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1.- Ley de Lambert. :

Esta ley establece que cuando pasa luz monocromtica por un medio homogneo, la
disminucin de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio,
lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida disminuye exponencialmente
al aumentar aritmticamente el espesor del medio absorbente (Fig. 2):

Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida b : Espesor del medio absorbente

k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz incidente,
del espesor del medio absorbente y de la naturaleza del medio.

2.- Ley de Beer :

La intensidad de un haz de luz monocromtica disminuye exponencialmente al aumentar

aritmticamente la concentracin de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a travs
de un medio homogneo (Fig. 3).

La relacin matemtica que da cuenta de esta ley se muestra a continuacin:

P / P0 = e -kc
donde :
Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida
c : Concentracin de la solucin
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k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz
incidente, de la concentracin de la solucin, y frecuentemente, de la naturaleza del medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

log P0 / P = a b c A = a b c

A = log P0 / P = - log T

donde :
del medio (longitud de
a : Absortividad b : Longitud o espesorla cubeta)
c : Concentracin de la solucin P/Po= T : Transmitancia

Los trminos absorbancia y transmitancia son definidos a continuacin.

Transmitancia (T) : Es la razn entre la luz monocromtica transmitida (P) por una muestra y
la energa o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energa radiante incidente como la
transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

T = P / P0 = 10-abc %T = 100 P / P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razn de la luz transmitida por la muestra

y la luz transmitida por un estndar arbitrario. Este estndar puede ser el liquido (solvente)
en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analtico (solucin que contiene todos los
componentes de la solucin problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida
arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estndar no es necesariamente 100%,
es necesario especificar el estndar con el cual la muestra es comparada.

Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energa radiante absorbida por una sustancia
pura o en solucin. Matemticamente, corresponde al logaritmo negativo de la
transmitancia.T, transmitancia expresada como fraccin decimal %T, transmitancia expresada
como porcentaje.

A = - log T = 2 log %T

Pero.
T = P / P0 = 10-abc
Luego

A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc

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A=abc

Esta ecuacin indica que la absorbancia es una funcin lineal de la concentracin, donde a es
una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las
unidades de b y c. Si la concentracin c est expresada en moles por litro y la longitud de la
cubeta b en centmetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar ( ) . Luego

A=bc

Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparacin entre la muestra

problema y un estndar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje
de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

Seleccin de longitud de onda de trabajo.

La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual

la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es mxima, y recibe la denominacin de
Lambda mximo (max). Para seleccionar el max., se hace un espectro de absorcin o curva
espectral, y que consiste en una grfica de la absorbancia de una solucin de la sustancia
absorbente de concentracin adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se
determina el max. (Fig.4).

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera

que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se
realizan en la zona visible del espectro electromagntico (380 a 800nm). En el caso de
sustancias no coloreadas, las mediciones se realizan en la regin ultravioleta del espectro
electromagntico (200 a 380nm).
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Curva de Calibracin.

Uno de los mtodos ms utilizados para determinar la concentracin de una muestra

problema, es el mtodo de la curva de calibracin. Esta curva de calibracin es una grfica
que relaciona la concentracin de al menos cinco soluciones de estndar de concentraciones
conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda mxima ( max) (Fig.
5).

Una vez obtenida la grfica se determina la funcin matemtica que presenta dicha recta a
travs del tratamiento estadstico de regresin de los mnimos cuadrados, la cual relaciona la
absorbancia y la concentracin de un analito. La siguiente ecuacin matemtica corresponde
a dicha funcin:

A=mc+n (Ecuacin 1)

A : Absorbancia. n : Intercepto de la recta

m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra

y el espesor b de la cubeta.

Luego se mide la absorbancia de la solucin problema y se interpola su valor en la grfica o

se reemplaza en la ecuacin (1), para obtener el valor de concentracin del analito. La
concentracin de la solucin problema debe estar comprendida en el rango de concentracin
que comprende la curva de calibracin. Si la concentracin de la solucin problema es menor
que la concentracin del estndar ms diluido, debe usarse el mtodo de adicin estndar,
que consiste en adicionar un volumen determinado de un estndar concentrado a la solucin
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problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las
obtenidas para la curva de calibracin. En el caso contrario, si la concentracin del analito es
mayor que la concentracin del estndar ms concentrado la solucin problema deber ser
diluida.

Al hacer la curva de calibracin, se debe emplear la longitud de onda de mxima absorbancia

(max.), para obtener una recta con la mxima pendiente y as tener mayor sensibilidad y
precisin al hacer las mediciones.

La medicin de la absorbancia de la solucin problema debe hacerse a la misma longitud de

onda que fue hecha la curva de calibracin.

EN LOS ALIMENTOS: La espectrofotometra, un adelanto cientfico, es actualmente la

tcnica ms precisa y exacta para el control de la medida, la formulacin y la calidad de los
colores deseados en los alimentos preparados. Los espectrofotmetros miden la reflectancia
espectral o la transmitancia de un objeto a travs de todo el espectro de longitudes de onda
de luz visibles a un humano, de 400nm a 700nm (nanmetros), lo que permite una
especificacin precisa de cualquier color deseado.

Los espectrofotmetros ofrecen una mayor especificidad, es por esto que son los instrumentos
elegidos para la formulacin del color en productos alimenticios, establecimiento de
estndares y tolerancias, comunicacin del color entre plantas y el control de calidad del color
en las operaciones del proceso. Durante la ltima dcada, los espectrofotmetros, se han
adoptado cada vez ms en la industria alimenticia para la estandarizacin del color y la
inspeccin de control de calidad de los ingredientes antes de usarlos, para la especificacin
del color del producto final (particularmente en mermeladas, jaleas, reservas, bebidas, etc),
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en la investigacin y desarrollo de nuevos productos alimenticios y bebidas, y en la seleccin

de alimentos y potencial de las tcnicas de seleccin de factores que van desde el contenido
natural de grasa a la categora de calidad de carnes, aves y pescados.

El ojo humano es un mquina que posee dos tipos de receptores, conos y bastones:
Los conos, que tienen una sensibilidad mxima a la luz de una longitud de onda de 555nm.
La parte del espectro amarillo/verde.
Los bastones, que tienen una sensibilidad mxima a la luz de una longitud de onda de 505nm.
La parte del espectro azul/verde. La parte central de la fvea, no tiene conos. La percepcin
del color no es posible si slo estn activos los bastones. Los Conos, tienen su mxima
funcionalidad en luminancias altas, comprendidas entre 3 y 10 cd/m2, e incluso mayores
(situaciones diurnas). Es entonces cuando hablamos de Visin fotpica para el ojo humano.
La visin humana en colores es posible porque disponemos de conos sensibles al rojo, verde
y azul. La sensibilidad espectral de la visin fotpica, est caracterizada por la curva
V(lambda) y alcanza la mxima sensibilidad a una longitud de onda de 555nm
correspondiente a los colores amarillo-verde. Es por ello que las fuentes de luz con alto
contenido en esta parte del espectro son muy eficaces para la visin humana cuando sta
acta de forma Fotpica.

PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO REGISTRO FOTOGRAFICO

Vertr una solucin de
permanganato de potasio
(0.02N), y 25 mL de una
alcuota, llevarlos a un
baln aforado de 100 mL,
y completar este volumen
con agua destilada.
Se coloc la solucin en una
buretra, se agreg 5mL de la
solucin, para despus
completar 15mL con agua
destilada.

Se tapa la muestra con

papel celofn, se agita, sin
dejar que el aire ingrese en
el tubo, esto con el fin de
homogenizar la solucin, y
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se mantiene fuera de la luz

hasta el momento de su
uso.
Se conecta el instrumento a
110 voltios, se enciende y se
deja durante 10 min
prendido para que se
estabilice.
Despus de ello se calibra el
espectrofotmetro con una
celda de agua destilada hasta
dar un valor de 100%, y se
llena otra celda con la
muestra.
Se toman los datos
correspondientes y se
elaboran las tablas
correspondientes.
Tabla #1.

PROCEDIMIENTO REGISTRO FOTOGRAFICO

Vertr una solucin de
permanganato de potasio
(0.02N), y 25 mL de una
alcuota, llevarlos a un
baln aforado de 100 mL,
y completar este volumen
con agua destilada.
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Se coloc la solucin en
una buretra, se agrega las
cantidades
correspondientes y se
termina de agregar agua
destilada hasta lograr
15mL.
Se tapa la muestra con
papel celofn, se agita, sin
dejar que el aire ingrese en
el tubo, esto con el fin de
homogenizar la solucin,
y se conserva al abrigo de
la luz hasta su uso.
Se conecta el instrumento
a 110 voltios, se enciende
y se deja durante 10 min
prendido para que se
estabilice.
Despus de ello se calibra
el espectrofotmetro con
una celda de agua
destilada hasta dar un
valor de 100%, y se llena
otra celda con la muestra.
Se toma opera el
espectrofotmetro para
variar la longitud de
onda para las diferentes
soluciones.
Se toman los datos de
concentracin y
absorbancia y se realizan
las diferentes tablas.
DATOS EXPERIMENTALES

Longitud de onda Porcentaje de Transmitancia

%T
380 0.0%
390 0.0%
400 0.0%
480 0.5%
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490 0.5%
500 0.4%
580 8.5%
590 15.7%
600 19.0%
650 29.7%
660 31.6%
670 33.7%
680 35.4%
690 36.8%
700 38.4%
710 40.0%
720 40.8%
730 42.0%
740 60.5%
750 61.9%
760 63.0%
Tabla #1

N TUBO ALCUOTA VOLUMEN MN

SOLUCIN DE AGUA MG/15ML MG/ML MG/LITRO
DE DESTILADA
TRABAJO
ML
1 1 14 0.16 0.01 0.37
2 2 13 0.32 0.02 0.73
3 3 12 0.47 0.03 1.10
4 4 11 0.63 0.04 1.47
5 5 10 0.79 0.05 1.83
6 6 9 0.95 0.06 2.20
7 7 8 1.11 0.07 2.57
8 8 7 1.26 0.09 2.93
9 9 6 1.42 0.10 3.30
10 10 5 1.58 0.11 3.67
Tabla #2

N 1 Mn Absorbancia ( )( ) ( )
Mg/litro
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( )
1 0.37 0.084 0.031 0.13
2 0.73 0.005 0.003 0.53
3 1.10 0.242 2.466 1.21
4 1.47 0.093 0.136 2.16
5 1.83 0.111 0.203 3.348
6 2.20 0.205 0.451 4.84
7 2.57 0.008 0.020 6.60
8 2.93 0.30 0.879 8.58
9 3.30 0.018 0.059 10.89
10 3.67 0.249 0.913 13.46
= 20.17 1.315 5.161 51.74

(1 )2
11 4.04 0.003 0.012 16.32
12 4.43 2.86 12.669 19.62
13 4.91 0.062 0.304 24.10
14 5.29 0.232 1.227 27.98
Tabla #3

Grafica