforesis
tandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o co-
Algunos de los usos de la electroforesis para cidos nuclei-
rriente elctrica (medida en amperios o miliamperios) de-
cos en geles de agarosa son determinar los tamaos mo-
pender de la fuerza inica del buffer. En el caso de trabajar
leculares de los cidos nucleicos, analizar los fragmentos
con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25
cortados con enzimas de restriccin (mapa de restriccin),
a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante,
comparar los tamaos de distintos tipos de DNA, aislar y
visualizado como una lnea azul, haya llegado a los lmites
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonacio-
de la parte inferior del gel.
nes moleculares, y analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a
Visualizacin de las muestras las tcnicas de hibridacin, como el Southern blot (DNA)
Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente que con- o el Northern blot (RNA), en que la presencia de deter-
tiene el colorante azul brillante de Coomassie y se incuba minada secuencia del cido nucleico en una mezcla de
por unos minutos; esto permitir la visualizacin de las molculas se distingue por su tamao, la cual se confirma
bandas de protenas. El proceso de coloracin se basa en la por hibridacin con una sonda especfica. En el caso de
atraccin electrosttica del enlace peptdico de las prote- las protenas, la electroforesis se aplica para la identifica-
nas sobre grupos de cido sulfnico, que tien la protena cin de fracciones proteicas o protenas particulares por
de color azul. Asimismo, las fuerzas de van der Waals y tamao, como es el caso de la electroforesis de globulinas,
las interacciones hidrofbicas participan en este proceso o protenas sricas; pero, sobre todo, para la identifica-
de unin mecnica. La tincin de Coomassie Blue clsi- cin de molculas particulares empleando despus una
ca, por lo general puede detectar bandas de protena de reaccin antgeno-anticuerpo especfica en la tcnica de
50 ng mientras que la tincin con plata incrementa este Western blot. Asimismo, la electroforesis es crucial en tc-
lmite de sensibilidad unas 50 veces. La tincin con plata nicas como la secuenciacin, en que, tras un corrimiento
consiste en desarrollar el color en el gel por incubacin en electrofortico de las cuatro reacciones de elongacin con
soluciones de metano al 140%: cido actico al 10%, luego los dideoxinucletidos (vase el captulo 18), se puede de-
metanol al 40%, seguido de agua y posteriormente tiosul- ducir la secuencia del segmento de cido nucleico. Incluso,
fato de sodio al 0.01%. Despus de este proceso, se lava y los secuenciadores automticos modernos emplean una
se procede a la incubacin en fro (4C) en cloruro de plata electroforesis capilar para el discernimiento de la secuen-
al 0.1%; posteriormente, se lava e incuba con carbonato de cia. Tambin, los termocicladores en tiempo real basan la
sodio al 2% en formalina al 0.04% (llamada tambin formol deteccin de los fragmentos amplificados en una electrofo
al 35%), que acta como revelador. Por ltimo, se incuba resis capilar, en que es posible la deteccin inmediata de los
con soluciones de cido actico antes de fotografiar o es- segmentos amplificados y su lectura por el lser correspon-
canear. diente al flurocromo con que el producto est marcado.
126 Metodologa del DNA recombinante