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1 Km. 1 1
--- = ------- . ---- + ----
v Vmax S V
Materiales y Reactivos:
1. Solucin Sustrato almidn 500 mg/L, en buffer 0.01 M Acetato de sodio y CaCl2 0.003
M (pH 5.6)
2. Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo en HCl 0.02M
3. Enzima amilasa
4. Tubos de prueba y pipetas
5. Centrfuga clnica
6. Espectrofotmetro o fotocolormetro
7. Bao de mara a 37 C
Procedimiento
Se montar el siguiente set de trabajo:
Reactivos 1 1B 2 2B 3 3B 4 4B 5 5B
H2Od (mL) 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 --- ---
Substrato almidn (mL) 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5
Enzima (L) 50 50 50 50 50
Inmediatamente mezcle e incube a 37C por 7.5 min
Solucin de Yodo (mL) 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
Enzima (L) 50 50 50 50 50
Leer al espectrofotmetro a 640nm
El blanco para el espectrofotmetro se realizar mezclando 0.5mL de agua con 4.5mL
de solucin de yodo.
Km =
Vmax =
Reactivos 1 1B 2 2B 3 3B 4 4B 5 5B
H2Od (L) 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50
Substrato almidn (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Enzima (L) 10 20 30 40 50
Inmediatamente mezcle e incube a 37C por 7.5 min
Solucin de Yodo (mL) 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
Enzima (mL) 10 20 30 40 50
Leer al espectrofotmetro a 640nm
Resultados y Discusin:
A. Anote sus resultados y realice los clculos respectivos.
Enzima [S]inicial [S]final Vel
Tubo Abs.
ml mg/mL mg/mL mg/mL.min
1 0.01 10
2 0.02 10
3 0.03 10
4 0.04 10
5 0.05 10
*Para determinar la concentracin final de sustrato ([S] final) emplear el coeficiente de
absorcin de la curva estndar de almidn realizada anteriormente.
*Para determinar la velocidad de reaccin en cada tubo:
V= [S] inicial [S]final (g/L)
Tiempo (min.)
BIBLIOGRAFA
1. Gutirrez R., Ana y Santa Cruz C., C. (1998) Gua de Prcticas Bioqumica.
Universidad Nacional Federico Villarreal.
2. WIENER LAB. 1995. Vademcum. Edicin Revisada y Actualizada. Rosario-Argentina.