MICROBIOLOGIA

CURSO: MICROBIOLOGIA

DOCENTE: ALEJANDRO ROLANDO DURAN NIEVA

ALUMNOS: CARDENAS RAMOS, Wilson

CRIOLLO,
Carlos

CICLO : VI

GRUPO : C

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INDICE

Dedicatoria pg. 4
Introduccin pg. 5
Objetivos pg. 6
Marco Terico pg. 7
Materiales pg. 13
Metodologa pg. 14
Resultados pg. 15
Conclusiones pg. 16
Recomendaciones pg. 17
Bibliografa pg. 18
Anexos pg. 19

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DEDICATORIA

Este trabajo en primer lugar est dedicado a nuestros padres, que durante
nuestro estudio estn acompandonos, iluminndonos y guindonos para
llegar a nuestras metas.

A nuestros profesores que con su dedicacin, paciencia, esmero y

profesionalismo, que nos dirigen durante todo este trayecto, con el objetivo de
ensearnos e instruirnos para nuestro futuro.

Muchsimas gracias por acompaarnos todos en este camino.

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INTRODUCCION

Entre los microorganismos del suelo que realizan la fijacin del nitrgeno atmosfrico,
los ms comunes y efectivos son los del genero Rhizobium, que colonizan y forman
ndulos en las races de las leguminosas, las bacterias obtienen alimento de la planta
y sta a cambio, recibe compuestos nitrogenados (Instituto Regional Federico
Errzuriz).
En las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrgeno
producen enzimas que toman el nitrgeno en su forma gaseosa de la atmsfera, y,
con los azcares que obtienen de la planta, fijan el nitrgeno dentro de la biomasa
bacteriana (Elaine R. Ingham, 2000)

Se dan dos grandes divisiones de bacterias fijadoras de nitrgeno: las bacterias
fijadoras de nitrgeno simbiticas y las bacterias fijadoras de nitrgeno asociativas
(Elaine R. Ingham, 2000). Las bacterias fijadoras de nitrgeno simbiticas, tales como
el Rhizobium, se dan en las legumbres. Estas bacterias forman ndulos en las races
de las plantas. Y estos ndulos son fciles de contar. Las bacterias fijadoras de
nitrgeno asociativas ocupan los espacios entre las clulas de las races de la planta,
y no alteran la arquitectura de la raz en absoluto (Elaine R. Ingham, 2000).

A finales de la dcada de los 70, Kloepper (1994) utiliz el trmino PGPR (plant
growth promoting rizobacterias; rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal)
para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benfico en las
plantas. Recientemente, la denominacin se ha extendido a microorganismos PGP
para incluir hongos y cualquier organismo afn (Vessey, 2003). Sin embargo, en la
ltima dcada un inters creciente ha sido dirigido hacia los microorganismos
endfitos, los cuales al estar menos afectados por el estrs ambiental y ms
aclimatados con su hospedero (Sturz y Nowak, 2000) podran representar una mayor
ventaja ecolgica. Sin embargo, la presencia de bacterias endfitas y su papel
dependen probablemente del cultivar y de su coevolucin con la especie microbiana
(Yanni et al., 2001).

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OBJETIVOS

OBJETIVOS GENERALES

El objetivo de esta prctica es aislar bacterias fijadoras de nitrgeno del gnero

Rhizobium de los ndulos de las races de la planta del frejol.

OBEJETIVOS ESPECFICOS

Se espera tambin probar medios de cultivo para el aislamiento de la mayor cantidad

de microorganismos fijadores de nitrgeno.

Adems se espera identificar mediante tincin Gram los microorganismos fijadores de

nitrgeno aislados en los medios de cultivo y comparar cuantitativamente la cantidad
de microorganismos.

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MARCO TEORICO

RHIZOBIUM

Estas bacterias interactan con la planta mediante una complicada simbiosis donde hay un
intercambio de seales bioqumicas, en primer lugar las races de las leguminosas excretan
exudados (Flavonoides e isoflavonoides) que estimulan las bacterias a adherirse al tejido
radical. Los rizobios se multiplican sobre la superficie de la raz causando un
encrespamiento de los pelos radicales. La pared celular se invagina y constituye un
pequeo hilo de infeccin por medio del cual los rhizobios penetran. El hilo crece hasta que
los rhizobios son liberados en el citoplasma de las clulas corticales. La planta responde
formando un pequeo tumor en la zona de infeccin, denominado ndulo. En el centro de
los ndulos esta sintetizada la nitrogenasa que es la responsable de fijar el nitrgeno en
forma de amonio que es aprovechado por las plantas. Las plantas recompensan las
bacterias proporcionndoles cidos orgnicos.

Rhizobium es un gnero de bacterias gram-negativas del suelo que fijan nitrgeno

atmosfrico.Pertenece a un grupo de bacterias fijadoras de nitrgeno que se denominan
colectivamente rizobio. Viven en simbiosis con determinadas plantas (como por ejemplo las
leguminosas) en su raz, despus de un proceso de infeccin inducido por la propia planta
mediante la secrecin de lectina, a las que aportan el nitrgeno necesario para que la planta
viva y est a cambio le da cobijo. Ms especficamente, la condicin de simbiosis viene
dada por la formacin de una molcula de transporte de oxgeno, equivalente a la
hemoglobina, llamada Leghemoglobina. Slo se puede sintetizar cuando los dos organismos
se encuentran en simbiosis; por parte de la bacteria se sintetiza el grupo Hemo de dicha
molcula, y por parte de la planta se sintetiza la apoprotena. As, mediante la nueva
molcula formada, se puede llevar a cabo el transporte de oxgeno necesario para el
metabolismo de la bacteria (y as poder fijar el nitrgeno requerido por la planta).

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CARACTERSTICAS

Las bacterias Rhizobium son organismos de vida libre

que habitan en la rizosfera y se alimenta de los restos de
organismos muertos. Estas contienen un plsmido
que codifica informacin que es vital para la infeccin y
la nodulacin de la planta hospedadora
correspondiente. Son bacilos mviles, Gram- negativos,
con dos capas de pared celular (la primera capa est
hecha por carbohidratos y protenas, y la segunda
capa por lpidos y carbohidratos), procariotas, aerobios
(necesita oxgeno para crecer), mviles (al hacerse el
test de motilidad, el agar se vuelve amarillo y no de su
color original morado-), beta (digiere la hemoglobina), crece casi en cualquier temperatura,
pero su desarrollo es ms ptimo a una temperatura de 25 C (77 F), sus dimensiones son
de 0.5-0.9 x 1.2-3.0 m, y cuenta con flagelos.

FIJACIN BIOLGICA DE NITRGENO

El nitrgeno es uno de los elementos qumicos esenciales para todos los seres vivos ya que
forma parte de los cidos nucleicos y de las protenas y, por lo tanto, es fundamental en la
estructura y el metabolismo celular (Paerl, 1998). Las plantas toman el nitrgeno
directamente desde el suelo en forma de nitratos (NO3-) o amonio (NH4+), algo que no
pueden hacer los animales, que precisan tomarlo en forma de compuestos orgnicos.

Slo algunos procariotas pueden tomar el nitrgeno directamente desde la atmsfera, va

fijacin de nitrgeno, convirtiendo el nitrgeno molecular en nitrgeno asimilable por otros
seres vivos.

Teniendo en cuenta que este elemento es muy abundante en la atmsfera, la obtencin de

nitrgeno directamente desde sta es una de las vas ms importantes para
el mantenimiento del ciclo del nitrgeno, del que forman parte las bacterias fijadoras de
nitrgeno, junto con otros grupos de bacterias que llevan a cabo procesos intermedios de
transformacin de compuestos nitrogenados y de des nitrificacin, que devuelve
finalmente el nitrgeno a la atmsfera. Por lo tanto, la existencia de un equilibrio en el ciclo
del nitrgeno es fundamental para la vida en la tierra y esto conlleva el
mantenimiento de los ecosistemas microbianos presentes en los medios terrestres
y acuticos

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LA SIMBIOSIS RIZOBIUM-LEGUMINOSA

El nitrgeno es muy abundante en la atmsfera, sin

embargo, las plantas no pueden utilizarlo en su forma
elemental y tienen que obtenerlo del suelo
principalmente en forma de nitratos o amonio. La fijacin
biolgica de nitrgeno es un proceso clave en la
biosfera, por el cual microorganismos portadores de la
enzima nitrogenada convierten el nitrgeno gaseoso en
nitrgeno combinado. El grupo de bacterias al que se
conoce colectivamente como rizobios, inducen en las
races (o en el tallo) de las leguminosas la formacin de
estructuras especializadas, los ndulos, dentro de los
cuales el nitrgeno gaseoso es reducido a amonio Se estima que este proceso contribuye
entre el 60-80 % de la fijacin biolgica de nitrgeno. La simbiosis es inhibida si existe un
exceso de nitrato o amonio en el suelo. En esta simbiosis en los ndulos, la planta husped
obtiene nutrientes nitrogenados de la bacteria (rizobios) y ofrece a sta una fuente de
carbono y un ambiente favorable para fijar nitrgeno. Esta simbiosis contribuye con una
parte considerable del nitrgeno combinado en la tierra y permite a las plantas leguminosas
crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos.

Las leguminosas muestran una amplia diversidad tanto morfolgica como de hbitats y
ecologa, encontramos desde formas herbceas anuales hasta rboles tropicales. Muchas
leguminosas son noduladas por los rizobios. La fijacin de nitrgeno en la simbiosis rizobio-
leguminosa es de considerable importancia en agricultura, porque causa un aumento
significativo del nitrgeno combinado en el suelo. Dado que la carencia de nitrgeno suele
darse en suelos desnudos y sin abonar, las leguminosas noduladas ofrecen una ventaja
selectiva en tales condiciones y pueden crecer bien en zonas donde no lo haran otras
plantas. Es por ello que leguminosas arbustivas y arbreas se emplean como plantas
pioneras en la reforestacin de zonas ridas y semiridas. Por el inters que estas bacterias
representan para la agricultura, emplendose como inoculantes (bio-fertilizantes) para los
cultivos se han realizado investigaciones extensas sobre este sistema simbitico, incluyendo
estudios sobre la diversidad y la taxonoma de los rizobios.Rhizobium fue la primera bacteria
producida a gran escala y se ha aadido como inoculante durante 105 aos a diversos
cultivos agrcolas, con xito en muchos casos.

Por otro lado, el uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ha

ocasionado graves problemas de contaminacin. No todo el fertilizante que se aplica lo
aprovecha la planta sino que en una cuanta importante acaba en lagos y lagunas. La
fijacin biolgica de nitrgeno es la opcin natural de fertilizacin qumica.

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ETAPAS DE FORMACIN DE NDULOS

1. Reconocimiento: Tanto la planta como la bacteria

deben reconocer al socio adecuado. Esto se realiza
gracias a que las races de las leguminosas segregan
materiales orgnicos que estimulan el crecimiento
microbiano en la rizosfera (no es exclusivo de los
rizobios). Si en el suelo hay presencia de rizobios,
estos se desarrollaran hasta construir poblaciones
densas. Es as que el primer paso de la formacin del
ndulo es la adherencia de la bacteria a los pelos
radicales de la planta correspondiente, y esto es
mediado por la ricadesina, una protena especfica de
adherencia presente en la superficie de toda
bacteria Rhizobium. Esta acta al unirse a complejos
de calcio que se encuentran en la superficie de los
pelos radicales. Tambin existen otras sustancias que hacen parte en esta
adherencia planta-bacteria, como por ejemplo las lectinas.
2. Excrecin de los factores nod por la bacteria: En primer lugar, las clulas de la
bacteria penetran el pelo radical por su extremo, y la bacteria excreta unas sustancias
denominadas factores nod, los cuales causan que el pelo radicado se rice. En esta
sustancia se encuentran los genes que dirigirn posteriormente las etapas
especifcas de la nodulacin. Estos son transmitidos atreves de plsmidos de gran
tamao, llamados plsmidos Sym, los cuales contienen genes de especificidad, lo
cual determina qu cepa de Rhizobium se unir a cierta planta hospedadora. Es as
que adems de los genes nod comunes, estn los especficos para cada especie
de Rhizobium. Por otro lado, los genes nod participan de la produccin de los ya
mencionados factores nod (oligosacridos), los cuales desencadenan la divisin
celular cortical de la planta para formar as el ndulo.
3. Invasin: La bacteria procede a invadir el pelo radical e inducen a la planta a formar
un tubo de celulosa conocido como tubo de infeccin, dentro del cual se multiplicaran
los rizobios.
4. Desplazamiento: Las bacterias se desplazan hacia la raz a travs del tubo de
infeccin y all la infeccin alcanza a las clulas contiguas a los pelos radicales, y los
factores nod estimulan la divisin celular de las clulas vegetales, formando
finalmente el ndulo.
5. Aparicin de los bacteroides: Dentro de las clulas de las plantas las
bacterias Rhizobium se multiplican y se convierten en formaciones ramificadas e
hinchadas, y es all donde aparecen los bacteroides, clulas bacterianas deformes

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necesarias para la fijacin de nitrgeno. stos quedan rodeados por porciones de la

membrana vegetal para formar unas estructuras llamadas simbiosoma, y en el
momento en que estas son formadas se da inicio a la fijacin de nitrgeno.
6. Divisin continua de clulas: Luego de la formacin del ndulo radical maduro, las
clulas bacterianas y vegetales deben permanecer en continua divisin.

IMPORTANCIA EN LA AGRICULTURA

La simbiosis entre la bacteria Rhizobium y las leguminosas tiene una gran importancia tanto
en la agricultura, como en el medio ambiente. En cuanto a la agricultura, se dice que se ve
beneficiada ya que causa un aumento significativo de nitrgeno combinado en suelos
desnudo y que carecen de este. Adems las leguminosas, parte esencial de la agricultura,
se ven favorecidas al poder crecer en zonas donde otras plantas no podran. Por otro lado,
ya que el nitrgeno es uno de los nutrientes esenciales limitados para el crecimiento de las
plantas, esta simbiosis aumenta el nivel de fijacin del nitrgeno atmosfrico, aumentando
as la produccin agrcola. Tambin beneficiaria a la agricultura econmicamente, pues
debido a que muchas industrias agrcolas dependen de la cosecha de leguminosas, el
hecho de que estas puedan crecer sin abonos nitrogenados (pues la bacteria los
remplazara) hace que sea posible el ahorrarse millones en abonos. En cuanto a la parte
ambiental, los fertilizantes son uno de los principales causantes del deterioro ambiental,
pues causan la eutrofizacin de masas de aguas, la erosin de suelos y generacin de
lluvias cidas. Estas bacterias fijadoras de nitrgeno pueden ser utilizadas en remplazo de
los fertilizantes nitrogenados para incrementar el crecimiento de las leguminosas, acabando
con los problemas ambientales que se han venido causando.

A primera vista puede parecernos extrao que un microorganismo nos ayude a tener plantas
fuertes y sanas, sin embargo existen miles de microorganismos a nuestro alrededor y
algunos de los que viven en el suelo tienen la habilidad de promover el crecimiento de las
plantas porque proporcionan nutrientes como nitrgeno, fsforo y hierro.

El proceso por el que los microbios pueden asimilar el nitrgeno gaseoso de la atmsfera se
llama Fijacin biolgica de nitrgeno y es una versin natural de la produccin industrial de
fertilizantes. Los microbios que realizan este proceso se pueden ver como pequeas
fbricas de fertilizantes nitrogenados. Algunas de estas bacterias fijadoras de nitrgeno
viven en estrecha relacin con las plantas y pueden proporcionarles nitrgeno haciendo que
estas dependan menos del nitrgeno del suelo o de los fertilizantes qumicos con nitrgeno.
Las bacterias ms conocidas que tienen esta capacidad se asocian a plantas leguminosas y
se llaman rizobios.

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El fsforo es un nutriente que puede ser abundante en el suelo pero que no es fcilmente
disponible para las plantas porque se encuentra en formas insolubles que no se pueden
utilizar. Existen microorganismos llamados solubilizadores de fosfatos que tienen la
habilidad de producir sustancias cidas que liberan el fsforo de los minerales del suelo y
as este nutriente ya puede ser absorbido por las plantas. Los microorganismos ms
conocidos que tienen esta capacidad son hongos llamados micorrizas pero tambin hay
bacterias que viven asociadas a las plantas que pueden solubilizar fosfatos.

El hierro es otro nutriente que tambin suele encontrarse en formas insolubles y no

disponibles para los vegetales en el suelo. Algunos microorganismos producen y liberan
unas sustancias llamadas siderforos que unen muy fuertemente al hierro, luego estos
complejos siderforo hierro son absorbidos por las races de las plantas.

Otra forma en la que los microorganismos pueden favorecer el crecimiento de las plantas es
mediante la produccin de hormonas vegetales, como las auxinas. Estas sustancias
promueven el crecimiento de las races de las plantas, lo que permite que puedan absorber
ms agua y nutrientes del suelo.

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MATERIALES

AISLAMIENTO DE RHYZOBIUM

Raz de frejol
Vaso precipitado
Aceite de inmersin
Coloracin Gram
Bistur
Porta Objeto
Leja

INSTRUMENTO

Microscopio

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METODOLOGIA

1. Seleccionar una planta, de preferencia una leguminosa para obtener los ndulos de
sus races.

2. Escoger una raz que tenga los ndulos y lavarlo con agua de la llave para eliminar la
mayor cantidad de suelo.

3. Desprender cuidadosamente el ndulo de la raz y colocarlo en una caja Petri

4. Triturar y colocar en el Portaobjeto.

5. Usar coloracin Gram positiva.

6. Usar la acetona para quitar la coloracin excesiva

7. Usar aceite de inmersin

8. Llevar al microscopio (100x)

9. Observar (Bacilos Gram Negativa)

10. Sembrar en agar nutritivo (Colonias blancas, Mucoides)

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RESULTADOS

Se logr identificar los ndulos de rhizobium en la raz de las leguminosas.

Al ser triturado los ndulos previamente lavados se logra colorear para su

observacin.

Se logra observar a la batera del rhizobium para poder obtener colonias blancas y
hacer el sembro en agar nutritivo para su reproduccin y produccin

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CONCLUSIONES

La necesidad de disminuir el uso de agroqumicos para aumentar las respuestas de

la agricultura.

Podemos obtener fijadores de nitrgenos sin necesidad de agroqumicos sintticos.

Estas plantas fijadores de rhizobium nos sirve para el uso de la biorremediacion de

suelos pobres.

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RECOMENDACIONES

Al realizar esta prctica tenemos que tener mucho cuidado de no introducir otras
bacterias al sembro de nuestras colonias de rhizobium, ya que daaramos nuestras
colonias con otra clase de bacterias u otro microorganismo.

Seguir cada procedimiento con sumo cuidado y materiales estriles.

Utilizar implementos de proteccin personal para la realizacin de la prctica.

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BIBLIOGRAFIA

Rubio, M. 1991. Factores que afectan al crecimiento y capacidad de fijar nitrgeno en

Bacterias del grupo Rhizobium Leguminosaurum. Tesis Facultad de Ciencias. Departamento
de Farmacia. Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 133-139 consultado el 20 de Julio
del 2009

Aislamiento, caracterizacin y seleccin de rhizobia autctonos que nodulan habichuela roja

(Phaseolus vulgaris L.), en la Repblica Dominicana.

https://buleria.unileon.es/bitstream/handle/10612/1585/Antonio.pdf?sequence=1

Aislamiento y seleccin de bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrgeno, a partir de

ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris.

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