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Educao Mdica Continuada

Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais *

Molecular biology in tropical dermatoses *
Ana Maria Roselino 1

Resumo: So apresentados conceitos bsicos sobre clula, cdigo gentico e sntese protica, e sobre
algumas tcnicas de biologia molecular, tais como PCR, PCR-RFLP, seqenciamento de DNA, RT-PCR e
immunoblotting. So fornecidos protocolos de extrao de nucleotdeos e de protenas, como salting
out no sangue perifrico e mtodos do fenol-clorofrmio e do trizol em tecidos. Seguem-se exemplos
comentados da aplicao de tcnicas de biologia molecular para o diagnstico etiolgico e pesquisa
em dermatoses tropicais, com nfase na leishmaniose tegumentar americana e hansenase.
Palavras-chave: Biologia molecular; Biologia molecular/mtodos; Hansenase; Hansenase/diagnstico;
Leishmaniose; Leishmaniose mucocutnea/diagnstico; Reao em cadeia da polimerase;
Polimorfismo gentico

Abstract: Initially, basic concepts are presented concerning the cell, genetic code and protein synthesis,
and some techniques of molecular biology, such as PCR, PCR-RFLP, DNA sequencing, RT-PCR and
immunoblotting. Protocols of nucleotides and of proteins extraction are supplied, such as salting out
in peripheral blood allied to phenol-chloroform and trizol methods in skin samples. To proceed,
commented examples of application of those techniques of molecular biology for the etiologic
diagnosis and for research in tropical dermatoses, with emphasis to American tegumentary
leishmaniasis and leprosy are presented.
Keywords: Leishmaniasis; Leishmaniasis, mucocutaneous/diagnose; Leprosy; Leprosy/diagnose;
Molecular biology; Molecular biology/methods; Polymerase chain reaction; Polymorphism, genetic;

INTRODUO
As doenas tropicais no Brasil, citadas tambm
como doenas exticas, procedem da contaminao
dos ndios por ocasio da colonizao, permitida pelas
temperaturas elevadas e pelo excesso de umidade nos
trpicos, condies ideais para essas doenas. O des-
matamento sem critrio, resultando em intensa altera-
o ambiental local e global, somado s condies cli-
mticas e baixa qualidade de vida caracterstica da
quase-totalidade dos pases situados em regies tropi-
cais , vem estimulando a ocorrncia de epidemias.1
Vrias tm sido as discusses em relao ao
impacto do aquecimento global sobre epidemias
decorrentes de transmisso do agente etiolgico pelo
ar e doenas relacionadas aos artrpodes, apontando
que medidas ambientais, econmicas, regulatrias
legais, como tambm medidas de sade pblica, se
tornam necessrias.2
Entre as doenas tropicais situam-se as doenas
negligenciadas, que ocorrem em regies pobres e
que, por sua vez, agravam a pobreza.3,4 Quando asso-
ciadas Aids, a situao torna-se pior.5-8 Mais recente-
mente, as doenas tropicais se transformaram em pro-
blema de mbito mundial, devido migrao popula-
cional e ao turismo internacional, refletido tambm

Aprovado pelo Conselho Editorial e aceito para publicao em 05.06.2008.

* Trabalho realizado no no Laboratrio de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo So Paulo (SP), Brasil.
Conflito de interesse: Nenhum / Conflict of interest: None
Suporte financeiro / Financial funding:: FAEPA-HCFMRP-USP (Fundao de Auxlio ao Ensino, Pesquisa e Assistncia); APH (Associao Paulista contra a
Hansenase - processos nos 092/2005; 112/2007); CNPq (proc. no 400930/05-6); Fapesp (proc. no 2007/54416-2).
1
MD, PhD. Professora-associada, Laboratrio de Biologia Molecular, Diviso de Dermatologia, Departamento de Clnica Mdica, Faculdade de Medicina de
Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo So Paulo (SP), Brasil.

2008 by Anais Brasileiros de Dermatologia

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em sua transmisso durante transplantes de rgos
slidos.9,10
Em relao, mais especificamente, s dermato-
ses tropicais, todos os dermatologistas no s lati-
nos, mas de todo o mundo necessitam ter familiari-
dade com as doenas tropicais que cursam com leses
cutneas, justamente devido ao aumento de viagens
para pases tropicais e subtropicais.11
As dermatoses tropicais podem ser classifica-
das segundo o agente etiolgico envolvido como
virais;12,13 bacterianas, em especial, as micobacteria-
nas;14,15 fngicas e parasitrias.16-18 Em inqurito de con-
sultas dermatolgicas em consultrios e em servios
credenciados, realizado no Brasil, a hansenase apare-
ce em 20o lugar no pas e em quarto lugar na Regio
Centro-Oeste.19 Entre as mais comumente relatadas
nas reas rurais do Panam, citam-se micetomas, para-
coccidiodomicose, lobomicose, cromomicose, histo-
plasmose, rinosporidiose, esporotricose, hansenase,
rinoscleroma e leishmaniose cutnea e mucocutnea.20
Biologia molecular e dermatoses tropicais
Para o diagnstico das dermatoses tropicais,
vrios so os mtodos subsidirios que, quando alia-
dos ao exame clnico, permitem o diagnstico etiol-
gico de cada uma delas. Para cada dermatose, existem
excelentes revises na literatura.12-18, 21-29
Entre as dermatoses bacterianas, fngicas e
parasitrias, com exceo do bacilo Mycobacterium
leprae, todos os organismos infectoparasitrios so
cultivveis, permitindo o diagnstico etiolgico da
doena em investigao. Porm, cada doena, por
sua vez, manifesta-se de forma distinta no homem,
quer pela virulncia do agente etiolgico, quer pela
susceptibilidade gentica e resposta imune do hos-
pedeiro.30,31 Por isso, algumas manifestaes clni-
cas, por exemplo, de doenas bacterianas, fngicas
ou parasitrias no hospedeiro com imunidade celu-
lar exacerbada, podem fugir do usual, pois o antge-
no pode encontrar-se escasso na bipsia da leso, e
o emprego de mtodos diagnsticos clssicos, em
busca da definio do agente infeccioso, pode
retardar o diagnstico etiolgico final.32,33 Tambm
vale a pena ressaltar que o emprego da biologia
molecular pode auxiliar no diagnstico etiolgico
diferencial entre as leses sarcodicas e da prpria
sarcoidose.34,35
Com a descoberta da molcula do cido deso-
xirribonuclico (DNA), por Watson e Crick em 1953, o
estudo dos tecidos e das clulas passa da observao
morfolgica, macroscpica ou microscpica, para a
molecular. A biologia molecular, alm de sua relevn-
cia clnica e epidemiolgica, representa um campo em
potencial para a pesquisa na rea mdica.36
Alm desses aspectos, o estudo per se das doen-
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as parasitrias, que envolvem vetores e hospedeiros
intermedirios, muito tem contribudo para o desen-
volvimento da biologia celular e molecular, assim
como para a imunologia.37
Por outro lado, a aquisio de conhecimentos
na rea de biologia molecular gerou, em 1973, por
Herbert Boyer e Stanley Cohen, novas possibilidades
para a construo do DNA recombinante, que, teorica-
mente, leva probabilidade de criao de novas for-
mas de vida.38
A seguir, faz-se breve reviso dos conceitos bsi-
cos e das aplicaes das tcnicas de biologia molecu-
lar, com exemplos prticos laboratoriais envolvendo
resultados parciais de projetos das linhas de pesquisa
Sero apresentadas as tcnicas de biologia molecular
rotineiramente usadas para o diagnstico do agente
etiolgico presente no tecido do hospedeiro e tam-
bm aquelas que buscam identificao de protenas e
de polimorfismos genticos do microorganismo ou
do hospedeiro, que podem ou no estar relacionados
susceptibilidade ou resistncia do hospedeiro frente
ao parasito. Para que sejam sedimentados os concei-
tos aqui descritos, sugere-se consultar o livro DNA
Segredos e Mistrios38 e, para mais detalhes, o livro
Molecular biology of the cell.39
Conceitos bsicos sobre a clula
As clulas so compostas por ncleo e citoplas-
ma. No ncleo, est contido o material gentico das
clulas; no citoplasma, as organelas responsveis por
suas funes e pela sntese de protenas, que ocorre
nos ribossomos.
Os organismos unicelulares, chamados de pro-
cariotos, como as bactrias, vrus e algumas algas, no
apresentam membrana nuclear separando o contedo
nuclear do citoplasma. As plantas e animais possuem
um ncleo verdadeiro, organismos eucariotos, onde se
situa o cdigo gentico, ou DNA. As regras gerais que
regem a informao gentica se aplicam a todos os
organismos vivos, quer procariotos, quer eucariotos.
As bactrias representam as clulas mais sim-
ples, posto que os vrus, que so ainda mais simples
do que as bactrias, no podem sobreviver de forma
independente. Os vrus so formados basicamente
pelas molculas de DNA ou de cido ribonuclico
(RNA), empacotadas em uma cpsula de protena. Os
vrus mais estudados so os bacterifagos, ou fagos,
que se perpetuam ao infectar uma bactria.
Vrus, bactrias e qualquer outra forma de
vida utilizam o cdigo gentico para a expresso pro-
tica. Da mesma forma que uma bactria aceita a
infeco de um vrus, permitindo a duplicao do
DNA viral e a sntese das protenas codificadas, um
gene humano pode tambm ser introduzido em uma
bactria, resultando a produo de protena em gran-
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de quantidade, configurando a engenharia gentica.

Assim, a estrutura da molcula DNA semelhante nos
vrus, bactrias, plantas e seres humanos.
Um gene representa a unidade codificadora de
uma protena. O DNA, molcula composta por vrios
genes, empacotado por protenas histonas , for-
mando os nucleossomos. Cada cromossomo forma-
do por nica molcula de DNA de dupla hlice super-
condensada com protenas. Nas clulas humanas exis-
tem 44 cromossomos autossmicos (22 pares) e dois
cromossomos sexuais (XX na mulher e XY no
homem). Os cromossomos humanos arranjados aos
pares constituem o caritipo humano.
Os organismos multicelulares se desenvolvem a
partir de uma nica clula, o zigoto. Como as clulas
se multiplicam por mitose, todas as clulas tm o
mesmo nmero de cromossomos e de genes, e a
mesma informao gentica da clula inicial, salvo as
mutaes que podem ocorrer no decorrer do proces-
so. Assim, quando se pretende examinar um gene,
isso pode ser feito em amostra de qualquer tecido. O
que diferencia um tecido do outro a expresso de
determinados genes. Portanto, quando se quer verifi- FIGURA 1: Molcula de DNA. O grupo fosfato liga o carbono 3 do
car a expresso de um determinado gene, busca-se o acar de um nucleotdeo ao carbono 5do acar do nucleotdeo
RNA no tecido que alvo de estudo. seguinte. Portanto, haver sempre uma das pontas da cadeia com
um grupo fosfato livre no carbono 5da desoxirribose (terminal 5)
e outra ponta constituda por um grupo OH livre ligado ao carbono
Conceitos bsicos sobre cdigo gentico e snte- 3 (terminal 3). A ligao de duas cadeias de nucleotdeos feita
se de protenas por pontes de hidrognio formando a dupla hlice do DNA.
O DNA molcula de carga negativa, compos- A ligao entre os nucleotdeos adenina e timina se faz por duas
ta por nucleotdeos. Cada nucleotdeo formado por pontes de hidrognio, enquanto a ligao entre citosina e guanina,
por trs pontes de hidrognio
um grupo fosfato, um acar (desoxirribose) e uma
base nitrogenada. Fonte: http://images.google.com.br/
O grupo fosfato, de carga negativa, liga-se ao
tomo carbono de nmero 5 do acar. As bases
nitrogenadas so formadas de anis de carbono e
nitrognio. As bases citosina (C) e timina (T) so for-
madas por um anel, enquanto as bases adenina (A) e hlice volta a complementar a outra pelo pareamento
guanina (G), por dois anis de carbono e nitrognio. das bases nitrogenadas.
A ligao de uma base ao carbono 1 do acar forma O DNA composto por seqncias de bases
o nucleotdeo completo (Figura 1). nitrogenadas que so transcritas ao RNA (xons) e por
O acar e o fosfato so invariveis nos seqncias no transcritas (ntrons).
nucleotdeos, representando a estrutura do DNA. A O RNA assemelha-se ao DNA, com a diferena
informao para a sntese das protenas est contida de que o acar ribose, que apresenta um grupo OH
na seqncia das bases nitrogenadas. ligado ao carbono 2 em vez de um tomo de hidrog-
Por meio de uma ligao fosfodister os nio, como na desoxirribose. Outra diferena, que
nucleotdeos formam a cadeia do DNA. A molcula do formado por nica hlice, embora possa dobrar-se e
DNA composta por duas cadeias de nucleotdeos, formar cadeia dupla entre as bases complementares.
que se ligam fracamente por pontes de hidrognio Em relao s bases, a uracila (U) no RNA substitui a
entre as bases nitrogenadas, constituindo a dupla hli- timina do DNA.
ce do DNA. Uma base A sempre se liga a uma T, Existem trs tipos de RNA: o RNA mensageiro
enquanto uma C sempre se liga a uma G (Figura 1). (mRNA), que carrega a informao do cdigo genti-
Em situaes experimentais, aumentando-se a tempe- co do DNA nuclear ao citoplasma; o RNA ribossmico
ratura, as pontes de hidrognio se rompem facilmen- (rRNA), que se liga s protenas para compor os ribos-
te, constituindo o processo de desnaturao. Quando somos; e o RNA transportador (tRNA), que carrega os
a temperatura esfria, ocorre a hibridizao, e uma aminocidos no citoplasma para formar a cadeia poli-

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peptdica protica.
Quando ocorre a informao para a expresso
gentica, a sntese de protenas se faz em trs
etapas:
1- Transcrio: Inicialmente, h formao de
uma molcula de RNA nuclear (hnRNA), cuja fita com-
plementar corresponde exatamente fita do DNA, res-
peitando a ligao A-U e C-G. Ocorre na regio pro-
motora do DNA, onde a enzima RNA polimerase d
incio a seu processo.
2- Processamento do RNA (ou splicing): Ainda
dentro do ncleo, as seqncias correspondentes aos
ntrons so removidas, sendo adicionadas a molcula
CAP (7-metil-guanosina) no terminal 5 e a cauda poli-
A no terminal 3, constituindo-se o mRNA.
3- Traduo: Uma vez no citoplasma, o mRNA
servir de molde para o tRNA, quando no ribossomo.
Para cada cdon (trs bases), um aminocido acres-
centado cadeia polipeptdica.
As protenas so formadas pela ligao dos ami-
nocidos, que podem ser de 20 tipos. Todo aminoci-
do composto por uma estrutura bsica: um tomo
de carbono central ligado a um grupo amino, a um
grupo carboxila e a um tomo de hidrognio. O que
diferencia um aminocido do outro o quarto grupo
lateral ligado ao carbono. O grupo amino tem carga
positiva. e o grupo carboxila tem carga negativa.
Portanto, a carga final do aminocido depender da
carga do grupamento lateral.
Para a sntese de uma protena, o grupo car-
boxila de um aminocido reage com o grupo amino
do outro, com a eliminao de uma molcula de
gua, formando a cadeia polipeptdica. Uma prote-
na pode ter uma ou mais cadeias polipeptdicas.
Depois que os aminocidos so ligados de forma
linear (estrutura primria), a cadeia peptdica
dobra-se sobre si mesma, formando a estrutura
espacial ou terciria da protena. A interao dos
diferentes grupamentos laterais de cada aminoci-
do que determina a estrutura espacial de uma
protena e, portanto, sua funo. Se ocorrer uma
mutao pontual na seqncia de bases do DNA, o
cdon gerado pode determinar a insero de um
aminocido trocado na cadeia polipeptdica. Esse
aminocido distinto pode resultar ou no numa
protena no funcional.
As protenas podem ser classificadas em:
estruturais, quando so responsveis pela estrutura
celular, como as protenas que compem a membrana
celular, e pela manuteno das funes celulares; anti-
corpos, responsveis pela defesa do organismo contra
elementos estranhos; de transporte celular, protenas
responsveis pelo transporte de molculas, como as
protenas de membrana com a funo de troca de ons
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para o meio intra ou extracelular; e enzimas, respon-
sveis por todas as reaes qumicas da clula.
A caracterstica mais importante das enzimas
sua especificidade cada enzima s catalisa um tipo
de reao qumica, atuando apenas sobre determina-
do substrato. Porm, como no participa intrinseca-
mente da reao, uma mesma molcula pode atuar
inmeras vezes.
As enzimas que muito interessam biologia
molecular so denominadas enzimas de restrio ou
endonucleases e foram descobertas em 1970. So
produzidas naturalmente em bactrias para proteg-
las contra a introduo do material gentico viral. A
bactria reconhece o DNA viral como estranho e des-
tri a molcula utilizando as enzimas de restrio,
que a cortam em vrios fragmentos, restringindo a
replicao viral.
Essas enzimas so especficas para determina-
dos stios de restrio, por isso no digerem o DNA da
prpria bactria. Por outro lado, quando presentes no
DNA da bactria, esses stios de restrio so protegi-
dos por um grupamento metil (CH3), que adiciona-
do molcula do DNA pela ao da enzima metilase.
Muitas vezes, os genes que codificam a enzima de res-
trio e a metilase encontram-se em posio adjacen-
te no genoma.
So conhecidas aproximadamente 900
enzimas de restrio, isoladas de mais de 230 esp-
cies. Essas enzimas so designadas de acordo com
o microorganismo do qual foram extradas. As trs
primeiras letras se referem ao nome cientfico do
microorganismo, portanto devem ser escritas em
itlico. A letra seguinte se refere linhagem da bac-
tria, e o nmero romano designa a ordem da des-
coberta da enzima. Por exemplo, EcoRI a enzima
extrada de Escherichia coli, linhagem R, sendo a
primeira enzima de restrio identificada nessa
bactria.
Com a possibilidade de serem cortados frag-
mentos de DNA de uma mesma espcie ou de esp-
cies diferentes e de serem ligados numa segunda
etapa, surge o DNA recombinante.
TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
1. PCR, PCR-RFLP e seqenciamento do DNA
Para as trs tcnicas PCR, PCR-RFLP e
seqenciamento utiliza-se DNA extrado da amos-
tra a ser analisada, quer seja sangue, clulas ou
tecido. A extrao e a purificao do DNA de uma
dada amostra podem ser feitas por mtodos labora-
toriais caseiros ou por kits comerciais. Sugere-se
consultar o livro Practical skills in biomolecular
sciences.40
 Extrao e purificao do DNA
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FIGURA 2: Extrao de DNA de sangue perifrico pelo mtodo Salting out
A extrao do DNA genmico do sangue total
perifrico, conhecida como salting-out, tcnica sim-
ples, cujo esquema pode ser visto na figura 2.
Se existe a inteno de se extrair DNA de clu-
las mononucleares perifricas, pode ser utilizado o
reagente Ficoll-Hypaque, que tem o inconveniente de
no ser barato. Esse mtodo muito utilizado em
experimentos que visam ao estudo da resposta imune-
celular in vitro; por exemplo, desafiando-se as clulas
mononucleares, mantidas em meios de cultura, con-
tra determinado antgeno, pode-se estudar a blastog-
nese, assim como a expresso de citocinas no sobre-
nadante por Elisa, ou por mRNA extrado das clulas.
Alm do sangue perifrico, outras amostras
podem ser utilizadas, como vrus, bactria, fungos,41
clulas vegetais ou animais. Para estudar as clulas
mantidas em meio de cultura, torna-se necessrio
separ-las por centrifugao. Mais comumente, a
inteno a de extrair DNA de fragmentos ou bipsias
do tecido, que podem ser mecanicamente homoge-
neizados previamente. As amostras de tecido podem
ser oriundas de animais,42 de insetos,43 etc.
A purificao e, por conseguinte, a quantifica-
o do DNA de amostra congelada mais vantajosa
em comparao com a amostra fixada em formol e
conservada em blocos de parafina. Porm, existem
191
protocolos eficientes para a obteno de DNA dessas
amostras44 e at de amostras citolgicas coradas em
lminas.45
Mais recentemente, tem-se utilizado amostra
de tecido coletada na forma de imprint em papel de
filtro e no momento da feitura da bipsia para exame
anatomopatolgico. Tambm se tm utilizado amos-
tras de linfa coletadas na forma de imprint em papel
de filtro no momento em que se coleta amostra para
baciloscopia, das regies dos lbulos de orelhas, coto-
velos, joelhos e de leso cutnea, em paciente com
suspeita clnica de hansenase. O papel de filtro inse-
rido em envelope contendo os dados do paciente,
podendo ser estocado em temperatura ambiente, se a
inteno extrair somente DNA. A grande vantagem
reside no envio dessas amostras pelo correio para
laboratrios de biologia molecular.
PCR (polymerase chain reaction)

Trata-se de tcnica descrita por Kary Mullis
nos anos 80, que lhe rendeu o prmio Nobel de
Qumica em 1993, e cujo princpio se baseia na snte-
se de milhares de cpias de DNA in vitro catalisada
pela Taq polimerase. Essa enzima isolada da bactria
Thermus aquaticus que, por viver na natureza em
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fontes de gua quente, evoluiu para sobreviver em
altas temperaturas mantm-se estvel depois de
repetidas exposies a 94oC.
A PCR compreende trs passos:
1- Desnaturao do DNA: a ruptura das pontes
de hidrognio, que ligam a dupla hlice do DNA,
feita em altas temperaturas, de 94oC a 98oC, por 5min.
2- Anelamento dos primers: esse passo ocorre
quando a temperatura reduzida entre 37oC e 65oC,
por 30seg.
3- Extenso ou sntese do DNA: esse passo se d
em intervalo de tempo que varia de dois a 5min, a
72oC, temperatura ideal para que a Taq polimerase
atue, havendo incorporao das bases nitrogenadas s
fitas copiadas.
Esse ciclo repetido de 25 a 35 vezes, sendo
que a partir do segundo ciclo, o tempo de desnatura-
o pode ser reduzido a 30seg.
Uma vez obtido o produto de DNA amplifica-
do, ele pode ser observado em gel de agarose ou de
poliacrilamida, atravs da eletroforese, verificando-se
o tamanho da banda esperada. Como o DNA tem
carga negativa, devido ao cido fosfrico, as amostras
iro migrar do plo negativo (ctodo) para o plo
positivo (nodo).
A agarose permite a separao de fragmentos
de 200pb a 50kb. Quanto menor a concentrao de
agarose (0,3%), menor a resistncia migrao da
molcula de DNA, facilitando, portanto, a migrao de
FIGURA 3: Extrao de RNA pelo mtodo do trizol
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fragmentos maiores. Por outro lado, para fragmentos
pequenos de DNA, torna-se necessrio aumentar a
concentrao de agarose (2% ou mais). Para frag-
mentos menores, at 1000pb, o gel de acrilamida
melhor, sendo ideal para produtos de seqenciamen-
to, permitindo a distino de fragmentos que diferem
em um par de bases.
Para o DNA ser visualizado no gel de agarose,
torna-se necessria a incubao do gel com um coran-
te fluorescente, o brometo de etdeo, cujas molculas
se intercalam entre os nucleotdeos da dupla hlice,
tornando-se fluorescente radiao ultravioleta.
Existem outros corantes, que no so txicos como o
brometo de etdeo, mas so mais dispendiosos. O gel
de poliacrilamida fixado e corado pela prata.
Para se observar o tamanho do fragmento
amplificado no gel de agarose ou de acrilamida, usa-
se um marcador de DNA com peso molecular conhe-
cido. Um comumente utilizado o DNA do fago lamb-
da digerido com a enzima de restrio HindIII. Os
fragmentos digeridos possuem peso molecular prede-
terminado, podendo ser vistos no gel como bandas.
Para se comprovar se a banda correta, isto ,
se o produto amplificado o esperado, pode ser feita
confirmao: a) transferindo-se o DNA do gel para uma
membrana de nitrocelulose pelo mtodo de Southern,
com posterior hibridizao com sonda complementar;
b) digerindo-se o produto da PCR com enzima de res-
trio; ou c) seqenciando-se o produto da PCR.
 PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length
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FIGURA 4: Extrao de DNA pelo mtodo trizol
polymorphism)
Esse mtodo bastante til quando se preten-
de confirmar determinado fragmento amplificado por
PCR. Conhecendo-se a seqncia amplificada, existem
sites que fornecem os stios de restrio daquele frag-
mento com as enzimas correspondentes
(http://www.neb.com/nebecomm/default.asp). O ideal
que se tenha um nico stio de restrio para deter-
minada enzima. Se as enzimas apresentarem mais que
um stio de restrio, deve-se optar por aquela que
corte o fragmento em outros fragmentos com pesos
moleculares distintos, e tambm que no sejam frag-
mentos to pequenos.
 Seqenciamento de DNA
O seqenciamento de DNA foi descrito em
1977 por Walter Gilbert e Fred Sanger, que dividiram
o prmio Nobel de qumica em 1980.
O seqenciamento do produto da PCR, ou da
banda de DNA eluda do gel de agarose, empregando-
se kits comerciais, utilizado para a confirmao da
PCR ou quando se est diante de um fragmento ampli-
ficado ainda desconhecido.
O seqenciamento compreende nova PCR com
o primer sense ou anti-sense; portanto, haver ampli-
ficao de uma cadeia simples de DNA. Os nucleot-
deos incorporados so dideoxinucleotdeos (ddNTPs)
fluorescentes, cada um com uma cor diferente, anlo-
gos aos nucleotdeos usuais, mas que impedem a pro-
193
gresso da sntese, pois na posio 3 do carbono do
acar aparece um hidrognio no lugar do grupo OH.
Assim, cada vez que um dideoxi incorporado, a rea-
o interrompida, e o seqenciador automtico faz
a leitura daquela base marcada.
Uma vez obtida, a seqncia do DNA compa-
rada com seqncias j depositadas no GeneBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e, caso no seja
encontrada, pode ser depositada com sua autoria.
2. RT-PCR (reverse transcription-PCR)
A RT-PCR utilizada quando se quer verificar a
expresso de determinado gene, por exemplo, a
expresso de genes de citocinas em amostras de teci-
dos.46 Para tal, torna-se necessria a extrao de RNA.
Cada clula contm cerca de 10pg de RNA,
sendo 80-85% de rRNA, 10-15% de tRNA e 1-5% de
mRNA. Enquanto rRNA e tRNA so de pequeno tama-
nho, o mRNA heterogneo e apresenta em sua
cadeia centenas a milhares de nucleotdeos. O RNA
mais difcil de ser purificado, comparado ao DNA,
devido fcil degradao durante o processo de extra-
o atribuda a ribonucleases contaminantes, e tam-
bm porque o tratamento rigoroso para separ-lo das
protenas resulta na fragmentao de sua cadeia.
Quando se quer extrair RNA de determinada
amostra, pode ser usado o mtodo fenol-clorofrmio
ou o mtodo do trizol. Este ltimo reagente permite a
extrao inicial do RNA, seguida pela extrao de DNA
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e de protenas de uma mesma amostra (Figuras 3-5).
Mais recentemente, tem sido extrado RNA de
apenas uma clula, empregando-se a tcnica de
microdisseco a laser.47
O mtodo da RT-PCR consiste na combinao
da tcnica de transcriptase reversa com a PCR, envol-
vendo trs etapas:
1- extrao do mRNA;
2- sntese do cDNA, fita complementar do
mRNA, pela enzima transcriptase reversa;
3- amplificao do DNA pela Tac polimerase.
Algumas DNAs polimerases estveis, por exem-
plo a enzima rTth, podem utilizar mRNA como fita
molde para a sntese de cDNA, permitindo que o
mtodo completo seja feito em tubo nico.
3. Eletroforese de protenas Immunoblotting
A eletroforese baseia-se na separao de
molculas com cargas eltricas distintas em um
campo eltrico. A corrida eletrofortica depender do
tamanho da molcula, da carga eltrica dos aminoci-
dos e do pH do buffer.
A eletroforese de protenas em gel de poliacri-
lamida (Page) a mais utilizada na anlise de prote-
nas. O gel de poliacrilamida formado por monme-
ros de acrilamida, cujas cadeias se interligam com
N,N-metileno bisacrilamida (bis), com formao de
polmeros de acrilamida. Aps a corrida eletrofortica
com amostras de protenas em estudo, o gel deve ser
fixado com cido tricloroactico e corado com prata
Figura 5: Extrao de protenas pelo mtodo trizol
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ou Coumassie Blue, sendo que o mtodo pela prata
mostra sensibilidade de cinco a 200 vezes maior.
O termo blotting refere-se transferncia das
fraes proticas contidas no gel de poliacrilamida
para uma membrana de nitrocelulose (Western blot-
ting). A utilizao de anticorpos marcados contra
determinada protena recebe o nome de immunoblot-
ting.
Para esse processo, inicialmente tem-se que
obter a protena em estudo (ver extrao de protenas
pelo mtodo trizol), o gel de poliacrilamida, buffer
apropriado e o aparelho de eletroforese vertical. Faz-
se o gel em duplicata. Um deles corado para visuali-
zao das bandas proticas, e o outro transferido
para membrana de nitrocelulose, utilizando-se um
aparelho de transferncia de protenas.
BIOLOGIA CELULAR APLICADA AO ESTUDO DE
DERMATOSES TROPICAIS
Leishmaniose tegumentar americana
Justifica-se a utilizao da PCR para o diagnsti-
co etiolgico da LTA pela baixa porcentagem de acha-
do do parasito na bipsia de pele, em especial na
forma mucosa. Levantamento realizado na regio nor-
deste do Estado de So Paulo demonstrou aproxima-
damente 55% de identificao do parasito na bipsia,
comparada a 85-90% na PCR.48,49
Quando se trata da forma mucosa, a porcenta-
gem do encontro do parasito na bipsia ainda
menor, reforando o emprego da PCR para seu diag-
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Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais 195

nstico.48-51 to procarioto.61
H vrios pares de primers descritos na literatu- Alguns resultados de PCR e de PCR-RFLP para
ra para o diagnstico molecular das leishmanioses.48-51 identificao de DNA de leishmnias em amostras de
Tem-se a alternativa de uso de primers que amplificam pele ou de mucosa so mostrados nas figuras 6-8.48,52,55
seqncias especficas de espcies de leishmnias48 ou
primers que amplificam seqncias comuns a todas as Hansenase
espcies. Neste ltimo caso, existe a opo do uso de A despeito da diminuio de casos de hansena-
primers que amplificam seqncia do DNA do minicr- se registrados, o nmero de casos novos diagnostica-
culo do cinetoplasto (kDNA), comum a todas espcies dos ainda permanece inalterado, e o diagnstico con-
de leishmnia.49-51
A utilizao de enzimas de restrio para deter-
minar a espcie da leishmnia tem sido muito descri-
ta na literatura, sendo mtodo mais barato e mais rpi-
do do que o seqenciamento do produto da PCR.49,52
Com a utilizao da PCR-RFLP, identificou-se a espcie
L. (L.) amazonensis na forma mucosa da LTA na regio
de Ribeiro Preto (SP).53
Em relao amostra a ser estudada para o
diagnstico da LTA, tem-se dado preferncia a mto-
dos de coleta no invasivos, como a escarificao da
borda da leso54 ou coleta de amostra em papel de fil-
tro, seguida pela extrao do DNA.55 Ultimamente,
tem-se utilizado o eludo da amostra, coletada em
papel de filtro na forma de imprint, diretamente na
PCR, seguida da confirmao por restrio enzimtica,
com resultados comparveis extrao do DNA da
bipsia de pele ou de mucosa de paciente com LTA.56
A PCR para pesquisa do parasito tambm pode FIGURA 6: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com amostras man-
tidas em cultura, utilizando-se par de primers especfico para kDNA,
ser aplicada ao flebtomo,43 assim como a espcie que amplifica fragmento de 120pb, comum a todas as leishmnias
identificada em amostras humanas pode estar relacio-
nada resposta teraputica da LTA.57 Colunas: 1. L. (V.) braziliensis (Lbb. 2903); 2. L. (L.) amazonensis
A manifestao clnica das leishmanioses depen- (IFLA/BR/67/PH8); 3. L. (L.) chagasi (LV 9.3); 4. amostra de DNA extrado
de sangue de co com calazar; 5: Trypanosoma cruzi; 6. PM 100pb.
de da trade: espcie do parasito-vetor-hospedeiro. Observar amplicon de 120pb para todas as amostras, com exceo da cul-
Entre os fatores genticos descritos no hospedeiro, tura de T. cruzi, confirmando a especificidade dos primers para
relacionados susceptibilidade e resistncia a parasi- Leishmania spp.. Observe neste gel que est havendo consumo quase
tos, tem-se o gene NRAMP1, que expressa uma prote- completo da concentrao de primers utilizada nas reaes (setas).

na de transporte de membrana. A protena Nramp1

(natural resistance-associated macrophage protein)
localiza-se na membrana de lisossomos de macrfagos
e tem como funo a troca de ons dos meios intrace-
lular e extracelular, estando relacionada resposta
imune do hospedeiro.58 Assim, procuraram-se polimor-
fismos do gene que expressa a protena Nramp1 pelo
mtodo PCR-RFLP em amostra populacional da regio
nordeste do Estado de So Paulo. Os resultados mos-
traram que o alelo C do polimorfismo 274C/T est rela-
cionado proteo para o desenvolvimento da LTA,
enquanto o gentipo TT do polimorfismo 823C/T
mostrou-se associado forma mucosa da LTA.59 FIGURA 7: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com amostras de
DNA de pacientes com suspeita clnica de LTA: 541 e 712 (i:
Em relao ao parasito, desde a descrio de imprint; b: bipsia; s: sangue). Utilizou-se par de primers especfi-
seu genoma, as espcies vm sendo comparadas para co para kDNA de leishmnias, cujo amplicon de 120pb. (-): cont-
se encontrar DNA-alvo que tenha potencial para uso role negativo, sem adio de DNA. Comparar os resultados com as
teraputico ou em vacinas.60 O DNA responsvel pela amostras de leishmnias mantidas em cultura. A PCR da amostra
541i positiva. Observe o resto de primers (setas). A PCR da
expresso da enzima topoisomerase I tem sido consi- amostra 712i duvidosa, pois o resto de primers maior do que a
derado molcula promissora no tratamento do parasi- banda de 120pb

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do de um gene MntH do bacilo M. leprae em amos-

tras de pacientes com hansenase.
As figuras 9 e 10 mostram resultados de PCR
com primers especficos para M. leprae em amostras
de tecido,66 assim como a amplificao do gene MntH
do bacilo M. leprae em DNA extrado de bipsias de
pacientes com hansenase.
Em relao ao hospedeiro, buscam-se polimor-

FIGURA 8: Amostras na forma de imprint de pacientes com suspeita

clnica de LTA. A. Gel de agarose 1,5%. Colunas 7 e 8 representam
os controles positivos para LTA (PCR com amostras de culturas de
L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis). Colunas 1, 4, 5: amostras
positivas; 3, 6: negativas; 2: PCR duvidosa, com amplificao
inespecfica, entre 200 e 300pb; 8: PM 100pb. B. Gel de acrilamida
10%. Padro enzimtico dos produtos das PCRs mostrados no gel
de agarose digeridos com a enzima BsrI esquerda do PM 100pb, e
com a HaeIII, direita. Houve confirmao da negatividade das
PCRs para LTA nas amostras 2, 3, 6. Observar os padres de
restrio, comparando os resultados das amostras 4 e 5 com as
amostras de leishmnias mantidas em cultura (setas). C. seqencia-
mento do produto da PCR da amostra 4, com primers sense e anti- FIGURA 9: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com primers
sense, confirmando tratar-se de LTA por L. (V.) braziliensis, quando P2/P366 e DNA extrado de amostras de pele de pacientes com
acessado o GeneBank hansenase forma multibacilar (204, 220, 226, 544, 438) e com diag-
nstico a esclarecer (541, 771). As PCRs das amostras 541 e 771 so
negativas, assim como a amostra de M. tuberculosis (M. Tb) manti-
da em cultura, confirmando a especificidade dos primers para M.
leprae. Observar as PCRs positivas para as amostras 544 e 438, alm
tinua sendo essencialmente clnico em vrias regies do uso completo de primers na reao (setas). As PCRs das
do pas. Em centros maiores, tm-se mtodos subsidi- amostras 204, 220 e 226 resultaram banda fraca, provavelmente
rios auxiliares ao diagnstico, como a baciloscopia, a devido ao baixo nmero de cpias, que precisam ser confirmadas.
Para tal, pode ser realizada nova PCR com o produto da PCR, ou
pesquisa do bacilo na bipsia e o mtodo sorolgico real time PCR, ou tentar o seqenciamento dessas amostras. C
que pesquisa anticorpos antiPGL1.25,62 O impasse resi- (-): controle negativo, sem adio de DNA
de nos doentes paucibacilares, quando no se encon-
tra o bacilo nas amostras pesquisadas, assim como a
pesquisa de antiPGL1 torna-se ineficaz nessa forma da
hansenase. Assim, ainda se buscam antgenos especfi-
cos para o imunodiagnstico da hansenase.63
A biologia molecular tem-se mostrado til para
o diagnstico etiolgico nas formas paucibacilares,
nos contactantes, e quando h suspeita de recidiva.
Vrios so os pares de primers utilizados no diagns-
tico por PCR, e mtodos moleculares tm sido compa-
rados.64,65
Quando h suspeita de recidiva, tem-se que
saber se o bacilo vivel, e, para tal, no basta o acha-
do de DNA nas amostras, sendo necessrio o reconhe-
cimento da expresso gnica, sendo a RT-PCR o mto-
do ideal.66
Como o bacilo no cultivvel, a descrio do
genoma de M. leprae67 vem permitindo o estudo FIGURA 10: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com DNA extra-
do de amostras de pele (ver Figura 9). As PCRs foram realizadas
molecular do bacilo em busca de genes-alvo para a com dois pares de primers especficos para o gene MntH do bacilo
teraputica. Assim, encontra-se em andamento o estu- M. leprae, que amplificam seqncias de 336 e de 1.136pb

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Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais
fismos genticos que possam estar implicados na
apresentao clnica da hansenase. Nesse sentido,
tem a autora estudado o gene que expressa a 2GP1
(-2-glicoprotena 1) ou apoliprotena H em amostra
populacional com hansenase.
CONSIDERAES FINAIS
O arsenal de tcnicas de biologia molecular tem
crescido consideravelmente, assim como os aparelhos
desenhados para sua aplicao. Para acompanhar o
desenvolvimento da cincia molecular, os conceitos
bsicos devem ser aprofundados no dia-a-dia.
Os dermatologistas com atividades essencial-
mente clnicas devem tambm inteirar-se do assunto,
haja vista que muitos laboratrios de anlises clnicas
j empregam em sua rotina tcnicas de biologia mole-
cular para diagnstico.
Em relao pesquisa em dermatoses tropicais,
muito se tem adquirido com a utilizao da biologia
molecular, sendo que o objetivo mais atual se encon-
tra dirigido para o desenvolvimento de frmacos e de
vacinas para seu controle.
AGRADECIMENTOS
tcnica do Laboratrio de Biologia
Molecular, FMRP-USP, Sandra Silva Rodrigues dos
Santos e aos alunos de ps-graduao Andrezza
Furquim da Cruz, Maria Jos Brochado e Olvia
Kim, pelo apoio tcnico e reviso do manuscrito.
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ENDEREO PARA CORRESPONDNCIA / MAILING ADDRESS:
Ana Maria Roselino
Diviso de Dermatologia FMRP-USP
Av. Bandeirantes 3900
14049 900 Ribeiro Preto SP
Fax: +55.16.36336695
E-mail: amfrosel@fmrp.usp.br
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200 Roselino AM
1. Em relao s doenas tropicais, assinale a
resposta INCORRETA:
a) Elas recebem esse nome porque incidem em
pases tropicais e subtropicais, e esto rela-
cionadas pobreza.
b) As doenas negligenciadas, includas nas
doenas tropicais, agravam a pobreza.
c) A temperatura elevada e a umidade nos trpi-
cos contribuem para o controle das epidemias.
d) As doenas tropicais podem ser relatadas,
segundo o agente etiolgico, como virais, bacteri-
anas e fngicas.
2. Em relao ao diagnstico das doenas tropicais,
assinale a resposta CORRETA:
a) As doenas tropicais, quer bacterianas, quer
fngicas, so confirmadas pelo cultivo do agente
etiolgico, incluindo as micobacterioses.
b) Quando o hospedeiro apresenta resposta
imunecelular exacerbada a determinada doena
tropical, seu agente etiolgico facilmente
encontrado ao exame histopatolgico.
c) Em algumas doenas tropicais, como nas
leishmanioses, o emprego de tcnicas de biologia
molecular facilita o diagnstico etiolgico.
d) Nas doenas tropicais, a virulncia do agente
etiolgico e a resposta imunolgica do hos-
pedeiro no influenciam a apresentao da forma
clnica da doena
3. Em relao clula, assinale a resposta CORRETA:
a) Eucarioto definido como organismo
unicelular que no apresenta membrana nuclear
separando o ncleo do citoplasma.
b) A sntese protica realizada no citoplasma,
em organelas chamadas ribossomos.
c) No organismo procarioto, o DNA se situa no
ncleo, responsvel pelo cdigo gentico.
d) A definio de um organismo procarioto ou
eucarioto reside na presena da membrana cito-
plasmtica, que separa as organelas citoplasmti-
cas do ncleo.
4. Em relao aos organismos procariotos, assinale a
resposta CORRETA:
a) Os vrus representam os organismos unicelu-
lares mais simples, possuindo DNA ou RNA
nuclear, envolto em cpsula protica.
b) As bactrias permitem que os vrus intro-
duzam seu material gentico em seu interior e,
assim, a sntese de protenas virais.
c) Os fagos so bactrias que permitem a repli-
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Questes e resultados das questes
cao viral e sua perpetuao.
d) Um gene humano pode ser introduzido no
ncleo de um vrus por meio da engenharia
gentica.
5. Nucleossomos representam genes empacotados
por protenas em uma molcula de DNA. De acordo
com o enunciado, assinale a resposta INCORRETA:
a) As protenas responsveis pelo empacotamen-
to dos genes so denominadas histonas.
b) A molcula de DNA composta por vrios
genes.
c) O cromossomo composto por vrios genes
e, por conseguinte, por vrias molculas de DNA
empacotadas por protenas.
d) Uma molcula de DNA supercondensada
por protenas, compondo um cromossomo.
6. Em relao a DNA, RNA e protenas, assinale a
resposta CORRETA:
a) A molcula de DNA formada por uma fita
simples constituda por nucleotdeos, grupamen-
to fosfato e um acar, a desoxirribose.
b) Enquanto o DNA se situa no ncleo, o RNA se
situa nas organelas citoplasmticas, em especial
no retculo endoplasmtico.
c) O cdigo gentico, ou cdon, formado por
trs bases nitrogenadas, e cada cdon incorpora
um dipeptdeo molcula da protena.
d) Um gene representa a unidade codificadora
de uma protena.
7. Quanto a DNA, RNA e protenas, assinale a
resposta INCORRETA:
a) O DNA molcula cujas seqncias de bases
nitrogenadas originaro o cdigo gentico para a
sntese protica.
b) O RNA, molcula de fita simples, responsv-
el pelo encaminhamento da informao gentica
do ncleo ao citoplasma.
c) A molcula de DNA composta por xons e
ntrons, sendo as seqncias dos ntrons tran-
scritas para o mRNA.
d) A molcula de RNA menor do que a do DNA,
pois s so transcritas seqncias especficas.
8. As protenas so formadas por aminocidos.
Assinale a resposta INCORRETA:
a) Quando duas molculas de aminocidos se
unem, o grupo carboxila de um deles se liga ao
grupo amina do outro, com eliminao de uma
molcula de gua, formando um dipeptdeo.
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Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais
b) Todos os 20 aminocidos conhecidos tm carga
eltrica negativa e, quando ligados de forma linear,
constituem a estrutura primria de uma protena.
c) A sntese de uma protena est diretamente
relacionada ao cdigo gentico. Portanto, se hou-
ver alterao de uma base no cdon, esta pode
resultar em uma protena alterada ou no.
d) Se todas as clulas humanas possuem o
mesmo cdigo gentico, todas as clulas expres-
sam protenas semelhantes.
9. Enzima uma protena. Assinale a resposta
INCORRETA:
a) Enzimas so responsveis pelas reaes
qumicas de uma clula; so especficas, atuando
sobre determinado substrato.
b) As endonucleases so enzimas de restrio
que podem cortar uma molcula de DNA em
vrios fragmentos.
c) As enzimas de restrio, produzidas no cito-
plasma viral, auxiliam a introduo do material
gentico viral em uma bactria.
d) As endonucleases so denominadas de acor-
do com o microorganismo do qual foram extra-
das; algumas suportam altas temperaturas, como
a Taq polimerase.
10. Assinale a frase INCORRETA:
a) Todas as clulas humanas possuem o mesmo
nmero de genes, portanto, a mesma informao
gentica.
b) Todas as clulas humanas expressam todos os
genes, portanto, a expresso de uma protena
pode ser estudada em qualquer clula.
c) Se todas as clulas humanas possuem o
mesmo cdigo gentico, um determinado gene
poder ser estudado em qualquer clula.
d) Todas as clulas humanas, com exceo das
clulas sexuais, possuem 46 cromossomos, con-
stituindo o caritipo.
11. A tcnica da PCR consiste na sntese in vitro de mil-
hares de cpias de DNA, catalisada pela enzima ter-
moestvel Taq polimerase. Assinale a resposta CORRETA:
a) A PCR tcnica simples, que consiste na
desnaturao das duas cadeias do DNA, seguida
pelo anelamento dos primers, e sntese do DNA,
catalisada por uma polimerase.
b) Para a tcnica da PCR, extrai-se RNA de qual-
quer clula ou tecido com o intuito de se estudar
a expresso protica.
c) A dupla hlice do DNA formada por duas
cadeias de polipeptdeos ligadas por pontes de
hidrognio.
d) A extrao de DNA para a PCR s alcanada
de amostra congelada a -70oC.
201
12. Para se realizar uma PCR, prepara-se a soluo de
reagentes, denominada mix, com o buffer, os oligonu-
cleotdeos, os primers, a amostra de DNA e a Taq
polimerase. Assinale a resposta INCORRETA:
a) Um elemento muito importante no buffer o
Mg2+, que atua como co-fator da polimerase.
b) Os primers devem ser desenhados cuidadosa-
mente, pois, quando inespecficos, se ligam a
vrios fragmentos do DNA genmico.
c) As bases A, U, C e G devem ser incorporadas
ao mix, porque a sntese do DNA depender de
sua concentrao no mix.
d) A Taq polimerase enzima isolada da bactria
Thermus aquaticos, que se mantm estvel a altas
temperaturas.
13. Assinale a resposta CORRETA:
a) Quando se quer estudar a expresso de deter-
minado gene, faz-se a extrao do RNA total da
amostra, a seguir, com a enzima transcriptase
reversa, transforma-se o RNA em cDNA, e, final-
mente, a PCR, constituindo a tcnica de RT-PCR.
b) As tcnicas de PCR e PCR-RFLP (restrio enz-
imtica) muito se prestam investigao etiolgi-
ca do agente causal em uma amostra, quer
humana, animal ou de inseto, cujos primers no
necessitam ser to especficos.
c) O seqenciamento do DNA tcnica mais dis-
pendiosa, pois depende de um seqenciador
automtico, e nada mais do que uma PCR da
PCR, originando fita dupla a ser analisada.
d) No existem tcnicas de extrao de DNA e de
RNA de uma nica amostra, tendo-se que optar
por uma das molculas a ser estudada.
14. Qual a melhor tcnica de biologia molecular para
se estudar um polimorfismo de determinado gene?
a) A PCR, sem dvida, podendo-se extrair RNA
do sangue perifrico, constituindo o RNA
genmico.
b) Se o polimorfismo j descrito, pode-se veri-
ficar na seqncia do DNA qual a enzima que
poder cortar a seqncia justamente no stio
polimrfico. Portanto, pode-se usar a PCR-RFLP.
c) Necessariamente, tem-se que proceder ao
seqenciamento do DNA aps a PCR.
d) Os polimorfismos genticos so estudados
por RT-PCR.
15. Quais as tcnicas laboratoriais para se verificar a
expresso de um gene?
a) Faz-se inicialmente a extrao de RNA total da
amostra e, a seguir, a RT-PCR com primers espec-
ficos para a seqncia do gene em estudo.
Tambm pode ser realizada hibridizao in situ,
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202 Roselino AM

com probes que se ligaro ao mRNA especfico. 18. Observe a figura abaixo e assinale a resposta
b) Pode-se buscar pela expresso protica no INCORRETA:
tecido, por exemplo, imuno-histoqumica com
anticorpo especfico contra a protena.
c) Pode-se realizar cultura das clulas que
expressam o gene em estudo, e, por Elisa, quan-
tificar a protena sintetizada no sobrenadante, ou
proceder immunoblotting com anticorpo contra
a protena.
d) Todas as respostas esto corretas.

16. Para se visualizarem os produtos de DNA ou

fraes proticas, utiliza-se a eletroforese. Assinale a
alternativa INCORRETA:
a) A eletroforese baseia-se na separao de
molculas com cargas eltricas distintas ou de
tamanhos diferentes.
b) O DNA, por ser molcula de carga negativa,
devido aos grupamentos fosfatos, migra do plo
negativo (ctodo) para o plo positivo (nodo).
c) A eletroforese com gel de acrilamida a mais Gel de acrilamida 10%. Produtos de digesto com as
utilizada para a anlise de protenas, que, em enzimas BsrI e HaeIII em amostras com suspeita clni-
geral, realizada em sistema vertical. ca de LTA. As amostras dos pacientes a a d devem ser
d) O DNA pode ser observado em gel de agarose comparadas com as amostras de leishmanias mantidas
ou de poliacrilamida, porm, para estudo de em cultura
molculas maiores, d-se preferncia ao gel de a. A amostra 3 de L. (L.) amazonensis.
acrilamida. b. A amostra 4 de L. (V.) braziliensis.
c. As amostras 1 e 2 apresentam padro de
17. Consultando a Figura 8B do texto, qual a sua restrio semelhante entre si e provavelmente so
anlise do padro de restrio enzimtico para as de L. (V.) braziliensis, porm o padro de
amostras 4 e 5? Assinale a alternativa CORRETA: restrio da BsrI no permite descartar L. (L.)
a) Ambas as amostras so de L. (V.) braziliensis, amazonensis.
comparadas s amostras de leishmanias mantidas d. Todas as amostras so de L. (V.) braziliensis.
em cultura.
b) Ambas as amostras so de L. (L.) amazonen- 19. Como voc interpreta os resultados das PCRs
sis, comparadas s amostras de leishmanias man- mostrados na figura abaixo? Assinale a resposta
tidas em cultura. INCORRETA:
c) A utilizao das enzimas de restrio BsrI e
HaeIII no se presta ao diagnstico diferencial
entre as espcies de leishmanias.
d) A enzima BsrI corta o fragmento de DNA
somente de L. (V.) brazilinsis, enquanto a HaeIII
corta somente de L. (L.) amazonensis.

Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR de amostras de

pacientes com suspeita clnica de LTA (colunas 1-10),
coletadas na forma de imprint em papel de filtro, que
devero ser comparadas ao amplicon de 120pb, obti-
do de amostra de L. (L.) amazonensis mantida em
cultura

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Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais 203

a) As amostras 2, e 4 a 8 so positivas, mas seria

importante confirmar com digesto enzimtica.
b) A amostra 1 tambm positiva, sem dvida.
c) A amostra 9 mostra rastro de DNA, mas parece
haver uma banda fraca na altura de 120pb.
d) Os restos de primers das amostras 2, e 4 a 8
se assemelham ao resto de primers da amostra
controle, reforando o resultado positivo.

20. Ainda em relao figura acima, assinale a alterna-

tiva INCORRETA:
a) Os rastros das amostras 9 e 10 provavelmente
so devidos a excesso de DNA.
b) A PCR da amostra 3 muito duvidosa, pois o
resto de primers mais intenso do que a prpria
banda de 120pb (setas).
c) Seria interessante diminuir a concentrao de
primers das reaes.
d) A concentrao de DNA total extrado do teci-
do igual para todas as amostras, j que foram
extradas usando-se o mesmo protocolo.

Gabarito
Disidrose: aspectos clnicos, etiopatognicos e
teraputicos. 2007;83(2):107-15.
1b 11 b
2a 12 c
3c 13 d
4a 14 d
5d 15 a
6b 16 b
7a 17 b
8c 18 d
9a 19 a
10 b 20 c

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