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T E S I S
P R E S E N T A
Victor Hugo Lagunas Muoz
NDICE
NDICE ............................................................................................................................. i
NDICE DE FIGURAS .....................................................................................................iii
NDICE DE TABLAS ....................................................................................................... v
NOMENCLATURA ......................................................................................................... vi
1. RESUMEN .................................................................................................................. 1
2. INTRODUCCIN Y JUSTIFICACIN ......................................................................... 3
3 ANTECEDENTES ........................................................................................................ 5
3.1 Melanina ............................................................................................................ 5
3.2 Tipos de melaninas............................................................................................ 5
3.3 Enzima tirosinasa .............................................................................................. 6
3.4 Biosntesis de melanina ..................................................................................... 7
3.5 Propiedades de la melanina .............................................................................. 9
3.6 Funciones biolgicas de la melanina ............................................................... 10
3.7 Usos de la melanina ........................................................................................ 10
3.8 Procesos de sntesis de melanina ................................................................... 11
3.9 Justificacin del proyecto y preguntas relevantes en relacin al mismo .......... 12
4. OBJETIVOS DEL PROYECTO ................................................................................. 13
4.1 General ............................................................................................................ 13
4.2 Particulares...................................................................................................... 13
5. MATERIAL Y MTODOS .......................................................................................... 14
5.1 Cepas bacterianas ........................................................................................... 14
5.2 Preparacin de bancos celulares y medios de cultivo ..................................... 14
5.3 Evaluacin de cultivos ..................................................................................... 15
Monmero de Feomelanina ................................................................................... 16
5.4 Condiciones de los cultivos y parmetros estudiados ..................................... 16
5.5 Determinacin de crecimiento bacteriano........................................................ 17
5.6 Recuperacin y cuantificacin de melanina..................................................... 18
5.7 Espectro de absorcin de melanina................................................................. 18
5.8 Determinacin de glucosa ............................................................................... 19
5.9 Determinacin de L-tirosina ............................................................................. 19
ii
NDICE DE FIGURAS
NDICE DE TABLAS
NOMENCLATURA
Smbolo Definicin Unidades
Amp Ampicilina.
Cys Cistena.
DCW Peso seco de clulas (por sus gDCW/l
siglas en ingls: Dry Cellular
Weight).
DOnm Densidad ptica a determinada
longitud de onda.
E. coli Escherichia coli.
EuMel Eumelanina.
FeoMel Feomelanina.
Glc Glucosa.
IPTG Isopropil -D-tiogalactopiransido.
p Plsmido.
P Producto.
qGlc Velocidad especfica de consumo de gGlc/gDWC.h
glucosa.
QP Productividad volumtrica de gEuMel/ l.h
eumelanina.
rpm Revoluciones por minuto. 1/min
Trc Promotor hbrido que contiene la
regin regulatoria -35 de trp y la
regin correspondiente a la caja -10
del promotor lac UV5 .
Tyr L-Tirosina.
UI Unidades internacionales. molesDOPACROMO/min
X Biomasa. gDCW/l
vii
1. RESUMEN
Las melaninas son heteropolmeros polifenlicos que presentan varios colores, por
ejemplo las feomelaninas (FeoMel) de amarillo a rojizo y las eumelaninas (EuMel) de
caf a negro. Las melaninas absorben luz ultravioleta, actan como intercambiadores
catinicos, semiconductores amorfos, biopolmeros de unin a drogas, protectores de
rayos X y gama, adems proporcionan actividad antioxidante y antiviral.
Para llevar a cabo este estudio, los cultivos se realizaron en medio mnimo (M9) con
2 g/l de glucosa y 0.4 g/l de L-tirosina en fermentadores con 750 ml de medio. La
aireacin y la agitacin se mantuvieron constantes a 0.5 vvm y 600 rpm,
respectivamente. Los parmetros y niveles que se estudiaron fueron: a)
concentracin de cofactor (CuSO4: 20, 40, 80 y 400 g/ml); b) concentracin del
marcador de resistencia del plsmido (ampicilina: 100 y 200 g/ml); c) concentracin
del inductor (IPTG: 0-1 mM); d) temperatura de crecimiento y de produccin de
melanina (25-35C); y e) pH durante la etapa de produccin de melanina (5.5-8.5).
extincin de 14.8 y 13.8 cm-1 (g/l)-1 a 400 nm para la eumelanina obtenida en este
trabajo y la analtica, respectivamente.
2. INTRODUCCIN Y JUSTIFICACIN
En el laboratorio de Ingeniera de Vas Metablicas del Departamento de Ingeniera
Celular y Biocatlisis de la UNAM (Lab. IVM-DICB-UNAM), se est desarrollando un
proyecto enfocado a la produccin de molculas biolgicas de inters comercial.
Dicho proyecto pretende la optimizacin y diversificacin de las vas del metabolismo
central del carbono y una parte del mismo est centrado en la va de biosntesis de
compuestos aromticos en la bacteria Escherichia coli. El objetivo es diversificar y
optimizar la biosntesis de al menos tres metabolitos aromticos de inters comercial:
fenilalanina, catecol y melanina. Particularmente, el inters por polmeros del tipo de
la melanina ha crecido mucho en aos recientes, debido a que se han identificado
muchas propiedades fisicoqumicas y aplicaciones importantes. Las melaninas
pueden actuar como fotoprotectores, intercambiadores catinicos, agentes quelantes
y semiconductores amorfos (della-Cioppa et al., 1990; Wang et al, 2000). As mismo,
este tipo de polmeros poseen actividad antioxidante y antiviral (Wang et al, 2000).
3 ANTECEDENTES
3.1 Melanina
Las melaninas son una familia de pigmentos de colores claros a negros, los cuales
se encuentran distribuidos en animales, plantas y microorganismos (della-Cioppa,
1990), son un grupo de heteropolmeros de alto peso molecular formados
principalmente por unidades de tipo indlico. Adems representan el principal
pigmento presente en varias estructuras que constituyen la superficie de los
vertebrados (Riley, 1997). Dentro de los microorganismos que pueden sintetizar
melanina se encuentran algunas bacterias y hongos microscpicos (Aurstad y Dahle,
1972; Sadasivan y Neyra, 1987; Hoti y Balaraman, 1993; Ikeda et al., 1996). La
produccin de melaninas por microorganismos silvestres ha sido reportada en
diversas especies bacterianas del gnero Aeromonas, Mycobacterium, Micrococcus,
Bacillus, Legionella, Streptomyces, Vibrio, Proteus, Shewanella (Wang, et al., 2000),
incluyendo las rizobacterias del genero Rhizobium, Azospirillum y Azotobacter
(Castro-Sowinski et. al., 2002).
organizadas en tetrmeros (Van Gelder et. al, 1997). Bsicamente la tirosinasa tiene
tres dominios, de los cuales el dominio central contiene 2 sitios de unin a cobre,
llamados CuA y CuB. Varias secuencias conservadas estn presentes en las
tirosinasas de diferentes fuentes, como se muestran en la Figura 3.1 (Van Gelder et
al, 1997).
Susceptibles a corte
Cu A CuB In vivo e in vitro
Probable
pptido seal 170 400 470 530
Eucariotes
superiores
Rico en Cys Trans membranal
Pptido transitorio 170 370 430 600
Plantas
Rico en Cys Rico en His
50 300 390 400 600
Hongos
30 220 270
Bacterias
Figura 3.2 Modelo propuesto del sitio activo y de unin a cobre de tirosinasa de
mamfero.
9
OH
tirosinasa O CO2H
dopa
dopaquinona
-
O N H
H+
HO 2C NH 2 HO dopacromo
tirosina
HO OH
CO2H
tirosinasa
HO N + CO 2H
H EUMELANINA
OH N OH N
OH ciclodopa H H
O
DHI DHICA
OH O
tirosinasa
cisteina
dopaquinona
OH OH
HO 2C NH2
CO 2H NH2
OH N
SR
R
S
S
R
CO2H NH 2 FEOMELANINA
N
cisteindopas tricocromos
Dopaquinona OH
tirosinasa OH
dopa CO 2H
N
R
S
4.2 Particulares
1. Estandarizar mtodos para cuantificar y semi-purificar la melanina.
2. Evaluar el efecto de los siguientes parmetros, sobre las cinticas de
crecimiento y produccin de melanina: pH, temperatura, concentraciones del
cofactor (Cu), marcador de resistencia (ampicilina) e inductor (IPTG).
3. Determinar la actividad enzimtica de tirosinasa en condiciones de cultivo
selectas.
4. Maximizar la productividad y rendimiento en E. coli W3110/pTrcMutmelA en
medio mineral-glucosa para la conversin de L-tirosina en eumelanina
5. Disear e implementar una estrategia, basndose en los parmetros
estudiados para lograr concentraciones mayores a 3 g/l de eumelanina.
6. Evaluar la potencialidad de E. coli W3110/pTrcMutmelA para producir
eumelanina y feomelanina.
14
5. MATERIAL Y MTODOS
5.1 Cepas bacterianas
Las cepas utilizadas en este trabajo se presentan en la Tabla 5.1.
El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech) es un derivado del vector pkk23-2, que tiene
el promotor fuerte trc (ubicado antes de un sitio de clonacin mltiple) y el terminador
transcripcional rrnB. Todas las cepas pertenecen a la Coleccin del Laboratorio de
Ingeniera de Vas Metablicas del Departamento de Ingeniera Celular y Biocatlisis
del Instituto de Biotecnologa de la UNAM.
La composicin del medio Luria fue: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura y
5 g/l de NaCl (Sambrook et al., 1989). La composicin del medio M9 (Atlas, 1993) por
litro fue: 6 g Na2HPO4 ; 3 g KH2PO4; 1 g NH4Cl; 0.5 g NaCl; 1 ml de solucin MgSO4
7H2O 1M;1 ml de solucin CaCl2 0.1M; 1 ml de solucin tiamina 1mg/ml; y 10 ml de
solucin de glucosa 20%, es decir a una concentracin inicial de glucosa de 2 g/l (a
menos que se indique otra cosa). Una vez disueltas en agua destilada, las primeras 4
sales se esterilizaron en autoclave, a 121C por 15 minutos. Las soluciones del resto
de las sales se esterilizaron por separado. La tiamina se esteriliz por filtracin (0.22
m).
Los monmeros que conforman la eumelanina son del tipo DHICA (Figura 5.1), cuyo
peso molecular aproximado es 208 g/mol (Sarna y Sealy, 1984), el de la tirosina es
181 g/mol y dado que cada molcula de tirosina da origen a una molcula de DHICA,
el rendimiento terico mximo (YEuMel/TYR) es: (208/181) = 1.15 gEuMel/gTYR.
OH
OH
CO2H
NH2 OH N
HO2C H
Tirosina
PM = 181 g/mol Monmero de eumelanina
PM = 208 g/mol
(HOOC)
S
N (COOH)
NH 2
Monmero de Feomelanina
PM = 295 g/mol
disuelto nunca fue menor al 50% (con respecto al valor de saturacin de aire). En
algunas ocasiones, tambin se llevaron a cabo cultivos en matraz de 500 ml (100 ml
de medio).
eumelanina mayores a 0.4 g/l, sta precipita y al centrifugar se acumula una cantidad
indeterminada en el paquete celular, ocasionando que el mtodo anterior no sea
confiable para cuantificar la biomasa. En estos casos la biomasa se tom como
constante, asignndole el valor que se obtena hasta concentraciones de eumelanina
menores o iguales a 0.4 g/l. Como se explica adelante, la DO400nm del sobrenadante
fue utilizada para cuantificar la melanina. En los casos requeridos, el sobrenadante
se almacen a -20C, para posteriormente analizar los productos del cultivo.
Del producto seco se tom una muestra y se solubiliz en agua a pH 10 con NaOH 6
N. Posteriormente se reajust el pH a 7 con cido clorhdrico 6 N, quedando la
melanina a una concentracin final de 0.05 g/l. Se midi la absorbencia de la
solucin a 400 nm y a otras concentraciones menores a 0.05 g/l. Con sto se obtuvo
la curva de absorbencia a 400 nm en un espectrofotmetro (Beckman DU-70,
Fullerton, CA), en funcin de la concentracin de melanina y se determin el
coeficiente de extincin de los productos obtenidos.
Para elaborar la curva patrn de tirosina se utilizaron diluciones 1:1 del medio M9 sin
glucosa con tirosina y la fase mvil antes mencionada, en las cuales las
concentraciones finales de la tirosina fueron 0, 0.01, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4 g/l
(Figura 5.2).
1.510 07
rea = 2.973x107x [L-Tirosina] + 0.067x107
r2 = 0.998
1.010 07
rea
5.010 06
0.010 -00
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
L-Tirosina (g/l)
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Preparacin de un banco de clulas
La aparicin de variantes celulares con morfologa diferente y con un nivel reducido
de expresin de protenas heterlogas, o con inestabilidad segregacional y/o
estructural de plsmidos, es un fenmeno observado frecuentemente con
microorganismos recombinantes. Con el propsito de reducir stas variaciones se
recurre a la obtencin de cepas con informacin gentica integrada en cromosoma
o, como en el presente trabajo, al uso de vectores que se disearon para reducir la
inestabilidad de los mismos. pTrc99A es un vector de mediano nmero de copias
(30), en el cual la expresin de los genes est controlada por el promotor artificial trc
(Amann et al., 1988). trc es un promotor fuerte e hbrido, ya que combina la regin
35 del promotor de trp y la regin 10 del promotor de lacUV5, el cual es regulado
por el operador lacO. Adems, pTrc99A contiene: un sitio de clonacin mltiple
(secuencias de ADN que son reconocidas por varias enzimas de restriccin, las
cuales permiten que se puedan insertar genes, mediante cortes y ligaciones de
genes con relativa facilidad); el gen que codifica para la protena represora lacq (que
lo hace inducible por Lactosa o IPTG); el gen que le confiere resistencia a ampicilina
como marcador de seleccin; los terminadores de la trascripcin rrnB T1 y T2; y el
origen de replicacin de pbr322. En total el tamao del plsmido ptrc99A es de 4,176
pares de bases.
Varios de los elementos citados hacen que pTrc99A sea un vector estructural y
segregacionalmente estable, no obstante con el objetivo de evitar fuentes de
variacin gentica en el presente trabajo se decidi preparar un banco de viales con
la cepa que se emple para llevar el estudio paramtrico. De esta manera, a partir de
una cepa de E. coli W3110 (cepa no patognica que se utiliza ampliamente en la
industria biotecnolgica para la produccin de protenas recombinantes), recin
transformada por electroporacin con el plsmido pTrc99A conteniendo el gen que
codifica para la tirosinasa de R. etli (pTrcMutmelA), se evalu la produccin de
melanina en cajas conteniendo medio Luria. De estas cajas se seleccion una
colonia, designada W3110/pTrcMutmelA, cuyo fenotipo es caracterstico de
22
Cultivo de E. coli/ptrcmelA
Precipitado Sobrenadante
(desecho)
Lavado con agua
destilada sobre filtro de
0.45 micras en vac o
Secado de la melanina
(100 C por 72 h)
Melanina
Figura 6.1. Proceso implementado para la recuperacin de melanina
1.4
1.2 Eumelanina Sigma
Absorbencia
1.0
Eumelanina obtenida
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
200 300 400 500 600 700 800
Longitud de onda (nm)
de los coeficientes de extincin, fueron de 13.8 y 14.8 cm-1 (g/l)-1 para las
eumelaninas de SIGMA y la producida en este trabajo, respectivamente, con
coeficientes de correlacin (r2) mayores a 0.999 en ambos casos. Los valores
numricos de coeficientes de extincin obtenidos concuerdan con valores reportados
en la literatura para eumelanina, p. ej. Sarna y Swartz (1988) reportan un valor de
14.7 a 400 nm.
1.00
Eumelanina Sigma
Absorbencia 400nm
y= 13.8x+ 0.008
0.75
Eumelanina obtenida
y= 14.8x+ 0.01
0.50
0.25
0.00
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Melanina (g/l)
Como se observa en la figura 6.4, una vez que la glucosa se agota y que el
microorganismo entra a la fase estacionaria, inicia la formacin de melanina, esto
indica que la produccin de la misma no esta asociada a crecimiento. Dicho
comportamiento se present en todos los experimentos llevados a cabo en la
presente tesis y se discutir a ms detalle en otras secciones. No obstante, se sabe
que la trascripcin de los insertos que estn bajo el control de trc en el vector
pTrc99A se da durante la fase de crecimiento (Amann et al., 1988) y, como se
mostrar adelante, que la actividad de tirosinasa y por ende la formacin de la misma
es durante la fase de crecimiento. En el caso de productos no asociados a
dP
crecimiento la formacin del mismo esta dada por la ecuacin = x (Ver anexo
dt
11.4 y 11.5), donde la constante EuMel representa la velocidad especfica de
produccin de eumelanina (mgEuMel/gDCWh). En la figura 6.4 se observa que la
27
1 2.0
Eumelanina x 4 (g/l)
Biomasa (gDWC/l) 1.6
Glucosa (g/l)
1.2
0.1
0.8
0.4
0.01 0.0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h)
gDWCh) gDWCh)
200 : 40 0.21 0.24 0.91 23.5 11.1 81.6
100 : 20 0.26 0.27 0.96 18.5 6.0 61.5
Para los dos casos evaluados disminuy ms del 50% a las 22 h del cultivo (2 en
la tabla 6.2). Esta disminucin puede deberse a que la estabilidad de la tirosinasa
disminuye despus de las 22 h. Adems, tanto 1 y 2 fueron mayores en el
experimento con la mayor concentracin de ampicilina y Cu en un 27 y 85%,
28
coli W3110/pTrcMutmelA, debido a que esta es una cepa que contiene el plsmido
pTrcMutmelA el cual aumenta la carga metablica en la clula.
= e RT
,
donde Ea es la energa de activacin (cal/mol) y representa la cantidad energa
necesaria para obtener crecimiento exponencial microbiano en cierto intervalo de
temperatura; A es una constante que representa un factor de frecuencia; R es la
constante de los gases ideales (en cal/mol.K) y T la temperatura (en K). Graficando
el log contra T-1, se obtiene una lnea recta, cuya pendiente es Ea/R (Figura 6.8).
Biomasa (gDWC/l)
0.1
0.01
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)
2.0
1.6
Glucosa (g/l)
1.2
0.8
0.4
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)
0.5
Eumelanina (g/l)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)
0.40
0.35
0.30
(h-1)
0.25
0.20
0.15
0.10
25.0 27.5 30.0 32.5 35.0
Temperatura (oC)
1.1
qGlc (gGlc/gDCWh)
y= 2.723x + 0.095
0.9
0.7
0.5
(h-1)
vector pTrc99A favorece la transcripcin de los insertos bajo el control de trc (Amann
et al., 1988). Los datos presentados en las Figura 6.5 y 6.9 sugieren que la
temperatura favorable para la actividad de la enzima est entre 30 y 32.5oC y que la
velocidad especfica de formacin de melanina se ve favorecida a 32.5 y 30C.
32
1
y= -7.437x+23.162128
(h-1)
0.1
3.20 3.25 3.30 3.35 3.40
1/T x 1000 (o K-1)
Figura 6.8 Aplicacin del modelo tipo Arrhenius para representar la dependencia de
la velocidad especfica de crecimiento con el recproco de la temperatura para E. coli
W3110/pTrcMutmelA.
33
(mgEuMel/gDCWh)
25
EuMel1
20
EuMel2
EuMel
15
10
0
25 27.5 30 32.5 35
Temperatura (C)
100
YEuMel/Tyr (%)
80
60
40
20
0
25 27.5 30 32.5 35
Temperatura (C)
Biomasa (gDWC/l)
1
0.1
0.01
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)
0.5
Eumelanina (g/l)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)
favorecieron la sntesis de melanina fueron 5.5 a 6.5 y 8.5, siendo 7.5 y 8.0 los que
provocaron la mayor velocidad de produccin. Cabe resaltar que a estos ltimos
valores se presento una sola velocidad, ocasionando que desapareciera la etapa de
produccin a una velocidad baja (Figura 6.12). Adems a los valores de 7.5 y 8.5 el
valor de se increment en promedio al doble del obtenido con pH 7.0.
El rendimiento de conversin de tirosina en melanina fue del 100% para los pHs de
7.0, 7.5 y 8.0, y menor a 70% para los otros valores evaluados (Figura 6.13). En
virtud de que la velocidad de produccin y el rendimiento se reducen drsticamente a
pH de 8.5, se decidi seleccionar como el pH 7.5 en lugar de 8.0, durante la etapa de
produccin, como el valor para continuar el estudio y evitar correr el riesgo de errores
durante el control de los cultivos, que podran afectar radicalmente la formacin de
melanina. De nuevo, como en el caso del estudio de temperatura, estos datos
sugieren que el pH ptimo de actividad de la enzima est entre 7.5 y 8.0.
50
(mgEuMel /gDCWh)
40 1
2
30
20
10
0
5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
pH
100
YEuMel/Tyr (%)
80
60
40
20
0
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH
IPTG qS 1 YEuMel/Tyr
(mM) (h-1) (gGlc/gDCWh) (mgEuMel/gDcWh) (%)
1 0.22 0.66 49.8 100
0.1 0.29 0.82 43.6 100
0.01 0.31 0.81 0.72 11.41
38
Biomasa (gDWC/l)
1
0.1
0.01
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
2.5
Glucosa (g/l)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
0.75
Eumelanina (g/l)
0.50
0.25
0.00
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
CuSO4 qS YEuMel/Tyr
(g/ml) (h-1) (gGlc/gDCWh) (mgEuMel/gDCWh) (%)
80 0.24 0.74 38.7 73
40 0.27 0.83 46.6 100
20 0.27 0.82 41.7 100
40
Biomasa (gDWC/l)
1
0.1
0.01
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
2.0
Glucosa (g/l)
1.5
1.0
0.5
0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
0.75
Eumelanina (g/l)
0.50
0.25
0.00
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
La adicin de cuatro pulsos de tirosina en polvo, para obtener adiciones de 0.4 g/l
cada una, aparte de la inicial, permiti producir un poco ms de 1.3 g/l de melanina y
mostrar que la enzima se mantiene activa, convirtiendo tirosina en melanina, en las
condiciones de cultivo evaluadas, hasta por ms de 60 h (Figura 6.16). Adems, la
conversin de los 1.2 g/l de tirosina, agregados en la primera parte del cultivo, en
melanina fue del 100% hasta las 60 h del cultivo, y la conversin de los 0.8 g/l de
tirosina adicionados en la etapa final del cultivo fue marginal, probablemente debido
a la inactivacin de la enzima.
1.5
Biomasa (gDWC/l)
Eumelanina (g/l)
z L-Tirosina (g/l)
1
1.0
0.1
0.5
0.01 0.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo (h)
2.0
Act. Enzimtica
1.5
(U/gDWC)
1.0
0.5
0.0
10 25
Tiempo (h)
total de 5.7 g/l, que corresponde al 100% de conversin del mximo terico de la
tirosina adicionada. La velocidad especfica de formacin de melanina fue de = 70.3
(mgMEL/gDWC h), la cual es 50% mayor que en los experimentos anteriores y en
trminos de productividad volumtrica se alcanz una velocidad de 95 mgMEL/l h, 5
veces mayor que la encontrada anteriormente cuando E. coli W3110/pTrcmelA fue
crecida utilizando 2 g/l de glucosa.
8
Biomasa (gDWC/l)
z Eumelanina (g/l)
7
Glucosa (g/l)
1
6
5
4
0.1
4 (g/l) tyr 3
2
1
0.01 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)
como control negativo a la cepa progenitora (W3110). Como era esperado, las
velocidades especficas de crecimiento fueron mayores que con medio mineral (0.63
h-1. para ambas cepas), la velocidad especfica de formacin de melanina fue de
28.27 mgEuMel/gDCW h, y la mxima concentracin de producto fue de 1.13 gEuMel/l, el
cual es mucho mayor al que se obtendra a partir de los 0.4 g/l de tirosina. Un
balance sobre los aminocidos aromticos (incluyendo la tirosina) presentes en el
medio Luria, permiti concluir que dicha cantidad de melanina se form por la
copolimerizacin de las especies activas formadas de la tirosina por la tirosinasa con
otros aminocidos presentes en el medio Luria.
10 1.5
Biomasa (gDWC/l)
Melanina (g/l)
1 1.0
0.1 0.5
W3110
W3110/ptrcmutmelA
0.01 0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
Es sabido que otro tipo de melaninas, con diferente color pueden formarse si las
especies reactivas formadas a partir de la tirosina copolimerizan con otros
aminocidos, en el caso especfico de la cistena se forma un polmero color rojizo-
caf que da lugar a la feomelanina (Ozeki et al., 1997). Como parte final del presente
trabajo se decidi evaluar el potencial de W3110/pTrcMutmelA para producir
feomelanina. Cabe aclarar que la cistena es altamente txica para las bacterias
entricas como E. coli (Mcfall y Newman, 1996), por esta razn se llev a cabo
preliminarmente una prueba de inhibicin al crecimiento de W3110/pTrcMutmelA por
cistena. Se realiz un barrido usando concentraciones de cistena por debajo de
1.116x10-3 M. Se encontr que la concentracin mxima de cistena que no afecta el
crecimiento de E. coli W3110/pTrcMutmelA es de 2.85 x10-4 M. Por lo tanto la
evaluacin se realiz con las condiciones indicadas en la figura 6.19, adicionando
desde el inicio del cultivo 2.85 x10-4 M de cistena. Adems, durante la fase
estacionaria se hicieron dos adiciones de cisterna de 5.7x10-4 y 2.85 x10-4 M, a las 12
y 24 h del cultivo, para completar de esta manera 0.335 g/l de la mezcla 1:1 molar de
tirosina y cisterna (Figura 6.19). Se decidi probar esta relacin considerando que en
la sntesis de feomelanina se incorpora una molcula de cistena por cada molcula
de tirosina reactiva.
48
1 0.5
z Feomelanina (g/l)
Biomasa (gDWC/l)
0.4
cistena
2.85x10-4 M 0.3
0.1 cistena
5.7x10-4M 0.2
0.1
0.01 0.0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
0.75
y= 9.47x + 0.0045
DO (400 nm) 0.50
0.25
0.00
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Feomelanina (g/l)
7. RESUMEN DE RESULTADOS
Las condiciones favorables para la produccin de melanina en cultivos lote con
medio mineral (M9) glucosa en E.coli W3110/pTrcmelA son:
Sulfato de cobre (CuSO4): 20-40 g/ml; Ampicilina: 200 mg/ml; IPTG: 0.1 mM;
Temperatura: 30 C; y pH 7durante el crecimiento exponencial y cambio a pH 7.5-8
en la fase estacionaria.
51
8. CONCLUSIONES
Como primera parte de este trabajo se concluye que si es posible obtener melanina,
con E. coli W3110/pTrcMutmelA, en medio mineral-glucosa-tirosina.
9. PERSPECTIVAS
Producir melanina a partir de glucosa alterando las rutas del metabolismo central y
de sntesis de compuestos aromticos en E. coli.
Disear cultivos de alta densidad celular, primero crecer las clulas a alta densidad
sin inducir, antes de entrar a fase estacionara, inducir (adiciona IPTG) por al menos
2 o 3 duplicaciones, agregar tirosina y tratar de alcanzar concentraciones de
melanina mayores a 20 g/l de manera que el proceso pueda ser factible para llevarlo
a la escala industrial.
10. REFERENCIAS
23. Kong, K-H., Hong, M-P., Choi, S-S., Kim, Y-T. y Cho, S-H. 2000. Purification
and characterization of a highly stable tyrosinase from Thermomicrobium roseum.
Biotechnol. Appl. Biochem. 31: 113-118.
24. Krol, E. S. y Liebler, D. C. 1998. Photoprotective actions of natural and
synthetic melanins. Chem. Res. Toxicol. 11: 1434-1440.
25. Lerner, A. B. y Fitzpatrick, T. B. 1950. Biochemical of melanin formation.
Physiol. Rev. 30: 91-126.
26. Liaw L.L., y Lee Y.W. 1995. His residues 102 and 117 of MelC1 play different
roles in the chaperones function for Streptomyces apotyrosinaes. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 214: 447453.
27. Mcfall, E., y Newman, E. B. 1996. Amino acids as carbon sources. Escherichia
coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. Eds. Neidhardt, F. C., Curtis
III, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W.S.,
Riley, M., Schaechter, M., y Umbarger, H. E. American Society for Microbiology Press
Washington D.C. I: 358-379.
28. Manual: Difco Laboratories. 1998. Onceava edicin. Marylan USA.
29. Mason, H. S.1948.The chemistry of melanin III. Mechanism of oxidation of
dihydroxyphenilalanine by tyrosinase. J. Biol. Chem. 172: 83-99.
30. Mercado-Blanco, J., Garca, F., Fernndez-Lopez, M. y Olivares, J.1993.
Melanin production by Rhizobium meliloti GR4 is linked to nonsymbiotic plasmid
pRmeGR4b: Cloning, sequencing, and expression of the tyrosinase gene mepA. J.
Bacteriol. 175: 5403-5410.
31. Miao, F. y Kompala, D.S. 1992. Overexpression of cloned genes using
recombinant Escherichia coli regulated by T7 promoter: 1. Batch cultures and kinetic
modeling. Biotechnol. Bioeng. 40: 787-796.
32. Neijssel, O. M., Teixeira de Mattos, M. J. y Tempest D.W. 1996. Growth yield
and energy distribution. Eds. Neidhardt, F. C., Curtis III, R., Ingraham, J. L., Lin, E.
C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W.S., Riley, M., Schaechter, M. y
Umbarger, H. E. American Society for Microbiology Press Washington D.C. 2: 1683-
1692.
58
dx
=xt (1)
dt
donde:
X es la biomasa (gDCW/l); t es el tiempo (h); y es una constante de proporcionalidad
que representa la velocidad especfica de crecimiento (h-1)
X = Xo e( t ) (2)
donde:
Xo es la biomasa al inicio de la fase de crecimiento exponencial (gDCW/l)
10 10
P (A) 8
X
1
Glu
6
Producto
Biomasa
P (PA)
P (NA)
4
0.1
0.01 0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
YX/S =
(X 2 X1 ) (gDCW/gGlc) (3)
(S1 S 2 )
Donde:
S2 y S1 son la concentracin de glucosa en la parte inicial y final, respectivamente
(gGlc/l); y X1 y X2 son la biomasa en la parte final e inicial de la fase de crecimiento
exponencial, respectivamente (gDCW/l).
qS = (gGlc/gDCW h) (4)
Yx / s
dP dx
= (5)
dt dt
dP
= X (6)
dt
1 dP
(gProducto/gDCW h) = = (8)
x dt
dP dx
= + x (7)
dt dt