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megaterium
Javier M. Naranjo, John A. Posada, Juan C. Higuita, Carlos A. Cardona
Instituto de Biotecnologa y Agroindustria, Departamento de Ingeniera Qumica, Universidad Nacional de Colombia sede Manizales, Cra. 27 No. 64-60, Manizales, Colombia
highlights
" Polyhydroxybutyrate production from glycerol with Bacillus megaterium was evaluated.
" Polyhydroxybutyrate production at industrial conditions using glycerol was simulated.
" Polyhydroxybutyrate production costs and glycerol valorization were assessed.
Article history: En este trabajo se realizaron anlisis tcnicos y econmicos para evaluar la transformacin
Received 12 December 2012
Received in revised form 22 January 2013 del glicerol en polihidroxibutirato usando Bacillus megaterium. La produccin de PHB se
Accepted 23 January 2013 Available
online 30 January 2013
compar utilizando glicerol o glucosa como sustratos y se obtuvieron rendimientos
similares. Los costes de produccin totales para la generacin de PHB con ambos
sustratos se estimaron a escala industrial. En comparacin con la glucosa, el glicerol
Keywords:
Bacillus megaterium mostr una disminucin de 10% y 20% en los costes de produccin de PHB utilizando
Glycerol dos esquemas de separacin diferentes respectivamente. Adems, un margen de beneficio
Adaptation
PHB bioproduction del 20% en el precio de venta de PHB utilizando glicerol como sustrato dio como
Simulation process
resultado una valorizacin del 166% del glicerol bruto. En este trabajo se demuestra la
viabilidad del glicerol como materia prima para la produccin de PHB en laboratorio
(hasta un 60% de acumulacin PHB) e industrial (2.6US$/kgPHB) scales is demonstrated.
2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
0960-8524/$ - see front matter 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2013.01.129
J.M. Naranjo et al./ Bioresource Technology 133 (2013) 3844 39
y Srivastava, 2005; Mahishi et al., 2003). Los PHA pueden ser de PHB en presencia de una fuente de exceso de carbono y restriccin
producidos a partir de fuentes renovables mediante un proceso de de nitrgeno (Lpez et al. 2012). Los cultivos de reserva se cultivaron
fermentacin bajo condiciones de crecimiento restringido para a 33C en caldo nutriente y se mantuvieron a 4C despus del
nitrgeno, fsforo, azufre y / u oxgeno en presencia de una fuente de crecimiento en agar nutritivo. El cultivo de reserva adaptado al
carbono excesiva y pueden ser biocompatibles y completamente glicerol como nica fuente de carbono se mantuvo a 4C despus del
biodegradados (Steinbchel, 2001; Lee, 1996). El polihidroxibutirato crecimiento en un medio de agar formulado. Las clulas de B.
(PHB) fue el primer tipo de PHA descubierto y el ms ampliamente megaterium adaptadas se almacenaron a 80C en crio-viales de 2 ml
estudiado. PHB tiene propiedades mecnicas similares a plsticos que contenan 30% de glicerol y 70% del cultivo lquido cultivado.
convencionales como polipropileno o polietileno, pero sus costos de
produccin son ms altos que los plsticos petroqumicos. El coste total 2.2 Medios culturales
de produccin del PHB depende del microorganismo (rendimiento y
productividad), de las fuentes de carbono y nitrgeno (sustratos), de las El medio de siembra se prepar con las siguientes
condiciones de fermentacin (temperatura, aireacin, valor pH) y de los concentraciones: (NH4)2SO4, 1 g/l; KH2PO4, 1.5 g/l; Na2HPO4, 9 g/l;
procesos de recuperacin y purificacin. La fuente de carbono podra MgSO47H2O, 0.2 g/l; and 1 ml of a trace element solution composed
representar el 25-45% de los costos totales de produccin (Nath et al., by: FeSO47H2O, 10 g/l; ZnSO47H2O, 2.25 g/l; CuSO45 H2O, 1 g/l;
2008), por lo tanto, la necesidad de encontrar fuentes de carbono ms MnSO44H2O, 0.5 g/l; CaCl22H2O, 2 g/l; H3BO4, 0.23 g/l;
baratas. Los residuos agroindustriales son candidatos atractivos ya que (NH4)2Mo7O24, 0.2 g/l; y HCl, 10 ml. Las fuentes de carbono
tienen algunas de las caractersticas deseadas, es decir, bajos precios y analizadas fueron glicerol y glucosa. La fuente de carbono y el
alta disponibilidad. Adems, cuando se utilizan residuos MgSO47H2O were autoclaved separately and added aseptically to the
agroindustriales como sustratos para la produccin de PHB, se evita su medium after cooling.
disposicin final directa resolviendo as un problema ambiental. Se ha
utilizado una amplia variedad de sustratos como el suero, los materiales
lignocelulsicos y el glicerol (obtenidos de la produccin de biodiesel)
con diferentes microorganismos para mejorar los rendimientos y la
produccin de PHB (Nath et al., 2008, Koller et al., 2008, 2005 , Y, en
el caso de los autores de la presente invencin, los autores de la presente
invencin, Pantazaki et al., 2009, Kim, 2000, Silva y otros, 2004, Yu y
Stahl, 2008, Cavalheiro y otros, 2009, Bormann y Roth, 1999, Nikel et
al.
Unas variedades de microorganismos son capaces de producir PHB de
diversos desechos agroindustriales. Estos microorganismos pueden ser
cepas silvestres tales como Cupriavidus necator (Cavalheiro et al.,
2009), Methylobacterium rhodesianum (Borman et al., 1999) o
microorganismos recombinantes tales como Escherichia coli CT1061
(Nikel et al., 2008). Las cepas bacterianas Gram positivas y Gram
negativas estn en el grupo de bacterias productoras de PHB.
Actualmente, el PHB se produce a escala industrial utilizando bacterias
Gram negativas. Sin embargo, los organismos Gram negativos
contienen lipopolisacridos (LPS) que co-purifican con los PHAs e
inducen una fuerte reaccin inmunognica (Valappil et al., 2007), lo
cual es indeseable para aplicaciones biomdicas. Las bacterias Gram
positivas carecen de LPS y son potencialmente mejores fuentes de PHA
cuando se usan con fines biomdicos (Chen y Wu, 2005).
Bacillus megaterium es una bacteria formadora de esporas grampo-
positiva, estrictamente aerobia, no motil, en forma de varilla, que tiene
la capacidad de producir PHB usando glucosa o glicerol como fuentes
de carbono (Lpez et al., 2012). En este trabajo se estudi la influencia
de diferentes condiciones de fermentacin para la produccin de PHB
utilizando B. megaterium. Adems, se realiz un anlisis
tecnoeconmico de la produccin de PHB a escala industrial y se
demostr una valorizacin del glicerol bruto.
2. Mtodos
2.1 Cepas bacterianas
La cepa Bacillus megaterium utilizada en este trabajo es una cepa
silvestre aislada de los sedimentos superficiales del estuario de Baha
Blanca (Buenos Aires, Argentina) y caracterizada como productora
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2.5.1 Biomasa
2.5.2Extraccin de PHB
2.5.5Metodologa de simulacin
3. Resultados y discusin
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flujo de aire 12
Aunque el glicerol puro se ha utilizado como nica fuente de
carbono para la produccin de PHB, hay evidencia de que algunas
especies de Bacillus tienen la capacidad de producir PHB a partir de
glicerol bruto. Sindhu et al. (2011) trabaj con Bacillus sphaericus
NII 0838 y la acumulacin de PHB fue de 31% del peso seco
celular. Deepthi et al. (2011) trabaj con Bacillus firmus NII 0830 y
la acumulacin de PHB fue 53% del peso seco celular. Sin
embargo, Cavalheiro et al. (2009) demostraron que los rendimientos
de PHB y las productividades usando Cupriavidus necator se
pueden mejorar utilizando glicerol puro (una mejora del 78%).
Posada et al. (2011) verificaron que el margen de beneficio
obtenido cuando el glicerol se purific antes de la etapa de
fermentacin es mayor en comparacin con el glicerol bruto y
suministr los costes generados por las etapas de purificacin.
3.1 Experimental
aproximadamente un 10% (en comparacin con el enfoque no controlado) Thus, the purification step used for LPS depletion in the PHB produced by Gram-
negative bacteria is not necessary.
3.2 Simulacin
La simulacin del proceso es una herramienta til para tener una idea de los
costos totales de produccin en un proceso que incluye materias primas,
consumo de energa y los costos de instalacin para iniciar la produccin de un
producto deseado. El anlisis de procesos de bloques se eligi como el mejor
esquema tecnolgico para la produccin de PHB (purificacin, fermentacin,
separacin y purificacin de glicerol).
a
Uncontrolled conditions: without control of both pH and oxygen saturation.
Para la separacin del PHB producido, se consideraron dos procesos
b Controlled conditions: pH = 7, oxygen saturation = 80%, temperature = 33 C. descendentes diferentes. Para los dos diferentes Procesos de Down Stream
c
CDW = cell dry weight. (DSP), denominados DSP A (Figura 4) y DSP B (Figura 5), ambas condiciones
d P/S = product/substrate consumed. de funcionamiento utilizadas y relacin de disolventes a la fase acuosa fueron las
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mismas que las descritas por Posada et al. (2011). Sin embargo, existen algunas
diferencias en las configuraciones de separacin
Table 2
Some PHB producing microorganisms from different agroindustrial wastes.
Substrate Microorganism PHB accumulation (%) References
Fig. 3. Simplified flowsheet of the glycerol purification process up to 98% weight. E-1: evaporator I, R-1, neutralizing reactor I, cen-1: centrifuge I, D-1: decanter I, E-2: evaporator II, DC-1: Distillation
Column I.
Fig. 4. Flowsheet for PHB production from glycerol using the Down Stream Process A (DSP A). (1) Pump; (2) Sterilizer; (3) heat exchanger I; (4) fermenter; (5) heater; (6) digestor; (7) centrifuge; (8) heat
exchanger II; (9) heat exchanger III; (10) decanter I; (11) distillation column I; (12) spray drier; (13) distillation column II; (14) decanter II;
(15) mixer I; (16) mixer II.
Fig. 5. Flowsheet for PHB production from glycerol using the Down Stream Process B (DSP B) (1) pump; (2) sterilizer; (3) heat exchanger I; (4) fermenter; (5) homogenizer; (6) centrifuge I; (7) heat
exchanger II; (8) heat exchanger III; (9) extractor; (10). centrifuge II; (11) heat exchanger IV; (12) decanter; (13) distillation column; (14) spray drier;
(15) mixer. Comparison of the total PHB production costs from both glycerol and glucose with two different
downstream processes.
Table 4
Yields in the separation and purification stages using glycerol or glucose as substrates with the
DSP B DSP B
DSP A or DSP B configurations. Raw materials (US$/kg PHB) 0.2 0.2 0.7 0.7
Feature Glycerol Glucose Utilities (US$/kg PHB) 1.3 0.8 1.2 0.9
Operating labor (US$/kg PHB) 0.1 0.1 0.1 0.1
Yield DSP A (%) 98.0 97.99
Maintenance (US$/kg PHB) 0.4 0.3 0.4 0.4
DES losses in DSP A (%) 0.3 0.2 Operating charges (US$/kg PHB) 0.2 0.2 0.2 0.2
PHB purity (%) 99.9 99.9 Plant overhead (US$/kg PHB) 0.06 0.04 0.07 0.05
Yield DSP B (%) 98.9 98.9 G and A cost (US$/kg PHB) 0.3 0.2 0.3 0.3
DES* losses in DSP B (%) 0.3 0.3 Depreciation of capital (US$/kg PHB) 1.0 0.7 1.0 0.7
Total (US$/kg PHB) 3.5 2.6 3.9 3.3
Purity PHB (%) 99.9 99.9
*
DES: diethylsuccinate.
Table 5
Mismo para ambos substratos con las configuraciones DSP A mostr ms de destilacin en todos los casos requiere la definicin de las especificaciones
prdidas de dietilsuccinato (DES) cuando el glicerol fue la fuente de preliminares utilizando el mtodo de acceso directo DSTWU incluido en
carbono comparado con la glucosa. Sin embargo, el rendimiento del proceso Aspen Plus. Este mtodo utiliza el procedimiento de Winn-Underwood-
de separacin fue el mismo en ambos casos (98% aproximadamente). En Gilliland proporcionando una estimacin inicial del nmero mnimo de etapas
DSP B, los rendimientos y las prdidas de DES fueron los mismos con tericas, la relacin mnima de reflujo, la localizacin de la etapa de
ambos sustratos.Simulation procedure
alimentacin y la divisin de productos. Para realizar el clculo riguroso de
3.2.2. Procedimiento de simulacin
las columnas de destilacin, se utiliz el mdulo Rad-Frac (basado en las
ecuaciones MESH).
Los procesos de produccin de PHB se simularon utilizando Aspen Plus
(Aspen Technologies Inc., EE.UU.). Por lo tanto, el diseo de las columnas
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Valappil,S.P., Misra, S.K., Boccaccini,A.R., Keshavarz, T., Bucke, C., Roya,I., 2007.
Largescale production and efficient recovery of PHB with desirable material properties,
from the newly characterized Bacillus cereus SPV. J. Biotechnol. 132, 251258.
Wu, K.J., Lin, Y.H., Lo, Y.C., Chen, Y.C., Chen, W.M., Chang, J.S., 2011. Converting glycerol
into hydrogen, ethanol and diols with a Klebsiella sp. HE1 strain via anaerobic
fermentation. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. 42, 2025.
Yazdani, S.S., Gonzalez, R., 2007. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability
for the biofuels industry. Curr. Opin. Biotech. 18, 213219.
Yu, J., Stahl, H., 2008. Microbial utilization and biopolyester synthesis of bagasse hydrolysates.
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