PCR (polimerase chain

reaction)
Reaccin en cadena de la polimerasa
Componentes del sistema
oligonucletidos (cebadores)
Tampn
Polimerasa termoestable
dNTP
DNA molde
Protocolo general
Aplicaciones
PCR inverso
PCR en tiempo real (PCR cuantitativo)
 PCR

amplificacin de la secuencia
comprendida entre los dos
cebadores

ciclos de amplificacin
desnaturalizacin
reasociacin
polimerizacin

Karry Mullis 1985

Premio Nobel 1993
 Componentes del sistema

1. Oligonucletidos
secuencia que flanquean el fragmento a amplificar
actan como cebadores
tamao de 20-24 nucletidos
diseo: 3-OH bien apareado
posibilidad de mutagnesis dirigida
 Componentes del sistema

2. Tampn
Tris pH 8,4, importancia de la concentracin de MgCl2. Afecta a:
incorporacin de dNTP, actividad polimerasa y Tm cebador-molde

Efecto de la
concentracin de MgCl2
en la PCR

A 0,5 mM
B 0,8 mM
C 1,5 mM
D 2 mM
E 2,5 mM
F 3 mM
 Componentes del sistema

3. Polimerasas
Direccin de polimerizacin 5-3. Necesita 3-OH. Copian molde. Usan dNTP

DNA polimerasa a) b) c) d) e)

Taq Thermus aquaticus 40 + - -

Vent Thermococcus litoralis 400 - + -
Pfu Pyrococcus furiosus 120 - + -
Tth Thermus thermophilus 20 + - +

a) origen b) vida media (min) a 95C c) exo 5 d) exo 3 e) transcriptasa inversa

 Componentes del sistema

4. dNTPs
dATP, dGTP, dGTP, dTTP a 100-200mM
Pueden utilizarse marcados con 32P, quimiolumisiscentes o fluorescentes
para que el producto del PCR se use como sonda.

5. Molde
DNA cualquier secuencia
RNA usando polimerasas con actividad de trascriptasa inversa (RT-PCR)
Procesamiento
Aplicaciones de la PCR

Diagnosis de enfermedades
Establecimiento de la huella gentica
Aislamiento de genes
Secuenciacin
Mutagnesis
Amplificacin de RNA: RT-PCR (trascriptasa inversa)
Amplificacin de secuencias adyacentes: PCR inversa
PCR en tiempo real
PCR inversa secuencia conocida

secuencias desconocidas
para conocer las
secuencias adyacentes digerir DNA
a otra secuenencia
conocida

ligar extremos

ER

+ER
PCR

30 ciclos de PCR