Cromatografìas en Columna (HPLC y GC)

Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (HPLC)
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Magister de Plantas Medicinales
Fundamentos
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla
debido a la influencia de dos efectos contrapuestos:
a) Retencin de los componentes de la mezcla por parte de la fase estacionaria (FE, slido o lquido
anclado a un soporte slido).
b) Desplazamiento de los mismos componentes con la fase mvil (FM) que fluye (lquida o gaseosa).
Por qu se logra la separacin?

1. Distinta afinidad de cada componente por FE y FM (en base a sus diferencias qumicas)
2. Migracin diferencial
3. Elucin por separado (orden de elucin)
1
Clasificacin
Segn el estado FM
de las fases:
Gas Lquido Slido
Gas
FE Lquido
GC LC
Slido
Segn el tipo de interaccin: Segn la geometra del lecho:

Particin En columna
Adsorcin Planar
Exclusin molecular
Intercambio inico
Proceso cromatogrfico columnar

Seal
Tiempo
Cromatograma
2
Cromatograma
tR : Tiempo de retencin
t0 : Tiempo muerto
Intensidad de la seal de deteccin
A: rea de pico
tR
h: Altura de pico
t0
h
A
Tiempo
Cromatografa lquida
en columna Disminucin del tamao
de partcula FE
Equipamiento capaz de
generar y tolerar
altas presiones
Sistemas de deteccin
ms sensibles
Cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC)
Mayor grado de separacin (mayor resolucin, HP)
Menores tiempos de anlisis
3
Hplc - ventajas y limitaciones
+
Alta capacidad de separacin (anlisis multicomponente)
Alta resolucin / rapidez
Aplicaciones cuantitativas reproducibles, gran sensibilidad
Requiere poca cantidad de muestra
Versatilidad
Automatizacin
-
Posibilidad de escala preparativa
Costo
Gran consumo de solventes
Personal capacitado
Identificaciones no precisas
Detectores
1. Sistema
cromatogrfico
y Fase Mvil
4
1. Sistema Cromatogrfico y FM
Equipamiento cromatogrfico
Reservorio de FM
Opcional
Sistema de gradiente a baja presin
Desgasificador en lnea
Bomba (flujo / presin)
Inyector (manual / automtico)
Columna (Opcional: horno)
Detector/es
Software controlador y registrador
Equipamiento Bsico Sistema de

deteccin y
registro
Descarte
Sistema
Inyector
de
FM bombeo
Pre-mezclada o no
SV miscibles entre si, poco
viscosos
Filtrada y desgasificada
Compatible con detector
SV calidad HPLC
5
Fase Mvil (FM)
Debe disolver la muestra
# No degradar ni disolver a la fase estacionaria
# Baja viscosidad y baja reactividad
# Compatible con el detector
# Alto grado de pureza (agua y SV calidad HPLC)
# Seguridad
Preparacin
# Ojo la miscibilidad!
# Medir volmenes por separado (posible contraccin de volumen al

mezclar)
# Debe ser filtrada y desgasificada
# pH de la fase mvil, parmetro crtico
# Posible precipitacin de sales (al mezclar buffer + SV org)
Desgasificacin de la FM
Membrana filtrante
Vaco
(0,45 m poro)
Vaco
Ultrasonido
Slo desgasificacin Desgasificacin + Filtracin

6
deteccin y
registro
Sistema de
gradiente
(opcional)
Desgasificador
en lnea
(opcional)
Descarte
Inyector
FM Sistema
de bombeo
Una o ms bombas
Tipos de sistemas de gradiente

mezclado a alta presin mezclado a baja presin
Sistema de gradiente a baja
presin
Desgasificador
en lnea
Cmara
mezcladora
Mayor exactitud en el mezclado Funciona con una sola bomba

Ms costoso (se requieren mltiples Se require un sistema desgasificador en lnea
bombas)
7
deteccin y
registro
Descarte
Inyector
Manual o automtico
FM Sistema Volumen fijo (loop) o variable
(jeringa)
de
bombeo

deteccin y
registro
Inyector Horno
(opcional)
Columna
# Tubo de material inerte, capaz de resistir
altas presiones
# Longitud entre 3 y 50 cm
# Disco de tefln o metal poroso en los
extremos
# Se acondiciona antes y despus del
anlisis
FM Sistema # Se guarda llena de SV, segn
instrucciones
de bombeo # Bitcora u hoja de seguimiento
# Relleno: slido particulado (3 10 m),
puede ser polar (fase normal) o no polar
(fase reversa)
8
Equipamiento Bsico
Sistema de
deteccin y registro
Detector UV:
Espectrofotomtrico # Rango
Inyector Arreglo de fotodiodos # Sensibilidad
FM Sistema Detector de fluorescencia
# Ruido
Espectrmetro de masa
de bombeo Otros: # Linealidad
Electroqumico # Especificidad
ndice de refraccin
FE
Fase Normal
Silica gel: -Si-OH
Tipo ciano: -Si-CH2CH2CH2CN
Tipo amina: -Si-CH2CH2CH2NH2
Tipo diol: -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2OH
Hidracarburos alfaticos y aromticos

FM Adicionalmente: alcoholes, teres, etc.
Hexano:MeOH
100:0 Poder de elucin
98:2
95:5
Polaridad
9
Fase Reversa
# Fase estacionaria de baja polaridad (ej. C18, C8)
# Fase mvil polar (agua -buffers, cidos-, MeOH, AcCN)
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C18 (ODS)
Si -O-Si
C8 (octil)
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
C4 (butil)
C18 (ODS) C8 (OS) Fenil, etc.
Si Si
fuerte medio
Analito Analito
H2O H2O H2O H2O
H2O H2O H2O H2O
H2O H2O
H2O H2O H2O H2O
Fase Reversa
FE RP-18
FM MeOH:Agua
MeOH:Agua
60:40 Polaridad
70:30
80:20 Poder de elucin

10
Detectores de absorcin UV-Vis
Detector UV-Vis
Muestra de
concentracin (C)
I0 I
Simboliza un
T= I / I0 A=-log(T)
fotodiodo
A = -bC = log (I / I0)

Arreglo de diodos
Muestra de
concentracin (C)
I0 I
Simboliza un
T= I / I0 A=-log(T)
fotodiodo
A = -bC = log (I / I0)
11
Detector UV-Vis
Cromatograma a 1
Mayor selectividad a mayor

longitud de onda
200 1 250 2 300 350

Cromatograma a 2
Longitud de onda [nm]

Detector UV-Vis
12
Detectores de
absorcin UV-Vis
Arreglo de diodos
Deteccin por espectrometra de masas (MS-LC)

Al salir de la columna, la muestra es transferida hacia un espectrmetro de masas.
Un espectrmetro de masas (MS) es un instrumento que ioniza una molcula en fase gaseosa utilizando
energa suficiente para que el ion resultante se rompa en iones ms pequeos (por bombardeo con e-). Debido
a que estos iones tienen diferentes relaciones masa/carga (m/z), es posible separarlos utilizando un campo
magntico o elctrico. El espectro de masas resultante contiene informacin cuali y cuantitativa sobre el analito.
Se generan dos salidas:
El cromatograma, que seala los tiempos de retencin
El espectro de masas de cada pico del cromatograma, el cual permite identificar los compuestos de la mezcla
cromatografiada (cada molcula tiene un patrn o espectro de fragmentos nico y distintivo)
Detector Universal
Cuantificacin + Identificacin
13
LC
El bombardeo e- ioniza la molcula haciendo que

pierda un e- por repulsin electrosttica,
generando el ion molecular (M+), de igual PM.
A continuacin se generan fragmentos ms

pequeos, todos con diferente m/z.
Los iones se pasan por un analizador de masas

donde se clasifican en funcin de su relacin de
valor m/z (la mayora tiene z=1).
3. Modo de
Operacin
14
3. Modo de Operacin
Flujo (ml/min)
Temperatura (si el equipo cuenta con horno)
Modo isocrtico o gradiente (si se tiene sistema de gradiente)
MeOH:H2O (6:4)
Modo Isocrtico:
Picos con >> tr
composicin
constante de la FM
MeOH:H2O (8:2)
Problema general de Picos no resueltos

elucin
Columna C18
3. Modo de Operacin
Modo Gradiente
Concentracin de MeOH en la FM
95%
Separacin
ptima
30%
Columna: C18
15
4. Muestras
a inyectar
4. Muestras a inyectar
Siempre se deben filtrar las muestras antes de inyectarlas (se
utilizan filtros de membrana de nylon o celulosa de 0.45 - 0.2
m de tamao de poro).
En el caso de no poder filtrar (ej. pequeo volumen de
muestra), se debe centrifugar.
Conviene prepararlas en FM o SV de menor fuerza
Desproteinizacin
# Precipitacin
# Adicin de solventes orgnicos (ej. acetonitrilo)
# Adicin de cidos (ej. TFA, perclrico)
# Adicin de metales pesados o sales neutras
# Ultrafiltracin
16
Extraccin en fase slida
(1) (2)
(3) (4)
Acondicionamiento del Adicin de la
Lavado Elucin
cartucho muestra
Solvente de
menor fuerza de
elucin
Solvente de
mayor fuerza de
elucin
Compuesto de
inters
Otros compuestos
(matriz,
interferencias)
Extraccin lquido-lquido
Agitacin
Centrifug.
Otros pre-tratamientos
# Dilucin # Liofilizacin
# Destilacin # Evaporacin concentracin
# Extraccin en Soxhlet # Etc, etc, etc.
17
Objetivos del pre-tratamiento
# Para mejorar la exactitud de la medida
# Para mejorar la sensibilidad y selectividad (especificidad)
# Para proteger y prevenir el deterioro de la columna y el equipo
No se deben inyectar:
Sustancias insolubles (ej. partculas, precipitados)
Sustancias que podran precipitar en las condiciones del mtodo
Sustancias que se adsorberan irreversiblemente a la columna
Sustancias capaces de disolver o reaccionar qumicamente con el relleno
de la columna
Sustancias agresivas para cualquier parte del equipo
5. Aptitud
del Sistema
18
5. Aptitud del Sistema (System suitability)
Se realiza para verificar que la resolucin y la reproducibilidad del sistema cromatogrfico
son adecuadas para el anlisis farmacopeico a realizar.
El ensayo considera que el equipamiento, el software, el mtodo analtico y las muestras
constituyen un sistema integral que se evala como tal.
La eficiencia del sistema se evala mediante el parmetro resolucin (Rs, debe haber al menos dos picos), o menos
comnmente mediante el clculo del nmero de platos tericos (N). Ambos parmetros deben superar un cierto valor
mnimo aceptable.
La precisin del sistema se evala mediante el coeficiente de variacin (CV) entre los valores de rea obtenidos por
inyecciones repetidas de una misma solucin de referencia
La asimetra del pico se evala mediante el clculo del factor de asimetra (As), y es importante ya que a mayor asimetra
de pico, mayor imprecisin en el valor de rea obtenido por integracin.
En el captulo general de Cromatografa 621, se establecen los cambios que pueden realizarse para lograr cumplir con este test.
Si con eso no fuera suficiente VALIDACIN
Por qu se pierde eficiencia?

1. Factores Intracolumnares
A = coef. de efecto de trayectoria mltiple
B = coef. de efecto de difusin longitudinal
C = coef. de efecto de transferencia de masa
H es la altura de plato terico en cm y es la
velocidad lineal de la FM
2. Factores Extracolumnares
Volumen de tuberas inyector-columna y columna-celda del detector
Volumen de inyeccin
Detector: volumen y velocidad de respuesta
19
Picos asimtricos o con cola (tailing)
Posibles causas de asimetra:
Efectos extracolumnares
Sobrecarga de la columna
Mecanismos mixtos de
retencin
Sitios superficiales
heterogneos
Sistemas no buffereados
As = a+b = W0,05
2a 2a
Nmero de platos tericos (N)

2
tR
N = 16 Wtg
2
tR
= 5, 54
W1 / 2
H
W1/2 2
H1/2 tR * H
=2
W Area
20
Equivalencias para el clculo de N
Resolucin (RS)
tR1 tR2
tR 2 t R1
RS =
1
(W1 W2 )
2
W1 W2
21
Para lograr una separacin completa...
(tR2 - tR1) (tR2 - tR1)
W1 W2 W1 W2
tR2 - tR1 = W1 = W2 tR2 - tR1 = W1 = W2
RS = 1 RS = 1
Tringulos, RS = 1 para Gaussianas, RS > 1.5 para
separacin completa separacin completa
Optimizacin de la separacin
1 2
La resolucin es una funcin del =
1 +
factor de separacin, el nmero de 2 1 2
platos tericos y el factor de
1 2
capacidad. =
4 2 + 1
Ideal 3 < k < 10
2.0
Efecto sobre la Rs
1.0 Ideal, N mximo

Efecto sobre la Rs
0.8
0.6 1.0
0.4
0.2
0.0 0.0
0 5 10 15 20 0 1.104 2.104 3.104
Factor de capacidad (k) N de platos tericos (N)
22
Optimizacin de la separacin
Cromatograma original
Ej. Reemplazo la FM por una con

Aumento de k menor fuerza de elucin
Reemplazo la columna por una ms

Aumento de N larga o ms eficiente
Cambio del tipo de relleno de la columna

Cambio la composicin de la FM
Aumento de Cambio la temperatura
6. Anlisis cuali
y cuantitativo
23
6. Anlisis cuali y cuantitativo
Anlisis
# Identificacin en base al tiempo de retencin
(mejor en mltiples sistemas: columnas,
cualitativo detectores)
# Comparacin de espectros (UV, MS)
Anlisis 1. Preparacin de la muestra
cuantitativo
2. Inyeccin de la muestra
3. Separacin cromatogrfica
A. Normalizacin interna 4. Deteccin
B. Estndar externo
C. Estndar interno 5. Integracin de la seal
D. Estndar agregado 6. Clculo de la concentracin de analito
Cromatografa Gaseosa (CG)
24
Fundamentos
Los compuestos orgnicos en la muestra se separan debido a diferencias en
su comportamiento de reparto entre el gas portador (fase mvil, no
interacta con la muestra, solo la lleva) y la fase estacionaria lquida (GLC,
gas-liquid cromatography).
En el caso de GSC (gas-solid cromatography), la separacin es por adsorcin
entre la FM y la FE (menos comn).
Cundo se aplica?
Es la tcnica a elegir para la separacin de compuestos orgnicos e
inorgnicos trmicamente estables y voltiles
Cromatgrafos de gases
25
En la cromatografa de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan al ser
distribuidos entre una fase mvil gaseosa y una fase estacionaria lquida o slida retenida en una
columna.
Al realizar una separacin por cromatografa de gases, la muestra es vaporizada e inyectada en la
parte superior de una columna cromatogrfica.
La elucin ocurre por el flujo de una fase mvil inerte gaseosa.
En contraste con la mayora de los tipos de cromatografa, la fase mvil no interacta con las
molculas del analito.
La nica funcin de la fase mvil es transportar al analito a travs de la columna.
Existen dos tipos de CG: cromatografa gas-lquido y cromatografa gas-slido.
La cromatografa gas-lquido est basada en la particin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase
lquida inmovilizada en la superficie de un empaque slido inerte o en las paredes del tubo capilar
La cromatografa gas-slido se basa en una fase estacionaria slida en la cual la retencin de los analitos
ocurre debido a una adsorcin fsica
Equipamiento bsico en CG Sistema de

deteccin y
registro
Control de
temperatura
Control de
presin
FM
Gas inerte: Ar,
He, N2
Secos y alta
pureza
Compatibles
con el detector
26
Fase mvil (gas portador)
Ms comunes: He, Ar, y N2 (por ser qumicamente inertes frente a la muestra y la fase
estacionaria).
Los gases deben estar secos y libres de oxgeno
(calidad cromatogrfica: pureza > 99,995%, con <0,5 ppm O2).
La eleccin del gas portador suele estar determinada por el detector a utilizar.
El gas es precalentado y filtrado antes de ingresar al sistema, pasando primero por la
cmara de inyeccin
Flujos tpicos:
Columna empaquetada: 25-150 ml/min.
Columna capilar: 1-25 ml/min
Gas recomendado para:
27
deteccin y
registro
Control de
temperatura
Control de
presin
Flujo constante del
gas portador
FM

deteccin y
registro
Control de
Inyector temperatura
Directa (columnas empacadas)
Split (columnas capilares)
Splitless (capilares, non-Split mode)
On-column
Control de
presin
FM
28
Sistema de inyeccin
Inyeccin directa: la muestra se introduce con

una jeringa a travs de un septum de goma
dentro de una cmara donde es vaporizada y
transportada por el gas al interior de la
columna.
La cmara de inyeccin se mantiene a una temperatura

lo suficientemente elevada para vaporizar la muestra en
forma casi instantnea (aprox. 50 C por encima de la
temperatura de ebullicin)
Sistema de inyeccin
Para columnas capilares, se puede emplear un

divisor de flujo (split), de forma que slo llegue
a la columna un 1% de la muestra (si la
concentracin lo permite, sino, splitless)
Si el flujo es 50 ml/min, la purga del septum es de 3
ml/min y el venteo del Split de 46 ml/min, ingresan a la
columna 1 ml/min, es decir, 1:50
El modo Split mejora la resolucin y eficiencia (picos ms
finos y separados), pero se pierde sensibilidad y precisin
29
Sistema de inyeccin
Directa
Inyecciones por vaporizacin: el gas portador se introduce en la
(columnas empacadas)
columna a travs del inyector, el cual est dentro de un bloque metlico
Split que se calienta. All la muestra inyectada se vaporiza, se mezcla con el gas
(columnas capilares) portador, y se transfiere a la columna.
On-column La muestra lquida se introduce directamente en la columna, y se vaporiza de acuerdo

con el programa de temperatura del proceso cromatogrfico (temp. del horno)
Requiere un sistema de inyeccin especial para guiar la aguja dentro de la columna (id < 0,3 mm), como as tambin
una jeringa especial. Es el mtodo de eleccin para muestras lbiles, que se degradaran a la temperatura del inyector
Poca reproducibilidad en la inyeccin Usar ST interno!

deteccin y
registro
Control de
temperatura
Columna
Empacadas
(menos usadas, se rellenan
con FE slida o lquida)
Control de Capilares
(suelen ser tubulares
presin abiertas, sin restriccin para
el flujo, impregnadas con
distintas FE lquidas)
FM
30
Columnas
cromatogrficas
empacadas
Pueden ser construidas con tubos de acero inoxidable, Al, Cu o vidrio.

Menor poder de separacin, pero admiten mucha cantidad de muestra
Suelen tener un dimetro interno entre 2 - 8 mm, y una longitud entre 2-6 m (tpicamente < 3 m).
Se rellenan de un material adecuado a las sustancias que se quiere separar (tamao de partcula del
orden de 150 m):
Ej. tierras de diatomeas (porosa, 0,5-10 m2/g, gr silanoles SiOH ) GSC
Lquido adsorbido sobre el slido poroso
GlC
Columnas
cromatogrficas
capilares
Los dimetros interiores suelen ser de 150-350 m.

La longitud suele ser superior a los 20 m (15-100 m).
En general se trata de columnas tubulares abiertas (open-tubular, OT columns),
con trayectoria libre para el flujo de la fase mvil, sin restriccin por el centro de la
columna
31
Nombre Temp. Mx.

Ejemplos de FE lquidas Polaridad Aplicaciones
comercial (C)
HC alifticos de bajo punto de
Escualano No polar Squalane 150
ebullicin
Apezion (grasa libre de silicona y libre de
Amidas, steres metlicos de AG,
halgenos apta para su uso bajo ultra alto No polar Apezion L 300
terpenoides
vaco)
Alcaloides, derivados de
Polidimetil siloxano Ligeramente polar SE-30 300350 aminocidos, drogas, pesticidas,
fenoles, esteroides
Alcaloides, drogas pesticidas, HC

Fenilmetil polisiloxano (50% fenil, 50%
Moderadamente polar OV-17 375 poliaromticos, bifenilos
metil)
policlorados
Alcaloides, derivados de
Trifluoropropilmetil polisiloxano (50%
Moderadamente polar OV-210 275 aminocidos, drogas, compuestos
trifluoropropil, 50% metil)
halogenados, cetonas
Cianopropilfenilmetil polisiloxano (50%

polar OV-225 275 Nitrilos, pesticidas, esteroides
cianopropil, 50% fenilmetil)
PEG polar Macrogol 20M 225 Aldehdos, steres, teres, fenoles
32
Efecto de la
longitud de la
columna

deteccin y
registro
Horno y control
de temperatura
El horno se debe poder
calentar y enfriar rpidamente
El programador de temperatura
permite trabajar en forma isotrmica
Control de o gradiente (solucin para muestras cuyos
componentes poseen Teb muy diferentes)
presin
FM
33
Modo isotrmico
La temperatura ptima es aproximadamente el punto medio de la gama de ebullicin de la
muestra.
Este mtodo funciona bien cuando el intervalo de temperaturas de ebullicin de la muestra es
estrecho.
Para una muestra conteniendo compuestos con puntos de ebullicin diferentes, si se trabaja a
temperaturas:
Bajas: las fracciones de bajo punto de ebullicin se resuelven bien, pero las fracciones de alto
punto de ebullicin son lentos para eluir (bandas ensanchadas, >>tr)
Altas: los componentes de mayor punto de ebullicin se resuelven bien (picos afilados ) pero
los de menor punto de ebullicin salen con el frente, o a tr tan << que no logran separarse.
Para resolver ese problema: Gradientes de temperatura
Modo isotrmico vs.

2
3
4
5 6
gradiente 1
2
3 5
4 6
1
2
3
4
5
6
34
deteccin y
registro
Los detectores
ms comunes son
los de Conductividad
Trmica (TCD) y
Ionizacin por Llama
Control de
temperatura (FID)
Control de
presin
FM
Sistemas de deteccin
Dispositivo que proporciona una medicin cuantitativa de los componentes de la mezcla que eluyen
con el gas portador.
En teora, cualquier propiedad de la mezcla gaseosa que sea diferente respecto al gas portador se
puede utilizar como un mtodo de deteccin.
Caractersticas ideales
Sensibilidad elevada
Bajo nivel de ruido
Respuesta lineal en un amplio rango dinmico
Tiempo de respuesta corto
Buena respuesta para toda clase de compuestos orgnicos (no-especfico)
Insensibilidad a las variaciones de flujo y temperatura
Estabilidad y robustez
Simplicidad en su operacin
Tcnica no destructiva
35
Tipos de detectores
Los detectores ms comunes son los de Conductividad Trmica (TCD) y Ionizacin por Llama (FID)
Detector de conductividad
trmica (TCD)
Fueron los primeros en desarrollarse

Miden el cambio en la conductividad trmica del gas portador debido a la presencia de la muestra (mayor
sensibilidad con He, H2)
Su diseo es simple: constan de un filamento (Pt, Au) calentado elctricamente a potencia constante. La
temperatura del filamento depende de la conductividad trmica del gas circundante.
La llegada de la muestra modifica la conductividad trmica del gas cambio de temperatura.
Ventajas: facilidad y sencillez de uso, til para una amplia gama de compuestos inorgnicos y orgnicos (no-especfico), no destructivo
(apto anlisis preparativo)
Desventajas: baja sensibilidad en relacin con otros mtodos de deteccin
36
Detector de ionizacin por llama (FID)
Es el ms ampliamente utilizado.
Al salir de la columna, la muestra se hace pasar por una llama
de aire-H2 donde sufre pirlisis o descomposicin qumica por
calentamiento intenso.
Esto genera e- y cationes orgnicos (CHO+). La aplicacin de un
pot ~ 300 voltios a travs de la llama crea una pequea
corriente (10-9 - 10-12 A), la que amplificada proporciona una
seal analtica til.
Ventajas: no se ve afectado por el flujo, los gases no
combustibles y agua, por lo que posee alta sensibilidad y bajo
ruido. La unidad es a la vez fiable y relativamente fcil de usar.
Sin embargo, esta tcnica requiere gas inflamable (es insensible
a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2 y NOx) y
tambin destruye la muestra.
37
38

Cromatografìas en Columna (HPLC y GC)

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Cromatografa Lquida de Alta

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Por qu se logra la separacin?

Segn el tipo de interaccin: Segn la geometra del lecho:

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Proceso cromatogrfico columnar

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Software controlador y registrador

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Equipamiento Bsico Sistema de

# Medir volmenes por separado (posible contraccin de volumen al

Slo desgasificacin Desgasificacin + Filtracin

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Tipos de sistemas de gradiente

Mayor exactitud en el mezclado Funciona con una sola bomba

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Equipamiento Bsico Sistema de

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Hidracarburos alfaticos y aromticos

100:0 Poder de elucin

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80:20 Poder de elucin

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Detectores de absorcin UV-Vis

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Mayor selectividad a mayor

200 1 250 2 300 350

Detectores de absorcin UV-Vis

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Deteccin por espectrometra de masas (MS-LC)

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El bombardeo e- ioniza la molcula haciendo que

A continuacin se generan fragmentos ms

Los iones se pasan por un analizador de masas

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Problema general de Picos no resueltos

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Por qu se pierde eficiencia?

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Nmero de platos tericos (N)

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1.0 Ideal, N mximo

Ej. Reemplazo la FM por una con

Reemplazo la columna por una ms

Cambio del tipo de relleno de la columna

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Anlisis 1. Preparacin de la muestra

Cromatografa Gaseosa (CG)

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