UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZAN

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

ANLISIS POR INSTRUMENTACIN Cdigo : L-AI
Ing. Juan Villanueva Tiburcio Pg. : 04
Ing. Csar Cueto Rosales Fecha : 02/05/17 (G1)
PRACTICA N 04 03/05/17 (G2)
ESPECTRO DE ABSORCIN DEL ANIN DICROMATO Y
DETERMINACIN DE CONCENTRACIONES

I. INTRODUCCIN

Espectroscopia en el rango ultravioleta-visible (UV-Vis) es una de las tcnicas de laboratorio ms comnmente encontrados
en el anlisis de alimentos. La cuantificacin de macro componentes (carbohidratos totales por el mtodo de fenol-cido
sulfrico), la cuantificacin de microcomponentes (tiamina por el procedimiento fluoromtrico tiocromo), estimaciones de
la rancidez (estado de oxidacin de lpidos por la prueba de cido tiobarbitrico), y pruebas de vigilancia (inmunoensayos
enzimticos), son algunos ejemplos que se pueden mencionar. En cada uno de estos casos, la seal analtica para la que se
basa el ensayo es la emisin o absorcin de radiacin en el intervalo UV-Vis. Esta seal puede ser inherente al analito, tal
como la absorbancia de la radiacin en el intervalo visible por los pigmentos, o un resultado de una reaccin qumica que
implica al analito, tal como el mtodo colorimtrico de Lowry basado en cobre para el anlisis de la protena soluble.

La radiacin electromagntica en la porcin UV-Vis del espectro vara en longitud de onda de aproximadamente 200 a 700
nm. El rango UV va de 200 a 350 nm y el intervalo Vis de 350 a 700 nm. El rango UV es incoloro para el ojo humano,
mientras que diferentes longitudes de onda en el rango visible tienen un color caracterstico, desde violeta en el extremo de
longitud de onda corto del espectro hasta rojo en el extremo de longitud de onda larga del espectro. La espectroscopia que
utiliza radiacin en el rango UV-Vis puede dividirse en dos categoras generales, la absorbancia y la espectroscopia de
fluorescencia, en base al tipo de interaccin radiacin-materia que se est monitoreando. Cada uno de estos dos tipos de
espectroscopia puede subdividirse ms en tcnicas cualitativas y cuantitativas. En general, la espectroscopia de absorcin
cuantitativa es la ms comn de las subdivisiones dentro de la espectroscopia UV-Vis.

Bases de la Espectroscopia de Absorcin Cuantitativa

El objetivo de la espectroscopia de absorcin cuantitativa es determinar la concentracin de analito en una solucin de

muestra dada. La determinacin se basa en la medicin de la cantidad de luz absorbida de un haz de referencia a medida que
pasa a travs de la solucin de muestra. En algunos casos, el analito puede absorber naturalmente radiacin en el intervalo
UV-Vis, de tal manera que la naturaleza qumica del analito no se modifique durante el anlisis. En otros casos, los analitos
que no absorben radiacin en el rango UV-Vis se modifican qumicamente durante el anlisis, convirtindolos en una
especie que absorbe radiacin de la longitud de onda apropiada. En cualquier caso, la presencia de analito en la solucin
afectar a la cantidad de radiacin transmitida a travs de la solucin y, por lo tanto, la transmitancia o absorbancia relativa
de la solucin se puede usar como un ndice de concentracin del analito.

En la prctica, la solucin a analizar est contenida en una celda de absorcin y colocada en la trayectoria de radiacin de
una longitud (es) de onda seleccionada (s). La cantidad de radiacin que pasa a travs de la muestra se mide entonces con
relacin a una muestra de referencia. La cantidad relativa de luz que pasa a travs de la muestra se utiliza entonces para
estimar la concentracin del analito. El proceso de absorcin puede ser acotado como en la Fig. 1. La radiacin incidente en
la celda de absorcin, P0, tendr una potencia radiante significativamente mayor que la radiacin que sale del lado opuesto
de la celda, P.

La disminucin de la potencia radiante a medida que el haz pasa a travs de la solucin se debe a la captura (absorcin) de
los fotones por las especies absorbentes. La relacin entre la potencia de los haces incidentes y de salida tpicamente se
expresa en trminos de la transmitancia o la absorbancia de la solucin. La transmitancia (T) de una solucin se define
como la relacin de P a P0 dada en la ecuacin [1]. La transmitancia tambin se puede expresar como un porcentaje como se
da en la ecuacin [2].
 Fig. 1. Atenuacin de un haz de radiacin a medida que pasa a travs de
una cubeta que contiene una solucin absorbente.

[1]

[2]

Dnde:
T = transmitancia
P0 = potencia radiante del haz incidente en la celda de absorcin
P = potencia radiante del haz que sale de la celda de absorcin
%T = porcentaje de transmitancia

Los trminos T y %T son intuitivamente atractivos, ya que expresan la fraccin de la luz incidente absorbida por la
solucin. Sin embargo, T y %T no son directamente proporcionales a la concentracin del analito absorbente en la solucin
de muestra. La relacin no lineal entre transmitancia y concentracin es un inconveniente ya que los analistas estn
generalmente interesados en las concentraciones de analito. Un segundo trmino utilizado para describir la relacin entre P
y P0 es la absorbancia (A). La absorbancia se define con respecto a T como se muestra en la ecuacin [3].

[3]

Dnde:
A = absorbancia
T y %T = como en las ecuaciones [1] y [2], respectivamente

La absorbancia es una expresin conveniente en que, en condiciones apropiadas, es directamente proporcional a la

concentracin de la especie absorbente en la solucin. Obsrvese que, basndose en estas definiciones para A y T, la
absorbancia de una solucin no es simplemente unidad menos la transmitancia. En la espectroscopia cuantitativa, la fraccin
del haz incidente que no se transmite no es igual a la absorbancia de la solucin (A). La relacin entre la absorbancia de una
solucin y la concentracin de la especie absorbente se conoce como la ley de Beer (Ecuacin [4]).

[4]

Dnde:
A = absorbancia
c = concentracin de especies absorbentes
b = longitud de la trayectoria a travs de la solucin (cm)
a = absortividad

No hay unidades asociadas con la absorbancia, A, ya que es el log de una relacin de potencias de haz. El trmino de
concentracin, c, puede expresarse en cualquier unidad apropiada (M, mM, mg/ml, %). La longitud de la trayectoria, b, est
en unidades de cm. La absortividad, a, de una especie dada es una constante de proporcionalidad dependiente de las
propiedades moleculares de la especie. La absortividad es dependiente de la longitud de onda y puede variar dependiendo
del ambiente qumico (pH, fuerza inica, disolvente, etc.) que experimenta la especie absorbente. Las unidades del trmino
de absortividad son (cm) -1 (concentracin) -1. En el caso especial en que la concentracin del analito se indica en unidades
de molaridad, el trmino de absortividad tiene unidades de (cm) -1 (M) -1. Bajo estas condiciones, se designa con el smbolo
, que se denomina absortividad molar. La ley de Beer expresada en trminos de la absortividad molar se da en la ecuacin
[5]. En este caso, c se refiere especficamente a la concentracin molar del analito.
 [5]

A y b = como en la ecuacin [4]

= absortividad molar
c = concentracin en unidades de molaridad

La espectroscopia cuantitativa depende de que el analista pueda medir con precisin la fraccin de un haz de luz incidente
que es absorbido por el analito en una solucin dada. Esta tarea aparentemente simple es algo complicada en la prctica real
debido a procesos distintos de la absorcin del analito que tambin resultan en disminuciones significativas en la potencia
del haz incidente. Un resumen grfico de los procesos de reflexin y dispersin que disminuirn la potencia de un haz
incidente se da en la Fig. 2.

Fig. 2. Factores que contribuyen a la atenuacin de un haz de radiacin a

medida que pasa a travs de una cubeta que contiene una solucin
absorbente.

Es evidente que estos procesos deben tenerse en cuenta si se necesita una

estimacin verdaderamente cuantitativa de la absorcin del analito. En la
prctica, se utiliza una celda de referencia para corregir estos procesos. Una
celda de referencia (blanco) es aquella que, en teora, coincide exactamente
con la celda de absorcin de la muestra con la excepcin de que no contiene
ningn analito. Una celda de referencia se prepara a menudo aadiendo agua
destilada a una celda de absorcin. Esta celda de referencia se coloca entonces en la trayectoria del haz de luz y se mide la
potencia de la radiacin que sale de la celda de referencia y se toma como P0 para la celda de muestra. Este procedimiento
supone que todos los procesos excepto la absorcin selectiva de radiacin por el analito son equivalentes para las celdas de
muestra y de referencia.

La absorbancia realmente medida en el laboratorio se aproxima a la ecuacin [6].

[6]

Dnde:
Psolvente = potencia radiante de la salida de la celda que contiene el disolvente (blanco)
Psolucin de analito = potencia radiante del haz que sale de la celda que contiene la solucin de analito
P0 y P = como en la ecuacin [1]
A = como en la ecuacin [3]

Desviaciones de la Ley de Beer

Nunca se debe asumir que la ley de Beer es estrictamente obedecida. De hecho, hay varias razones por las cuales la relacin
lineal predicha entre absorbancia y concentracin puede no ser observada. En general, la ley de Beer es aplicable solamente
a soluciones diluidas, hasta aproximadamente 10mM para la mayora de los analitos. La concentracin real en la que la ley
se convierte en limitante depender de la qumica del analito. A medida que las concentraciones de analito aumentan, las
distancias intermoleculares en una solucin de muestra dada disminuirn, alcanzando finalmente un punto en el que las
molculas vecinas afectan mutuamente la distribucin de carga del otro. Esta perturbacin puede afectar significativamente
a la capacidad del analito para capturar fotones de una longitud de onda dada; es decir, puede alterar la capacidad de
absorcin del analito (a). Esto hace que la relacin lineal entre concentracin y absorcin se descomponga, ya que el
trmino de absortividad es la constante de proporcionalidad en la ley de Beer (suponiendo una longitud de trayectoria
constante, b). Otros procesos qumicos tambin pueden resultar en desviaciones de la ley de Beer, tales como la asociacin-
disociacin reversible de las molculas de analito o la ionizacin de un cido dbil en un disolvente sin tampn. En cada
uno de estos casos, la forma predominante del analito puede cambiar a medida que se vara la concentracin. Si las
diferentes formas del analito, por ejemplo, ionizado vs neutro, tienen absortividades diferentes (a), entonces no se observar
una relacin lineal entre la concentracin y la absorbancia.
Otra fuente de desviacin de la ley de Beer puede surgir de las limitaciones en la instrumentacin utilizada para las
mediciones de absorbancia. La ley de Beer se aplica estrictamente a situaciones en las que la radiacin que pasa a travs de
la muestra es monocromtica, ya que en estas condiciones un solo valor de absorcin describe la interaccin del analito con
toda la radiacin que pasa a travs de la muestra. Si la radiacin que pasa a travs de una muestra es policromtica y hay
variabilidad en las constantes de absorcin para las diferentes longitudes de onda constituyentes, entonces la ley de Beer no
ser obedecida. Un ejemplo extremo de este comportamiento se produce cuando la radiacin de la longitud de onda ideal y
la radiacin dispersa de una longitud de onda que no es absorbida en absoluto por el analito simultneamente pasan a travs
de la muestra al detector. En este caso, la transmitancia observada se definir como en la ecuacin [7]. Obsrvese que se
alcanzar un valor lmite de absorbancia como P0 >> P, que ocurrir a concentraciones relativamente altas del analito....

[7]
Dnde:
Ps = potencia radiante de la luz dispersa
A = como en la ecuacin [3]
P y P0 = como en la ecuacin [1]

OBJETIVOS
Hallar la mxima absorcin mediante la curva de barrido espectral del dicromato.
Obtener la curva de calibracin (estndar) para el dicromato.
Determinar la concentracin de una muestra a partir de la curva estndar.

II. MATERIALES Y METODOS Curva estndar

A partir de la solucin patrn realizar cinco
2.1. Equipo diluciones: 1/2; 1/4; 1/6; 1/8; 1/10 (calcular la
Espectrofotmetro UV-Vis Genesys 10s molaridad de todas las diluciones).
Balanza analtica Medir sus absorbancias a la longitud de onda
2.2. Materiales determinada anteriormente y graficar
Matraz aforado 25 ml absorbancia versus concentracin.
Erlenmeyer de 250 ml Ajustar los puntos a una recta por el mtodo de
Pipetas de 5 y 10 ml mnimos cuadrados. A partir de la regresin
Tubos de ensayo lineal obtenida, se determinara la concentracin
Celdas para espectrofotmetro de la muestra.
Micropipeta 100 1000 l
III. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Tips de micropipeta
2.3. Reactivos Representar grficamente el espectro de absorcin del
Dicromato de sodio dicromato (absorbancia frente a longitud de onda).
Agua bi-destilada
Representar la absorbancia vs molaridad, y la lnea de
2.4. Mtodos ajuste (curva estndar).
Determinar:
Espectro de absorcin de solucin de dicromato El coeficiente de absortividad molar del anin
de potasio dicromato
Preparar solucin 0,5 x 10-3 M de dicromato de La concentracin de la muestra.
potasio.
Blanco agua bi-destilada. IV. CONCLUSIONES
Medir las absorbancias en el intervalo de
longitudes, desde 340 nm hasta 500 nm, con
V. REFERENCIAS
intervalos de 1 nm,
Graficar la curva de absorbancia versus longitud
de onda. Para determinar la longitud de onda a la
cual presenta su mxima absorcin que se
utilizar para realizar la curva de calibracin y
determinar la concentracin de la muestra.