Prctica N 3 de Microbiologa General: preparacin de medios de
cultivo y manejo de la autoclave
Fuentes Lpez Karen; Manuel Alvarez Hernndez; Heifren Villadiego Morales; Camilo Andrs
Crdenas
MSc: Johanna Rojas
UNIVERSIDAD DE SUCRE, FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIA, PROGRAMA DE
BIOLOGIA, MICROBIOLOGA GENERAL.
Resumen.
En las practicas relacionadas con medios
de cultivo, es necesario que el ambiente y
las herramientas a utilizar estn
previamente esterilizadas, esto, para
disminuir el grado de contaminacin en
las muestras (medios de cultivo), puesto
que el desarrollo de las actividades se
basan en inocular organismos especficos,
al no utilizar herramientas estriles, se
corre el riesgo de que no solo se
desarrolle el organismo propio, si no, que
se expresen muchos organismos ajenos al
especifico. En esta prctica, se
implementaron medios comerciales
deshidratados, cuyos volmenes a utilizar,
se calcularon respectivamente para cada
caso, teniendo en cuenta las indicaciones
estipuladas por los fabricantes, se
procedi a realizar la preparacin de tres
medios de cultivo (liquido, slido y solido
inclinado);para cada uno de estos, se
procedi segn las indicaciones
postuladas por la gua d laboratorio. Cabe
resaltar, que el proceso de autoclave se
simulo con la induccin realizada por el
docente a cargo, esto, debido a que no se
contaba con la disponibilidad de tiempo
necesaria, por tanto nos facilitaron el
material ya esterilizado y se someti a
inoculacin , hasta la observacin
analtica del siguiente da.
Palabras clave: medio de cultivo,
esterilizacin, autoclave, incubadora.
Introduccin.
En los laboratorios que tratan
experimentos con entes microbiolgicos,
es imprescindible laborar con material y
soluciones estriles, esto con la finalidad de
que los resultados que se obtengan
correspondan al microorganismo que est
presente en la muestra de estudio
especfica, y no a algn contaminante
presente en el medio o los materiales
utilizados que puedan desarrollarse y
falsear las pruebas. [1]. Para ello antes de
realizar trabajos prcticos
microbiolgicos, los materiales se deben
esterilizar, junto con los medios de cultivo
que se pretendan utilizar. Cabe resaltar,
que a lo largo de todo el procedimiento de
inoculacin, se dispone de una
herramienta especfica (mechero) que al
emitir vapor respecto a su llama, reduce
considerablemente el riesgo de
contaminacin.
Se entiende por esterilizacin a aquella
serie de procedimientos por los cuales se
somete a una esterilizacin de todas las
formas vivas de microorganismos, sean
patgenos o no, que se encuentran en el
material a utilizar, por lo general estos
procesos de esterilizacin suelen
efectuarse con calor hmedo vapor, en
aparatos especializados como son las
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autoclaves; las autoclaves, son sistemas
cerrados en los cuales se forma vapor de
agua que se somete a una presin elevada,
una atmosfera, lo cual, hace que el agua
alcance una temperatura de 121c
causando as, la desnaturalizacin de
enzimas, lo que conlleva a la muerte de
los microorganismos y la destruccin de
las esporas. Habitualmente, se esteriliza a
121c durante un tiempo de 20 minutos,
debido a que, si se somete el material a
temperaturas superiores, puede generarse
la destruccin del mismo. [2].
El medio de cultivo, construye el aporte
de nutrientes indispensables para el
crecimiento de los microorganismos. La
composicin precisa depender de las
propiedades de la especie que se quiera
cultivar, debido a que las necesidades
nutricionales varan considerablemente.
Existen microorganismos poco exigentes
que crecen de forma adecuada en medios
de laboratorios normales, y preparar a partir de componentes
microorganismos muy exigentes que
necesitan determinadas sustancias como
vitaminas, suero o sangre para
desarrollarse. [3].
El primer medio de cultivo, se conoci
cuando el miclogo Biefeld, consigue
asilar y cultivar esporas de hongos en
medios solidos realizados a base de
gelatinas, sin embargo, este sistema no
era el adecuado para las bacterias (tamao
mnimo), posteriormente Lister en 1878,
popularizo un mtodo enfocado al cultivo
puro, basndose en diluciones seriadas en
medios lquidos. Despus Koch realizo
investigaciones con rodajas de papa como
un soporte nutritivo slido, pero no tardo
en recurrir al caldo de forma lquida,
diseada al que en 1881 aadi gelatina,
logrando un medio solido transparente
ideal para la observacin morfolgica
microscpica de las colonias microbianas,
en 1882 el mdico alemn Walter Hesse
introduce el agar-agar (polisacrido
extrado de algas roas) como un
surfactante. En 1887, un ayudante de
Koch llamado Petri, comienza a utilizar
placas de cristal planas, para reemplazar a
las clsicas bandejas de vidrio cubiertas
con campanas que se usaban hasta esa
poca. [4].
En la prctica de laboratorio
microbiolgica, se busca llevar a cabo la
preparacin de tres medios de cultivos,
cuyas composiciones presentan
variaciones, as mismo son muy
diferentes en cuanto a su consistencia
(liquido, slido y solido inclinado). Este
ltimo aspecto de diferencias
significativas, es vital a la hora de
preparar dichos cultivos. Aunque los
medios artificiales o sintticos, se pueden
individuales, estos pueden adquirir
comercialmente como medios
deshidratados. De los cuales fueron los
que se utilizaron en este caso; a los que
solamente se les debe aadir la cantidad
de agua necesaria. El fabricante indica la
composicin, caducidad y la cantidad de
material que debe reparase por cada litro
incluso indican el cmo deben
esterilizarse. As mismo se plantea que el
estudiante aprenda las aplicaciones y
funcionamiento de las autoclaves en los
procesos de investigacin.
METODOLOGA
Preparacin de medios de cultivo.
Medio lquido (caldo)
Para preparar un volumen de 45 ml se
realizaron los clculos pertinentes a la
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determinacin de los gramos de caldo de
urea a pesar. Una vez pesado se introdujo
el contenido en el interior de un beaker al
que se le adicion agua destilada. Se
mezcl y homogeneiz para finalmente,
verter 9 ml de la solucin en tres tubos de
ensayos que seras esterilizado en una
autoclave.
Medio slido
Para preparar un volumen de 55 ml se
realizaron los clculos respectivos para
determinar la cantidad de agar en polvo a
pesar, siendo estos 2,2g.
Este total de agar fue introducido en un
Erlenmeyer, y mezclado con agua
destilada.
Para esta prctica se dispona de una
muestra en Erlenmeyer previamente
esterilizada, debido a que no se contaba
con el tiempo adecuado para llevar a cabo
la esterilizacin en la autoclave.
El contenido del medio se verti en dos
cajas de Petri estriles, adicionando,
aproximadamente, 15 ml en cada una.
Finalmente se envolvieron en papel craft
y se llevaron a incubacin. Transcurridas
20 horas se revis las muestras para
verificar si hubo o no contaminacin.
Resultados y Discusin
Ilustracin 1. Preparacin de medios de
cultivo. Medio lquido (caldo)
Ilustracin 2. Preparacin de medios de
cultivo. Medio slido
La mayor causa de contaminacin en el
medio de crecimiento es el
almacenamiento inadecuado. El mal
manejo de cultivos mientras se incuban
puede contaminarlos directamente o
simplemente alterar su cubierta
protectora, permitiendo acceder al
sustrato a microbios oportunistas del
ambiente. La nica manera de evitar este
tipo de contaminacin consiste en
mantener una vigilancia adecuada cuando
se manejan cultivos y abstenerse de
manipularlos lo ms posible.
Es esencial que los cultivos sean
mantenidos en condiciones libres de
ATBs durante al menos parte del tiempo,
y de preferencia todo el tiempo; de lo
contrario persistir la contaminacin
crptica, su origen ser difcil de
determinar, y su eliminacin imposible.
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Ilustracin 3. Preparacin de medios de
cultivo. Medio lquido (caldo) y Medio
slido.
Contaminacin con organismos de rpido
crecimiento son menos problemticos, ya
que suelen manifestarse y detectarse
fcilmente, en nuestro caso no hubo
contaminacin en ninguno de los medios
debido al manejo adecuado tanto de los
reactivos como los materiales al momento
de realizar la prctica.
Ilustracin 4. Esterilizacin de asa.
El asa de siembra fue esterilizada en la
llama antes de usarla y despus de haber
sido usada. Su esterilizacin garantiz
que no se diera la contaminacin de los
medios en estudio con otros
microorganismos que estuvieran
presentes en el filamento metlico.
Ilustracin 5. Asas microbiolgicas.
El mtodo ms confiable de eliminacin
de una contaminacin microbiana es
descartar el cultivo, el medio de cultivo y
los reactivos usados con l.
Conclusin
En el ambiente se encuentran
diversos microorganismos, desde
hongos hasta las bacterias, e
incluso atreves de dicho ambiente
se propagan gran cantidad de
virus; por ello, se hace necesario
llevar acabo la experimentos de
laboratorio debido a la
contaminacin microbiana que se
encuentra en nuestro ambiente.
Se debe tener en cuenta las
indicaciones estipuladas por los
fabricantes del material
deshidratado, como son la
composicin, caducidad y
cantidad de agua necesarias. Con
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 el fin de obtener un componente
adecuado para los posteriores
procesos.
Al momento de preparar los
medios de cultivo, es de vital
importancia, tener en cuenta el
tipo de consistencia o textura del
mismo, ya que esto influye musgo
en el tipo de metodologa a
implementar en dicha preparacin.
Es importante, tener un previo
conocimiento sobre cada una de
las partes de las autoclaves, as
como su respectiva funcionalidad
en los procesos de esterilizacin.
Cuestionario.
a) Qu es un medio de cultivo y
para que se utiliza?
Son sustratos o soluciones que estn
conformados por nutrientes esenciales
(como por ejemplo macro elementos y
micro elementos) para el desarrollo de los
microorganismos. Se utilizan para ayudar
en el crecimiento de microorganismos
que posteriormente sern objetos de
estudios de una forma controlada, debido
a que el medio de cultivo ser preparado
en el laboratorio.
b) Qu es el agar y cul es su
procedencia?
Es un polisacrido proveniente de Japn
que fue descubierto en el siglo XVII y es
muy usado en la cocina japonesa
tradicional por sus propiedades
gelificantes. Este es obtenido de algas
marinas como las algas del gnero
Gelidium.
c) Qu es un medio de cultivo
natural y uno sinttico?
Un medio de cultivo natural es aquel que
est preparado a partir de sustancias de
origen animal o vegetal por lo que se
desconoce su composicin qumica
exacta.
Un medio de cultivo sinttico es aquel
que tiene una composicin qumica
definida tanto cualitativamente como
cuantitativamente y son utilizados para
resultados de reproduccin.
d. Escriba el nombre y formula de
sustancias que son utilizadas en los
medios de cultivo como fuentes de
carbono, nitrgeno, fsforo y azufre.
e. Qu factores fsicos y qumicos
pueden afectar la estabilidad de los
medios de cultivo?
Temperatura, desecacin, radiaciones,
ondas sonoras, presin hidrosttica,
presin osmtica, pH, antibiticos,
desinfectantes y antispticos.
f. Esquematice una autoclave e indique
sus partes.
g. Cul es el mecanismo por el cual el
vapor saturado a presin mata los
microorganismos?
El vapor saturado es un vapor hmedo
que es capaz de transmitir la energa de
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condensacin sobre los materiales a
esterilizar, esto le permite tener un poder
de penetracin elevado debido al cambio
de volumen que se experimenta en la
condensacin produce una gran cantidad
de energa que es capaz de eliminar los
microorganismos debido a que estos son
susceptibles a los cambios bruscos de
temperatura.
h. Cules son los mtodos ms corrientes hubo crecimiento, quieres decir que esta
utilizados para esterilizar?
Mtodos fsicos: Calor hmedo
(autoclave), calor seco (horno),
esterilizacin por radiacin (ionizante,
ultravioleta y gama).
Mtodos qumicos: Alcoholes, Aldehdos,
fenoles, antibiticos, antispticos.
i. Ciertos organismos poseen la estructura
biolgica ms termo resistente, para
supervivencia. Cul es y en que
microorganismos se encuentra?
j. Qu significa termorresistencia en
microbiologa?
La termorresistencia es la capacidad que
tiene un microorganismo de soportar
temperaturas elevadas sin presentar algn
cambio en su estructura y que le permite
mantener su integridad.
k. Usualmente cmo se esterilizan las
cajas de Petri y las pipetas?
Se lavan con detergente en primera
instancia y luego se enjuagan con agua
normal y agua destilada, se secan con
papel absorbente para despus cubrirlas
con papel kraft, luego de estar cubiertas
se someten a esterilizacin por calor seco,
donde son llevadas al horno a una
temperatura de 160 a 170 C durante una
hora o ms.
l. Cmo se verificara que un medio de
cultivo procesado en la autoclave quedo
realmente esterilizado?
Para tener la certeza de que quedo estril,
lo tienes que meter en autoclave 15 min a
121C, al vaciarlo en tu placa de Petri lo
debes hacer en un rea estril, cerca de un
mechero y despus de que solidifico lo
debes incubar 24 horas, al trmino si no
estril y listo para sembrar. Recuerda
siembra en un rea estril y cerca de un
mechero.
m. consulte sobre lavado tcnico,
envoltura y esterilizacin de elementos de
vidriera (pipetas, cajas de Petri, balones,
matraces)
Para asegurar el xito de un proceso
esterilizante es necesario considerar las
siguientes pautas: 1. Esterilizacin previa:
Ser necesaria cuando el material y/ o
equipos hayan sido utilizados con material
infeccioso o presunto infeccioso, por ejemplo
placas de Petri inoculadas, tubos conteniendo
cultivos de microorganismos, frascos
empleados en el cepario, etc. Sern
esterilizados en autoclave a 1 atm. De presin
durante 15 30 minutos. Para las pipetas,
Micropipetas y tubos de hemlisis puede
emplearse este mtodo o sumergirlas
inmediatamente despus de ser utilizadas en
solucin desinfectante de formol al 10 %
durante una hora. 2. Limpieza previa: Se
realizar para eliminar las partes gruesas de
suciedad o residuos no infecciosos (gratitud,
resto de pegamento, cinta adhesiva, carbono,
tinta de rotulado, etc.). Se emplear el
raspado con esptulas, cepillo, esponjas
metlicas, paos, etc. Se enjuagar repetidas
veces bajo el chorro de agua corriente a
presin (conectando a la canilla un tapn
perforado o tapando parcialmente con un
dedo). Se aconseja un ltimo enjuague con
agua destilada. Se dejar secar en canasto o
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rejilla de alambre boca abajo a temperatura
ambiente o estufa a 60 80 C. El material de
vidrio que luego de este tratamiento an
quedase manchado ser sumergido en una
solucin sulfocrmica durante 24 hs (Este
procedimiento lo realiza personal
especializado del Droguero). 3. Preparacin
del material de vidrio: este
acondicionamiento debe realizarse de manera
tal de asegurar la perfecta esterilizacin del
mismo en todos sus puntos y evitar la
posterior contaminacin. a. Placas de Petri: se
envuelven en papel madera segn la tcnica
indicada por el instructor (se esterilizan en
estufa a 160- 180C durante dos o una hora
respectivamente). b. Tubos de ensayos, tubos
de hemlisis y tubos de Khan: se confecciona
en tapn de algodn y se cubre con un
capuchn de papel aluminio. (se esterilizan en
estufa). c. Pipetas: se obtura el extremo
superior con un filtro de algodn y luego se
envuelven con tiras de 4 a 5 cm. de ancho de
papel madera comenzando por la punta de la
misma. Debe rotularse cada una con la
capacidad y graduacin correspondiente (se
esterilizan en estufa).
FSICOS:
1- A) CALOR: Acta por desnaturalizacin
de protenas y contribuye a la fusin de
lpidos de membranas.
CALOR HMEDO: la desnaturalizacin y
coagulacin se facilita en presencia de agua
pues se rompen los puentes de hidrgeno
entre los grupos C = O----HN que constituye
la estructura secundaria y se agrega (tambin
mediante puente de hidrgeno) una molcula
de agua a cada extremo de esas uniones rotas.
Las protenas en soluciones ms diluidas
coagulan a menor temperatura que las
concentradas. Esterilizar exclusivamente en
calor hmedo: medios de cultivos, recipientes
contaminados, material de goma, y todo
elemento que no resista las altas temperaturas
del calor seco. El autoclave utiliza vapor a
presin superior a la normal. As, la
temperatura del vapor de agua asciende a
121C. El vapor saturado penetra en los
recipientes tomando contacto con los
microorganismos a destruir, all se condensa
liberando calor. El calentamiento es rpido
por la gran cantidad de calor latente del vapor
de agua, que libera al condensarse sobre la
superficie del objeto. CALOR SECO:
Deshidrata las bacterias, virus, etc. y facilita
la coagulacin o desnaturalizacin de las
protenas. Se requieren mayores temperaturas
para producir dao irreversible (muerte). Se
acepta que el calor seco acte oxidando los
constituyentes intracelulares. En el proceso
de esterilizacin son prioritarios los procesos
oxidativos y de fusin de membranas por
sobre la desnaturalizacin. Resulta lento por
la menor eficacia del calor seco y por la
lentitud del transporte del calor (conveccin y
radiacin).
1-B) RADIACIONES Luz
ultravioleta: solamente para aire o
para superficie o capas muy delgadas
de lquidos pues no penetra. Se usa
para consultorios, salas, laboratorios,
cmaras, quirfanos. No atraviesan el
vidrio. Las ondas UV tienen
suficiente energa para causar roturas
en el ADN, produciendo la muerte
del organismo expuesto. Las cmaras
de siembra vienen equipadas con una
lmpara de luz UV para mantener el
rea estril, la cual se debe apagar
cuando se ingresa a la cabina por la
peligrosidad a la exposicin de las
radiaciones (quemaduras, eritemas,
cncer de piel) 2-C) MECNICOS:
Filtracin: para medios de cultivo,
sueros y soluciones que se alteren
con el calor. En la mayora de los
filtros hay tres factores principales
que intervienen en la retencin de
partculas (bacterias, virus, protenas,
etc.): a) Efecto mecnico de filtro,
segn el tamao del poro. b)
Repulsin o atraccin elctrica c)
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 Absorcin y adsorcin Por b y c
pueden resultar que el filtro retenga
partculas menores que el dimetro
del poro. La mayora de los filtros
bacterianos tienen cargas negativas
igual que las bacterias y los virus. Se
disminuye la retencin por sta
causa, trabajando a pH entre 7 y 6.
esterilizacin de instrumentos y
componentes a utilizar en
procesos microbiolgicos, con el
fin de prevenir el margen de error
en os

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